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Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 1
GENÉTICA MOLECULAR
EXPERIMENTAL
PROTOCOLOS LABORATORIAIS
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 2
EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO – SANGUE TOTAL
Citogene Blood Kit
Deitar 250 µL de sangue total para microtubo de 1,5 mL
Adicionar 750 µL de RBC Lysis Solution
Inverter para homogeneizar e incubar 10’ à temperatura ambiente
Centrifugar durante 5’ a 12.000xg
Remover o sobrenadante deixando o pellet e cerca de 100-200 µL de líquido residual
Agitar vigorosamente o tubo para ressuspender o pellet de células no líquido residual
Adicionar 250 µL de Cell Lysis Solution e homogeneizar por pipetagem
Adicionar 5 µL de Proteinase K (20 mg/mL)
Incubar durante 30’ a 65°C
Adicionar 5 µL de RNase A Solution, misturar por inversão 25x e incubar a 37°C durante
1 hora (passo opcional)
Adicionar 85 µL de Protein Precipitation Solution ao lisado celular
Agitar no vortex durante 20’’ para homogeneizar completamente
Centrifugar durante 5’ a 12.000xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se
acastanhado e consistente
Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 mL contendo 250 µL de Isopropanol
Misturar até que se forme o precipitado de DNA
Centrifugar durante 5’ a 12.000xg
Rejeitar o sobrenadante e adicionar 1 mL de Etanol 70%
Inverter várias vezes para lavar o pellet
Centrifugar durante 1’ a 12.000xg
Desprezar o sobrenadante e secar o pellet ao ar durante 10-15’
Adicionar 100 µL de DNA Hydration Solution
Incubar durante 1 hora a 65°C para dissolver completamente o DNA (passo opcional)
Conservar a amostra a 4°C
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4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 3
EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO – ESFREGAÇO BUCAL
Citogene Buccal Kit
Esfregar 10 vezes a mucosa bucal com 1 escova (5 escovas)
Mergulhar as escovas 10 vezes em 300 µL (650 µL) de Cell Lysis Solution num
microtubo de 1,5 mL
Ter o cuidado de escorrer bem a(s) escova(s) para não perder líquido
Incubar durante 15’ a 65°C
Arrefecer a amostra
Adicionar 100 µL (200 µL) de Protein Precipitation Solution ao lisado celular
Agitar no vortex durante 20’’ para homogeneizar completamente
Colocar a amostra em gelo durante 5’
Centrifugar durante 5’ a 12.000xg. O precipitado de proteínas deve apresentar-se
consistente
Transferir o sobrenadante para microtubo de 1,5 mL e adicionar 450 µL (600 µL) de
Isopropanol e 0,5 µL (1 µL) de Glicogénio (opcional)
Misturar a amostra cuidadosamente 50 vezes e manter o tubo à temperatura ambiente
durante pelo menos 5’
Centrifugar durante 10’ a 12.000xg
Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado ao ar durante 10-15’
Adicionar 50 µL (100 µL) de DNA Hydration Solution
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 4
QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA
A partir da solução de DNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H2O.
Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H2O.
