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Roberto Rasslan
Efeito da solução salina hipertônica e da
pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e a
atividade inflamatória na sepse induzida por
obstrução e isquemia intestinal em ratos
São Paulo
2013
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do Título de
Doutor em Ciências
Programa de: Clínica Cirúrgica
Orientadora: Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Rasslan, Roberto Efeito da solução salina hipertônica e da pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e a atividade inflamatória na sepse induzida por obstrução e isquemia intestinal em ratos / Roberto Rasslan. -- São Paulo, 2013.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Clínica Cirúrgica.
Orientadora: Edna Frasson de Souza Montero. Descritores: 1.Solução salina hipertônica 2.Pentoxifilina 3.Sepse 4.Traumatismo
por reperfusão 5.Obstrução intestinal 6.Inflamação 7.Ratos
USP/FM/DBD-107/13
iv
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e documentação.
Guia de apresentação e dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Cordeiro da Cunha, Maria Julia de A.L. Freddi, Maria F. Crestana,
Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3ª ed. São Paulo:
Divisão de Biblioteca e Documentações; 2012
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List Journals Indexed in Index
Medicus.
v
Dedicatória
vi
Aos meus pais, Nilza e Samir. Esta etapa da minha profissão é fruto de todo
investimento e estímulo que recebi. Palavras não expressam o quanto
representam na minha vida.
À minha companheira Maria Fernanda, presente em todas as fases desde
trabalho, inclusive no laboratório. Você transformou esta trajetória mais
suave.
Às minhas irmãs Flávia e Paula, amigas que me apoiam sempre.
À minha avó Toninha, exemplo de determinação e que teve grande
influência na minha educação.
vii
Agradecimentos
viii
Agradecimento especial
Ao Professor Luiz Francisco Poli de Figueiredo, pela sugestão do tema,
orientação inicial e entusiasmo contagiante na realização deste projeto. Será
sempre lembrado como exemplo de Professor e Pesquisador.
ix
À Divisão de Clínica Cirúrgica III do Hospital das Clínicas da Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo pela formação recebida e
oportunidade de pertencer a essa equipe. Sinto-me honrado em fazer parte
deste Serviço, reduto de cirurgiões de grande prestígio.
À Profa.Dra Edna Frasson de Souza Montero, Professora Associada da
FMUSP e orientadora desta tese, por ter adotado este projeto em
andamento. O destino fez com que tivesse a oportunidade de conhecê-la.
Esse convívio foi para mim um privilégio, pois além dos conhecimentos
adquiridos, acredito que ganhei uma amiga.
Ao Prof.Dr. Edivaldo Massazo Utiyama, Diretor do Serviço de Cirurgia
Eletiva da Divisão de Clínica Cirúrgica III da FMUSP, pelos conselhos,
ensinamentos e amizade. Exemplo de cirurgião, comprometido com a
formação de gerações de médicos.
Ao Prof. Dr. Celso de Oliveira Bernini, Diretor do Serviço de Emergência
do Hospital das Clínicas da FMUSP, pela contribuição decisiva na minha
formação como cirurgião e por ser modelo de médico que todos os jovens se
espelham.
x
À Dra. Jacqueline de Fátima Jackysyn, pesquisadora do Laboratório de
Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62) da FMUSP, presença constante, pela
valiosa ajuda na elaboração dos marcadores inflamatórios avaliados neste
trabalho.
À Nathália Cruz de Victo, colega de pós-graduação, pela contribuição na
realização do Western blot e ELISA.
Aos Professores Ruy Jorge Cruz Junior e Eliezer Silva, pelas sugestões
feitas na prova de qualificação desta tese que contribuíram em muito na
finalização deste projeto.
Ao Prof.Dr. Luiz Fernando Ferraz da Silva, docente da Disciplina de
Patologia, pela análise histológica deste estudo.
Aos funcionários do LIM-62 Mario Itinoshi, Marco de Luna, Luci Takasaka,
Ana Maria Heimbecker e Elisabete Minami pela disponibilidade, simpatia e
amizade que ajudaram este projeto se tornar realidade.
À Sra. Junko Takano Osaka, do Laboratório de Pesquisa em Cirurgia
Experimental (LIM-26), pela ajuda fundamental no início deste projeto.
xi
Aos acadêmicos Thiago Camargo Ferreira e Vitor Alves Pessoa da Costa
que acompanharam a execução do trabalho e permanecem na continuidade
do projeto.
À Dra. Marcia Kiyomi Koike, pelo auxílio e conselhos na análise estatística.
Ao Sr. Elias Aparecido Marcelino, técnico do Laboratório de Pesquisa em
Cirurgia Experimental (LIM-26), por me ensinar os cuidados que todo
pesquisador deve ter com os animais.
Aos colegas Alberto Bitran, Sergio Henrique Damous, Renato Silveira
Leal e Abel Hiroshi Murakami, pela amizade, apoio e cobertura no
ambulatório e centro cirúrgico para realização deste trabalho.
Aos Assistentes da Divisão de Clínica Cirúrgica III, da Cirurgia Eletiva e
da Emergência, pela amizade e agradável convívio.
À Sra. Eliane Falconi Monico Gazzetto, secretária da pós graduação do
Programa de Clínica Cirúrgica, zelosa para o cumprimento dos prazos
xii
Sumário
xiii
Sumário
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Abstract
1. Introdução.............................................................................................. 1
2. Objetivos................................................................................................ 10
3. Métodos................................................................................................. 12
3.1. Padronização do modelo experimental........................................... 13
3.2. Amostra .......................................................................................... 14
3.3. Anestesia e preparo dos animais................................................... 14
3.4. Procedimentos operatórios............................................................. 14
3.5. Quantificação do malondialdeído (MDA) no tecido pulmonar e
intestinal.......................................................................................... 21
3.6. Preparo para extração de proteína em tecido pulmonar................. 21
3.7. Quantificação de proteína............................................................... 22
3.8. Dosagens de citocinas.................................................................... 23
3.9. Eletroforese de proteínas e Western blot........................................ 25
3.10 Análise estatística.......................................................................... 26
4. Resultados............................................................................................. 27
4.1. Pressão arterial............................................................................... 28
4.2. MDA no tecido intestinal e pulmonar............................................... 30
4.3. Expressão de citocinas no tecido pulmonar.................................... 33
4.4. Expressão do NF-B no tecido pulmonar....................................... 38
5. Discussão.............................................................................................. 40
6. Conclusão.............................................................................................. 56
7. Anexos................................................................................................... 58
8. Referências............................................................................................ 66
xiv
Lista de Figuras
xv
Lista de Figuras
Figura 1 – Fotografia com exposição do íleo terminal, ceco e do suprimento
vascular........................................................................................................16
Figura 2 – Fotografia mostrando ligadura intestinal e do pedículo
vascular........................................................................................................16
Figura 3 – Fotografia mostrando segmento intestinal isquêmico
.......................................................................................................................19
Figura 4 – Fotografia mostrando distensão intestinal proximal ao segmento
ocluído..........................................................................................................19
Figura 5 – Fotografia com ressecção do segmento intestinal isquêmico
......................................................................................................................20
Figura 6 – Fotografia mostrando anastomose intestinal término-
terminal.........................................................................................................20
Figura 7 – Curva da pressão arterial média durante o protocolo experimental
nos diferentes tempos de avaliação..............................................................29
Figura 8 – Gráfico do tipo Boxplot dos valores do malondialdeído no tecido
intestinal........................................................................................................31
Figura 9 – Gráfico do tipo Boxplot dos valores do malondialdeído no tecido
pulmonar.......................................................................................................32
xvi
Figura 10 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de IL-6 no tecido
pulmonar.......................................................................................................34
Figura 11 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de CINC-1 no tecido
pulmonar.......................................................................................................35
Figura 12 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de IL-1 no tecido
pulmonar........................................................................................................36
Figura 13 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de IL-10 no tecido
pulmonar........................................................................................................37
Figura 14 – Gráfico do tipo Boxplot da expressão de NF-B no tecido
pulmonar .......................................................................................................39
xvii
Lista de Tabelas
xviii
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Valores da mediana da pressão arterial média nos diferentes
tempos de avaliação para os grupos de estudo ...........................................29
Tabela 2 – Valores de malondialdeído no tecido intestinal para os grupos de
estudo............................................................................................................31
Tabela 3 – Valores de malondialdeído no tecido pulmonar para os grupos de
estudo............................................................................................................32
Tabela 4 – Expressão de IL-6 no tecido pulmonar para os grupos de
estudo............................................................................................................34
Tabela 5 – Expressão de CINC-1 no tecido pulmonar para os grupos de
estudo............................................................................................................35
Tabela 6 – Expressão de IL-1 no tecido pulmonar para os grupos de
estudo............................................................................................................36
Tabela 7 – Expressão de IL-10 no tecido pulmonar para os grupos de estudo
.......................................................................................................................37
Tabela 8 – Expressão de NF-B no tecido pulmonar para os grupos de
estudo............................................................................................................39
xix
Resumo
xx
Resumo
Rasslan, R. Efeito da solução salina hipertônica e da pentoxifilina sobre o
estresse oxidativo e a atividade inflamatória na sepse induzida por obstrução
e isquemia intestinal em ratos. [tese] São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo; 2013.
A obstrução intestinal representa uma das afecções abdominais agudas
mais frequentes, com altas taxas de complicações e mortalidade,
principalmente na vigência de sepse decorrente da isquemia intestinal. A
reanimação volêmica precoce na sepse implica em ganho de sobrevida,
entretanto, algumas discussões referentes ao fluido utilizado ou mesmo à
terapêutica associada com drogas persistem atuais. Desta forma, o presente
estudo propõe avaliar os efeitos da solução salina hipertônica e da
pentoxifilina na resposta inflamatória e no estresse oxidativo, em modelo
experimental que se assemelha ao problema clínico. Foram utilizados 36
ratos Wistar machos com peso entre 250 e 300 g. Os animais foram
submetidos à laparotomia exploradora com ligaduras do íleo terminal a 10
cm e 1,5 cm da válvula íleo-cecal, além de oclusão do pedículo vascular
responsável pela irrigação deste segmento intestinal. Após 24 horas, os
animais foram reoperados e distribuídos em grupos (N=6), conforme o
tratamento: sem reanimação volêmica (OI); Ringer lactato - 32 mL/kg (RL);
solução salina hipertônica a 7,5% - 4 mL/kg (SH); pentoxifilina 25 mg/kg
(PTX); Ringer lactato com pentoxifilina (RLPT) e solução salina hipertônica
com pentoxifilina (SHPT). Ao término do tratamento, realizou-se ressecção
do segmento intestinal isquêmico e anastomose para estabelecimento do
trânsito intestinal. Os animais foram observados por duas horas, com
medidas da pressão arterial média (PAM) registradas em 4 momentos. Após
o período de observação, os animais foram submetidos à eutanásia com
coleta do intestino e pulmão para análise. A quantificação do malondialdeído
(MDA), no pulmão e intestino, foi realizada através do TBARS. No tecido
xxi
pulmonar, também foram avaliadas as citocinas inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-
10 e CINC-1) pelo método de ELISA e o fator de transcrição nuclear
fosforilado (NF-) por Western blot. Os níveis da PAM, aos cinco minutos
após o tratamento, ficaram mais elevados nos grupos RL e SH (p<0,05),
com valor maior no SH em relação ao RL (p<0,05); aos 45 minutos, não se
observou diferença nos níveis da PAM. A expressão das citocinas IL-1, IL-6
e CINC-1 foi menor nos grupos SH, PTX e SHPT em relação ao OI e RL
(p<0,05). Os grupos SH, PTX e SHPT apresentaram níveis inferiores de
IL-1 e IL-6 comparadas ao RLPT (p<0,05) e os grupos SHPT e PTX foram
iguais entre si. A expressão de IL-10 foi menor no grupo SHPT quando
comparada ao OI (p<0,05). A expressão do NF-B nos grupos SH, PTX e
SHPT foi menor em relação ao OI (p<0,05), sendo que o SHPT ainda foi
menor que o RL (p<0,05). Referente ao estresse oxidativo, no pulmão houve
menor produção do MDA no grupo SHPT comparado aos demais (p<0,05) e
no intestino, o MDA foi inferior nos grupos SH, PTX, RLPT e SHPT
comparados aos OI e RL (p<0,05). Estes resultados permitem concluir que a
solução salina hipertônica a 7,5% associada ou não à pentoxifilina, e a
pentoxifilina isoladamente, atenuam o estresse oxidativo e inibem a ativação
do NF-B, implicando em menor atividade inflamatória com redução na
produção de citocinas.
