PROGRAMA MITOGÊNICO PROGRAMA MITOGÊNICO DESENCADEADO DURANTE A DESENCADEADO DURANTE A

INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍCIAVACCÍCIA

Laboratório de Vírus Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais

Grupo de Transdução de SinalOrientador: Cláudio Antônio Bonjardim

Linha de Pesquisa

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

VíruVíruss

Agentes infecciosos

Constituídos basicamente de uma cápsula protéica que guarda o material genético – RNA ou DNA.

Parasitas intracelulares obrigatórios

Extremamente dependentes de toda maquinaria energética e biossintética de seus hospedeiros

Interação Vírus-Interação Vírus-hospedeirohospedeiro

Hospedeiro susceptível

Interações altamente especializadas

Tropismo da infecção

Interação Vírus-Interação Vírus-hospedeirohospedeiro

Manipulação das respostas e funções celulares do hospedeiro:

Evasão da resposta imune

Interferência na produção de citocinas

Controle da repressão/indução da apoptose

Controle da proliferação e/ou diferenciação celular

Criação um ambiente celular propício para uma multiplicação bem-sucedida

Manipular e intervir nas vias de sinalização que regulam esses processos

Alterações nas vias de sinalização celular e transcrição gênica do hospedeiro

Citoplasma

Núcleo

MAPK

MAPKs MAPKs (Mitogen-activated protein kinase)

Proliferação

Apoptose

Diferenciação

Sobrevivência

MEKKs

MKK7MKK4 MKK3 MKK6

JNK/ SAPK

p38

MAPKKKMAPKKK

MAPKKMAPKK

MAPKMAPK

Cascata de Sinalização das MAPKsCascata de Sinalização das MAPKs

Resposta Resposta BiológicaBiológica

EstímuloEstímuloEstresse, Fatores de Estresse, Fatores de Crescimento, GPCRs, Crescimento, GPCRs,

Citocinas InflamatóriasCitocinas Inflamatórias

Raf

ERK

MEK

Fatores de Fatores de Crescimento, Crescimento,

Mitógenos, GPCRsMitógenos, GPCRs

Crescimento, Crescimento, Diferenciação, Diferenciação,

DesenvolvimentDesenvolvimentoo

Inflamação, Apoptose, Inflamação, Apoptose, Crescimento, Crescimento, DiferenciaçãoDiferenciação

Os Vírus e as Os Vírus e as MAPKsMAPKs

Hepatite B (HBx)

HIV

Herpes

Influenza

Hepatite C

Vírus Vaccinia

Vírus VaccíniaVírus Vaccínia

Pertencente à mesma família do vírus causador da varíola

Utilizado para imunização contra a varíola (1967 – 1977)

Atualmente – vírus de laboratório

Década de 80 – grande interesse pelo VV como ferramenta de estudos em biologia molecular

Recentemente, verificou-se a emergência de zoonoses causadas pelo vírus vaccínia-like.

Erradicação da doença no mundo

Vírus VaccíniaVírus Vaccínia

Família: Poxviridae

Subfamília: Chordopoxvirinae

Gênero: Orthopoxvirus

Características:

Complexos vírus envelopados que medem em torno de 300 nm;

Genoma – DNA fita dupla linear;

Ciclo replicativo citoplasmático.

2 tipos de partículas infectivas: - IMV: 90% da progênie viral - EEV: principais formas de disseminação do VV

Genoma do Vírus VaccíniaGenoma do Vírus Vaccínia

Genes ConservadosITRs ITRs

191 Kpb / 263 genes

Genes essenciais – polipeptídeos estruturais e enzimas envolvidas no

metabolismo da DNA

Variáveis - Genes não-essenciais – interação com o

hospedeiro e virulência

Núcleo

Replicação doDNA

Transcrição de genes tardios

Desnudamentosecundário

Desnudamentoprimário

Ciclo de MultiplicaçãoCiclo de Multiplicação

VírionIMV

EEVIEV Morfogênese

IMV

Transcrição de genes imediatamente

precoces

Transcrição de genes imediatamente

precoces

Transcrição de genes

precoces

Poxvírus e Poxvírus e MitogêneseMitogênese

Fator de Crescimento do VV - VGF

Similaridades estruturais e funcionais ao EGF e TGF- ;

Liberado no sobrenadante das células infectadas;

Estimula o crescimento e/ou a atividade metabólica de células não infectadas adjacentes, favorecendo a expansão da infecção;

A atividade mitogênica de VGF é considerada benéfica para a replicação do VV.