Calcular a concentração de DNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula:
Concentração de DNA (g / mL) A260 x FD x 50
Avaliar a qualidade da solução de DNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A260/A280
A280 Absorvência em 280 nm
A260 Absorvência em 260 nm
FD Factor de diluição
50 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de DNA com a concentração de
50 g/mL
A260 / A280 1,8 – 2,0
Controlo da integridade do DNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 mL)
Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 mL
Adicionar 50 mL de TBE 1X
Fundir a agarose no micro-ondas
Deixar arrefecer até 60C
Adicionar brometo de etídio para concentração final de 0,5 g/mL
Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços
Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X
Aplicar a mistura da solução de DNA com tampão de deposição (10 L + 5 L,
respectivamente) em paralelo com um marcador de MM ( DNA x HindIII)
Migrar a 80 - 100V durante 1 h
Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 5
Reagentes
Agarose SeKeam LE e NuSieve GTG
Tampão TBE 10X
Tris-HCl 89 mM
Ácido bórico 89 mM
EDTA 2 mM
Solução de brometo de etídio 10 mg/mL
Solução de deposição das amostras
50% sacarose
0,1% Azul de bromofenol
0,1% Xileno cianol
50 mM EDTA pH 8,0
Marcadores de massas moleculares (0,5 g/L)
Fago digerido com HindIII
AVISO IMPORTANTE
MANUSEAMENTO DE BROMETO DE ETÍDIO
O brometo de etídio é um poderoso mutagéneo e é moderadamente tóxico. Como tal, deve
ser manipulado usando luvas
A solução de brometo de etídio será fornecida pelo professor
Os lixos (pontas de pipetas automáticas, gel) são colocados em recipiente apropriado
O brometo de etídio em tampões é destruído com excesso de lixívia ou adsorvido em carvão
activado
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 6
CÁLCULOS
A280 nm A260 nm A260 nm /A280 nm [ ] = ug/mL
Volume amostra inicial uL
Volume final
solução DNA uL
Massa DNA ug
Sangue
Total
Esfregaço
Bucal
Rendimentos teóricos - 16-50 ug DNA / mL sangue e 0,2-2 ug DNA / escova
CONCLUSÕES
Amostra Sangue Total Esfregaço Bucal
Rendimento
Qualidade
Integridade
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4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 7
ISOLAMENTO DE LINFÓCITOS
Material e Reagentes
10 mL sangue total colhido em tubos com anticoagulante (heparinato de lítio ou EDTA)
Tubos Greiner Leucosep com filtros estéreis de 15 mL
Tubos Nunc de 15 mL
Ficoll-Paque (Pharmacia nº 17-0840-03)
Solução de Hanks (Sigma H-2513)
Protocolo
Encher um tubo Greiner LeucoSep com Ficoll-Paque até ao filtro
Depositar sobre o filtro 2,5 mL de sangue total homogeneizado
Centrifugar a 2.700 rpm / 20’ / 25C (não usar travão nesta centrifugação)
Retirar o anel de linfócitos com auxílio de pipeta com ponta estéril para tubo Nunc de 15 mL
Centrifugar a 4.000 rpm / 10’ / 25C
Retirar o sobrenadante com auxílio de pipeta com ponta estéril
Ressuspender o precipitado de linfócitos em 500 µL de Solução de Hanks e transferir para
microtubo de 1,5 mL
Repetir esta operação
Centrifugar 20’’ a 12.000 rpm e retirar o sobrenadante
Após este passo manter o precipitado de linfócitos em gelo
Extracção de RNA total
Usar todo o precipitado de linfócitos
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4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 8
ISOLAMENTO DE LEUCÓCITOS
Material e Reagentes
10 mL sangue total colhido em tubos com anticoagulante (EDTA ou heparinato de lítio)
Tubos Nunc de 50 mL
RBC Lysis Solution (Citogene Blood kit)
Solução de Hanks (Sigma H-2513)
Protocolo
Deitar 2,5 mL de sangue total num tubo Nunc de 50 mL
Adicionar 15 mL de RBC Lysis Solution
Incubar durante 15’ à temperatura ambiente
Centrifugar 10’ a 4.000 rpm e retirar o sobrenadante
Ressuspender o precipitado de leucócitos em 1000 µL de Solução de Hanks e transferir para
microtubo de 1,5 mL
Centrifugar 2’ a 12.000 rpm e retirar o sobrenadante
Repetir esta operação
Após este passo manter o precipitado de leucócitos em gelo
Extracção de RNA total
Usar todo o precipitado de leucócitos
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 9
EXTRACÇÃO DE RNA A PARTIR DE CÉLULAS
Isolate RNA Mini Kit
BIOLINE
1. Lise das células
Adicionar 450 L de Lysis Buffer R ao precipitado de células e homogeneizar bem por
pipetagem até não serem visíveis agregados de células
Incubar durante 3´ à temperatura ambiente
2. Homogeneização a amostra
Pipetar o lisado para uma Spin Column R1 (azul) previamente colocada num tubo
colector de 2 mL
Centrifugar a 12.000 rpm durante 2’ para a completa homogeneização da amostra. As
membranas e núcleos ficam retidos na coluna. No tubo colector fica o citosol (RNA).
Descartar a coluna e GUARDAR O FILTRADO
3. Retenção do RNA na coluna
Adicionar ao filtrado igual volume de etanol 70% (450 L) e homogeneizar bem por
pipetagem. Nota: não agitar no vortex!