Descritores: Solução salina hipertônica; Pentoxifilina; Sepse; Traumatismo
por reperfusão; Obstrução intestinal; Inflamação; Ratos
xxii
Abstract
xxiii
Abstract
Rasslan, R. Effects of hypertonic saline and pentoxifylline on oxidative stress
and inflammatory activity in sepsis-induced by intestinal obstruction and
ischemia in rats. [thesis] São Paulo: School of Medicine, University of São
Paulo; 2013
Intestinal obstruction is one of the most common acute abdominal diseases,
with high rates of complications and mortality, especially in the presence of
sepsis due to intestinal ischemia. The early volume resuscitation in sepsis
involves survival gain, however, some discussions concerning the fluid used
or even combination therapy with drugs persist today. The present study
proposes to assess the effects of hypertonic saline and pentoxifylline on
inflammatory response and oxidative stress in an experimental model
resembling the clinical problem. The study included 36 male Wistar rats
weighting between 250 and 300 g. The animals underwent laparotomy with
ligation of the terminal ileum 10 cm and 1.5 cm from the ileocecal valve and
occlusion of the vascular pedicle responsible for the irrigation of this intestinal
segment. After 24 hours, the animals were reoperated and distributed in
groups (N=6), according to treatment: without volume resuscitation (OI);
Ringer lactate - 32 mL/kg (RL), hypertonic saline 7.5% - 4 mL/kg (HS);
pentoxifylline 25 mg/kg (PTX); Ringer lactate with pentoxifylline (RLPT) and
hypertonic saline with pentoxifylline (SHPT). After the infusion of the drugs,
the ischemic bowel was resected and performed the anastomosis for
establishment of intestinal transit. The animals were observed for two hours,
with measurements of mean arterial pressure (MAP) recorded in 4 times.
After the observation period, the animals were euthanized with bowel and
lung collection for analysis. Inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, IL-10 and
CINC-1) were assessed by ELISA and phosphorylated nuclear transcription
factor (NF-) was determined by Western blot, both measured in lung
tissue. The quantification of the malondialdehyde (MDA) in the lung and
xxiv
intestine was performed using the TBARS assay. Initial levels of MAP were
higher in groups RL and HS than others (p<0.05), but at the end levels were
similar in all groups. The expression of IL-1, IL-6 and CINC-1 was lower in
the SH, PTX and SHPT groups compared to OI and RL (p <0.05). The SH,
SHPT and PTX groups showed lower levels of IL-1 and IL-6 compared to
RLPT (p <0.05) and SHPT and PTX groups were equal. The synthesis of IL-
10 was lower in SHPT compared to OI (p <0.05). The expression of NF-B in
SH, PTX and SHPT groups was lower compared to OI (p <0.05), whereas
the SHPT was still less than the RL (p <0.05). MDA in the lung was lower in
SHPT compared to the other groups (p<0.05) and in the intestine was lower
in SH, PTX, RLPT and SHPT groups compared to OI and RL (p<0.05). The
results indicate that hypertonic saline 7.5% with or without pentoxifylline, and
pentoxifylline alone attenuate oxidative stress and inhibit the activation of
NF-B, resulting in lower inflammatory activity with reduced production of
cytokines.
Keywords: Hypertonic saline; Pentoxifylline; Sepsis; Reperfusion injury;
Intestinal Obstruction; Inflammation; Rats
1
1. Introdução
2
A obstrução intestinal representa uma das afecções abdominais agudas
mais frequentes, com altas taxas de complicações e mortalidade, que atinge
de 20-30% na presença de necrose de alça. Este elevado índice é atribuído
muitas vezes ao diagnóstico tardio e preparo pré-operatório inadequado 1.
No abdome agudo obstrutivo, a distensão intestinal é resultado da
hipersecreção, comprometimento da motilidade do órgão e diminuição da
absorção, além do acúmulo de gás, decorrente da fermentação bacteriana e
da deglutição. A resposta inflamatória apresenta participação importante na
fisiopatologia dessa afecção. Este processo envolve inicialmente aumento
do fluxo sanguíneo intestinal, seguido de maior ativação de neutrófilos e
macrófagos, que desencadeia a liberação de citocinas, espécies reativas de
oxigênio e óxido nítrico 2, 3. Ressaltando a relevância destes mediadores, Lu
e cols. 2, em modelo de obstrução intestinal, observaram que a inibição do
estresse oxidativo promovia diminuição da lesão tecidual e menor acúmulo
de líquido e distensão do intestino.
A atividade inflamatória implica em sequestro de líquidos na parede e luz do
intestino que determina diminuição da volemia, com agravamento da
condição sistêmica. O acúmulo de água e eletrólitos no interior do órgão
ocorre, inicialmente, devido ao comprometimento da absorção e, mais
tardiamente, devido à secreção aumentada, secundária à lesão da mucosa.
O controle da atividade inflamatória proporciona aumento da capacidade
absortiva em modelo de obstrução intestinal 3. Entretanto, deve-se destacar
a participação das toxinas bacterianas, aumentadas na obstrução intestinal,
no comprometimento da absorção de líquidos e eletrólitos. Em animais livres
3
de bactérias submetidos à obstrução intestinal não se constatou alteração na
absorção e secreção de líquidos, reforçando a participação de bactérias
nesse processo 4.
O aumento do conteúdo intraluminal determina distensão da víscera, de tal
forma que compromete a perfusão tecidual, implicando em alteração da
permeabilidade da mucosa intestinal 5, contribuindo para a translocação
bacteriana, considerada fator importante na patogênese da sepse 6. Samel e
cols. 7 documentaram, em modelo de obstrução intestinal em ratos, a
passagem de bactérias marcadas com fluorescentes da luz intestinal para
outros órgãos. Deitch 8, em trabalho clínico, demonstrou a presença de
bactérias nos linfonodos mesentéricos em 59% dos casos de obstrução
intestinal na ausência de necrose. Entretanto, a participação do intestino na
sepse extrapola o conceito da translocação bacteriana, pois envolve a
liberação de fatores inflamatórios que promovem lesões locais e sistêmicas
6, 9. A obstrução intestinal e outras situações como trauma e choque, que
comprometem a irrigação esplâncnica, faz com que ocorra aumento da
população bacteriana, ativação celular e produção de mediadores que
intensificam a resposta inflamatória, podendo culminar na síndrome de
disfunção e insuficiência de múltiplos órgãos 6, 9, responsáveis pela elevada
mortalidade na sepse.
A etiopatogenia e a fisiopatologia da sepse são assuntos complexos e de
grande interesse, pois o seu conhecimento pode implicar no
desenvolvimento de medidas terapêuticas que podem modificar o desfecho
da doença. A sepse resulta de relação complexa do microrganismo com as
4
respostas imune, inflamatória e de coagulação do hospedeiro, de tal forma
que a mesma agressão pode se manifestar de maneira distinta em cada
doente 10.
A resposta do hospedeiro diante da infecção consiste em identificar e
controlar a invasão do patógeno, com a restauração do tecido, e assim ativar
a resposta celular e humoral, estimulando mecanismos inflamatórios e anti-
inflamatórios 11. A sepse pode ser dividida em duas fases: a precoce, que se
caracteriza por liberação de citocinas inflamatórias, e a tardia, com
predomínio das anti-inflamatórias como IL-10 12. O aumento da expressão
de moléculas de adesão no endotélio e nos neutrófilos promove a
transmigração de neutrófilos para o sítio da infecção. O processo de
interação neutrófilo-endotélio se altera na sepse com ativação inadequada
de neutrófilos e liberação de espécies reativas de oxigênio, que exacerba a
resposta inflamatória 13-15.
Os receptores tipo Toll (TLR) ativados interagem com moléculas que
culminam com a fosforilação do fator de transcrição nuclear B (NF-B),
proteína de transcrição nuclear. Esta proteína localiza-se no citoplasma na
forma inativa, devido à presença da proteína I-B (Inibidora de B). Após
estímulo dos TLR, ocorre a degradação do - por meio da kinase I-K. O
NF-B ativado é considerado marcador de mau prognóstico na sepse, pois
quando ativado penetra no núcleo e é capaz de expressar genes de
citocinas inflamatórias, como fator TNF-, IL-1, IL-6 e CINC-1 (cytokine
induced neutrophil chemoattractant), da classe da IL-8, amplificando a
resposta à infecção 16-18.
5
O tratamento da sepse abdominal no abdome agudo obstrutivo exige a
reanimação volêmica, uso precoce de antibióticos, correção de distúrbios
eletrolíticos e metabólicos com remoção imediata do fator obstrutivo 19, 20.
Rivers e cols. 21 demonstraram a importância da reanimação volêmica
agressiva e precoce na sepse, fase em que ainda é possível reverter o
quadro instalado, período denominado de “hora de ouro”. Nesta fase, as
medidas baseiam-se na restauração do estado hemodinâmico com
recuperação do volume intravascular e ajuste da oferta e demanda do
oxigênio 22.
A estabilização do quadro hemodinâmico exige o uso de grande quantidade
de fluidos, porém a administração excessiva de líquido gera extravasamento
para o interstício com repercussões deletérias, destacando-se entre elas o
edema pulmonar. As soluções de cristalóides são as mais utilizadas,
principalmente o Ringer lactato 23, entretanto, o seu uso está associado à
exacerbação da resposta inflamatória em modelo de choque hipovolêmico,
com ativação de neutrófilos, aumento de morte celular por apoptose e
disfunção endotelial 24-27. Mesmo após estabilização da condição
hemodinâmica do doente, constata-se a persistência da disfunção da
microcirculação e suas consequências como isquemia tecidual 28.
Em virtude dos efeitos deletérios do Ringer lactato, principalmente na
ativação da resposta inflamatória, tem sido estimulado o estudo de novas
soluções na reanimação volêmica no choque 22, 23, 29. Velasco e cols. 30 em
1980, foram pioneiros no estudo da solução salina hipertônica a 7,5%
associado com colóide no choque hipovolêmico e observaram que a
6
reanimação com 10% do volume perdido promoveu a restauração dos
parâmetros hemodinâmicos e nenhuma mortalidade no período avaliado. Na
mesma ocasião, este grupo de pesquisadores testou a solução salina
hipertônica em doze doentes com choque, de etiologia distinta, refratário a
volume e droga vasoativa, e constataram reversão instantânea do choque
em onze deles 31. Tais observações desencadearam o interesse pelo tema,
estimulando vários estudos experimentais e clínicos, inicialmente em trauma
e depois em sepse.
As alterações hemodinâmicas observadas com o uso da solução salina
hipertônica são decorrentes da melhora da contratilidade e débito cardíaco,
aumento da pré-carga, diminuição da pós-carga e restauração da
microcirculação 32-35.
A solução salina hipertônica apresenta propriedades de modular a resposta
imune e inflamatória 35. Esta característica é atribuída à inibição da interação
leucócito-endotélio e atenuação da infiltração de neutrófilos nos tecidos, 36-39
além da inibição da fosforilação do NF-B, com produção diminuída de
citocinas 37, 40-44.
Em virtude dos efeitos animadores da solução salina hipertônica no cenário
experimental, Hannemann e cols. 45 estudaram a solução em doentes com
sepse, e obtiveram aumento na oferta de oxigênio e débito cardíaco, porém
as alterações hemodinâmicas tiveram curta duração.
Em 2012, um estudo prospectivo randomizado proposto por van Haren e
cols. 46 analisaram o uso do medicamento em doentes com choque séptico.
7
Os autores constataram melhora dos parâmetros hemodinâmicos
envolvendo contratilidade cardíaca e do tônus vascular, porém sem
alteração da microcirculação.
Tendo em vista a relevância da resposta inflamatória, inclusive com a
abrangência sistêmica de seus efeitos, tem-se desenvolvido pesquisas
associando terapêutica farmacológica às soluções de reanimação.
Dentro deste contexto, a pentoxifilina, derivada da metilxantina, modifica a
conformação das hemácias com melhora do fluxo sanguíneo na
microcirculação e diminui a atividade inflamatória, reduzindo a ativação de
neutrófilos e a produção de TNF- 47. Devido às propriedades da
pentoxifilina, o uso clínico tem sido preconizado na insuficiência arterial
crônica 48, sepse neonatal e hepatite alcoólica 49. A translocação bacteriana
induzida pelo choque hipovolêmico foi reduzida em animais tratados com
este fármaco, conforme relato de Koyluoglu e cols. 50. Em modelo de
obstrução intestinal, com ligadura do íleo distal, o uso da pentoxifilina
diminuiu a translocação bacteriana, apesar de não haver diferença nos
níveis do TNF-.
O emprego da pentoxifilina, em modelos de sepse, demonstrou menor lesão
pulmonar e hepática 52, 53 e diminuição das citocinas pró-inflamatórias 54, 55.
Derre e cols. 56, em estudo com células humanas estimuladas com
lipopolissacáride, evidenciaram menor fosforilação do I-B e atenuação do
NF-B.
8
Alguns estudos clínicos propuseram o uso da pentoxifilina na sepse grave e
choque séptico. Staubach e cols. 57, em estudo duplo cego randomizado,
não constataram diferença de mortalidade no grupo pentoxifilina em relação
ao placebo, porém observaram melhora nos parâmetros cárdio-respiratórios.
Shukla e cols. 58, em doentes com peritonite, demonstraram menor
incidência de infecção da ferida operatória e do tempo de internação
hospitalar nos doentes que receberam pentoxifilina.
