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Novas Perspectivas em Imunohematologia EritrocitriaIII Jornada Brasileira de Hemoterapia Campo Grande, 19 e 20/09/2008
Lilian Castilho, PhD
HemaglutinaoMistura de hemcias lavadas com anticorpos anti-eritrocitrios especficos (monoclonal ou policlonal) Algumas especifidades no disponveis ou limitadas Teste com mais de 100 anos (Karl Landsteiner 1901, Nobel Laureate) A rotina de sorologia de grupos sanguneos dirigida para a deteco dos antgenos de grupos sanguneos clinicamente significantes: ABO, RH, KEL, FY, JK e MNS
sta Aloimunizao detectada pela PAI e compatibilidade entre receptor e metodologia possibilitou o desenvolvimento doador a prtica da medicina transfusional durante o sculo XX
Limitae s Falta de reagentes policlonais e monoclonais: Dificuldades na fenotipagem de doadores e pacientes
Hemaglutinao
Caracterizao dos reagentes de hemcias utilizados na deteco e identificao de anticorpos
Variabilidade de reatividade dos anticorpos monoclonais quando comparados com os policlonais Fraca reatividade de anticorpos clinicamente significantes Falta de um mtodo nico (universal) para deteco e identificao de anticorpos Subjetividade na realizao, leitura e interpretao dos resultados
Hemaglutinao Limitae s
Dificuldades na: fenotipagem de pacientes politransfundidos fenotipagem de hemcias cobertas com IgG identificao de ags variantes identificao de ags de baixa e alta frequncia
Hemaglutinao Limitae s
O que fazer!
Hemaglutinao Limitae sD homozigoto ou heterozigoto?
A R1r ou R1R0?
Hemaglutinao Limitae sD fraco ou D parcial?
HemaglutinaoLimitaes: Reagentes de hemcias Dificuldade na incluso de clulas homozigotas Limite na incluso e excluso de aloanticorposdevido a falhas nos painis de hemcias para os ags D, C, c, E, e, Fya, Jka, S e ags de baixa incidncia nos reagentes de triagem
Controle de qualidade de reagentes de hemcias(determinao de zigozidade para D, Fya, Fyb)
Fenotipagem de grupos sanguneosLimitaes Testes e incluso de dados so trabalhosos Nmeros de doadores que podemos fenotiparProver sangue antgeno-negativo para pacientes com o anticorpo correspondente Prover sangue fentipo compatvel para pacientes politransfundidos (ex: falciformes)
O especialista da medicina transfusional do futuro ter a sua disposio tcnicas moleculares para identificar gentipos eritrocitrios Jeff McCullough Transfusion 2003,43:823-28, Editorial
Zoom no DNA
Genotipagem!!!Resultados seguros nas situaes em que a hemaglutinao limitada
Antgenos de grupos sanguneos: produtos de genes antgenos carreados em protenas so codificados diretamente pelos genes antgenos carboidratos esto sob o controle de genes que codificam glicosiltransferases 28/29 genes identificados polimorfismos de GS definidos ao nvel gentico anlise molecular dos genes de GS pode ser til na clnica entendimento das bases moleculares de GS permitiu explorar suas funes