Aplicar o filtrado numa Spin Column R2 (rosa) previamente colocada num tubo colector
de 2 mL. Centrifugar a 12.000 rpm durante 2’ Desprezar o filtrado; o RNA vai ficar retido
na coluna
4. Lavagem da coluna
Pipetar 500 L de Wash Buffer AR para a coluna e centrifugar a 12.000 rpm durante 1’
para lavar o RNA
Transferir a coluna para um novo tubo colector, adicionar 700 L de Wash Buffer BR e
centrifugar a 12.000 rpm durante 1’ para lavar a membrana. Desprezar o filtrado
Transferir a coluna para novo tubo colector e centrifugar novamente a 12.000 rpm durante
mais 2’ para eliminar todos os vestígios de etanol
5. Extracção do RNA
Transferir a coluna para microtubo de 1,5 mL e adicionar 50 L de H2O RNase-free
directamente na membrana. Repousar durante 5 - 10 minutos. Centrifugar a 8.000 rpm
durante 1’ para eluir o RNA
Conservar a amostra a -20°C ou -80°C
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4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 10
EXTRACÇÃO DE RNA A PARTIR DE CÉLULAS
Trizol
Invitrogen
Adicionar ao precipitado de células 1 mL de TRIZOL
Lisar as células e homogeneizar por pipetagem
Adicionar 200 µL de clorofórmio
Agitar e centrifugar 2’ / 13.000 rpm / 4°C
Separar a fase aquosa (≈ 600 µL) para novo microtubo de 1,5 mL
Adicionar igual volume de isopropanol e agitar
Incubar 15’ / RT
Centrifugar 10’ / 13.000 rpm / 4°C
Retirar o sobrenadante e lavar o precipitado com etanol 75%
Centrifugar novamente e retirar o sobrenadante
Ressuspender o precipitado em 50 µL de H2O RNase-free e quantificar (±100-250ng/µL)
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 11
QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO RNA
A partir da solução de RNA obtida, efectuar uma diluição de 1:50 em H2O.
Ler as absorvências em 280 e 260 nm contra um branco de H2O.
Calcular a concentração de RNA na solução obtida utilizando a seguinte fórmula:
Concentração de RNA (g / mL) A260 x FD x 40
Avaliar a qualidade da solução de RNA obtida por cálculo das razões de absorvência: A260/A280
A280 Absorvência em 280 nm
A260 Absorvência em 260 nm
FD Factor de diluição
40 1 U de absorvência a 260 nm corresponde a uma solução de RNA com a concentração de
40 g/mL
A260 / A280 1,9 – 2,1
Controlo da integridade do RNA por electroforese em gel de agarose 1% (50 mL)
Pesar 0,5 g de agarose para matraz de 100 mL
Adicionar 50 mL de TBE 1X
Fundir a agarose no micro-ondas. Deixar arrefecer até 60C
Adicionar brometo de etídio para concentração final de 0,5 g/mL
Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços
Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X
Aplicar a mistura da solução de RNA com tampão de deposição (10 L + 5 L,
respectivamente) em paralelo com um marcador de MM ( DNA x HindIII)
Migrar a 80 - 100V durante 1 h
Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 12
CÁLCULOS
A280 nm A260 nm A260 nm /A280 nm [ ] = ug/mL
Volume amostra inicial uL
Volume final
solução RNA uL
Massa RNA ug
Linfócitos
(coluna)
Linfócitos
(Trizol)
Rendimentos teóricos - ≈ 25x10
6 células / 5 mL, 10ug RNA / 10
6 células em cultura
0,5 ug / 106 linfócitos
CONCLUSÕES
Amostra Sangue Total
Rendimento
Qualidade
Integridade
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 13
AMPLIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DO DNA POR PCR Polymerase Chain Reaction
A. Introdução
Esta técnica permite partir de quantidades mínimas de DNA (da ordem dos 0,2 - 1 g) e, por
amplificação enzimática in vitro, obter mais de 1 milhão de cópias de determinado fragmento
de DNA. Este é delimitado por um par de primers, cada um constituído por 20 nucleótidos e
complementar de cada uma das cadeias a amplificar.