Em virtude dos efeitos do uso da solução salina hipertônica e da
pentoxifilina, Coimbra e cols. 59 estudaram a associação destes
medicamentos e constataram diminuição de lesão pulmonar, com menor
infiltração de leucócitos neste tecido e diminuição na produção de TNF- e
IL-1, em modelo de choque hemorrágico. Costantini e cols. 60 analisaram
esta estratégia de tratamento e evidenciaram menor fosforilação do I-B e
ativação do NF-B.
No que se refere à sepse, Coimbra e cols 61 estudaram a associação da
solução salina hipertônica à pentoxifilina em células sanguíneas estimuladas
com toxinas, com inibição da ativação de neutrófilos. Kim e Lee 62
analisaram os efeitos dessa estratégia de tratamento em ratos submetidos à
injeção endotraqueal de lipopolissacáride e demonstraram menor produção
de TNF-eIL-6.
Tendo em vista que a injeção de toxinas na indução de sepse representa um
modelo que se distancia do contexto clínico e o limitado número de estudos
no que se refere à reanimação volêmica do doente com obstrução intestinal
9
complicada, o presente trabalho visa testar a hipótese de que a solução
salina hipertônica a 7,5% associada à pentoxifilina atenuaria a resposta
inflamatória e o estresse oxidativo em modelo experimental de sepse,
determinada por obstrução e isquemia intestinal em ratos.
10
2. Objetivos
11
Avaliar os efeitos da reanimação volêmica com solução salina hipertônica a
7,5% associado à pentoxifilina sobre o estresse oxidativo e atividade
inflamatória em modelo de sepse, induzido por obstrução e isquemia
intestinal em ratos.
12
3. Métodos
13
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo sob número 172/11, em 2011. Todos os animais foram manipulados
segundo os princípios do National Institute of Health (1985) e The American
Physiological Society (1995) para o cuidado, manipulação e utilização de
animais de laboratório. A padronização do modelo experimental foi
desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Cirurgia Experimental (LIM-26).
A coleta de dados foi realizada no Laboratório de Investigação Médica em
Fisiopatologia Cirúrgica (LIM-62) da Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo.
3.1. Padronização do modelo experimental
Para o desenvolvimento e padronização do modelo experimental de
obstrução e isquemia intestinal, foram utilizados 103 ratos. A mortalidade
decorrente do modelo experimental ocorreu em 47 animais (45,6%) nas
primeiras 24 horas após a isquemia e obstrução intestinal, sendo os óbitos
assim distribuídos: 30 (63%) antes, oito (17%) durante e nove (20%) após a
reoperação. A mortalidade relacionada à complicação anestésica ou do
cateterismo cervical ocorreu em oito animais (7,7%). Foi realizado
experimento completo em 48 animais e, em virtude de dificuldades no
processamento do material, restaram 36 amostras para análise.
Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo operador na tentativa
de uniformizar ao máximo as variáveis das diferentes etapas do
procedimento.
14
3.2. Amostra
Foram utilizados 36 ratos Wistar, machos, provenientes do Biotério da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, com peso de 250 a
300 g. Os animais foram mantidos, nas fases pré e pós-experimental, em
ambiente controlado para temperatura (230C), umidade e exposição à luz
artificial, com ciclo claro-escuro de doze horas com livre acesso a ração e
água.
3.3. Anestesia e Preparo dos Animais
Os animais foram submetidos à anestesia geral com injeção intraperitoneal
de cetamina (50 mg/kg) associada à xilazina (10 mg/kg) na mesma seringa
e, imediatamente após efeito do anestésico, foi realizada tricotomia cervical
e abdominal com antissepsia local. Doses complementares de anestésico
foram administradas pela mesma via para manutenção do plano anestésico.
3.4. Procedimentos Operatórios
Os animais, após a realização da anestesia, foram submetidos à laparotomia
exploradora mediana com exposição do ceco e identificação da válvula íleo–
cecal. Realizada ligadura do íleo terminal, com fio de algodão 4-0,
15
aproximadamente a 10 cm da válvula íleo-cecal, ocasionando obstrução
intestinal e outra ligadura a 1,5 cm da válvula com intuito de impedir refluxo
de sangue colateral para o intestino delgado (Figuras 1 e 2). Em seguida, foi
identificado o pedículo vascular responsável pela irrigação do segmento
intestinal ocluído e feita a ligadura dos ramos terminais dos vasos
mesentéricos com fio de algodão 4–0, gerando isquemia do mesmo
segmento (Figura 2).
16
Figura 1 Fotografia com exposição do íleo terminal, ceco e do suprimento
vascular
Figura 2 Fotografia mostrando as ligaduras do segmento intestinal e do
pedículo vascular
17
Ao término do procedimento, foi injetado 0,5 mL de solução de Ringer lactato
na cavidade abdominal para reposição de líquido perdido para o meio
externo em decorrência da laparotomia exploradora, seguido do fechamento
da parede abdominal com sutura contínua do plano peritônio-aponeurótico e
da pele com sutura interrompida com pontos simples, utilizando fio de Nylon
4-0. Os animais foram mantidos em ambiente controlado para temperatura e
umidade com livre acesso a água e jejum para sólidos.
Após 24 horas de obstrução e isquemia intestinal segmentar, os animais
foram anestesiados, conforme protocolo descrito, e submetidos a novo
procedimento operatório. Realizado acesso cervical, com exposição e
canulação da veia jugular e artéria carótida direita com Intracath 22G
(Bencton–Dickson, EUA), para infusão de volume e medida da pressão
arterial média. A medida hemodinâmica foi obtida por meio da conexão do
cateter ao monitor Dixtal DX2020 (Dixtal Biomédica, Brasil), e registrada nos
seguintes momentos: após cateterização, para obtenção da medida inicial, e
aos cinco, 30 e 45 minutos após a reanimação volêmica.
Os 36 animais foram sorteados para distribuição nos grupos, ficando cada
um dos seis grupos com seis animais:
- Sem Reanimação Volêmica – OI;
- Ringer Lactato (32 mL/kg) – RL;
- Solução Salina Hipertônica 7,5% (4 mL/kg) – SH;
- Pentoxifilina (25 mg/kg) – PTX;
- Ringer Lactato (32 mL/kg) associado com Pentoxifilina (25 mg/kg) – RLPT;
18
- Solução Salina Hipertônica (4 mL/kg) associado com Pentoxifilina
(25mg/kg)– SHPT
A infusão de volume ocorreu manualmente no período de cinco minutos
após a canulação dos vasos cervicais. Em seguida, procedeu–se à
laparotomia exploradora com constatação de distensão de intestino delgado
e isquemia do segmento terminal do íleo (Figuras 3 e 4). Realizado
ressecção do intestino isquêmico com anastomose término–terminal em
plano único total e pontos separados com fio de Polipropileno 6-0, com
posterior fechamento da cavidade abdominal em dois planos com sutura
contínua de fio Nylon 4–0 (Figuras 5 e 6).
A eutanásia dos animais, por exsanguinação sob anestesia, ocorreu duas
horas após o término da ressecção e da anastomose intestinal. Em seguida,
foi feita a remoção cirúrgica dos pulmões e do segmento ileal, cinco
centímetros acima da anastomose.
19
Figura 3 Fotografia mostrando segmento intestinal isquêmico
Figura 4 Fotografia mostrando distensão intestinal proximal ao segmento
ocluído
20
Figura 5 Fotografia com ressecção do segmento intestinal isquêmico
Figura 6 Fotografia mostrando anastomose intestinal término-terminal (seta)
21
3.5. Quantificação do malondialdeído (MDA) no tecido pulmonar e
intestinal
Os tecidos foram homogeneizados em um mL de KCl 1,15% com sonicador
(Polytron PT3100) e utilizado para dosagem do MDA. Determinou-se a
lipoperoxidação das membranas celulares causada pela formação de
radicais livres através do método de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS), o qual mede a quantidade de TBARS derivado da
lipoperoxidação, sendo seu valor expresso em nanomoles por miligrama de
proteína (nmol/mg de proteína). Após a homogeneização, as alíquotas foram
centrifugadas a 10.000 giros por minuto durante 20 minutos a 4°C
(Centrifugue 5804® Eppendorf, Hamburg, Germany). Para reação,
adicionou-se a 100 µL do sobrenadante 100 µL de duodecil sulfato de sódio
(SDS) a 8,1%, 750 µL de ácido acético a 20% e 750 µL de ácido
tiobarbitúrico (TBA) a 0,8%. A mistura foi aquecida por 50 minutos à
temperatura de 95°C. Após o período estabelecido, amostras de 200 µL
foram analisadas no espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados foram
expressos em µg/mg de proteína (Bradford, 1976). Todas as análises foram
feitas em duplicata.
22
3.6. Preparo para extração de proteína em tecido pulmonar
Para extração de proteínas utilizou-se amostras do tecido pulmonar em um
mL de tampão RIPA (50 mM Tris HCl pH8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5%
Sodium Deoxycholate e 1% SDS), suplementado com inibidor de proteína
(para cada 10 mL de tampão foi adicionado um comprimido de inibidor de
proteína, Complete mini EDTA-free - Roche).
Em um tubo de dois mL foi acrescentado um mL de tampão RIPA às
amostras. Estas foram homogeneizadas com sonicador (marca Politron) e
em seguida, o material transferido para outro tubo de dois mL. No intervalo
de cada amostra, o sonicador foi lavado em três tubos de 50 mL com água
Milli-Q e por último em álcool 70%, e posteriormente secado delicadamente
com papel.
Após processamento de todas as amostras, os tubos foram centrifugados
por 10 minutos a 2.000 rotações por minuto em uma temperatura de 4ºC.
Após a centrifugação o sobrenadante foi transferido para outro tubo de dois
mL e as amostras foram conservadas em gelo seco.
3.7. Quantificação de proteína
Para a quantificação de proteína das amostras utilizou-se como padrão uma
solução de BSA 2 mg/mL (8 L de BSA 10 mg/mL em 32 L de tampão
23
RIPA). Para fazer a curva padrão foi pipetado 20 L de tampão RIPA em
quatro tubos de um ml e acrescentado 20 l da solução de BSA dois mg/mL
no primeiro tubo e feita uma diluição seriada nos demais tubos. As amostras
foram diluídas 20 vezes (um L da amostra em 19 L de água Milli-Q).
Para as dosagens de proteínas utilizamos o kit BSA Protein Assay (Pierce
Protein Biology Products – Thermo Scientific). Em uma placa de 96 poços
foram pipetados 25 L/poço do reagente A’ (20 l do reagente S com um mL
do reagente A, preparado conforme instruções do fabricante e
homogeneizado), onde foram aplicadas as amostras e a curva padrão. Em
seguida, cinco L/poço das amostras diluídas e da curva padrão também
foram adicionados a 200 L/poço do reagente B. Incubou-se a placa em
temperatura ambiente por 15 minutos e a mesma foi lida em
espectrofotômetro a 690 nm. Cada amostra foi dosada em triplicata.
3.8. Dosagens de citocinas: IL-1IL-6, IL-10 e CINC-1
A dosagem das citocinas no tecido pulmonar previamente congelado em
nitrogênio líquido foi realizada utilizando-se o método de ELISA por Duo-set
(R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA).
Inicialmente, as amostras de tecido foram maceradas e homogeneizadas em
PBS na concentração de um mg/mL. Após este procedimento, as amostras
foram centrifugadas a 2600 rotações por minuto na centrífuga (Eppendorf
5804R Hamburg, Germany) por 15 minutos a 6°C. O sobrenadante colhido
foi utilizado nas dosagens.
24
Na placa com 96 poços foram adicionados 100 µL/poço de anticorpo de
captura anti- citocinas daquelas do presente estudo. Após incubação durante
a noite, a 4°C, o sobrenadante foi desprezado e a placa lavada três vezes
com o tampão de lavagem. Em seguida, foi realizada a reação de bloqueio
adicionando-se 200 µL/poço de albumina sérica bovina a 2% em PBS e
incubação por uma hora à temperatura ambiente (20 a 26°C). A placa foi
novamente lavada por três vezes com tampão de lavagem. Adicionou-se em
duplicata 100 µL/poço do padrão e das amostras, procedendo-se à
incubação da placa por duas horas à temperatura ambiente. Para curvas
padrão, utilizou-se citocinas recombinantes nas concentrações de 62,50;
125; 250; 500; 1000; 2000; 4000 e 8000 pg/mL. Após repetir o procedimento
de lavagem da placa, foram adicionados 100 µL/poço do anticorpo de
detecção biotinilado para cada citocina e a placa incubada por duas horas à
temperatura ambiente. Ao término da incubação, o processo de lavagem da
placa foi repetido e em seguida adicionou-se 100 µL/poço da enzima
estreptoavidina peroxidase na proporção 1:200 de enzima: PBS com 0,05%
de tween-20 e incubação por uma hora à temperatura ambiente e protegida
da luz. Em seguida, o ciclo de lavagem da placa foi repetido e a reaç o
re elada pela adiç o de 00 /poço de , , , tetramethylbenzidina (TMB)
e incubação de 30 minutos a uma hora na temperatura ambiente e protegida
da luz. A reação foi bloqueada adicionando-se 50 µL/poço de H2SO4 (1N),
avaliando-se a densidade óptica das amostras a 450 nm, imediatamente
após o bloqueio da reação. Todas as análises foram feitas em duplicata.
