Post on 12-Feb-2015
Análise Instrumental Avançada
Espectroscopia de Infravermelho Espectrometria de Massas
Profa. Dra. Sonia A. Andrade Chudzinski
Prof. Dr. Erick Polleti
Espectroscopia de Infravermelho e Espectrometria de Massa
Objetivos:
• Ensaio de composição • Qualidade do produto final • Pesquisa e desenvolvimento de novos produtos • Instrumentação
Conteúdo Programático - IV
• Introdução à técnica/aplicações• Teoria da espectrometria de absorção na região do
Infravermelho.• Modos de vibração e deformação• Interações acopladas.• Ligação de hidrogênio.• Instrumentação• Preparação de amostras.• Interpretação de espectros.
Conteúdo Programático - MS
• Espectroscopia de massas/Aplicação• Introdução à técnica.• Teoria da espectrometria de massas.• O espectro de massa e interferências• Determinação da fórmula molecular.• Reconhecimento de picos.• Padrões de fragmentação • Preparação de amostras.• Interpretação de espectros.
Metodologia
• Aulas expositivas.
• Estudo de artigos científicos que utilizam as técnicas estudadas.
• Interpretação de espectros.
• Resolução de problemas.
• Visita a um laboratório de Pesquisa nessas áreas.
Cronograma
• 13/08 - Princípios e Aplicações de MS• 20/08 – Aula Prática MS• 27/08 - Princípios e Aplicações/Exercícios sobre MS• 03/09 -Princípios e Aplicações de IR• 10/09 – Prática IR• 17/09 -Princípios e Aplicações/Exercícios sobre IR• 24/09 -Avaliação Teórica/prática• 01/10 -Resultados Avaliação e Revisão/Discussão de artigos
• Técnica analítica, utilizada para identificar e quantificar compostos conhecidos e elucidar a estrutura e a propriedade química de moléculas
Espectrometria de Massa
• Aplicações:
• Detectar e identificar o uso de substancias por atletas
Análises judiciais (abuso de drogas)• Determinar como as drogas são metabolizadas pelo corpo• Monitorar a respiração de pacientes por anestesistas durante a
cirurgia• Diagnóstico de Cancer o outras doenças• Biotecnologia: Proteomica• Monitorar processos industriais• Análise de poluentes
Espectrometro de massas
É um instrumento que separa íons, positivos ou negativos, produzidos a partir de átomos ou moléculas de acordo com a
razão massa/carga (m/q)
•Vaporização da amostra (amostras voláteis/termolábeis)
• Ionização da fase gasosa (bombardeamento com feixe de elétrons)Ex: C6H5CH2CH3 + e- C6H5CH2CH3
+ + 2 e- (etilbenzeno) (íon molecular)
•Relaxação/fragmentação
•C6H5CH2+ / atraídos por uma fenda/selecionados
•Separação dos íons de acordo com massa/carga(m/z)
Mecanismo
Espectro de massa - Etilbenzeno
Pico base – tem arbitrariamente o valor de intensidade 100
Como funciona? Existem diversos modelos de espectrômetros que diferem quanto à fonte de ionização ou quanto ao analisador de massas
Componentes básicos de um espectrômetro
Ionizador• MALDI• Electrospray (ESI)
Amostra
+_
Analisador de Massa• Tempo de vôo (TOF)• Quadrupolo• Ion-Trap
Detector
Espectrometria de Massas
Métodos de Ionização
• O ponto de partida para uma análise por espectrometria de massa é a formação de íons gasosos do analito.
•O espectro de massa de uma certa espécie molecular é altamente dependente do método usado para a formação dos íons.
•Fontes de íons:
Tipo Básico Nome Agente Ionizante
Fase gasosa Impacto de elétrons (EI) Elétrons energéticos
Ionização Química (CI) Íons gasosos reativos
Ionização por campo (FI) Eletrodo com alto potencial
Dessorção Dessorção por campo (FD) Eletrodo com alto potencial
Ionização por eletronebulização (ESI) Campo elétrico elevado
Dessorção/ionização com laser auxiliada por matriz (MALDI)
Feixe de laser
Bombardeio com átomos rápidos (FAB) Feixe atômico energético
Espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)
Feixe de íons energéticos
Ionização por termonebulização Alta temperatura
Fontes de íons para a Espectrometria de Massa Molecular
Impacto de Electrons
H-C:HH
H+ e H-C
H
HH + 2e
CATION
CH4
H-CH
HH
H-CH
H+ + H
H-CH
HH++
CATIONRADICALClivagem -Ligação
Um elétron de alta energia pode retirar um elétron da ligação, criando um radical cátion (Um íon positivo com e- desemparelhado).