Uma série de ciclos térmicos repetitivos permite a desnaturação do DNA, a ligação dos
primers às cadeias e a sua extensão pela enzima termo-estável Taq DNA polimerase,
originando-se uma acumulação exponencial do fragmento amplificado.
B. Protocolo experimental
Meio de reacção
Num microtubo de 500 L adicionar os seguintes reagentes:
Reagentes (concentração inicial) Volumes Reagentes (concentração final)
Tampão PCR (10x) (MgCl2 2mM) 5 uL
dNTPs (2 mM) 5 uL
Primer A (5 mM) 5 uL
Primer B (5 mM) 5 uL
Taq DNA polimerase (5 U/ml) 0,2 uL
DNA amostra 5 uL
H2O x uL
Volume total 50 uL
Cobrir com 30 L de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador)
Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de amplificação
Reacção de PCR
Ciclos Condições
95oC / 5 min
58oC / 1 min
72oC / 2 min
95oC / 40 seg
58oC / 40 seg
72oC / 90 seg
1 72oC / 5 min
1
30
No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de
agarose 2% (5 L de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pBR322
xMspI ou 100 bp ladder).
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4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 14
ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS DE DNA POR SSCP
Single Strand Conformation Polymorphism
Gel de poliacrilamida 8% (2 geis – 15 mL) Conc. Final
Acrilamida / bisacrilamida (37,5:1) 3,0 mL
TBE 10X 1,5 mL 1X
EDTA 0,5M pH8,0 60 µL 2 mM
Glicerol 750 µL 5%
Água Milli Q 9,0 mL
Persulfato amónio 10% 100 µL
TEMED 10 µL
Preparação da amostra
5 µL produto PCR + 7 µL mix EDTA/SDS/LB Bleu
Homogeneizar
Desnaturar a 95°C durante 5 min
Colocar em gelo durante 5 min
Aplicar 12 µL no gel
LB Bleu
Formamida 19 mL
Azul bromofenol 10 mg
Xileno cianol 10 mg
EDTA 0,5M pH8,0 800 µL
EDTA/SDS 10X
SDS 20% 500 µL
EDTA 0,5M pH8,0 2 mL
LB Bleu /EDTA/SDS
20 µL LB Bleu + 2 µL EDTA/SDS 10X
Electroforese
Migração a 12,5 mA / gel até saída de xileno cianol do gel
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 15
Coloração com nitrato de prata (DNA Silver Staining kit – GE Healthcare)
Colocar o gel em tina e cobrir com solução de fixação 1X durante 10’. Retirar
Adicionar solução de coloração 1X e deixar 15’ em contacto ao abrigo da luz, agitando
de vez em quando. Retirar
Lavar com água Milli Q durante 1’. Retirar
Adicionar solução revelação 1X. Agitar suavemente até aparecimento das bandas
Parar a reacção por adição de solução de paragem e preservação 1X e deixar actuar
durante 15’
Colocar o gel entre folhas de papel celofane e secar no secador de géis
Solução de fixação 5X
Ácido benzeno-sulfónico 3,0% (p/v) em etanol 24% (v/v)
Solução de coloração 5X
Nitrato prata 1,0% (p/v)
Ácido benzeno-sulfónico 0,35% (p/v)
Solução de carbonato sódio 5X
Carbonato sódio 12,5% (p/v)
Formaldeído 37%
Formaldeído 37% (p/v) em água
Tiossulfato de sódio 2%
Tiossulfato sódio 2% (p/v) em água
Solução de revelação 1X
Carbonato sódio 5X 25 mL
Tiossulfato sódio 2% 125 µL
Formaldeído 37% 125 µL
Água 100 mL
Solução de paragem e preservação 5X
Ácido acético 5% (v/v)
Acetato sódio 25% (p/v)
Glicerol 50% (v/v)
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 16
DETECÇÃO DE MUTAÇÕES POR ENSAIOS DE RESTRIÇÃO
PCR / RFLP
A. Introdução
Determinadas mutações podem abolir ou introduzir sítios de restrição nas moléculas de DNA;
por outro lado, a ausência desses sítios de restrição naturais pode ser ultrapassada pela sua
criação artificial por PCR (ACRS - amplification created restriction site).
Esta característica pode ser aproveitada para o rastreio de mutações.