25
3.9. Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e Western-blot
Este método foi utilizado para verificar a expressão da proteína NF-B,
utilizando como controle a actina.
A análise das proteínas presentes nos extratos de tecido pulmonar foi
realizada por meio da eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
(SDS-PAGE - “Sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis“), seguida de
Western-blot. Como resultado da presença de um detergente neutralizante,
no caso o SDS, as proteínas das amostras foram desnaturadas e suas
cargas neutralizadas, fazendo com que elas migrassem no gel de acordo
com a massa molecular.
Após o preparo do gel de corrida [mix de acrilamida 30% (1% bisacrilamida:
29% acrilamida); Tris-Cl 1,5 M (pH 8,8); SDS 10%; água miliQ; persulfato de
amônio 10% e TEMED], esse foi acoplado a um sistema vertical (Mini
Protean II, Bio Rad) o qual permanecia em contato com o tampão de
eletroforese (25 mM Tris; 250 mM glicina; 0.1% SDS; pH 8,3). Nessa fase,
foram aplicadas nas cavidades 20 µg de proteína dos extratos de tecido
(para aplicar as amostras foi adicionado azul de bromofenol). Seguiu-se com
a eletroforese a 80-100 V, voltagem constante por cerca de duas horas.
Como as proteínas de interesse possuem semelhantes pesos moleculares, a
porcentagem de poliacrilamida destes géis foi de 12%.
Após a eletroforese, as proteínas dos géis foram transferidas para
membranas de PVDF 0,45 µm (Pierce) utilizando o equipamento semi-dry da
Bio-rad por 50 minutos a 15 V (Tampão de transferência - 39 mM glicina; 48
26
mM Tris base; 37% SDS e 20% metanol, pH 8,3). Após a transferência, as
membranas foram colocadas por duas horas na solução de bloqueio
adequada. Nesse sentido, para a marcação com o anticorpo aqui descrito,
utilizou-se para o bloqueio uma solução 5% BSA em TBS-Tween (150 mM
NaCl; 50 mM Tris-Cl; 0,05% Tween 20, pH 7,5); 0,1% Azida. A seguir, as
membranas foram incubadas com os anticorpos primários overnight a 4°C,
lavadas em TBS-Tween e marcadas por uma hora à temperatura ambiente
com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase alcalina apropriado. As
membranas foram novamente submetidas à lavagem por 3-4 vezes
consecutivas em TBS-Tween. A detecção dos imunocomplexos ocorreu pelo
método de quimioluminescência e seguida da exposição das membranas a
filmes de auto-radiografia. O anticorpo primário utilizado foi o NF-B (Santa
Cruz Biotechnology, Inc). Os anticorpos secundários espécie-específico anti-
coelho estavam conjugados à peroxidase alcalina.
3.10. Análise estatística
Os dados foram avaliados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis,
sendo a análise posterior (post hoc), dois a dois, com os testes sugeridos
pelo programa Sigma-Stat versão 3.1 (Systat Software, San Diego, CA), a
saber: Teste de Dunn para IL-10 e NF-B; e Teste de Student Newman
Keuls para as demais análises.
Adotou-se o nível de significância de 0,05 para rejeição da hipótese de
nulidade, e níveis descritivos (p) iguais ou inferiores a esse valor foram
considerados significantes.
27
4. Resultados
28
4.1 Pressão arterial
No momento inicial da cateterização cervical a pressão arterial média
apresentava níveis inferiores a 90 mmHg em todos os grupos. A reanimação
volêmica com solução salina hipertônica e Ringer lactato determinou
aumento dos níveis da pressão arterial média, após cinco minutos do
tratamento (T2), ao comparar com os demais grupos. O uso da solução
hipertônica determinou aumento em relação ao grupo RL. O uso da
pentoxifilina cursou com diminuição do valor da pressão arterial em T2,
porém sem diferença estatística em relação aos grupos RLPT e SHPT.
No terceiro momento da medida da pressão arterial (T3), aos 30 minutos do
tratamento, os animais que receberam pentoxifilina, isoladamente ou com
hipertônica, evoluíram com aumento da pressão arterial média em relação
aos demais grupos. Os níveis pressóricos do grupo SHPT, neste período,
foram maiores comparados aos demais, com exceção do grupo PTX. Os
grupos tratados com hipertônica e pentoxifilina isoladamente apresentaram
níveis da pressão arterial maiores que os animais reanimados com Ringer
lactato. Ao término do procedimento, após 45 minutos do tratamento (T4),
todos os grupos apresentaram os mesmos valores de pressão arterial
média, conforme se observa na Tabela 1 e Figura 7.
29
Tabela 1 – Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg -
mediana) nos diferentes tempos de avaliação: imediatamente após a
cateterização (T1) e após reanimação volêmica com 5 (T2), 30 (T3) e 45
minutos (T4), respectivamente.
Pressão Arterial Média Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT
T1 77 78 88 81 74 82 T2 82 97 132 74 80 85 T3 73 68 82 87 70 92 T4 80 75 80 74 73 85
Figura 7 – Curva da pressão arterial média durante o protocolo experimental
nos diferentes tempos de avaliação: imediatamente após a cateterização
(T1) e após reanimação volêmica: 5 minutos (T2), 30 minutos (T3) e 45
minutos (T4), respectivamente. (**; p<0,05 em RL comparado a OI, PTX,
RLPT e SHPT; π; p<0,05 em SH comparado a OI, RL, PTX, RLPT e SHPT;
&; em SHPT comparado a OI, RL, SH e RLPT).
PA
M (
mm
Hg)
π
**
&
30
4.2 MDA no tecido intestinal e pulmonar
A quantificação do MDA intestinal apresentou redução dos valores nos
grupos SH, PTX, RLPT e SHPT em comparação aos animais sem
reanimação volêmica (grupo OI) e aos tratados com Ringer lactato (grupo
RL), como se observa na Tabela 2 e Figura 8.
Na avaliação do tecido pulmonar, o grupo SHPT apresentou níveis inferiores
em relação aos demais grupos. Os animais pertencentes aos outros grupos
de tratamento não apresentaram diferença quando comparados ao OI
(Tabela 3 e Figura 9).
31
Tabela 2 - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)
no tecido intestinal para os grupos de estudo, analisado por TBARS
Intestino Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 0,42 0,52 0,30 0,30 0,29 0,27 Média 0,40 0,65 0,30 0,28 0,31 0,26 Desvio-padrão 0,05 0,45 0,04 0,06 0,11 0,03
Figura 8 – Expressão do malondialdeído no tecido intestinal (*;p <0,05 em
OI comparado a SH, PTX, RLPT e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a
SH, PTX, RLPT e SHPT).
**
*
32
Tabela 3 – Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)
no tecido pulmonar para os grupos de estudo, analisado por TBARS
Pulmão
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 047 0,41 0,42 0,44 0,43 0,30 Média 0,49 0,50 0,51 0,44 0,49 0,30 Desvio-padrão 0,16 0,24 0,18 0,09 0,12 0,03
Figura 9 – Expressão do malondialdeído no tecido pulmonar (&;p <0,05 em
SHPT comparado a OI, RL, SH, PTX e RLPT).
&
33
4.3 Expressão de citocinas no tecido pulmonar
Na análise da IL-6, os grupos SH, PTX e SHPT apresentaram valores
menores em relação aos animais sem reanimação e aos tratados com
Ringer lactato, inclusive quando se acrescentou a pentoxifilina ao Ringer. O
esquema de tratamento com pentoxifilina isoladamente ou em associação à
solução hipertônica promoveu diminuição de IL-6 em relação aos grupos SH
(Tabela 4 e Figura 10).
A expressão de CINC-1 diminuiu em todos os grupos tratados comparados
ao OI. Os animais que receberam Ringer lactato apresentaram níveis
elevados desta citocina em relação aos demais grupos submetidos à
reanimação volêmica. Apesar do valor menor da CINC-1 quando utilizada a
solução salina hipertônica com pentoxifilina comparado aos grupos SH, PTX
e RLPT, não se evidenciou diferença estatística (Tabela 5 e Figura 11).
Os valores de IL-1 são menores nos grupos SH, PTX e SHPT comparados
aos animais sem reanimação volêmica e aos que receberam Ringer lactato,
mesmo associado à pentoxifilina (Tabela 6 e Figura 12).
A produção de IL-10 foi menor nos grupos SHPT em relação aos animais do
grupo OI. Os valores são menores nos grupos: SHPT comparado ao RL e
PTX comparado ao OI, com tendência à significância (Tabela 7 e Figura 13).
34
Tabela 4 - Expressão de IL-6 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos
de estudo, analisado por ELISA
IL-6
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 1,84 2,16 0,95 0,53 1,57 0,62 Média 2,04 2,08 1,05 0,59 1,50 0,61 Desvio-padrão 0,63 0,44 0,41 0,22 0,40 0,08
Figura 10 – Expressão de IL-6 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI
comparado a SH, PTX e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a SH, PTX e
SHPT, π;p <0,0 em SH comparado a PTX e SHPT, ¥;p <0,05 em RLPT
comparado a SH, PTX e SHPT).
** *
¥
π
35
Tabela 5 - Expressão de CINC-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os
grupos de estudo, analisado por ELISA
CINC-1
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 0,73 0,66 0,52 0,50 0,53 0,41 Média 0,76 0,64 0,51 0,49 0,54 0,42 Desvio-padrão 0,14 0,06 0,11 0,08 0,06 0,04
Figura 11 – Expressão de CINC-1 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI
comparado RL, SH, PTX, RLPT e SHPT, **;p <0,05 em RL comparado a SH,
PTX, RLPT e SHPT).
*
**
36
Tabela 6 - Expressão de IL-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos
de estudo, analisado por ELISA
IL-1
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 2,54 1,98 1,36 1,50 2,25 1,71 Média 2,40 2,06 1,40 1,58 2,42 1,66 Desvio-padrão 0,44 0,52 0,26 0,33 0,55 0,13
Figura 12 – Expressão de IL-1 no tecido pulmonar (*;p <0,05 em OI
comparado a SH, PTX e SHPT, **; p <0,05 em RL comparado a SH, PTX e
SHPT, ¥; p <0,05 em RLPT comparado a SH, PTX e SHPT).
*
**
¥
37
Tabela 7 - Expressão de IL-10 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os
grupos de estudo, analisado por ELISA
IL-10
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 0,37 0,29 0,21 0,08 0,19 0,08 Média 0,47 0,36 0,19 0,12 0,20 0,078 Desvio-padrão 0,38 0,92 0,10 0,11 0,10 0,04
Figura 13 – Expressão de IL-10 no tecido pulmonar (*;p <0,05, em OI
comparado a SHPT).
*
*
38
4.4 Expressão do fator de transcrição nuclear B ativado (NF-B) no
tecido pulmonar
Os grupos SH, PTX e SHPT demonstraram menor expressão do NF-B em
relação aos animais sem reanimação volêmica (OI). O tratamento com
Ringer lactato isoladamente ou em associação com pentoxifina apresentou
valores menores de NF-B, porém sem significância estatística em relação
ao OI. O único tratamento que resultou em diminuição dos níveis de NF-B
na compararação com Ringer lactato (p<0,05) foi o esquema de solução
salina hipertônica associada à pentoxifilina – grupo SHPT. (Tabela 8 e
Figura 14)
%
39
Tabela 8 - Expressão do NF-B no tecido pulmonar para os grupos de
estudo, analisado por Western-blot
NF-B
Grupos OI RL SH PTX RLPT SHPT Mediana 266493 113220 57981 76217 96425 51114 Média 286301 121379 64337 79111 93435 47347 Desvio-padrão 81767 39290 25061 18467 17145 16597
Figura 14 – A. Western blot do NF-B. A imagem representa três animais
para cada grupo de tratamento. B. Representação gráfica da expressão da
atividade do NF-B no tecido pulmonar (*; p<0,05 em OI comparado a SH,
PTX e SHPT, **; p<0,05 em RL comparado a SHPT).
40
5. Discussão
41
Os modelos de sepse mais utilizados em animais consistem em infusão de
bactérias e toxinas na corrente sanguínea ou na via aérea, que levam à
deterioração rápida do animal e óbito precoce em seis a doze horas,
diferente do que se observa nos doentes em que a instalação da disfunção
de múltiplos órgãos ocorre dias após o início da infecção 63, 64.
As citocinas pró-inflamatórias, nesta situação, cursam com aumento muito
rápido e importante, contrastando com o que ocorre no doente séptico que
apresenta aumentos menos evidentes destes valores, num intervalo de
tempo mais prolongado. Em virtude da piora rápida observada nos animais
nesse modelo, a intervenção terapêutica deve ser precoce, ou antes mesmo
da agressão, fato que se distancia do contexto clínico 65.
A falta de similaridade entre o modelo experimental e a prática médica
poderia justificar os diferentes resultados entre os trabalhos realizados no
laboratório e os ensaios clínicos 63, 64, 66. Outro aspecto de contraste refere-
se ao agente patogênico, infusão de apenas um tipo específico de bactéria,
geralmente germes gram-negativos, e ausência de um foco infeccioso.