Espectro de Massa
100%
50%
43
58
71114
m/e
ion molecular
Isótopos picos - P+1, P+2, etc
note: 114-71 = 43
note: 43 = massa do radical
Pico base – 100%100%
50%
43
58
71114
m/e
Tipo Básico Nome e Acrônimo Agente Ionizante
Fase gasosa Impacto de elétrons (EI) Elétrons energéticos
Ionização Química (CI) Íons gasosos reativos
Ionização por campo (FI) Eletrodo com alto potencial
Dessorção Dessorção por campo (FD) Eletrodo com alto potencial
Ionização por eletronebulização (ESI) Campo elétrico elevado
Dessorção/ionização com laser auxiliada por matriz (MALDI)
Feixe de laser
Bombardeio com átomos rápidos (FAB) Feixe atômico energético
Espectrometria de massa de íons secundários (SIMS)
Feixe de íons energéticos
Ionização por termonebulização Alta temperatura
Fontes de íons para a Espectrometria de Massa Molecular
ESI (Electrospray ionization)
Gás nebulizador N2 Análise massa
+ 3.500 V
Eletrodo
IONIZAÇÃO
ESI (Electrospray ionization)
http://www.youtube.com/watch?v=K-GhE1uWoV4
• As amostras são embebidas em uma matrix
• A ionização ocorre através da emissão de um laser
MALDI (Matrix laser assisted desorption/ionization) - Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser
Matrix (uv absorbing)cyano-4-hydroxy cinnamic acid
peptídeo
Placa MALDI
Placa
espelho
LASER
++
++
++
++
+
+
- ve
- ve
MALDI
Analisadores de Massas
Detector
Quadrupolo
AmostraVoltagens
Íon ressonante
Íon não ressonante
QUADRUPOLO• Seleciona determinadas m/z
http://www.youtube.com/watch?v=8AQaFdI1Yow
Analisador de massa
TOF ( Time of Flight) – “Tempo de vôo”
+
++
++
+
++ +
Íons - amostra Detector
Distância fixa
Mais leveMais pesado
Tempo de vôo menor
Tempo de vôo maior
Ìons com a mesma energia cinética Vácuo
Analisador de massa
Espectro de massa - Etilbenzeno
Pico base – tem arbitrariamente o valor de intensidade 100
Espectrometria de Massas em tandem – MS/MS
Célula de colisão: o íon 237 é fragmentado em íons menores
Íons selecionados passam pelo MS-2
Detecção
• Analisadores de massa são conectados em série
• Ideal para amostras complexas (maior sensibilidade)
• Fragmentação de peptídeos – Célula de Colisão (Gás Argônio)
MS-1
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. MS1 é uma fonte de íons para MS2.
MS2
MS1Cromatografia líquida : íons totais
Quadrupole-Time Of Flight Mass Spectrometry (Q-TOF MS)
Quadrupolo(MS1)
Célula de colisão
Argon
detector
Aceleração - TOF
(MS2)
Dr Kevin MillsInstitute of Child Health, UCL, London
Espectrometria de Massas em tandem – MS/MS
Digestão enzimática
MS1
Fracionamentocromatografia
Seleção do íon precursor
Espectrometria de Massas em tandem – MS/MSPrimeira Espectrometria de
Massa (MS-1)
Seleção do íon precursor
+ fragmentação
MS/MS
Segunda Espectrometria de Massa
• Pares de íons : complementariedade de sequência
a/xb/yc/z
Fragmentação de Peptídeos
Dependendo no tipo de quebra que ocorre (tipo de ligação que é quebrada), tem-se a produção de determinados íons:
• Íons C terminal : a, b, c• Íons N terminal: x, y, z
íons resultantes da quebra das ligações peptídicas !