B. Ensaios de restrição
Para microtubo de 1,5 mL pipetar a seguinte mistura reaccional:
Reagente Concentração Inicial Concentração Final Volume a pipetar
Tampão 10X 1X
DNA (produto de PCR) 15 L
Enzima HinfI 10 U/L 4U
H2O qbp 25L
Incubar durante a 37C (ou outra temperatura adequada) durante 60’
Parar a reacção por adição de 5 L de solução de deposição (Nota: contém EDTA)
C. Electroforese em gel de SeaKem LE agarose 2%
Pesar 1 g de agarose para matraz de 100 mL
Adicionar 50 mL de TBE 1X
Fundir a agarose no micro-ondas
Deixar arrefecer até 60C
Adicionar brometo de etídio para concentração final de 0,5 g/mL
Verter no molde e colocar o pente para a formação dos poços
Após formação do gel colocá-lo na tina de electroforese e cobrir com tampão TBE 1X
Aplicar 20 L do produto de digestão e em paralelo um marcador de MM (pBR322xMspI)
Migrar a 80-100V durante 1 h
Visualizar o resultado por observação no ultravioleta e fotografar o gel
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 17
Detecção da mutação p.R261Q (CGA→CAA) no gene PAH
Sequência normal do exão 7
tat gtg act act cca cta cca aag gtc tcc tag tgc ctc tga ctg agt ggt gat gag ctt tga gtt ttc
ttt ctt ctt ttc atc cca gCT TGC ACT GGT TTC CGC CTC CGA CCT GTG GCT GGC CTG
CTT TCC TCT CGG GAT TTC TTG GGT GGC CTG GCC TTC CGA GTC TTC CAC
TGC ACA CAG TAC ATC AGA CAT GGA TCC AAG CCC ATG TAT ACC CCC GAA
CCg tga gta ctg tcc tcc agc tac cag ttg cca ggc aca atg agc gcc atc ttt tcc tgc tgc aag
aat gag gtt tgg gtt cag ttg ctg gct ggt cca cag
Sequência mutada do exão 7
tat gtg act act cca cta cca aag gtc tcc tag tgc ctc tga ctg agt ggt gat gag ctt tga gtt ttc
ttt ctt ctt ttc atc cca gCT TGC ACT GGT TTC CGC CTC CGA CCT GTG GCT GGC CTG
CTT TCC TCT CGG GAT TTC TTG GGT GGC CTG GCC TTC CAA GTC TTC CAC
TGC ACA CAG TAC ATC AGA CAT GGA TCC AAG CCC ATG TAT ACC CCC GAA
CCg tga gta ctg tcc tcc agc tac cag ttg cca ggc aca atg agc gcc atc ttt tcc tgc tgc aag
aat gag gtt tgg gtt cag ttg ctg gct ggt cca cag
Primers utilizados
7A: 5’ - CTCCTAGTGCCTCTGACTGA - 3’
7B: 5’ - ACCAGCCAGCAACTGAACCC - 3’
Enzima utilizada
HinfI Sequência de reconhecimento: 5’ - GANTC - 3’
CÁLCULOS
Tamanho dos produtos de PCR (pb) Tamanho dos produtos de restrição (pb)
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 18
RT-PCR
Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction
Access RT-PCR System Kit
Promega
A. Introdução
O RT-PCR semi-quantitativo é uma metodologia sensível e versátil que permite determinar a
presença ou ausência de transcritos específicos, assim como avaliar os seus níveis de
expressão. Inicia-se com a síntese de um molde de cDNA em cadeia dupla a partir do RNA
mensageiro, seguindo-se a respectiva amplificação em cadeia. Esta última reacção é
terminada na fase exponencial, de forma a avaliar a quantidade relativa de mRNA inicialmente
presente, prevenindo o fenómeno de plateau. O cDNA correspondente ao mensageiro da β-
actina é frequentemente utilizado como padrão interno, dado o gene que codifica paraβ-actina
ser constitutivo.
O sistema usado utiliza a transcritase reversa do vírus do mieloblastoma aviário (AMV-RT)
para a síntese da primeira cadeia de cDNA a partir do mRNA e a DNA polimerase de Thermus
flavus (Tfl DNA polimerase) para a síntese da cadeia complementar do cDNA e para a sua
amplificação.