Aplicaes dos testes moleculares em doadores desangue Genotipagem em larga escala para identificao de antgenos comuns e raros Produo de painis de hemcias complementares Zigozidade D, Fya, Fyb : controle de qualidade de reagentes Determinao de variantes Rh (D fraco, Del, evar ) Prover sangue antgeno-negativo para pacientes com aloanticorpos (ex falciformes)
Aplicaes dos testes moleculares na medicina transfusional Suporte transfusional de pacientes politransfundidos ou aloimunizados reduzindo ou prevenindo a alomunizao Suporte transfusional de pacientes com teste direto da AGH positivo
Identificao de fentipos raros Identificao de variantes Rh que apresentam risco de aloimunizao Confirmao do gentipo quando um antgeno fracamente expresso Resoluo de discrepncias ABO, RhD
Aplicaes dos testes moleculares na medicina materno-fetalMe possui anticorpo IgG clinicamente significante Pai heterozigoto para o gene que codifica o antgeno de interesse, ou desconhecido Genotipagem fetal (plasma materno)
Aplicaes dos testes moleculares no controle de qualidade de reagentes de hemciasFentipo A D+ Fy(a+b) Fy(ab+) Provvel Gentipo AA, AO RHD/RHD or RHD/ FY*A/FY*A or FY*A/FY or FY*A/FY*X FY*B/FY*B or FY*B/FY or FY*B/FY*X
Testes moleculares utilizados na determinao de alelos de grupos sanguneos
Testes moleculares para anlise de genes de grupos sanguneos Amplificao do DNA por PCR PCR-RFLP PCR-alelo-especifico PCR-multiplex
Clonagem e sequenciamento Real time PCR Mtodos automticos Microarray
Genotipagem de grupos sanguneosTcnicas atualmente empregadas so trabalhosas e demoradasAS-PCR e PCR-RFLP requerem
trabalho manual anlise por electroforese (gel de agarose, poliacrilamida) Repeties Diferentes ensaios para a mesma amostraPCR Real-Time fornece anlise em tubo fechado
trabalho manual
Perspectivas: Microarray
Transfusion Maio 2005
Vol 45
DNA array-Chips O que um chip de DNA? (um chip uma matrix) Informtica: armazena uma lista de dados ordenados Biologia: Armazena um grupo de molculas DNA ordenadas (PCR, oligonucleotdeos...) em uma superfficie slida (vidro, nylon, lminas de slica)
DNA array-Chips Produo Oligos colocados em uma superfcie de vidro (50-100 micras, 0.2-0.5 nL) Milhares de sequncias possvel criar novos arranjos em semanas/meses
Perspectivas: Microarray DNA array -Chips
Perspectivas: Microarray DNA array -Chips Grande nmero de amostras (boa plataforma para doadores de sangue) PCR multiplex Anlise ps-PCR rpida, automtica para numerosos polimorfismos de grupos sanguneos Sistema fechado para prevenir contaminao Anlise computadorizada dos resultados Download direto das interpretaes para a base de dados
DNA array -BLOODchip
Sondas de oligonucleotideos em lminas de vidro (Progenika) ABO, Rh (Cc, D, Ee) Kell, Jk, Fy, Di, Do, Co, MNSs
Protocolo BloodChipag agc c ac actgctgct ta acg cg tc tca ag gc ct t1500bp
MPX II (outros) Cy5 dCTP (MNS; RHCE , DO, KEL, CO, JK, DI, FY)
RHD positivo
DNA Ladder
DNA Ladder
MPX I (ABO e RHD) biotina dUTP
RHD negativo
Controle Negativo PCR c
t gc ct tca ag cg gtc cta tac ctg tgc agagc acac
1000bp 800bp 600bp 500bp 400bp 300bp 250bp 200bp