Desta forma, foram desenvolvidos modelos de peritonite que consistem em
perfuração intestinal, inoculação de fezes na cavidade abdominal e ligadura
do ceco com perfuração, compatíveis com quadros abdominais da clínica
diária. Esta última situação envolve dois tipos de agressão: necrose do ceco
em decorrência da ligadura e peritonite em virtude do extravasamento de
conteúdo intraluminal. O choque se instala de forma rápida se não instituído
algum tipo de intervenção 63, 65-68, embora a elevação das citocinas seja
42
gradual. Este modelo tem sido muito utilizado nos últimos 30 anos para
avaliar a fisiopatologia da sepse 66. Quando se discute a ligadura e punção
do ceco, este tipo de agressão difere no número de punções e na extensão
da ligadura, com índice de mortalidade variável entre os autores 69.
No presente trabalho, na tentativa de se encontrar modelo de sepse com
quadro evolutivo mais próximo ao que ocorre na clínica, optou-se pelo
modelo com obstrução e isquemia intestinal em ratos, com ligadura
segmentar do íleo distal e do respectivo suprimento vascular, adaptado de
outros modelos 7, 43, 51, 70.
Samel e cols (6) utilizaram modelo de obstrução e isquemia de um segmento
intestinal fechado, porém com extensão muito curta, para avaliar
translocação bacteriana. No presente modelo, aumentou-se o tamanho do
segmento intestinal obstruído. Zanoni e cols. 43, trabalhando com modelo de
obstrução e isquemia intestinal, observaram culturas positivas em 86% de
linfonodos do mesentério e em 57% das culturas do sangue. Kocdor e cols.
51 observaram translocação bacteriana em 100% dos linfonodos do
mesentério em modelo de oclusão simples do íleo terminal sem oclusão
vascular. Entretanto, Akcay e cols. 70 estudaram a translocação bacteriana
na obstrução intestinal em ratos e constataram que os animais submetidos à
obstrução em alça fechada apresentaram maior crescimento bacteriano nos
tecidos analisados, quando comparados com obstrução intestinal simples.
Esses dados referentes à translocação bacteriana em modelos de obstrução
e isquemia intestinal permitem inferir que o modelo adotado neste trabalho
induz quadro de sepse de instalação insidiosa.
43
No presente estudo, a causa da sepse induzida por isquemia e obstrução
intestinal, culminando com a translocação bacteriana, é removida no
momento da reanimação volêmica, de tal forma que o sítio da infecção é
controlado, simulando o que ocorre na clínica. No entanto, os principais
estudos testaram diferentes terapêuticas em condições nas quais o
tratamento primário da sepse não foi praticado 53, 54, 62, 71, 72. Há que se
destacar, ainda, que a reanimação volêmica e ressecção intestinal foram
realizadas 24 horas após a indução da isquemia e obstrução intestinal.
Desta forma, optou-se por um modelo que envolve a isquemia e a obstrução
intestinal segmentar, associando algumas características dos modelos já
referidos.
As limitações deste estudo decorrem dos diferentes momentos de início da
infecção, com avaliação em momento único, sem estabelecer a dinâmica da
resposta inflamatória – desde a translocação bacteriana até a instalação da
sepse. Acrescente-se a dificuldade inerente aos aspectos técnicos do
modelo, que implica numa reoperação após o trauma inicial no animal com
sepse, além da dificuldade técnica, pela anastomose intestinal e tempo para
realização do procedimento. A análise da sobrevida deve ser criteriosa, pois
a mortalidade precoce após a ressecção do segmento intestinal isquêmico
pode ser decorrente da manipulação operatória e suas complicações.
Parker e Watkins 68 consideram que um modelo de sepse deve apresentar
as seguintes características: infecção localizada com evolução para sepse e,
por fim, a instalação da disfunção de múltiplos órgãos de forma gradual em
animais sem anestesia. Baseado nestas informações, a proposta foi estudar
44
sepse utilizando o modelo de obstrução e isquemia intestinal por conferir
estas propriedades.
Este modelo se caracteriza pela sepse em decorrência da translocação
bacteriana e isquemia intestinal, além da hipovolemia secundária à
distensão intestinal com edema e sequestro de líquido intraluminal. O
contexto clínico representado por este modelo pode ser demonstrado em
doentes com abdome agudo obstrutivo e necrose intestinal e o tratamento
exige reanimação hidro-eletrolítica, administração de antibióticos e o
tratamento operatório 73.
Com relação aos níveis da pressão arterial média, os grupos Ringer lactato e
solução salina hipertônica apresentaram aumento cinco minutos após a
infusão da solução, mais acentuado no segundo grupo. Em virtude das
propriedades de vasodilatação da pentoxifilina, a associação desta com a
solução salina hipertônica resultou em discreto aumento cinco minutos após
a reanimação, porém manteve esta tendência até 30 minutos de
procedimento, sendo que nesse momento o nível da pressão arterial média
foi superior aos demais grupos, exceto nos animais tratados com
pentoxifilina. Cruz e cols. 74 não evidenciaram diferença na pressão arterial
média, em modelo de choque hipovolêmico, nos animais tratados com
solução salina hipertônica e pentoxifilina em relação à hipertônica isolada.
Ao final do procedimento, os valores pressóricos se igualaram, confirmando
que os efeitos físicos da solução hipertônica tem curta duração, de acordo
com trabalho clínico de Hannemann 45.Tal fenômeno se deve às
45
propriedades físicas da solução salina hipertônica pelo gradiente de pressão
osmótica com mobilização do líquido do intracelular para o extracelular 34.
Velasco e cols. 30 em modelo de choque hipovolêmico constataram aumento
no volume plasmático de 11 mL/kg após infusão da solução salina
hipertônica, representando um acréscimo de 2,75 mL do volume plasmático
a cada um mL da solução. Por outro lado, a solução salina padrão induziu
uma expansão de 0,33 mL a cada um mL infundido. Esta característica da
solução hipertônica de estabelecer os parâmetros hemodinâmicos com
menor volume de líquido infundido foi demonstrada por Horton e Walker 75
em cães submetidos à injeção de endotoxina. Os animais reanimados com
solução hipertônica tiveram um balanço hídrico cinco vezes menor
comparado ao do grupo Ringer lactato.
A utilização do Ringer lactato teve início na década de sessenta durante a
guerra do Vietnã, após observação da utilização de plasma fresco no choque
hipovolêmico na segunda guerra mundial estar associada com lesão renal.
Na vigência de choque, o líquido presente no interstício é redistribuído para
o espaço intravascular e intracelular, de tal forma que o volume do
cristalóide deve ser acentuado no sentido de repor o interstício e
intravascular. Com a utilização do Ringer lactato se observou uma nova
entidade denominada de “pulm o de choque”, responsá el pela mortalidade
tardia. Posteriormente, tal fenômeno foi constatado nas unidades de terapia
intensiva e recebeu a denominação de Síndrome da Angústia Respiratória
do Adulto 23.
46
A reanimação volêmica com grande volume implica em edema da parede
intestinal que está associado com íleo adinâmico no pós-operatório e maior
período de jejum, além do aumento da permeabilidade do órgão 76. O
aumento da pressão intra-abdominal e as implicações decorrentes da
síndrome compartimental também são reflexos do uso excessivo de líquido
no manejo destes doentes. Radhakrishnan e cols. 77 demonstraram, em
modelo animal de hipertensão abdominal, menor edema e recuperação mais
rápida do trânsito intestinal quando administrada solução salina hipertônica.
Mazzoni e cols. 78 demonstraram que a expansão plasmática ocorre pela
transferência de líquido das células vermelhas e do endotélio, edemaciados
na presença do choque, com perda de 8% do volume para o intravascular .
O edema celular compromete o fluxo capilar e da microcirculação devido ao
edema do endotélio e das hemácias. Portanto, as características físicas da
solução salina hipertônica promovem a restauração do fluxo da
microcirculação.
Desta forma, tendo em vista que o volume infundido de solução salina
hipertônica foi oito vezes menor ao do Ringer lactato, e mesmo assim
determinou aumento dos níveis da pressão arterial média no momento inicial
da avaliação, o emprego da solução hipertônica poderia prevenir os efeitos
deletérios do uso excessivo de fluidos na reanimação volêmica.
A peroxidação lipídica é a reação de radicais livres com lípides insaturados
da membrana celular com destruição da sua estrutura e comprometimento
dos mecanismos de troca iônica, acarretando em condições extremas e
47
morte celular. A perda da integridade da mucosa intestinal se relaciona aos
danos causados pelos radicais livres de oxigênio 15.
Shih e cols. 37, em modelo de punção e ligadura cecal, estudaram o efeito da
solução hipertônica e constataram que a produção de radicais livres de
oxigênio nos diferentes tecidos é menor no grupo tratado com hipertônica.
Theobaldo e cols 44, em estudo recente, após injeção intraperitoneal de
endotoxinas, demonstraram redução da peroxidação lipídica no intestino 24
horas após o tratamento com solução salina hipertônica, sendo que não
havia diferença na análise precoce destes marcadores. A utilização da
pentoxifilina em modelo de isquemia e reperfusão evidenciou diminuição de
malondialdeído, produto final da peroxidação lipídica 14.
No presente trabalho, na análise do malondialdeído pulmonar, a associação
terapêutica pentoxifilina e solução salina hipertônica promoveu redução do
estresse oxidativo, mostrando um efeito na sepse similar ao observado em
modelo de trauma 79. Entretanto, os grupos salina hipertônica e pentoxifilina
associada ou não ao Ringer lactato, quando comparados com os grupos
Ringer lactato e sem tratamento, apresentaram valores menores deste
marcador bioquímico, porém sem significância estatística. Alguns autores
mostraram que ambas, solução salina hipertônica e a pentoxifilina
isoladamente, diminuem o estresse oxidativo em modelo de sepse 14, 37,
entretanto, a diferença entre os resultados pode ser justificada pelos tipos
distintos de modelo de sepse, e também ao curto espaço de tempo entre o
tratamento e análise do tecido. Em relação ao malondialdeído no intestino, a
solução salina hipertônica e a pentoxifilina, isoladas ou associadas entre si,
48
promoveram a redução da peroxidação lipídica. Além disso, a pentoxifilina
atenuou o estresse oxidativo promovido pelo Ringer lactato.
A sepse na fase inicial se caracteriza por intensa atividade inflamatória e
esse momento é responsável pela morbidade e mortalidade precoce. Após
esse período, o sistema imune diminui a produção de citocinas pró-
inflamatórias e se observa aumento na expressão de proteínas anti-
inflamatórias, ocasionando um estado de imunossupressão na sepse 12.
Esta mudança no comportamento da resposta inflamatória justifica os
desfechos desfavoráveis dos trabalhos clínicos com a utilização de
medicamentos inibidores da inflamação 80.
O TNF- IL-1 e IL-6 são as principais citocinas pró-inflamatórias, sendo a
IL-10 de atividade anti-inflamatória. O nível sérico das citocinas é variável e
distinto na sepse 12. O conceito inicial era de que os doentes apresentavam
níveis muito elevados das citocinas, como se observou nos experimentos
animais com injeção de toxinas, sendo que a mortalidade se atribuía à
ativação exacerbada do sistema imune. Esse pensamento sofreu
questionamentos após os resultados desanimadores com terapia para
bloquear a via da inflamação, apesar deste tipo de tratamento diminuir a
mortalidade em alguns estudos de laboratório 80.
O uso de medicamentos que bloqueiam o TNF- em ratos com peritonite
cursou com piora da sobrevida 81, 82. No contexto clínico, a terapia com a
inibição do receptor do TNF- implicou em mortalidade de 53%, contra 30%
no grupo placebo 83.
49
Como a patogênese da sepse é um processo dinâmico e complexo, devido à
transição da fase de inflamação para imunossupressão em tempos
diferentes em cada doente, a modulação do sistema imune talvez deva ser
proposta terapêutica melhor do que o bloqueio completo dos mediadores 12.
No último ano, três trabalhos multicêntricos randomizados avaliando
medicamentos com efeitos antagonistas aos biomarcadores da sepse foram
concluídos e não demonstraram benefício em relação ao tratamento com
placebo. A proteína C recombinante, o antagonista de receptor do tipo Toll e
a talactoferrina foram os medicamentos analisados. Um dos motivos pelos
resultados desanimadores no uso da imunoterapia na sepse é o intervalo de
tempo entre a instalação da infecção e o início do tratamento. Acredita-se
que o uso da imunoterapia deva ser embasada nos níveis séricos dos
biomarcadores para a identificação da fase da sepse, pró-inflamatória ou de
imunossupressão, pois a administração do medicamento deve ser realizada
no momento de concentração máxima das citocinas 84.
Diante deste contexto, a pentoxifilina é um agente capaz de modular a
atividade inflamatória, principalmente na diminuição da síntese do TNF- e
outras propriedades como a menor aderência do neutrófilo ao endotélio,
menor produção de IL-6 e IFN- e inibição da citotoxicidade das células T 85,
86. Da mesma forma, a solução salina hipertônica, além dos efeitos físicos,
também atua no controle dos radicais livres de oxigênio, na inibição da
ativação leucocitária e das citocinas 32, 87.