B. Protocolo experimental
Meio de reacção
Num microtubo de 500 L adicionar os seguintes reagentes:
Reagentes (concentração inicial) Volumes Reagentes (concentração final)
Tampão Reacção AMV/Tfl (5X) 10 uL
dNTPs (10 mM) 1 uL
Primer Forward (5 mM) 2 uL
Primer Reverse (5 mM) 2 uL
MgSO4 (25 mM) 2 uL
Misturar por pipetagem e adicionar:
Transcritase Reversa AMV (5 U/uL) 1 uL
DNA polimerase Tfl (5 U/uL) 1 uL
Agitar suavemente e adicionar RNA:
Molde de RNA y uL 1 ug (103 - 10
6 cópias)
H2O DEPC x ul
Volume total 50 ul
Cobrir com 30 L de parafina líquida (opcional, depende do tipo de termociclador)
Colocar os microtubos no termociclador e iniciar os ciclos de síntese de cDNA e amplificação
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 19
Reacção de RT-PCR
Ciclos Condições Função
1 48oC / 45 min Transcrição reversa
1 94oC / 2 min Inactivação de AMV-RT e desnatu-
ração de RNA / cDNA / primer
94oC / 30 seg Desnaturação
60oC / 1 min Hibridação
68oC / 90 seg Elongação
1 68oC / 2 min Elongação final (opcional)
25
No final retirar a fase aquosa inferior para novo microtubo e controlar a reacção em gel de
agarose 2% (5 L de produto de PCR), aplicando em paralelo um marcador de MM (pBR322
xMspI ou 100 bp ladder)
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 20
SÍNTESE DE cDNA
Reverse Transcription System A3500
Promega
1. Preparação de RNA
4 L solução de RNA total
Incubar a 70C / 10’ gelo (mínimo 5’)
2. Preparação da mistura de RT
Misturar: Nuclease Free Water 5,75 L
10X Reaction Buffer 4,0 L
MgCl2 25 mM 2,0 L (3mM)
Mix dNTP 10 mM 2,0 L (0,5 mM)
Primer 1,0 L
RNase Inhibitor 0,5 L
AMV Reverse Transcriptase 0,75 L
Volume total 16,0 L
Agitar
Adicionar 16 L da mistura de RT a cada amostra de RNA total (4 L) → 20 L
3. Reacção de RT
Oligo (dT) 15 Primer - 42C / 15’; 95C / 5’
Random Primers – RT / 10’; 42C / 15’; 95C / 5’
Colocar em gelo ou a -20C até utilização posterior em PCR
Nota: A realização deste protocolo permite a obtenção de 20 μL de cDNA. Normalmente é
efectuada uma diluição de 1/3 deste cDNA antes da realização do PCR.
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 21
WESTERN BLOTTING
Isolamento de linfócitos a partir de sangue total em gradiente de Ficoll
Doseamento de proteínas pelo método de Bradford
Preparação da amostra para conservar a -20ºC: diluição ½ em tampão de amostra
DIA 1
Preparação da amostra para o processo electroforético: descongelar as amostras e diluí-
las em tampão de amostra para perfazer a concentração ideal (8 – 16 μg) num volume de
aplicação de 20 μL
Montagem do sistema
Nota: desengordurar placas com etanol
Preparação do gel de resolução a 10%:
Enchimento das placas com ajuda de uma seringa até 1cm abaixo dos pentes
Cobrir o gel com H2O
Polimerização ± 20 min
Colocação do sistema no frigorífico tapado com papel de alumínio até ao dia seguinte.
