Post on 14-Mar-2020
Manipulação genética em
modelos animais
Antes da biologia molecular aplicada a genética:
-Modelos animais = mutações espontâneas
-Transmitidas para descendentes
-Identificar defeitos genéticos de interesse
Com os avanços das técnicas de biologia molecular e celular e da engenharia genética:
novas metodologias passaram a ser empregadas e tornou-se possível a manipulação do
DNA bem como a alteração controlada do genoma
Animais transgênicos
•O termo transgênico: engloba animais que tiveram genes adicionados
(transgênicos por adição), modificados (knockin) ou retirados (knockout).
•As técnicas para a geração de modelos transgênicos representavam uma
das mais promissoras biotecnologias tanto para fins comerciais como para
diversas áreas da pesquisa básica
•Os primeiros animais transgênicos knockout, produzidos pela técnica de
recombinação homóloga em células tronco só foram gerados em 1987
por dois grupos diferentes (Doetschmann e cols, 1987; Thomas e
Capecchi, 1987)
Mario R. Capecchi, Ph.D., of the University
of Utah, has won the 2007 Nobel Prize in
Physiology or Medicine
animais transgênicos
•Diferentes espécies como boi, porco, ovelha, coelho, rato e
camundongo , etc...
Camundongos:
•menor tamanho,
•custo de manutenção reduzido,
•embriões de boa qualidade para manipulação,
•além de ser uma das poucas espécies cuja manutenção de células
tronco indiferenciadas em cultura é viável, o que possibilita a retirada de
genes por recombinação homóloga e geração de modelos knockout
Em pesquisa biomédica, na criação de modelos animais de doenças
humanas, entre elas,
•doenças cardiovasculares,
•auto-imunes e neurológicas,
•AIDS
• câncer
•Tais modelos animais permitem o exame detalhado da fisiopatologia
da doença, além de servirem para delinear novas formas de
tratamento, desenvolvimento de testes diagnósticos, agentes
terapêuticos inovadores e em terapia gênica
Camundongos transgênicos
Importância:
Camundongo transgênicoPor adição
Camundongos knockout
Camundongos knockout
Step 1. Isolate developing embryo at blastocyst stage. This embryo is from a strain of mice with gray or white fur.
Step 2. Remove embryonic stem cells from gray or white-fur blastocyst. Grow stem cells in tissue culture.
(C57Bl6 albino)
Células embrionarias: 129
Recombinação homologaneomicina
Timidina kinase
Timidina kinase
Não vive na presença de
ganciclovir
+ neomycin + gancyclovir
Step 3. Transfect stem cells with homologous recombination construct. Select for homologous recombination by growing stem cells in neomycin and gancyclvir.
Step 4. Remove homologously recombined
stem cells from petri dish and inject into a new
blastocyst that would have only white fur.
Step 5. Implant several chimeric blastocysts into pseudo-pregnant, white or black fur mouse.(C57Bl6)
Step 6. Mother will give birth to a range of mice. Some will be normal white fur mice but others will be chimeric mice. Chimeric mice have many of their cells from the original white fur blastocyst but some of their cells will be derived from recombinant stem cells. Fur cells from recombinant stem cells produce gray patches which are easily detected.
Step 7. Mate the chimeric mice with wild-type white fur mice. If the gonads of the chimeric mice were derived from recombinant stem cells, all the offspring will have gray fur. Every cell in gray mice are heterozygous for the homologous recombination.
Step 8. Mate heterozygous gray mice (+/ H) and genotpye the gray offspring. Identify homozygous recombinants (H / H) and breed them to produce a strain of mice with both alleles knocked out. The pure breeding mouse strain is a "knockout mouse".
knockout mouse
Step in the Process Responsibility Timeframe
1. Wait for transfection avaliability: 1-2 weeks
2. Transfection, picking, expanding, freezing:
CORE 4 weeks
3. Screening: Investigator 1 month max
4. Expanding homologous recombinant clones:
CORE 3 weeks
5. Reconfirmation: Investigator 2 weeks
6. Karyotype: CORE 2-3 weeks
7. Blastocyst injection: CORE 1-2 weeks
8. Transfer chimeric mice after blastocyst injection:
CORE 5 weeks
9. Breeding for germline transmission: Investigator 1-6 months
10. Breeding to homozygosity: Investigator 2-3 months
Reasonable expectation: 1 year
A Timeline for Knockouts after DNA is provided to Core
green fluorescent protein
GFP
Vitor – 1o camundongo transgênico pela microinjeção pronuclear
UNIFESP-2001 - hipertenso
Outros modelos
Pink e cérebro
“Vamos conquistar o mundo”
Obrigado!!!