Fragmentação de Peptídeos
• As ligações peptídicas são as menos energéticas, assim espera-se que a formação do par de fragmentos b/y seja mais frequente que os demais pares de fragmentos
íon yíon b
• Devido às diferenças na força das ligações, diferentes íons ocorrem em diferentes proporções
MW ion ion MW
88 b1 S GFLEEDELK y9 1080
145 b2 SG FLEEDELK y8 1022
292 b3 SGF LEEDELK y7 875
405 b4 SGFL EEDELK y6 762
534 b5 SGFLE EDELK y5 633
663 b6 SGFLEE DELK y4 504
778 b7 SGFLEED ELK y3 389
907 b8 SGFLEEDE LK y2 260
1020 b9 SGFLEEDEL K y1 147
Peptídeo: S-G-F-L-E-E-D-E-L-K
Fragmentação de Peptídeos
100
0250 500 750 1000
m/z
% I
nte
nsit
y
K1166
L1020
E907
D778
E663
E534
L405
F292
G145
S88 b ions
147260389504633762875102210801166 y ions
Fragmentação de Peptídeos
37
100
0250 500 750 1000
m/z
% I
nte
nsit
y
K1166
L1020
E907
D778
E663
E534
L405
F292
G145
S88 b ions
147260389504633762875102210801166 y ions
y7
y2 y3 y4
y5
y8 y9
b3
b5 b6 b7b8 b9
b4
y6
Fragmentação de Peptídeos
A E P T I R
M/z
Inte
nsity
A E P
A
A E
A E P T
72.0201.1
298.1399.2
Íons fragmentados
Determinação da sequência
• Analisa o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos
M/z
Inte
nsity
A E P T I R
72.0 129.0 97.0 101.0 113.1 174.1
A-0 AE-A AEP-AE
AEPT-AEP
AEPTI-AEPT
AEPTIR-AEPTI
Workflow para análise MS/MS
• Não utiliza Gel
•Combinação da cromatografia líquida com a espectrometria de massas
• Ideal para misturas complexas de proteínas
• Identificação de proteínas básicas
• Identificação de proteínas de baixa expressão
• A mistura de proteínas é digerida e separada por cromatografia líquida seguida da identificação dos peptídeos através da MS/MS
• Envolve uma série de processos de separação de misturas.
• A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.
Mixtura de Peptídeos
Separação dos
peptídeos
Conc
entr
ação
de
elue
nte
UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatogragphy)
acoplado ao espectrômetro de massa (Q-TOF)
- alta pressão
- microcapilares
Proteômica Shotgun
• Cromatrografia ligada em série com espectrômetro
Cromatografia Líquida ligada em série com o espectrômetro de massa
Melhor separação
A) Coluna usada na cromatografia tradicional (HPLC)
B) Microcapilar usada em UPLC
A
B
Combinações de colunas com fases estacionárias diferentes: troca catiônica / hidrofóbica
ou
troca aniônica / hidrofóbica
Digestão Troca iônica
SCX RP
Fase reversa
2D-LC
Espectrometria de massas
• Cromatografia Multidimensional (2D-LC) - MudPit
Cromatografia Líquida ligada em série com o espectrômetro de massa
•Cromatografia Multidimensional
• As colunas são acopladas ortogonalmente
• Frações da primeira coluna são seletivamente transferidas para a segunda coluna para uma separação adicional
Análise dos dados - Bioinformática
Proteína Peptídeos proteolíticos Espectro de massa
Espectro de massa Teórico
Peptídeos proteolíticos teóricos
Sequência da proteína
As proteínas devem ser completamente solubilizadas e desnaturadas
Solubilização:
• Quebra das interações (interações não covalentes e pontes dissulfeto)
• Prevenir a degradação de proteínas
• Reduzir componentes não protéicos
• Agentes redutores
• Agentes Caotrópicos
• Detergentes
Paba et al (2003) Proteomics.
Uréia + Tiouréia : melhor solubilização!
Preparação da Amostra
• Remoção de sais
- Interferem diretamente no processo eletroforético
- Causam zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuição do campo elétrico.
- Nessa zonas, as proteínas não focalizam e aparecem como faixas
Separação das Proteínas
Gel 2DGel 1D Cromatografia líquida
Determinação de Massas para identificação
Gel SDS-PAGE (Poliacrilamida Gel Electrophoresis)
• β-mercaptoetanol, DTT, SDS e calor para desnaturação
Calor, agente redutor e SDSSDS : detergente fortemente
aniônico (confere carga negativa às proteínas)
+
-
Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem gel, somente tampão).
Assim, quando em um gel de poliacrilamida, estas proteínas podem ser separadas por peso molecular
O que tem de especial o SDS??
A velocidade de migração em campo elétrico depende da dimensão, forma e carga das
moléculas.
SDS: - romper as estruturas secundárias e terciárias das proteínas
- confere carga negativa
Bandas bem definidas Bandas não definidas
Boa estratégia para comprovar qualidade da extração de proteínas!
Gel SDS-PAGE: unidimensional (1D)
Eletroforese bidimensional (2D)
• Análise simultânea de até 5.000 proteínas
• Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes
• Primeira dimensão: separação pelo pI de cada proteína (Focalização isoelétrica)
• Segunda dimensão: separação pelo peso molecular de cada proteína (SDS-PAGE)
Proteínas com a mesma massa
Proteínas com o mesmo pI
Focalização Isoelétrica: 1a dimensão
• As proteínas são moléculas anfotéricas, ou seja, possuem tanto carga positiva como carga negativa
•A carga líquida de uma proteína é função da soma de suas cargas negativas e positivas.