DIA 2
Preparação do gel de concentração 4%:
1 GEL 2 GEÍS
Acrilamida (37,5:1) 40% 490 μL 980 μL
Tris 0,5 M pH 6,8 1,25 mL 2,50 mL
SDS 10% 50 μL 100 μL
H2O 3,2 mL 6,4 mL
TEMED 10 μL 20 μL
PSA 10% 25 μL 50 μL
Remoção da H2O da superfície do gel absorvendo com papel de filtro
Aplicação do gel de concentração, colocação dos pentes e polimerização
1 GEL 2 GEÍS
Acrilamida (37,5:1) 40% 3,10 mL 6,20 mL
Tris 1,5 M pH 8,8 3,15 mL 6,30 mL
SDS 10% 125 μL 250 μL
H2O 6,05 mL 12,10 mL
TEMED 10 μL 20 μL
PSA 10% 62,5 μL 125 μL
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 22
Preparação das amostras: descongelar as amostras diluídas e submetê-las a fervura
durante 5 min (não esquecer de colocar tampas!) e colocá-las no gelo até aplicação
Preparação do Tampão de Corrida:
200 mL Running Buffer 5X pH 8.3
Perfazer 1000 mL com H2O
Nota: Reutilizável (conservar a 4ºC)
Colocação do tampão de eléctrodo, retirar os pentes e fazer as aplicações das amostras e
do marcador MM (previamente aquecido a 40ºC/1 min – 8 μL)
Migração:
Gel de concentração – 30 mA/ ± 40 min
Gel de resolução – 60 mA/ até saída corante
Preparação da membrana e papéis de filtro (2 por membrana) para a transferência
Preparação do Tampão de Transferência (Tampão Towbin):
25 mM Tris – 6,08g
192 mM Glicina – 28,8 g
20% Metanol – 400 mL
Perfazer 2000 mL com H2O, não acertando o pH (≈ 8,3)
Nota: Reutilizável (conservar a 4ºC)
Desmontagem do sistema e colocação em tampão de transferência: 30 min o gel e 10 min
a membrana
Electrotransferência: 45 min / ± 240 mA de modo a não ultrapassar os 25 V
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 23
ESQUEMA DE MONTAGEM DA ELECTROTRANSFERÊNCIA
Lavagem da membrana com PBS 1X:
10 mL PBS 10X
Perfazer 100 mL com H2O
Nota: Guardar a 4ºC para lavagem subsequente.
Blocagem com PBSM 5% durante 2 horas a 4ºC com agitação
20 mL PBS 10X
10 g leite em pó
Perfazer 200 mL com H2O
Nota: Guardar a 4ºC para incubações dos Ac.
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 24
Incubação com os anticorpos primários durante a noite a 4ºC com agitação.
DIA 3
Lavagem da membrana com PBST: 1x e rejeitar + 3x 10min
100 mL PBS 10X
1 mL Tween 20
Perfazer 1000 mL com H2O
Nota: Guardar a 4ºC para lavagens subsequentes
Incubação com o anticorpo secundário (1:1600) durante 2 horas RT com agitação
Anticorpo secundário – Blotting Grade Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Human Absorbed)
Horseradish Peroxidase Conjugate – BioRad nº 170-6515
30 mL PBSM 5% + 10 μL Ac secundário
Lavagem da membrana: 2x 10 min com PBST + 1x 10 min com PBS 1X
Revelação: Kit Pico Pierce
500 μL solução A + 500 μL solução B
Incubação durante 5 min
6 mL PBSM 5% +
- 6 μL Ac E1
- 18 μL Ac E2
- 5 μL Ac E3
- 3 μL Ac BP
Genética Molecular Experimental - Opção
4º Ano - 1º Semestre 2015 / 2016 25
SOLUÇÕES STOCK:
Tampão de amostra
200 mM Tris-HCl, pH 6,8
2% (p/v) SDS
40% (v/v) Glicerol
0,04% (p/v) Azul Coomassie G-250
2% (v/v) β-mercaptoetanol
Tampão Tris 1,5 M pH 8,8
Tris-Base – 54,45g
H2O – 150 mL
Ajustar pH 8,8 com HCl 1N, completar 300 mL com H2O e autoclavar
Tampão Tris 0,5 M pH 6,8
Tris-Base – 6 g
H2O – 60 mL
Ajustar pH 6,8 com HCl 1N, completar 100 mL com H2O e autoclavar
PSA 10%
Persulfato de amónio – 1 g
H2O – 10 mL
Dividir em alíquotas de 250 µL e congelar a -20ºC
SDS 10%
SDS – 10 g
H2O – 100 mL
Dissolver a 68ºC e ajustar a pH 7,2
Running Buffer 5X pH 8,3
Tris-Base – 15 g
Glicina – 72 g
SDS – 5 g
Perfazer 1000 mL com H2O
PBS 10X
1370 mM NaCl – 80 g
27 mM KCl – 20 g
100 mM Na2HPO4 – 14,2 g
18 mM KH2PO4 – 2,45 g
Perfazer 1000 mL com H2O