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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS POR PRECIPITAÇÃO
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora:
Dr. Adalberto Pessoa Junior Dra. Beatriz Vahan Kilikian Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres
Estudante:
Ely Vieira Cortez
Lorena-SP-Brasil 1998
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIÀ INDUSTRIAL
, RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS POR PRECIPITAÇÃO
Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora
' ,.,.
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Lorena-SP-Brasil 1998
Dedico este trabalho à minha esposa Ednéa, aos meus filhos Bruno e Carolina, aos meus pais e irmãos, aos quais todas as palavras não seriam suficientes para expressar a minha gratidão.
AGRADECIMENTOS
Ao apoio financeiro da Capes e da FAPESP.
Aos professores, alunos e funcionários do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena, pela oportunidade e apoio. sem os quais este trabalho não poderia ter sido realizado.
CONTEÚDO Página
1 - INTRODUÇÃO 1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2
2. 1 - DOWNSTREAM PROCESSING 2
2.2 - FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE PRECIPITAÇÃO: SOLUBILIDADE. 4
2.3 - "SAL TJNG our 6
2.4 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS E ÉTERES DE CELULOSE 9
2.5- PRECIPITAÇÃO COM SOLVENTE ORGÂNICO 11
2.6- PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 15
2. 7 -XILANASES 16
2.7.1 - Importância e características da xilanase 16
2. 7. 2 - Aplicações biotecnológicas 20
2. 7.3 - Extração e purificação de xilanases 22
3.0 - OBJETIVOS 24
4 - MATERIAIS E MÉTODOS 25
4.1 - MICRORGANISMO 25
4.2 - MEIO DE CULTURA FORMULADO A PARTIR DO HIDROLISADO
HEM/CELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR 25
4.3 - PRODUÇÃO DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS 25
4.4 - ESTOCAGEM DO MEIO FERMENTADO 26
4.5 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE AMÓNIO E
SULFA TO DE AMÓNIO COM METILCELULOSE. 26
4.6 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE SÓDIO 27
4. 7 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE POR ADIÇÃO DE ETANOL 27
4.8 - PRECIPITAÇÃO DA /3-XILOSIDASE POR ADIÇÃO DE ETANOL 28
4.9 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 29
4.10 - PRECIPITAÇÃO COM ÁCIDO TRICLOROACÉTICO (TCA) 30
4. 11 - INFLUÊNCIA DO PH DO MEIO DE CULTURA NA PRECIPITAÇÃO 30
4. 12 - MÉTODOS ANALÍTICOS 31
4.12.1 -Atividade enzimática da xilanase 31
4.12.2 -Atividade enzimática da ~-xilosidase 32
4.12.3 - Determinação do teor de proteínas totais 32
4.12.4 - Ensaios Eletroforéticos 33
4.13- PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL 34
4. 14 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS KM
(CONSTANTE DE MtCHAEL!slMENTEN) E VM {VELOCIDADE MAxlMA) DA /3-
X/LOSIDASE NO MEIO FERMENTADO INICIAL E APÓS A
RECUPERAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 35
4.15 METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS 36
5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES 38
5.1 - ESTUDOS INICIAIS DE PRECIPITAÇÃO 38
5.1.1- Etanol 38
5.1.2 - Sulfato de Amônio 39
5.1.3 - Sulfato de Amônia na presença de Metilcelulose 40
5. 1.4 - Sulfato de Sódio 42
5.1.5 - Conclusão dos testes com agentes precipitantes 44
5.2 - SELEÇÃO DO MÉTODO DE DOSAGEM DE PROTEÍNA 44
5.3 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL 48
5.4 - PRECIPITAÇÃO DAS XILANASES E /3-XILOSIDASES 52
5.5 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS 59
5. 6 - ELETROFORESE 61
5. 7 - CONSTANTES CINÉTICAS DA /3-XILOSIDASE INICIAL E DA
RECUPERADA POR PRECIPITAÇÃO 65
6 · CONCLUSÕES 68
.. 1,, -, ,-
1 -
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69
APÊNDICE
li
LISTA DE TABELAS Página
Tabela 2.1 - Processos de separação e tipos de separação (krijqsrnan,
1991) ', , 2
Tabela 2.2 - Enzimas precipitadas por sulfato de amônio 9
Tabela 2.3 - Enzimas precipitadas por solventes orgânicos 14
Tabela 2.4 - Purificação de enzimas xilanolíticas 23
Ta bela 4. 1 - Níveis das variáveis empregadas no~ experimental 34
Tabela 4.2 - Matriz para um planejamento fatorial 22 com ponto central 35
Tabela 5.1 - Efeito do etanol e tampões no método de Bradford e Lowry 46
Tabela 5.2 - Resultados do planejamento em Recuperação de Atividade
(RA) e em Aumento de Pureza (AP) 49