Citoplasma

Núcleo

EGR-1

c - fos

MEK

ERK 1/2

Magalhães et al, 2001Elk-1

MEK

ERK 1/2

RSK 2A

ndra

de e

t al, 2

00

4

Citoplasma

Núcleo

EGR-1

Andra

de e

t al, 2

00

4

TyK

MEK

ERK

RSK-2

Elk-1

STK

?

?

?

c-jun

JNK

CREB/ATF-1

?

?

TESE DE DOUTORADO

Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento Significado Funcional do Gene de Resposta Precoce ao Crescimento – EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia– EGR-1 – para a Biologia do Orthopoxvirus Vaccinia

Patrícia Nogueira da Gama Silva

+1 c-fos

Citoplasma

Núcleo

estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie

MEK

ERK

PKA

SRF

AP-1SRE CRE

ATF-1

+1 egr-1

SRE

MEK

ERK

TyK

TCFSRF

ELK-1 RSK-2

Citoplasma

Núcleo

VV

A BVV

STK

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie

+1 ???

EBS

Egr-1

Egr-1

C

Citoplasma

Núcleo

+1 ???

AP-1

? JUN

?

?

UO126

+1 c-fos

Citoplasma

Núcleo

estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie

MEK

ERK

PKA

SRF

AP-1SRE CRE

ATF-1

+1 egr-1

SRE

MEK

ERK

TyK

TCFSRF

ELK-1 RSK-2

Citoplasma

Núcleo

VV

A BVV

STK

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie

+1 ???

EBS

Egr-1

Egr-1

C

Citoplasma

Núcleo

+1 ???

AP-1

? JUN

?

?

UO126

+1 c-fos

Citoplasma

Núcleo

estágio precoce (0 -1 hpi)adsorção penetração

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)pós-penetração progênie

MEK

ERK

PKA

SRF

AP-1SRE CRE

ATF-1

+1 egr-1

SRE

MEK

ERK

TyK

TCFSRF

ELK-1 RSK-2

Citoplasma

Núcleo

VV

A BVV

STK

estágio precoce-tardio (1-36 hpi)Pós-penetração progênie

+1 ???

EBS

Egr-1

Egr-1

C

Citoplasma

Núcleo

+1 ???

AP-1

? JUN

?

?

UO126

EGR-1

Rho RacCdc42

Ras

PAK-1PAK-1

Raf

MEK

ERK

?Citoplasma

Núcleo

Rac

PAK-1PAK-1

JNK

MKK4/7

?

ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA ENVOLVIMENTO DA PROTEÍNA QUINASE - PAK1 - DURANTE A QUINASE - PAK1 - DURANTE A

INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS INFECÇÃO CELULAR PELO VÍRUS VACCÍNIAVACCÍNIA

Luciana Garcia AndradeLuciana Garcia Andrade

Projeto de Pesquisa

GDP

PAK-1PAK-1

PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)

GTPRac / Cdc42

Serina-treonina kinase

Dinâmica do Citoesqueleto /

Motilidade Celular Proliferação/Sobrevivência

(MEK/ERK)

Pro-inflamatórios/Estresse

(JNK/SAPK)

PAK-1 PAK-1 (p21-activated kinase - 1)

Domínio Catalítico(aa 255 – 529)

PDB AI

Nck Grb2Rac

Cdc42

G

Domínio Autoinibitório

OBJETIVOSOBJETIVOS

GeralGeral

Analisar a contribuição da serina/treonina quinase PAK1 (p21- activated kinase) na

transmissão dos sinais mitogênicos desencadeados após a infecção de células

de fibroblasto murino A31 pelo vírus vaccínia.

EspecíficosEspecíficos

Gerar clones expressando de maneira estável mutação que confere dominância negativa para a proteína PAK-1;

Verificar se a infecção pelo VV induz a fosforilação de PAK-1, bem como sua cinética de ativação;

Verificar o significado funcional de PAK-1 na multiplicação do vírus vaccínia.

