Novos Sistemas Terapêuticos

Vantagens dos novos sistemas terapêuticos

 Vectorização do p.a.  Diminuição da dose  Diminuição dos efeitos secundários

Vectorização

 Vectorização Passiva

 Vectorização Activa

Vectores

 Lipossomas

 Nanopartículas

Nanoesferas

Nanocápsulas

Nanopartículas sensíveis a campos magnéticos

Outras partículas

Vectores virais

Vectores de DNA

Terapia génica do sonho à realidade

Terapia génica

Introdução de genes, em células de pacientes, de modo a permitir a modulação ou a correcção de uma doença.

Subs. de genes defeituosos

Gene defeituoso Gene inexistente

Gene viral (infecção)

Inibição RNA m RNA m

Proteínas virais Proteína Subs. proteína Inib. proteína

Tratamento sintomático Sintomas clínicos

Manifestações patológicas Novo virus

 Cura da doença na sua origem, sem efeitos secundários

 Evita as limitações do uso de proteínas na prática clínica (baixa biodisponibilidade, fraca farmacocinética, elevados custos de fabrico)

A promessa da terapia génica

1940 gene e DNA

1960 – descoberta da estrutura do DNA 1972 – 1º splicing de

DNA

1973 – 1º experiências de clonagem (Bayer & Cohen)

1975 – isolamento de DNA Humano

1989- marcação genética

1993- Estudos de Imunoterapia anti-HIV

Terapia Génica – Breve História

Estudo de substituição de gene ADA

14 Setembro 1990 Ashanto Desilva

4 anos Imunodeficiência severa combinada

Adenosina desaminase - função adequada do sistema autoimune Vulnerável a infecções

TERAPIA GÈNICA - NIH

Criança com vida normal - 15 anos

Realidade   Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo

celular   Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de

material genético   Estável na corrente sanguínea   Entrega eficiente do material genético às células

Mas

 Necessário o conhecimento profundo das doenças

 Descoberta do genoma humano - identificação de genes causadores de doenças

ESTRATÉGIA ADEQUADA

Estratégia utilizadas em terapia génica somática

 O conceito original - substituição de genes defeituosos ou introdução de genes inexistentes

Limitada a doenças causadas por um só gene Patologia Gene defeituoso ou inexistente Tecido/célula alvo Fibrose quística - CFTR (gene regulador da condutância transmembranar) Tracto respiratório Anemia de Fanconi (Complementação do grupo C) Células hematopoiéticas SCID (Adenosino desamoinase - ADA) Linfócitos

Estratégias utilizadas em terapia génica somática

 Uso de genes marcadores - inserção de genes não residentes - monitorização (linfócitos de infiltração tumoral, transplantes de medula ossea em doentes com

leucemia); evolução de uma patologia (monitorizar o desenvolvimento de metástases)

 Utilização de genes “terapêuticos”  Proteínas farmacológicas  genes “suicidas”

 Genes que codificam a expressão de proteínas farmacologicamente activas (citoquinas, hormonas ou enzimas deficitárias)   IL-2 ou factor de necrose tumoral ⇒ resposta

imunológica a tumores  Produção de insulina, factor de coagulação IX ..

em órgãos não fisiológicos  Produção sistémica de moléculas solúveis de

CD4

  Inserção de genes “suicidas”

 Terapia antiviral e antitumoral   Inserção do gene codificador da cadeia A da

toxina diftérica controlado pelo promotor do HIV-1

 Timidina - quinase do vírus Herpes simplex (HSV-Tk) - permite a bifosfatação do ganciclovir com inibição da síntese do ADN

 Citosino-desaminase. Permite a conversão do 5-fluorcitosina em 5-fluoruracilo

(activação dos genes suicidas depende de promotores específicos das células tumorais)

 O uso de oligonucleótidos “antisense”

Formação de estruturas do tipo triplex

 O uso de oligonucleótidos “antisense”   Por bloqueamento da acção dos pliceossomas   Por ligação complementar do oligonucleótido

“antisense” a uma fracção do ARNm

 O uso de ribozimas

Condicionantes subjacentes à aplicação da terapia génica

Condicionantes genéticas Profundo conhecimento da doença Mecanismos de controlo da expressão génica Técnicas e processos que possibilitem o transporte e cedência intracelular de material genético

Moléculas de ARN capases de promover a clivagem específica de outras moléculas de ARN

Transporte e cedência intracelular de material genético   Propriedades fisico-químicas do material

genético n Macromoléculas hidrofílicas n Elevado peso molecular n Carga superficial negativa

n Alteração da biodisponibilidade (nucleases) n  Internalização e tráfego intracelular n Translocação para o núcleo

 Modificações químicas

MAS

N

NH

O

H3C

OOO

P

XO

O

{O - FosfodiesterS - FosforotioatoCH3 - Metilfosfanato

X

Propriedades fosfodiester metilfosfonato fosforotioato

Estabilidade biológica -- +++ ++

Uptake celular + ++ +/-

Eficácia de hibridização +++ + ++

Activação da RNase H +++ -- +++

• Plasmídeos bacterianos

• Injecção intramuscular • Microinjecção directa • Introdução forçada de partículas • Electroporação • Coprecipitação de partículas

 Vectores de tipo viral - aprender com a natureza

LTR LTRGene terapêutico

Vector retroviralLTR LTRgag pol env

psi-

gag

polenv

Vector construtor

4 Integração noADN hospedeiro

produto genético

3 Infecção das células alvo

2 Formação de partículas virais

Partículas virais recombinantes

1 Transdução do vector viral

Retrovírus: RNA ⇒ transcriptase reversa ⇒ DNA

Falta de especificidade Tradução impossível em células que não se dividem Possibilidade de assumir a forma infecciosa Genes de pequenas dimensões Integração ao acaso ⇒ pró-oncogenes

 Adenovírus: ADN •  Infectam todas as células •  Mutagenese limitada e menor patogenicidade •  Transporte de material genético de grandes

dimensões Expressão transiente Imunogenicidade - administração repetida limitada

O CASO DO PACIENTE 18 University of Pensylnani´s Institute for Human Gene Therapy

Jesse Gelsinger 18 anos Ensaio clínico fase 1

Morte Adenovirus ⇒ ornitina transcarbamilase

Metabolização deficiente do nitrogénio existente nos alimentos

Resposta do Sistema Imunitário ARDS - Síndrome de stress respiratório no adulto

Privação de oxigénio - morte por asfixia

 Vectores do tipo não viral  Polímeros catiónicos  Nanopartículas  Lipossomas

Porquê transportadores positivos?

Condensação do material genético por anulação das

cargas positivas

MAS

Necessária libertação para ser activo

In vivo

 Administração de lipoplexos na veia da cauda

Cauda Coração

Sistema capilar do pulmão Coração

Sistema capilar do coração Figado

Orgão (tumores)

1ª Barreira - circulação sanguínea   Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo

celular   Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de

material genético   Estável na corrente sanguínea   Entrega eficiente do material genético às células

Distribuição dos lipoplexos na presença de PEG

Ligação específica

Terapia génica Estratégia terapêutica promissora para cura de

doenças