Tabela 5.3 -Análise de variância (ANOVA) para as variáveis a e b 50
Tabela 5.4 - Efeitos estimados para variáveis 1 e 2 50
Tabela 5.5 -Análise de variância do modelo 51
Tabela 5.6 - Variação do pH mediante a adição de etanol ao meio
fermentado 58
Tabela 5.7 - Aumento de pureza das enzimas xilanases totais e f3-
xilosidases em função da concentração de etanol aplicada na
precipitação do meio fermentado 59
Tabela 5.8 - Resultados obtidos pela precipitação fracionada 60
Tabela 5.9 - Balanço de atividades enzimáticas e proteínas totais da
precipitação fracionada 61
Tabela 5.1 O - kM e Vm da f3-xilosidase 66
Ili
LISTA DE FIGURAS Página
Figura 2.1 - Ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos na
superfície da proteína (SCOPES, 1994) 7
Figura 2.2 - Concentração de acetona (0° e, ph 6,5) necessárias para
precipitar as seguintes proteínas encontradas em extratos de
tecido de músculo: fosforilase, piruvato quinase, aldolase,
lactato desidrogenase, enolase, creatina quinase,
fosfoglicerato quinase, mioquinase, mioglobina, parvalbumina
(em ordem decrescente de massa molar) (SCOPES, 1994) 13
Figura 2.3: (a) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana.
ac: grupo acetil; a-4-o-me-glca: ácido a-4-o-metil glucurônico;
a-araf: a-arabinofuranose. (b) Hidrólise de
xilooligossacarídeos pela J3-xílosidase (SUNNA e
ANTRANIKIAN, 1997) 18
Figura 5.1 - Porcentagem de proteínas totais (•) e de atividade de
xilanase (D) solúveis após precipitação conduzida em meio
tamponado com tampão acetato 100 mM, pH 5,5, em função
da concentração de etanol, na temperatura de 4° e (os teores
de proteínas foram determinados pelo método de Bradford) ....... 39
Figura 5.2 - Recuperação por precipitação das xilanases totais em função
da concentração de sulfato de amônio 40
Figura 5.3 - Recuperação da atividade das xilanases totais em função
precipitação com sulfato de amônia na presença de O, 1 % de
metil celulose (•); recuperação das xilanases totais em
função da precipitação com sulfato de amônia (0) 42
Figura 5.4 - Recuperação das xilanases totais (•) e proteínas totais (D)
por precipitação em função da concentração de sulfato de
amônio 43
iv
Figura 5.5 - Interferência em mg/L na concentração de proteínas totais
causada pelo etanol na microanálise de Bradford 47
Figura 5.6 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre
concentração de etanol e pH no planejamento 22 50
Figura 5.7 -Recuperação(%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases e
proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6 53
Figura 5.8 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, 13-xilosidases
e proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5,9 53
Figura 5.9 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases
e proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3 54
Figura 5. 1 O - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases
e proteína totais em experimentos conduzidos no pH 7,0 54
Figura 5.11 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade das
xilanases totais em diversos valores de pH 55
Figura 5. 12 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade da 13-
xilosidase em diversos valores de pH 56
Figura 5.13 - Recuperação por precipitação com etanol das proteínas
totais em diversos valores de pH 57
Figura 5.14 - Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) das
etapas da precipitação fracionada: linha 1 - marcador de
massa molar (66 kDa, 45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa e
20, 1 kDa); linha 2 - fração inicial; linha 3 - precipitado obtido
após precipitação com 20% de etanol; linha 4 - precipitado
obtido após precipitação com 60% de etanol (massas molares
de 11 O e 104 kDa); linha 5 - precipitado obtido após
precipitação com 80% de etanol (31, 30 e 20 kDa) 64
V
Figura 5. 15 - Atividade da f3-xilosidase presente no meio inicial (D) e após
precipitação fracionada com etanol (•) em função da
variação da concentração de substrato (pNpX) 65
Figura 5.16 - Inverso dos valores da atividade da f3-xiiosidase presente no
meio inicial (D) e após precipitação fracionada com etanol(•)
em função do inverso das concentrações do substrato
(Lineweaver-Burk) 66
vi
RESUMO