Materiais e Materiais e MétodosMétodos

Células:Células A31 – clone de Balb/3T3

- Obtenção dos clones de PAK-1- Infecção / Expressão protéica

Células VERO - Produção do estoque do VV- Titulação viral

Vírus:Vírus Vaccínia WR (Western Reserve)

- Purificados /Titulados

Vetores:

pcMV6m – WT PAK1

PAK1-WTBam HI

Eco RI

Amp

pcMV6m – DN PAK1

PAK1- K299

RBam HI

Eco RI

Amp

PAK – K299R

Dominante Negativo para PAK-1

Sub-clonagem:

PAK1 – WT KPAK1 – DN R

pcMV6m – WT -PAK1

PAK1-WTBam HI

Eco RI

Amp

pcMV6m – PAK1 – K299R

PAK1- K299

RBam HI

Eco RI

Amp

Transformação bacteriana:

E. coli – DH5

Transformação

LB Agar + AMP

LB Agar + AMP

Amplificação de cópias do plasmídio

LB + AMP

PurificaçãoPequena-escala

Média-escala

Eletroforese em gel de agarose

Purificação do Plasmídio

Transfecção de células A31

pcDNA 3– PAK-WT ou

pcDNA 3– PAK –K299R

Transfecção:

Células A31Células A31

Transfecção

G418

Seleção dos clones

resistentes

Caracterização dos clones resistentes

Células A31 ou ClonesCélulas A31 ou Clones

Carenciadas com 1% de SFB por 12 horas

Infectadas com o VV (MOI de 10,0) por tempos variáveis

Estratégia de TrabalhoEstratégia de Trabalho

Extração de proteínas totais

“Western blot”

Extração de mRNA total

“Northern blot”

Vírus

Titulação

Análise de Multiplicação

Viral

Fenótipo de Placa de Lise

Viral

Reação com o anticorpo primário

Transferência de “Western”

+

-

+-

Bloqueio

Reação com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase

Filme Raio-X

Sistema Revelador

Revelação

Exposição

Pré hibridação

Hibridação com sonda marcada

Revelação

Lavagem

+

- Exposição

Transferência de “Northern”

P-JNK

1 3 4 5 6 7 8 9 102

KDa

4654

M VV M VV M VV M VV M VV

A31 NT WT 6 WT 7 WT 8 WT 9

KDa

46

54

1 3 4 5 62 7 8 9 10

P-JNK Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV Mock VV

A31 NT DN 1 DN 5 DN 6 DN 10

Teste – caracterização dos clones Teste – caracterização dos clones de PAK-1 de PAK-1

Acumulação de EGR-1 induzida pelo VVAcumulação de EGR-1 induzida pelo VV

1 2 3 6 12 24 36 48 1 2 3 6 12 24 30 36 48

MOCK VV (WR) (m.o.i. 3,0)

Egr-1

Tempo (hpi)

ERK-1ERK-2

KDa

80

4442

1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18

VV (WR) (m.o.i. 3,0)

- 10 20 50 100C SFB

1 2 3 4 5 6 7

18S rRNA

egr-1

H7 (M)

Co-participação de diversas vias sinalizadoras Co-participação de diversas vias sinalizadoras associadas com a indução de EGR-1 após associadas com a indução de EGR-1 após

infecção pelo VV infecção pelo VV

MOCK EG

F

VV WR

MEK-DN 3

Egr-1

KDa

80

4442

1 2 3 4 5 6 7

ERK-1ERK-2

8 9 10 11 12 13 14

3 6 12 3 6 12 ½ 3 6 12 3 6 12 ½MOCK E

GF

VV WR

MEK-WT 11

Tempo (horas)

MEK – ERK – EGR-1MEK – ERK – EGR-1

MEK-DN 3MEK-WT10

VV 48 hpi

Controle

MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Fenótipo da Placa de Lise Viral)

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

6 12 24 48

Horas pós-infecção

Tít

ulo

Vir

al (

Lo

g)

MEK-WT10

MEK-DN3

MEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VVMEK/ERK 1/2 é necessária à multiplicação do VV(Análise da Multiplicação Viral)

O Vírus Vaccínia induz a ativação de

proteínas quinases e genes envolvidos

com mitogênese e/ou reprogramação

celular, criando as condições necessárias

à geração eficiente de novas progênies

virais.