50
Assim, o atendimento inicial do doente em choque séptico exige a
reanimação volêmica a fim de restaurar os parâmetros hemodinâmicos,
distúrbios da microcirculação, alterações celulares e ajustar a demanda e a
oferta do consumo metabólico que são alterados pelas vias da inflamação 32.
A estratégia do tratamento com solução salina hipertônica e pentoxifilina foi
estudada em modelos animais de choque hipovolêmico e os trabalhos
demonstraram atenuação da resposta inflamatória na fase aguda, com
menor produção de citocinas e redução dos parâmetros inflamatórios nos
tecidos 59-61, 79, 88. Apesar dos efeitos animadores do uso isolado destas
terapêuticas em modelo experimental de sepse 35, 37, 53, 86, 89, 90, a associação
de ambas foi pouco utilizada 62.
Kim e Lee 62, em trabalho recente, estudaram a reanimação volêmica com a
associação de pentoxifilina e solução hipertônica em animais submetidos à
sepse, através da injeção intratraqueal de lipopolissacáride, com avaliação
da resposta inflamatória aguda. O trabalho demonstrou que este tipo de
tratamento confere menor expressão de TNF-, IL-1 e IL-6 comparado ao
grupo Ringer lactato. Nesta análise, o acréscimo da pentoxifilina ao Ringer
lactato não proporcionou diminuição da atividade inflamatória.
O presente estudo mostra uma elevação das citocinas inflamatórias de fase
aguda, podendo-se assim inferir que o momento avaliado reflete a fase
inicial da sepse, período em que a reanimação volêmica e a imunoterapia
acarretam diminuição da mortalidade 20, 84.
51
O tratamento dos animais com solução salina hipertônica, pentoxifilina e
solução salina hipertônica com pentoxifilina resulta em queda dos níveis
destes marcadores quando comparados ao Ringer lactato. A pentoxifilina
associada ou não à solução hipertônica resultou em diminuição dos níveis
de IL-6 em relação ao grupo SH, afirmando o sinergismo de proteção destes
dois medicamentos.
A pentoxifilina não atenuou os efeitos inflamatórios do Ringer lactato neste
modelo de sepse, com exceção da análise da CINC-1, confirmando as
observações de Kim e Lee 62, em 2012. Tais achados diferem dos resultados
em choque hemorrágico conforme relato de Yada – Langhi e cols. 91, 92, que
evidenciaram atenuação da infiltração de neutrófilos e lesão pulmonar nos
animais tratados com Ringer lactato associado à pentoxifilina.
Gogos e cols. 93, analisando doentes de terapia intensiva, constataram que
os níveis elevados de TNF- e IL-10 estavam associados com maior
mortalidade, sendo ainda pior quando os níveis de IL-10 eram mais elevados
que o TNF-. Os autores concluíram que a persistência da síntese elevada
de IL-10 era o principal preditor de mortalidade. Muenzer e cols. 69
estudaram o efeito do bloqueio da IL-10, em modelo de peritonite seguido de
pneumonia, e obtiveram ganho de sobrevida em decorrência do aumento
das citocinas pró-inflamatórias e diminuição bacteriana na corrente
sanguínea.
Vale ressaltar que, no presente estudo em que o grupo SHPT apresentou
menor produção de IL-10, foi analisado apenas o valor desta citocina anti-
52
inflamatória numa fase inicial, sendo necessário avaliação em período de
tempo mais tardio após o tratamento. Desta forma, estes dados apontam a
importância de conhecer o balanço das citocinas pró e anti-inflamatórias e a
relação destas com a fase da resposta imune 69.
Assim, a proposta de atenuar a resposta imune inicial, com diminuição na
síntese das citocinas inflamatórias, pode implicar em menor ativação das
citocinas anti-inflamatórias. Este fenômeno pode ser observado no presente
estudo com produção inferior de IL-1, IL-6 e CINC-1 no grupo solução
salina hipertônica com pentoxifilina, e menor expressão de IL-10.
O mecanismo responsável pela diminuição da síntese das citocinas pró-
inflamatórias está diretamente relacionado com a ativação do NF-B por
meio de estímulos extracelulares como lipopolissacáride, espécies reativas
de oxigênio e outros agentes citotóxicos, dentre estes, as próprias citocinas
inflamatórias 10.
Arnalich e cols.94 avaliaram a atividade do NF-B em doentes com sepse
grave e evidenciaram que os níveis desta proteína estavam mais elevados
nos doentes com maior índice de gravidade e naqueles que morreram,
sendo assim, o NF-B preditor de mortalidade. Tais evidências também
foram relatadas nos doentes com síndrome da resposta inflamatória
sistêmica 95.
Em modelo de choque hemorrágico, a associação solução salina hipertônica
e pentoxifilina promoveu menor produção do NF-B em relação ao Ringer
lactato 60, 88, 96. No presente estudo, os animais tratados com solução salina
53
hipertônica, pentoxifilina e a associação destes dois medicamentos cursaram
com atenuação da expressão do NF-B quando comparados ao grupo sem
reanimação volêmica. Entretanto, a solução salina hipertônica com
pentoxifilina foi o único esquema terapêutico superior ao Ringer lactato,
reiterando o sinergismo destas drogas no controle da atividade inflamatória.
Este sinergismo não tem sido avaliado na literatura, pois não comparam a
associação com a solução salina hipertônica ou a pentoxifilina isoladamente.
No futuro, a imunoterapia deverá ser uma ferramenta no tratamento da
sepse, de tal forma que provavelmente será individualizada com dados
clínicos e laboratoriais 84, 93, 97. Deve haver um esforço para identificar a fase
da sepse em que se encontra o doente, se inflamatória ou anti-inflamatória,
para definir a melhor terapêutica. Trabalhos atuais estão direcionados a
estudar a imunossupressão e os mecanismos de estimular o sistema imune
neste momento, com determinadas citocinas como IL-7 e IL-15 97.
A literatura carece de estudos avaliando a fase de imunossupressão da
sepse após o uso no atendimento inicial da solução salina hipertônica,
isoladamente ou em conjunto com a pentoxifilina.
Este trabalho avaliou o efeito das diferentes soluções na reanimação
volêmica logo após o tratamento, caracterizada pela fase pró-inflamatória da
sepse, devido aos valores elevados das citocinas inflamatórias. Faz-se
necessária uma análise da ação da solução salina hipertônica com
pentoxifilina em intervalo de tempo maior após a terapêutica, para definir a
duração das propriedades protetoras encontradas na avaliação inicial e o
impacto na sobrevida.
54
Apesar dos trabalhos experimentais avaliando a solução salina hipertônica,
isoladamente ou associada à pentoxifilina, no cenário clínico no que se
refere ao doente séptico, poucos foram os estudos desenvolvidos.
Recentemente, van Haren e cols. 46 conduziram um ensaio clínico
comparando a solução salina hipertônica a 7,5% com colóide e seus
resultados preliminares referentes a desfechos fisiológicos, mostraram
melhora da contratilidade miocárdica e do tônus vascular, embora sem efeito
sobre a microcirculação da mucosa gástrica e sublingual. Tais observações
reforçam a importância de estudos com maior número de doentes para
avaliar disfunção de órgãos e mortalidade.
A sepse é uma doença complexa tendo em vista o número de variáveis que
interferem e influenciam na análise da terapêutica e dos resultados, por isso
o modelo experimental visa reproduzir no laboratório esta doença, porém
com controle de variáveis para se compreender a fisiopatologia, assim como
a resposta terapêutica a determinadas estratégias. Desta forma, a translação
do conhecimento experimental poderá ser realizada com maior segurança
para o doente.
A associação da solução salina hipertônica com pentoxifilina demonstrou a
capacidade terapêutica de reanimação volêmica, baseada em menor volume
com atividade anti-inflamatória, capaz de eventualmente diminuir as
disfunções orgânicas através da redução do estresse oxidativo e da
atividade inflamatória. Apesar do tratamento com a pentoxifilina apresentar
resultados semelhantes ao esquema solução salina hipertônica com
pentoxifilina, no contexto clínico não é factível o tratamento do doente com
55
choque sem a restauração dos parâmetros hemodinâmicos. Foram poucos
os trabalhos que avaliaram a associação solução salina hipertônica com
pentoxifilina e compararam esta modalidade de tratamento com o uso
isolado das soluções.
Apesar do conhecimento cada vez mais detalhado da fisiopatolologia e do
investimento no desenvolvimento da imunoterapia, a sepse persiste como
afecção com expressiva mortalidade e seu tratamento é desafio que precisa
de modificações, necessitando novos e contínuos estudos.
56
6. Conclusão
57
A reanimação volêmica com solução salina hipertônica a 7,5% associada ou
não à pentoxifilina, e a pentoxifilina isoladamente em modelo de sepse,
induzido por obstrução e isquemia intestinal em ratos, promoveu redução do
estresse oxidativo e da atividade inflamatória.
58
7. Anexos
59
Anexo 1 – Carta de aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa
60
Anexo 2 – Tabelas
Pressão arterial média em T1
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 78 82 81 86 63 82 75 88 109 95 - 82 51 84 71 84 71 89 81 68 89 71 79 95 94 73 89 75 66 84 83 78 88 84 76 108 65 68 87 78 74 74 74 77 91 66 76 70
Mediana 76 77 88 81 74 82 Média 75 77 85 79 72 81
D. padrão 12 7 6 9 5 15 Intervalo (25-75%)
67-82 69-83 81-89 72-85 66-76 72-92
Tabela A - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg)
imediatamente após a cateterização cervical (T1).
Pressão arterial média em T2
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 83 96 137 73 68 74 79 101 162 84 - 102 73 92 114 99 83 106 82 77 109 - 82 101 93 113 130 68 75 83 87 76 137 86 86 85 - 102 132 74 80 79 74 98 132 56 67 94
Mediana 82 97 132 74 80 85 Média 81 94 131 77 77 87
D. padrão 7 12 16 13 7 13 Intervalo (25-75%)
74-87 80-101 118-137 68-86 68-83 76-101
Tabela B - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) cinco
minutos após o tratamento (T2).
61
Pressão arterial média em T3
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 70 94 85 91 63 92 70 65 101 92 - 92 63 60 73 88 61 106 71 66 75 81 71 109 75 73 82 85 103 91 76 61 87 77 91 97 90 70 80 95 65 72 89 82 84 80 70 102
Mediana 73 68 82 86 70 92 Média 75 71, 80 86 74 92,8
D. padrão 9 11 5 6 15 12 Intervalo (25-75%)
70-85 62-79 75-85 80-91 63-91 83-104
Tabela C - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) 30
minutos após o tratamento (T3).
Pressão arterial média em T4
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 74 91 84 93 72 93 67 75 107 88 - 88 82 59 80 100 - 112 76 78 76 - 73 102 81 65 78 71 80 81 84 63 88 66 - 75 88 75 73 74 66 80 78 78 90 60 85 85
Mediana 79 75 80 74 73 85 Média 78 73 81 78 75 86
D. padrão 6 10 6 14 7 13 Intervalo (25-75%)
74-83 63-78 76-88 66-93 69-82 77-97
Tabela D - Valores da pressão arterial média (expressos em mmHg) 30
minutos após o tratamento (T4).
62
Intestino Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT
0,34 1,51 0,34 0,32 0,22 0,28 0,42 0,48 0,29 0,37 0,28 0,22 0,48 0,36 0,21 0,32 0,42 0,25 0,42 0,56 0,20 0,27 0,18 0,31 0,35 0,71 0,32 0,28 0,48 0,25 0,43 0,27 0,36 0,25 0,31 0,28
Mediana 0,42 0,52 0,30 0,30 0,29 0,27 Média 0,40 0,65 0,30 0,28 0,31 0,26
D. padrão 0,05 0,45 0,04 0,06 0,11 0,03 E. padrão 0,02 0,18 0,01 0,02 0,04 0,01 Intervalo (25-75%)
(0,35-0,43)
(0,36-0,71)
(0,26-0,31
(0,20-0,34)
(0,21-0,42)
(0,24-0,28)
Tabela E - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)
no tecido intestinal para os grupos de estudo, analisado por TBARS.
Pulmão Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT
0,50 0,38 0,72 0,48 0,42 0,31 0,68 0,99 0,43 0,41 0,45 0,36 0,45 0,43 0,41 0,35 0,67 0,32 0,70 0,44 0,33 0,60 0,38 0,26 0,30 0,38 0,77 0,35 0,42 0,30 0,34 0,39 0,40 0,50 0,63 0,28
Mediana 047 0,41 0,42 0,44 0,43 0,30 Média 0,49 0,50 0,51 0,44 0,49 0,30
D. padrão 0,16 0,24 0,18 0,09 0,12 0,03 E. padrão 0,06 0,09 0,07 0,03 0,05 0,01 Intervalo (25-75%)
(0,34-0,68)
(0,38-0,44)
(0,40-0,72)
(0,35-0,50)
(0,42-0,63)
(0,28-0,32)
Tabela F - Valores de malondialdeído (expressos em nmol/mg de proteína)
no tecido pulmonar para os grupos de estudo, analisado por TBARS.