Neste trabalho foi utilizada a precipitação como técnica de recuperação das enzimas xilanolíticas produzidas por Penícillium janthinellum em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente a precipitação dessas enzimas foi realizada por processo de batelada, com os seguintes agentes precipitantes: etanol (concentrações de 1 O, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80% v/v, pH 5,5 e a 4°C), sulfato de sódio (concentrações de 5, 15, 25, 40 e 60% p/p, pH 5,5 e a 25ºC), sulfato de amônio e sulfato de amônio com metilcelulose (concentrações de sulfato de amônio de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 % da concentração de saturação; concentração de metilcelulose de 1 % p/v; pH 5,5 e a 25ºC). Foram precipitados aproximadamente 30% da proteína total com 40% de etanol, enquanto as xilanases permaneceram com 95% de atividade. Quase 100% da atividade xilanolítica foi recuperada com 80% de etanol. Com 50% de sulfato de amônio, precipitou-se toda a xilanase contida no meio, ao passo que com sulfato de amônio e metilcelulose foram necessários 40% de sulfato de amônio para obter o mesmo resultado. A máxima recuperação foi de 72% com 25% de sulfato de sódio. Em função dos resultados obtidos, realizou- se a precipitação com etanol em concentrações de 20, 40, 60 e 80% em diferentes valores de pH (4,6, 5,9, 6,3 e 7,0) e a 4°C, para comparar o comportamento da xilanase total com o da J3-xilosidase, ambas presentes no meio. Em seguida foi realizada uma precipitação fracionada dessas enzimas, em três etapas, com etanol em concentrações de 20, 60 e 80%, em pH 4,5 e a 4ºC. Aproximadamente 70% da proteína total do meio foi precipitada na primeira etapa (com 20% de etanol). A segunda etapa (com 60% de etanol) permitiu recuperar 75% da J3-xilosidase e aumentar a pureza 6 vezes. A massa molar da J3-xilosidase recuperada foi estimada entre 104 e 11 O kDa. Na terceira etapa da precipitação fracionada (com 80% de etanol), ocorreu a recuperação de 82% da xilanase total e a pureza aumentou 4,4 vezes. As massas molares das xilanases precipitadas na terceira etapa foram 20 e 30 kDa. As constantes cinéticas da J3-xilosidase antes da recuperação (Km=1,07 mM e Vm=0,35 U/ml) e após a recuperação (Km=1,03 mM e Vm=0,38 U/ml) foram similares, indicando que a precipitação praticamente não causou alteração nesses parâmetros.
ABSTRACT
Precipitation was used as a technique to recover xylanolytic enzymes produced by Penicillium janthinellum in sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate. lnitially, the enzymes were precipitated batchwise with the following precipitants: ethanol (at concentrations of 1 o, 20, 30, 40, 50, 60, 70, and 80% v/v, pH 5.5, 4ºC), sodium sulfate (at concentrations of 5, 15, 25, 40 and 60%, pH 5.5, 25°C), ammonium sulfate and ammonium sulfate plus methylcellulose (concentrations of ammonium sulfate with 10, 20, 30, 40, 50 and 60% of saturation concentration; concentration of methylcellulose of 1 % w/v; pH 5.5, 25ºC). About 30% of total protein was precipitated with 40% ethanol, whereas xylanase remained with 95% activity. Almost 100% of the xylanase activity was recovered with 80% ethanol. With 50% ammonium sulfate, aü the xylanase present in the medium precipitated, whereas with ammoníum sulfate plus methylcellulose the sarne resu!t was attained with 40% ammonium sulfate. The maximum recovery value (72%) was achieved with 25% sodium sulfate. As a function of the results obtained, precipitation was performed with ethanol at concentrations of 20, 40, 60 and 80% at different pH values (4.6, 5.9, 6.3 and 7.0) and 4°C, in order to compare the behaviors of total xylanase and 13- xylosidase present in the medium. Additionally, a fractional precipitation of these enzymes was performed in three stages, at pH 4.5, 4°C, and 20, 60 and 80% ethanol concentrations. ln the first stage (20% ethanol) approximately 70% of total protein precipitated. ln the second stage (60% ethanol) 75% of 13- xylosidase was recovered and a 6-fold increase in purity was observed. The estimated molecular weight of recovered !3-xylosidase was inthe range of 104 to 11 O kDa. ln the third stage (80% ethanol), 82% of the total xylanase was recovered and purity increased 4.4-fold. The molecular weights of the xylanases that precipitated in this stage were 20 and30 kDa. The kinetic constants of 13- xylosidase bafore recovery (l<M=1.07 mM and Vrn=0.35 U/ml) and after recovery (i<M=1.03 mM and Vrn=0.38 U/ml) were similar, indicating that the precipitation practically did not affect these parameters.