• A carga das proteínas é determinada pelo pH do meio onde estão suspensas
• O valor do pH onde as cargas se anulam chama-se ponto isoelétrico (pI)
pH ácido: inonizam em seus radicais amina carga positiva
pH básico: ionizam em seus radicais carboxila carga negativa
Gradiente de pH estável
Em pH baixo, muitas proteínas possuem carga positiva enquanto que em pH alto possuem carga negativa
Quando um campo elétrico é aplicado, o cátodo e o ânodo movem as proteínas até seus pontos isoelétricos onde cada proteína possui carga neutra
As proteínas pàram de migrar, pois atingem seu ponto isoelétrico em um pH específico.
Ponto isoelétrico no pH 7,5Ponto isoelétrico no pH 6,8Ponto isoelétrico no pH 8,5Ponto isoelétrico no pH 10,1Ponto isoelétrico no pH 5,6
Focalização Isoelétrica
Remover proteção da fita
Aplicar amostra no sarcófago
Colocar a fita sobre a amostra
Ettan™ Multiphor™ 3
Ettan™ IPGphor™
Focalização Isoelétrica
Poder de Resolução do gel bidimensional
Faixa de pH mais estreita aumenta o poder de resolução das proteínas
Gel Bidimensional (2D)
2D PAGE: Detecção das proteínasCoomassie Blue
Fluorescentes
(Invi
trog
en)
Células Normais de Fígado Células de Tumor de Fígado
Nitrato de Prata
62
Métodos Sensibilidade Características
Coomassie Blue R 250 50-100 ngCompatível EM
Baixo custo
Coomassie Blue G 250 10 ngCompatível EMFácil manuseio
Prata 1 ng Alta sensibilidade
Sypro Ruby 1 ng
Alta sensibilidadeCompatível EM
Necessita de instrumento sofisticado para aquisição
de imagens
2D PAGE: Detecção das proteínas
Análise das imagens de géis
Presença ou Ausência de spots
Posição de spots (Modificações pós-traducionais)
Volume de spots: quantificação relativa
Proteoma Comparativo ou Diferencial
Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões
Condição A Condição B
Análise das imagens de géis
Análise das imagens de géis
• Excisão de spots do gel : manual ou mecânico
Retirada e tratamento de spots ou bandas
Separação dos Ions
• Apenas os cátions são “deflected” por um campo magnético;
• A quantidade de “deflection” depende da relação m/z.• O sinal do detector é proporcional ao número de “hitting”
no detector;
• Pela variação do campo magnético, ions de todas as massas são coletados e contados.
Equipamento
Espectro de Massa
Pico base (100%)
GC-MS
Uma mistura de compostos é separada por cromatografia, então identificada por espectrometria de massa.
Alta Resolução MS
• Massas medidas 1 parte em 20,000.
• Uma molécula com massa de 44 pode ser C3H8, C2H4O, CO2, ou CN2H4.
• Se a massa é mais exata 44.029.......
C3H8 C2H4O CO2 CN2H4
44.06260 44.02620 43.98983 44.03740
Isótopos
=>
81Br
Moléculas com Heteroátomos
• Isótopos: presentes em usual abundância.• Hidrocarbonetos contêm 1.1% C-13, então sempre terá
um pequeno pico M+1.• Se Br está presente, M+2 é igual a M+.• If Cl está presente, M+2 é um terço de M+.• If I , está presente pico em 127;.• If S está presente, M+2 será 4% de M+.
Espectro de Massa com S
=>
Espectro de Massa com Cl
=>
Espectro de Massa com Br
=>
Espectro de Massa com Alcanos
Espectro de Massa com Alcenos
Ressonância estabilizando cátions favoráveis
=>
Problema 1
Problema 1
Problema 2
Problema 2
Problema 3
Problema 3
Problema 4
• Bibliografia
• SILVERSTEIN, R. M., WEBSTER, F. X., KIEMLE, D.J., “Spectrometric Identifications of Organic Compounds”, seventh edition, John Wiley and Sons, Inc., 1997.
• MURADIAN. J., “Espectroscopia no infravermelho”, IQ-USP, São Paulo, 1978.
• WILLARD, M., MERRITT, Jr & DEAN, J., “Análise Instrumental”, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1974.
• RUSSELL, D.H., Ed. Experimental Mass Spectrometry. New York: Plenum Press. 1994