63
IL-6
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 3,00 2,00 1,60 0,50 1,98 0,57 1,81 2,32 1,50 0,57 1,81 0,51 1,70 1,61 0,68 0,45 0,87 0,67 2,60 2,58 1,07 0,57 1,23 0,70 1,88 2,47 0,84 1,05 1,61 0,54 1,27 1,54 0,61 0,44 1,53 0,68
Mediana 1,84 2,16 0,95 0,53 1,57 0,62 Média 2,04 2,08 1,05 0,59 1,50 0,61
D. padrão 0,63 0,44 0,41 0,22 0,40 0,08 E. padrão 0,26 0,18 0,17 0,09 0,16 0,03 Intervalo (25-75%)
(1,70-2,60)
(1,61-2,47)
(0,68-1,50)
(0,44-0,56)
(1,23-1,81)
(0,54-0,68)
Tabela G - Expressão de IL-6 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os
grupos de estudo, analisado por ELISA.
CINC-1
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 0,91 0,66 0,44 0,40 0,54 0,38 0,95 0,55 0,56 0,38 0,56 0,44 0,63 0,70 0,67 0,58 0,63 0,40 0,67 0,69 0,57 0,52 0,52 0,50 0,79 0,57 0,47 0,49 0,53 0,39 0,60 0,66 0,36 0,59 0,43 0,42 Mediana 0,73 0,66 0,52 0,50 0,53 0,41
Média 0,76 0,64 0,51 0,49 0,54 0,42 D. padrão 0,14 0,06 0,11 0,08 0,06 0,04 E. padrão 0,06 0,02 0,04 0,03 0,02 0,01 Intervalo (25-75%)
(0,63-0,91)
(0,57-0,69)
(0,44-0,57)
(0,40-0,58)
(0,52-0,56)
(0,39-0,44)
Tabela H - Expressão de CINC-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os
grupos de estudo, analisado por ELISA.
64
IL-1
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 2,83 2,07 1,80 1,70 1,97 1,71 2,60 2,93 1,21 1,31 2,41 1,70 2,47 1,82 1,49 1,52 1,93 1,56 2,72 2,30 1,22 1,48 3,34 1,73 2,16 1,89 1,58 2,19 2,75 1,84 1,62 1,36 1,12 1,31 2,08 1,45
Mediana 2,54 1,98 1,36 1,50 2,25 1,71 Média 2,40 2,06 1,40 1,58 2,42 1,66
D. padrão 0,44 0,52 0,26 0,33 0,55 0,13 E. padrão 0,18 0,21 0,10 0,13 0,22 0,05 Intervalo (25-75%)
(2,16-2,72)
(1,82-2,30)
(1,21-1,58)
(1,31-1,70)
(1,97-2,75)
(1,56-1,73)
Tabela I - Expressão de IL-1 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os grupos
de estudo, analisado por ELISA.
IL-10
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 1,20 0,88 0,22 0,11 0,25 0,07 0,25 0,12 0,24 0,02 0,36 0,13 0,49 0,17 0,06 0,32 0,19 0,10
0,16 0,45 0,33 0,08 0,13 0,09 0,55 0,14 0,11 0,08 0,10 0,01 0,21 0,42 - - - -
Mediana 0,371 0,294 0,219 0,0820 0,190 0,0850 Média 0,476 0,363 0,192 0,123 0,206 0,0782
D. padrão 0,38 0,92 0,10 0,11 0,10 0,04 E. padrão 0,15 0,11 0,04 0,05 0,04 0,01 Intervalo (25-75%)
(0,20-0,55)
(0,13-0,45)
(0,09-0,26)
(0,06-0,16)
(0,12-0,27)
(0,05-0,10)
Tabela J - Expressão de IL-10 (em ng/mL) no tecido pulmonar para os
grupos de estudo, analisado por ELISA.
65
NF-B
Animal OI RL SH PTX RLPT SHPT 1 422864 123240 99636 60109 82950 16758 2 334739 126466 70560 69891 67184 44640 3 261826 83000 44304 101121 105910 57960 4 271161 103200 45402 99982 108864 62496 5 190836 194432 86432 82544 108763 56765 6 236384 97940 39689 61020 86940 45464
Mediana 266493 113220 57981 76217 96425 51114 Média 286301 121379 64337 79111 93435 47347
D. padrão 81767 39290, 25061 18467 17145 16597 E. padrão 33381 16040 10231 7539 6999 6775 Intervalo (25-75%)
236384- 334739
97940- 126466
44304- 86432
61020- 99982
82950- 108763
44640- 57960
Tabela L - Expressão do NFB no tecido pulmonar para os grupos de
estudo, analisado por Western-blot.
66
8. Referências
67
1. Rasslan S. Obstrução Intestinal. in Rasslan, S. Afecções Cirúrgicas
de Urgência. São Paulo: Robe editorial, 1995. pp. 121-137.
2. Lu RH, Chang TM, Yen MH, Tsai LM. Involvement of superoxide anion
in the pathogenesis of simple mechanical intestinal obstruction. J Surg Res.
2003;115(2):184-90.
3. Nellgard P, Cassuto J. Inflammation as a major cause of fluid losses in
small-bowel obstruction. Scand J Gastroenterol. 1993;28(12):1035-41.
4. Heneghan JB, Robinson JW, Menge H, Winistorfer B. Intestinal
obstruction in germ-free dogs. Eur J Clin Invest. 1981;11(4):285-90.
5. Enochsson L, Nylander G, Ohman U. Effects of intraluminal pressure
on regional blood flow in obstructed and unobstructed small intestines in the
rat. Am J Surg. 1982; 144(5):558-61.
6. Deitch EA. Gut-origin sepsis: Evolution of a concept.
Surgeon.2012;10(6):350-6
7. Samel S, Keese M, Kleczka M, Lanig S, Gretz N, Hafner M, et al.
Microscopy of bacterial translocation during small bowel obstruction and
ischemia in vivo--a new animal model. BMC Surg 2002; 2:6.
8. Deitch EA. Simple intestinal obstruction causes bacterial translocation
in man. Arch Surg. 1989; 124(6):699-701.
9. Deitch EA. Bacterial translocation or lymphatic drainage of toxic
products from the gut: what is important in human beings? Surgery.
2002;131(3):241-4.
10. Russell JA. Management of sepsis. N Engl J Med. 2006;
355(16):1699-713.
11. Silva E, Passos Rda H, Ferri MB, de Figueiredo LF. Sepsis: from
bench to bedside. Clinics. 2008;63(1):109-20.
12. van der Poll T. Immunotherapy of sepsis. Lancet Infect Dis.
2001;1(3):165-74.
68
13. Ahmed N, Christou N. Systemic inflammatory response syndrome:
interactions between immune cells and the endothelium. Shock. 1996; 6
Suppl 1:S39-42.
14. Sener G, Akgun U, Satiroglu H, Topaloglu U, Keyer-Uysal M. The
effect of pentoxifylline on intestinal ischemia/reperfusion injury. Fundam Clin
Pharmacol. 2001;15(1):19-22.
15. Grune T, Berger MM. Markers of oxidative stress in ICU clinical
settings: present and future. Curr Opin Clin Nutr Metab Care.
2007;10(6):712-7.
16. Muzio M, Mantovani A. Toll-like receptors. Microbes Infect. 2000;
2(3):251-5.
17. Brown MA, Jones WK. NF-kappa B action in sepsis: The innate
immune system and the heart. Front. Biosci. 2004; 9:1201-1217.
18. Salomao R, Brunialti MK, Rapozo MM, Baggio-Zappia GL, Galanos C,
Freudenberg M. Bacterial sensing, cell signaling, and modulation of the
immune response during sepsis. Shock. 2012; 38(3):227-42.
19. Diaz JJ, Jr., Bokhari F, Mowery NT, Acosta JA, Block EF, Bromberg
WJ, et al. Guidelines for management of small bowel obstruction. J Trauma.
2008;64(6):1651-64.
20. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, et
al. Surviving Sepsis Campaign: International Guidelines for Management of
Severe Sepsis and Septic Shock: 2012. Crit Care Med. 2013;41(2):580-637.
21. Rivers E, Nguyen B, Havstad S, Ressler J, Muzzin A, Knoblich B, et
al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic
shock. N Engl J Med. 2001; 345(19):1368-77.
22. Vincent JL, Gerlach H. Fluid resuscitation in severe sepsis and septic
shock: an evidence-based review. Crit Care Med. 2004;32(11S):S451-4.
23. Moore FA. The use of lactated ringer's in shock resuscitation: the
good, the bad and the ugly. J Trauma. 2011;70(5 Suppl):S15-6.
69
24. Deb S, Martin B, Sun L, Ruff P, Burris D, Rich N, et al. Resuscitation
with lactated Ringer's solution in rats with hemorrhagic shock induces
immediate apoptosis. J Trauma. 1999; 46(4):582-8; discussion 588-9.
25. Rhee P, Burris D, Kaufmann C, Pikoulis M, Austin B, Ling G, et al.
Lactated Ringer's solution resuscitation causes neutrophil activation after
hemorrhagic shock. J Trauma. 1998; 44(2):313-319.
26. Savage SA, Fitzpatrick CM, Kashyap VS, Clouse MWD, Kerby JD.
Endothelial dysfunction after lactated Ringer's solution resuscitation for
hemorrhagic shock. J Trauma. 2005; 59(2):284-290.
27. Koustova E, Stanton K, Gushchin V, Alam HB, Stegalkina S, Rhee
PM. Effects of lactated Ringer's solutions on human leukocytes. J Trauma.
2002; 52(5):872-8.
28. Astiz ME, Galera-Santiago A, Rackow EC. Intravascular volume and
fluid therapy for severe sepsis. New Horiz 1993; 1(1):127-36.
29. Vincent JL, Gottin L. Type of fluid in severe sepsis and septic shock.
Minerva Anestesiol. 2011;77(12):1190-6.
30. Velasco IT, Pontieri V, Rocha e Silva M, Jr., Lopes OU. Hyperosmotic
NaCl and severe hemorrhagic shock. Am J Physiol. 1980; 239(5):H664-73.
31. de Felippe J, Jr., Timoner J, Velasco IT, Lopes OU, Rocha-e-Silva M,
Jr. Treatment of refractory hypovolaemic shock by 7.5% sodium chloride
injections. Lancet. 1980; 2(8202):1002-4.
32. Oliveira RP, Velasco I, Soriano FG, Friedman G. Mechanisms of
action of hypertonic saline resuscitation in severe sepsis and septic shock.
Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 2006; 6(2):201-6.
33. Oliveira RP, Velasco I, Soriano FG, Friedman G. Clinical review:
Hypertonic saline resuscitation in sepsis. Crit Care. 2002; 6(5):418-423.
34. Rocha-e-Silva M, Poli de Figueiredo LF. Small volume hypertonic
resuscitation of circulatory shock. Clinics. 2005; 60(2):159-72.
35. Libert N, de Rudnicki S, Cirodde A, Thepenier C, Mion G. Is there any
place for hypertonic saline for fluid resuscitation in septic shock? Ann Fr
Anesth Reanim. 2010; 29(1):25-35.
70
36. Rizoli SB, Kapus A, Parodo J, Rotstein OD. Hypertonicity prevents
lipopolysaccharide-stimulated CD11b/CD18 expression in human neutrophils
in vitro: role for p38 inhibition. J Trauma. 1999; 46(5):794-8; discussion 798-
9.
37. Shih CC, Chen SJ, Chen A, Wu JY, Liaw WJ, Wu CC. Therapeutic
effects of hypertonic saline on peritonitis-induced septic shock with multiple
organ dysfunction syndrome in rats. Crit Care Med. 2008; 36(6):1864-1872.
38. Pascual JL, Khwaja KA, Chaudhury P, Christou NV. Hypertonic saline
and the microcirculation. J Trauma. 2003; 54(5 Suppl):S133-40.
39. Pascual JL, Khwaja KA, Ferri LE, Giannias B, Evans DC, Razek T, et
al. Hypertonic saline resuscitation attenuates neutrophil lung sequestration
and transmigration by diminishing leukocyte-endothelial interactions in a two-
hit model of hemorrhagic shock and infection. J Trauma. 2003; 54(1):121-
130.
40. Shields CJ, O'Sullivan AW, Wang JH, Winter DC, Kirwan WO,
Redmond HP.Hypertonic saline enhances host response to bacterial
challenge by augmenting receptor-independent neutrophil intracellular
superoxide formation. Ann Surg. 2003; 238(2):249-257.
41. Hatanaka E, Shimomi FM, Curi R, Campa A. Sodium chloride inhibits
cytokine production by lipopolysaccharide-stimulated human neutrophils and
mononuclear cells. Shock. 2007;27(1):32-5.
42. Shih CC, Tsai MF, Chen SJ, Tsao CM, Ka SM, Huang HC, et al.
Effects of Small Volume Hypertonic Saline on Acid-Base and Electrolytes
Balance in Rats with Peritonitis-Induced Sepsis. Shock. 2012;38(6):649-55.