1 - INTRODUÇÃO
Enzimas são proteínas que catalisam com grande eficiência as reações
biológicas. O uso crescente desses catalisadores em processos industriais
deve-se à alta sensibilidade e especificidade de suas reações químicas, bem
como ao avanço das pesquisas em genética e da tecnologia de processos
fermentativos para a produção de enzimas. No entanto, enzima obtida por
processo fermentativo geralmente encontra-se bastante diluída no meio de
cultivo, sendo portanto, a sua separação e purificação um fator crítico em
biotecnologia, principalmente pelos altos custos operacionais. O estudo de
técnicas visando a redução desses custos torna-se necessário à medida que se
deseja obter produtos competitivos e viáveis comercialmente (ASENJO, 1990).
Neste sentido, existe uma concentração de pesquisas para o desenvolvimento
de técnicas de separação e purificação que atendam à demanda desses
produtos tanto em qualidade como em quantidade (ROGALSKI e
LOBARZEWSKI, 1995; EL-HELOW e EL-GAZAERLY, 1996; PESSOA JR. e
VITOLO, 1996, 1997).
As enzimas xilanolíticas apresentam bom potencial de utilização
industrial e vêm sendo amplamente estudadas no meio acadêmico (KUMAR e
RAMóN, 1996; WONG et ai., 1994; ISHIHARA et ai., 1997, MILAGRES e
PRADE, 1994). A técnica escolhida para recuperar essas enzimas foi a
precipitação com etanol, tendo em vista sua simplicidade de execução, a
relativa abundância deste solvente orgânico em nosso país e a ampla aplicação
deste método no fracionamento de proteínas. em especial o plasma sangüíneo.
Esta técnica, em geral, proporciona baixo fator de purificação, mas, utilizando-
se da diferença de solubilidade entre as enzimas de interesse e as proteínas
contaminantes com relação à presença de diferentes concentrações do
solvente orgânico na solução, pode-se alcançar um significativo aumento de
pureza do produto final.
O presente trabalho insere-se na linha de pesquisa do Departamento de
Biotecnologia da FAENQUIL, sobre recuperação por precipitação das enzimas
xilanolíticas produzidas pelo fungo Penicillíum janthinellum cultivado em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.
1
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - DOWNSTREAM PROCESSING
O objetivo do "Downstream Processing" (DSP) é recuperar o produto de
um biorreator para o nível desejado de pureza e com a formulação correta. Para
isto, diferentes tipos de operações são envolvidas. Com exceção do
rompimento celular, secagem e formulação (o qual inclui imobilização),
processos de bioseparação formam o centro do "Downstream Processing"
(KRIJGSMAN, 1991, PESSOA JUNIOR, 1995).
A Tabela 2.1 apresenta um levantamento de processos de separação e
tipos de separação.
Tabela 2.1 - Processos de separação e tipos de separação (KRIJGSMAN,
1991)
Parâmetro de separação Dispositivo Tipo de separação
tamanho de partícula filtro/centrífuga/ separação de fases
sedimentador
densidade centrífuga/sedimentador separação de fases
difusão osmose reversa molecular
iônico troca iônica/eletrodiálise molecular
solubilidade extração molecular
pressão de vapor destilação molecular
atividade superficial adsorção molecular
DSP é particularmente importante em biotecnologia onde as formas
finais dos produtos são, usualmente, muito diferentes do estado em que são
obtidos no biorreator. Como exemplo, pode ser citado um típico processo de
fermentação que fornece uma mistura de massa celular com outros
componentes do meio nutriente. O produto desejado pode estar dentro da
2
célula, como constituinte de uma mistura muito complexa, no meio aquoso
diluído ou ainda distribuído entre os dois. Em qualquer caso, sua recuperação,
concentração e purificação necessita de várias operações, às quais são
também limitadas por aspectos econômicos. Muitas operações padrões nos
laboratórios tornam-se impraticáveis, ou dispendiosas, em processos
industriais. Além disso, bioprodutos são freqüentemente compostos sensíveis,
cujas estruturas ativas só podem ser preservadas sob condições limitadas de
pH, temperatura e força iônica. Em função destas restrições conclui-se que não
existem técnicas gerais, ou mesmo, uma seqüência de operações que possam
ser recomendadas para recuperação e purificação de produtos biotecnológicos.