RHD exon 2 1315bp RHD exon 7 731bp RHD exon 9 525bp RHD exon 8 498bp RHD exon 5 470bp ABO exon 7B 461bp RHD exon 1 415bp ABO exon 6 410bp RHD exon 6 407bp ABO exon 7A 371bp RHD exon 10 360bp RHD exon 4 317bp RHD exon 3 304bp ABO exon 2 217bp ABO exon 4 151bp
Protocolo BloodChip
MPX I (ABO and RHD) Streptavidin Cy3 MPX II (outros) Cy5 dCTP l mutante heterozigoto normal
ABO phenotype of O1vO1v
Anlise dos dados: BloodChip
DNA array -BeadChip Genotipagem para: C/c, E/e, Kk, MNSs, Jka /Jkb, Fya/Fyb, Dia/Dib, Coa/Cob, Lwa/Lwb, Sc1/Sc2, Lua/Lub Doa/Dob, Hy, Joa, Hgb S Custo competitivo
T M
BioArray Solutions Ltd
Construindo BeadChips...Bead Functionalization
BioArray Solutions Ltd
4,000 ENCODED BEADS
Bead Synthesis & Encoding
Pooling Array Assembly
BeadChip Wafer
0.3 mm
BeadChipTM -ProtocoloBioArray Solutions LtdgDNA
2:00 hP
P
+
1: AMPLIFICAOPrimers
m-PCR
OH
OH OH
P
2: SELEO DA FITAREMOO DE PRIMERS E dNTPs
1:30 h
DIGESTION OF P-STRAND
ssDNADNA POLYMERASE + dNTPs + labeled dNTP
3: eMAPTARGET
ANNEALING E EXTENSO
0:30 h
PROBE
CUSTOM BEADCHIP
4: AQUISIO IMAGEM E ANLISE
1:00 h96 amostras
Discriminao por extenso do alelo-especficoAssay ImageMATCH T G C T A A C G A T MISMATCH A C G X A C G T T C T A T C A A G A T GeMAP
DNA Polymerase
G C T A T A C G T A A T G
Aquisio da imagem
BioArray Solutions Ltd
Decoding Image
Automated Snapshot Array Imaging
Assay Image
Anlise dos dados:GentiposAnlise do chip
BioArray Solutions Ltd
Anlise do DNA (para cada par de sondas)
SNP = FY - GATA ( FY - 33T>C )
AA
" AB
" BB
BioArray Solutions Ltd
Anlise dos dados:FentiposSilencing FY Doa Coa Lub Fyb Lua Fya Sc1 Sc2 Jkb Jka Dib Dia Hy C h ip N a m e S a m p le W a rn M sg Fyx[Fy(b+w) 1 HgbS Jo(a) LWb LWa Dob Cob Cm m nt M C K N + + + + + E S + c e k s + + + + + + + +
H E A 0 4 96 1 _ 1 H E A 0 4 96 1 _ 2 H E A 0 4 96 1 _ 3 H E A 0 4 96 1 _ 4 H E A 0 4 96 1 _ 5 H E A 0 4 96 1 _ 6 H E A 0 4 96 1 _ 7 H E A 0 4 96 1 _ 8
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
+ + + + + -
+ + +
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-
+ -
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+ -
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-
-
1 No
- No No + 1 No 2
2 No
- ++ 1 No - No No + 2 No
Uma vez que se tenha kits adequados para genotipagem de pacientes e doadores de sangue, ser possvel realizar a busca eletrnica da unidade de sangue compatvel disponvel no estoque do banco de sangue David Anstee Transfusion 2005,45:650-53, Editorial
Busca de unidades compatveis para pacientes falciformesDUFFY GATA FY265 DO-793 DO-350 DO323 KELL KIDD GPB GPA LU
14 Pacientes AA AB BB 288 Doadore s AA AB BB
0 5 9
2 4 8
14 0 0
1 8 5
12 2 0
14 0 0
0 1 13
5 6 3
2 4 8
7 4 3
0 1 13
46 88 154
69 81 138
284 4 0
41 153 94
284 4 0
286 2 0
04
92 156 40
58 88 142
135 92 61
0 7 28 1
284
Gentipos para 20 SNPs obtidos em 5 hs
Fentipos deduzidos de gentipos de doadores compatveis com os pacientes falciformesFentipo ABO/Rh Fentipo deduzido do gentipo Pacientes falciformes Doadores de sangue
O R0r O R0r O R0r B R0r O R2r B R2r O R1r O R1r A R1r O R2R2 O R1R2 O rr