43. Zanoni FL, Benabou S, Greco KV, Moreno AC, Cruz JW, Filgueira FP,
et al. Mesenteric microcirculatory dysfunctions and translocation of
indigenous bacteria in a rat model of strangulated small bowel obstruction.
Clinics. 2009; 64(9):911-9.
44. Theobaldo MC, Barbeiro HV, Barbeiro DF, Petroni R, Soriano FG.
Hypertonic saline solution reduces the inflammatory response in
endotoxemic rats. Clinics. 2012; 67(12):1463-8.
45. Hannemann L, Reinhart K, Korell R, Spies C, Bredle DL. Hypertonic
saline in stabilized hyperdynamic sepsis. Shock. 1996; 5(2):130-4.
71
46. van Haren FMP, Sleigh J, Boerma EC, La Pine M, Bahr M, Pickkers P,
et al. Hypertonic fluid administration in patients with septic shock: a
prospective randomized controlled pilot study. Shock. 2012;37(3):268-75.
47. Coimbra R, Melbostad H, Hoyt DB.Effects of phosphodiesterase
inhibition on the inflammatory response after shock: role of pentoxifylline. J
Trauma. 2004; 56(2):442-9.
48. Salhiyyah K, Senanayake E, Abdel-Hadi M, Booth A, Michaels JA.
Pentoxifylline for intermittent claudication. Cochrane Database Syst Rev.
2012:18; 1:CD005262.
49. Whitfield K, Rambaldi A, Wetterslev J, Gluud C. Pentoxifylline for
alcoholic hepatitis. Cochrane Database Syst Rev. 2009:7;(4):CD007339.
50. Koyluoglu G, Bakici MZ, Elagoz S, Arpacik M. The effects of
pentoxifylline treatment on bacterial translocation after hemorrhagic shock in
rats. Clin Exp Med. 2001; 1(1):61-6.
51. Kocdor MA, Kocdor H, Gulay Z, Gokce O. The effects of pentoxifylline
on bacterial translocation after intestinal obstruction. Shock. 2002; 18(2):148-
151.
52. Michetti C, Coimbra R, Hoyt DB, Loomis W, Junger W, Wolf P.
Pentoxifylline reduces acute lung injury in chronic endotoxemia. J Surg Res.
2003; 115(1):92-9.
53. Coimbra R, Porcides RD, Melbostad H, Loomis W, Tobar M, Hoyt DB,
et al. Nonspecific phosphodiesterase inhibition attenuates liver injury in acute
endotoxemia. Surg Infect (Larchmt). 2005; 6(1):73-85.
54. Coimbra R, Melbostad H, Loomis W, Tobar M, Hoyt DB.
Phosphodiesterase inhibition decreases nuclear factor-kappa B activation
and shifts the cytokine response toward anti-inflammatory activity in acute
endotoxemia. J. Trauma. 2005; 59(3):575-582.
55. Oliveira IS, Oliveira WRS, Cavassani SS, Brunialti MKC, Salomao R.
Effects of Pentoxifylline on Inflammation and Lung Dysfunction in Ventilated
Septic Animals. J Trauma. 2010; 68(4):822-826.
72
56. Deree J, Martins JO, Melbostad H, Loomis WH, Coimbra R. Insights
into the regulation of TNF-alpha production in human mononuclear cells: the
effects of non-specific phosphodiesterase inhibition. Clinics. 2008; 63(3):321-
8.
57. Staubach KH, Schroder J, Stuber F, Gehrke K, Traumann E, Zabel P.
Effect of pentoxifylline in severe sepsis - Results of a randomized, double-
blind, placebo-controlled study. Arch Surg. 1998; 133(1):94-100.
58. Shukla VK, Ojha AK, Pandey M, Pandey BL. Pentoxifylline in
perforated peritonitis: results of a randomised, placebo controlled trial. Eur J
Surg. 2001; 167(8):622-4.
59. Coimbra R, Porcides R, Loomis W, Melbostad H, Lall R, Deree J, et al.
HSPTX protects against hemorrhagic shock resuscitation-induced tissue
injury: An attractive alternative to Ringer's lactate. J Trauma. 2006; 60(1):41-
49.
60. Costantini TW, Deree J, Martins JO, Putnam JG, de Campos T,
Coimbra R. A novel fluid resuscitation strategy modulates pulmonary
transcription factor activation in a murine model of hemorrhagic shock.
Clinics. 2010;65(6):621-8.
61. Coimbra R, Loomis W, Melbostad H, Tobar M, Porcides RD, Lall R, et
al. Role of hypertonic saline and pentoxifylline on neutrophil activation and
tumor necrosis factor-alpha synthesis: A novel resuscitation strategy. J
Trauma. 2005; 59(2):257-264.
62. Kim HJ, Lee KH. The effectiveness of hypertonic saline and
pentoxifylline (HTS-PTX) resuscitation in haemorrhagic shock and sepsis
tissue injury: Comparison with LR, HES, and LR-PTX treatments. Injury.
2012;43(8):1271-6
63. Poli-de-Figueiredo LF, Garrido AG, Nakagawa N, Sannomiya P.
Experimental models of sepsis and their clinical relevance. Shock. 2008; 30
Suppl 1:53-9.
64. Esmon CT. Why do animal models (sometimes) fail to mimic human
sepsis? Crit Care Med. 2004;32(5S):S219-22.
73
65. Zanotti-Cavazzoni SL, Goldfarb RD. Animal models of sepsis. Crit
Care Clin. 2009; 25(4):703-19, vii-viii.
66. Dejager L, Pinheiro I, Dejonckheere E, Libert C. Cecal ligation and
puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends
Microbiol. 2011;19(4) :198-208.
67. Wichterman KA, Baue AE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock--a
review of laboratory models and a proposal. J Surg Res. 1980; 29(2):189-
201.
68. Parker SJ, Watkins PE. Experimental models of gram-negative sepsis.
Br J Surg. 2001;88(1):22-30.
69. Muenzer JT, Davis CG, Chang K, Schmidt RE, Dunne WM,
Coopersmith CM, et al. Characterization and modulation of the
immunosuppressive phase of sepsis. Infect Immun. 2010;78(4):1582-92.
70. Akcay MN, Capan MY, Gundogdu C, Polat M, Oren D. Bacterial
translocation in experimental intestinal obstruction. J Int Med Res. 1996;
24(1):17-26.
71. Garrido ADG, Cruz RJ, de Figueiredo LFP, Silva MRE. Small volume
of hypertonic saline as the initial fluid replacement in experimental
hypodynamic sepsis. Crit Care. 2006;10(2):R62..
72. Hogue B, Chagnon F, Lesur O. Resuscitation Fluids and Endotoxin-
Induced Myocardial Dysfunction: is Selection a Load-Independent Differential
Issue? Shock. 2012;38(3):307-13.
73. Pekmezci S, Saribeyoglu K, Korman U. Guidelines for management of
small bowel obstruction. J Trauma. 2009;66(4):1262.
74. Cruz RJ, Jr., Yada-Langui MM, de Figueiredo LF, Sinosaki S, Rocha e
Silva M. The synergistic effects of pentoxifylline on systemic and regional
perfusion after hemorrhage and hypertonic resuscitation. Anesth Analg.
2006;102(5):1518-24.
75. Horton JW, Walker PB. Small-volume hypertonic saline dextran
resuscitation from canine endotoxin-shock. Ann Surg. 1991;214(1):64-73.
74
76. Moore-Olufemi SD, Xue H, Attuwaybi BO, Fischer U, Harari Y, Oliver
DH, et al. Resuscitation-induced gut edema and intestinal dysfunction. J
Trauma. 2005;58(2):264-70.
77. Radhakrishnan RS, Xue H, Moore-Olufemi SD, Weisbrodt NW, Moore
FA, Allen SJ, et al. Hypertonic saline resuscitation prevents hydrostatically
induced intestinal edema and ileus. Crit Care Med. 2006; 34(6):1713-8.
78. Mazzoni MC, Borgstrom P, Arfors KE, Intaglietta M. Dynamic fluid
redistribution in hyperosmotic resuscitation of hypovolemic hemorrhage. Am
J Physiol. 1988; 255(3 Pt 2):H629-37.
79. Deree J, Martins JO, Leedom A, Lamon B, Putnam J, de Campos T, et
al. Hypertonic saline and pentoxifylline reduces hemorrhagic shock
resuscitation-induced pulmonary inflammation through attenuation of
neutrophil degranulation and proinflammatory mediator synthesis. J Trauma.
2007;62(1):104-11.
80. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N
Engl J Med. 2003; 348(2):138-50.
81. Eskandari MK, Bolgos G, Miller C, Nguyen DT, DeForge LE, Remick
DG. Anti-tumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after
cecal ligation and puncture or endotoxemia. J Immunol. 1992; 148(9):2724-
30.
82. Echtenacher B, Weigl K, Lehn N, Mannel DN. Tumor necrosis factor-
dependent adhesions as a major protective mechanism early in septic
peritonitis in mice. Infect Immun. 2001; 69(6):3550-5.
83. Fisher CJ, Jr., Agosti JM, Opal SM, Lowry SF, Balk RA, Sadoff JC, et
al. Treatment of septic shock with the tumor necrosis factor receptor:Fc
fusion protein. The Soluble TNF Receptor Sepsis Study Group. N Engl J
Med. 1996; 334(26):1697-702.
84. Rivers EP, Jaehne AK, Nguyen HB, Papamatheakis DG, Singer D,
Yang JJ, et al. Early biomarker activity in severe sepsis and septic shock and
a contemporary review of immunotherapy trials: not a time to give up, but to
give it earlier. Shock. 2013;39(2):127-37.
75
85. Kreth S, Ledderose C, Luchting B, Weis F, Thiel M.
Immunomodulatory properties of pentoxifylline are mediated via adenosine-
dependent pathways. Shock. 2010;34(1):10-6.
86. Coimbra R, Melbostad H, Loomis W, Porcides RD, Wolf P, Tobar M, et
al. LPS-induced acute lung injury is attenuated by phosphodiesterase
inhibition: effects on proinflammatory mediators, metalloproteinases, NF-
kappaB, and ICAM-1 expression. J Trauma. 2006;60(1):115-25.
87. Khan R, Kirschenbaum LA, Larow C, Astiz ME. The effect of
resuscitation fluids on neutrophil-endothelial cell interactions in septic shock.
Shock. 2011;36(5):440-4.
88. Rhee P, Cooney RN, Deree J. Hepatic transcription factor activation
and proinflammatory mediator production is attenuated by hypertonic saline
and pentoxifylline resuscitation after hemorrhagic shock. J Trauma.
2008;64(5):1230-8.
89. Wan L, Bellomo R, May CN. Bolus hypertonic or normal saline
resuscitation in gram-negative sepsis: systemic and regional haemodynamic
effects in sheep. Crit Care Resusc. 2011;13(4):262-70.
90. Yu G, Chi X, Hei Z, Shen N, Chen J, Zhang W, et al. Small volume
resuscitation with 7.5% hypertonic saline, hydroxyethyl starch 130/0.4
solution and hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40 injection
reduced lung injury in endotoxin shock rats: comparison with saline. Pulm
Pharmacol Ther. 2012;25(1):27-32.
91. Yada-Langui MM, Coimbra R, Lancellotti C, Mimica I, Garcia C,
Correia N, et al. Hypertonic saline and pentoxifylline prevent lung injury and
bacterial translocation after hemorrhagic shock. Shock. 2000;14(6):594-598.
92. Yada-Langui MM, Anjos-Valotta EA, Sannomiya P, Silva MRE,
Coimbra R. Resuscitation affects microcirculatory polymorphonuclear
leukocyte behavior after hemorrhagic shock: Role of hypertonic saline and
pentoxifylline. Exp Biol Med. 2004;229(7):684-93..
93. Gogos CA, Drosou E, Bassaris HP, Skoutelis A. Pro- versus anti-
inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis: a marker for
prognosis and future therapeutic options. J Infect Dis. 2000;181(1):176-80.
76
94. Arnalich F, Garcia-Palomero E, Lopez J, Jimenez M, Madero R,
Renart J, et al.. Predictive value of nuclear factor kappaB activity and plasma
cytokine levels in patients with sepsis. Infect Immun. 2000; 68(4):1942-5.
95. Nakamori Y, Koh T, Ogura H, Tanaka H, Fujimi S, Kasai K, et al.
Enhanced expression of intranuclear NF-kappa B in primed
polymorphonuclear leukocytes in systemic inflammatory response syndrome
patients. J Trauma. 2003; 54(2):253-60.
96. Deree J, de Campos T, Shenvi E, Loomis WH, Hoyt DB, Coimbra R.
Hypertonic saline and pentoxifylline attenuates gut injury after hemorrhagic
shock: the kinder, gentler resuscitation. J Trauma. 2007;62(4):818-27;
discussion 27-8.
97. Hotchkiss RS, Opal S. Immunotherapy for sepsis--a new approach
against an ancient foe. N Engl J Med. 2010;363(1):87-9
77