Fy(a-), Do(a-) S-, K-, Jk(b-) Fy(a-), S-, K-, Jk(b-) Fy(a-), Do(a-), KS-, K-, Jk(a-), S-, K-, Jk(b-) Do(a-), KDo(a-), s-, K-, Jk(b-) Do(a-), K-, Jk(b-) S-, KDo(a-), s-, K-, Jk(b-) S-, K-, Jk(b-) K-
2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5 3 6 3 4 2 5 4 2 0 2 2
Total
14
38 / 288
Alelos raros encontrados em doadoresDNA arrayGentipos KEL*1/1 GYPB* S-sFY*A/B (265) LU*A/B LU*A/A CO*A/B GYPB* S-sHY 323 T JO 350 T DI*A/B DI*A/A Total Fentipos deduzidos Kk+ SsU Fy(a+bx) Lu(a+b+) Lu(a+b) Co(a+b+) S-s-Uvar HyJo(a) Di(a+b+) Di(a+b) Doadores 1 5 6 6 3 8 2 2 3 9 1 46/1000(4.6%)
Resultados de genotipagem na clnica Caso Clnico-Histrico Paciente feminina descendente de Asiticos, 56 anos 4 gestaes, transfuses prvias? Paciente em dilise, agendada para cirurgia Solicitado 2 unidades de sangue PAI positiva 2+ em AGH Painel positivo 2+ em AGH com todas as clulas, negativo com DTT Autocontrole negativo
Resultados de genotipagem na clnica Caso Clnico-GenotipagemSilencing FYChipName Sample WarnMsg
Fyx[Fy(b+w)No No 1
HgbS
Jo(a)
LWb
LWa
Dob
Cob
Doa
Lub
Coa
Fyb
Lua
Sc1
Sc2
Fya
Jkb
Jka
Dib
Dia
Hy
Cmmnt
M
C
K
N
E
S+
c
e
k
HEA04961_1 HEA04961_2 HEA04961_3 HEA04961_4 HEA04961_5
A1 A2 A3 A4 A5
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+ -
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s+ + + + +
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1
No No 1 2
+
Fentipo da paciente: O, Ro, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a+b-), M+N-S-s+, Lu(ab+), Do(a-b+), Hy+, Jo(a+), Di(a+b-), Co(a+b-), Sc1,-2 b
Paciente com anti-Di
Confirmao sorolgica em gel com
Caso Clnico: Concluso24 polimorfismos de grupos sanguneos em 5hs Identificao de fentipo raro Soros raros preservados Menor custo se comparado ao testes sorolgicos: adsoro, eluio, enzimas, qumicos, fenotipagem)
Tecnologia Microarray permiteResolver problemas complexos Fornecer unidades de sangue compatveis Encontrar doadores raros Melhorar a qualidade e segurana transfusionalTecnologia Microarray: potencial para mudar a prtica na medicina transfusional
O fim da sorologia est prximo?
Um gentipo no um fentipo Genotipagem molecular para o complexo RH nem todos os alelos ainda descritos Validao e ensaios clnicos com os chips levaro tempo para assegurar a confiabilidade da genotipagem de grupos sanguneos em larga escala Interpretao de um grupo ABO incorreta pode ser desastrosa Novas mutaes com genes de grupos sanguneos continuaro a surgir e, podem ser necessrias atualizaes dos chips
Um sculo de descobertas: Como ser o novo sculo?2005 Anlise de grupos sanguneos por microarray
Concluso Sorologia continuar por um bom tempo (?): ABO Genotipagem um mtodo seguro e pode ser aplicado para determinao de grupos sanguneos Plataformas com mltiplos testes podem ser utilizadas para pesquisa e diagnstico Genotipagem em larga escala pode trazer benefcios para o doador e paciente se adequadamente aplicada
O Futuro: plataforma que pode permitir que cada indivduo tenha seu gentipo de grupos sanguneos, HLA e HPA definidos rapidamente ao nascimento (esta informao acompanhar o indivduo ao longo da vida)
Obrigado pela ateno!