Cada caso requer o estudo aprofundado para definição das operações
unitárias ideais (GLATZ, 1990, SCOPES, 1994, SCAWEN etal., 1985 ).
Entretanto, mesmo sendo onerosas as operações necessárias para
purificar diversos produtos biotecnológicos, há uma tendência de crescente
demanda desses produtos na próxima década. Pesquisas recentes apontam
um aumento médio anual de 12% nas vendas de produtos biotecnológicos nos
Estados Unidos, partindo de US$1 O, 1 bilhões no ano de 1996, para uma
previsão de US$32,4 bilhões no ano de 2006. As enzimas fazem parte de um
segmento de expressiva participação no contexto geral de produtos
biotecnológicos, o qual deve saltar de US$275 milhões em 1996 para US$1,6
bilhões no ano de 2006, perfazendo uma alta nas vendas de 19% ao ano
durante este período (SHAMEL e KEOUGH, 1995).
Para satisfazer a demanda destes produtos, várias são as técnicas de
"downstream processing" empregadas, dentre as quais podem ser citadas a
precipitação por sais, precipitação por polietilenoglicol, ultrafiltração, extração
em sistemas de duas fases aquosas e por micelas reversas, cromatografia,
precipitação por solvente orgânico e outras. A separação de proteínas de meios
aquosos por precipitação é um dos métodos industriais mais importantes de
recuperação e pré-purificação dessas biomoléculas (VIRKAR et ai., 1982). É um
processo de separação que consiste da conversão do soluto a sólido, o que
poderá, subseqüentemente, ser removido por uma etapa de separação sólido-
líquido. Idealmente, precipitação resulta em concentração e purificação
(GLA TZ, 1990). Na precipitação as proteínas são desconformadas, isto é, têm
3
sua estrutura tridimensional modificada, tratando-se portanto de um método
agressivo, pois a função bioquímica das proteínas depende de tal estrutura.
Este método somente se aplica quando a redissolução do precipitado é possível
(SCOPES, 1994).
Esta técnica é freqüentemente utilizada em etapas primárias na
seqüência de operações de "downstream", reduzindo o volume para estágios
posteriores (STRATILOVA et ai., 1996; MANSOUR et ai., 1996; KOYAMA et ai.,
1990). Para misturas menos complexas do que os extratos celulares é,
também, uma etapa efetiva de purificação. As principais vantagens do uso de
precipitação para concentração e purificação são: operações unitárias
facilmente adaptáveis em larga escala, possibilidade de execução de modo
contínuo e o uso de equipamentos simples. Além disso, existe uma vasta
quantidade de agentes precipitantes de custo reduzido ou que podem ser
utilizados em baixas concentrações (GLA TZ, 1990).
2.2 • FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE PRECIPITAÇÃO: SOLUBILIDADE
Uma típica proteína globular possui em sua superfície zonas
hidrofóbicas, zonas hidrofílicas, incluindo grupos ionizáveis, e variam de uma
proteína para outra. Essas moléculas possuem, em geral, massa molar entre
1 O. 000 a 500. 000 Daltons. São porém compactas em comparação com outros
componentes que apresentam massas molares similares, como ácidos
nucléicos e polissacarídeos. As complexas interações entre a superfície da
proteína e o solvente ao seu redor determinam a sua solubilidade. Sendo
assim, uma proteína torna-se insolúvel pela alteração de suas características
superficiais ou pela mudança do solvente (GLA TZ, 1990; RICHARDSON et ai.,
1990; ROTHSTEIN, 1994).
A solubilidade é, portanto, o resultado de interações polares com o
solvente aquoso, interações iônicas com os sais presentes no meio, ou
repulsão eletrostática entre moléculas ou pequenos agregados solúveis de
moléculas. Os sais aumentam a solubilidade das proteínas por interações dos
íons com as suas cargas superficiais reduzindo as atrações eletrostátícas e as
cargas disponíveis. Na ausência de força iônica na solução. as cargas
4
superficiais ficam disponíveis, e assim, pode ocorrer agregação por atração
entre cargas opostas. As moléculas com elevada proporção de zona hidrofóbica
na superfície pouco interagem com o solvente orgânico sendo, portanto, pouco
solúveis. Uma carga total líquida próxima de zero (ponto isoeiétrico) minimiza as
repulsões eletrostáticas entre as moléculas de proteína, resultando em
interações entre as zonas hidrofóbicas (SCOPES, 1994).
A curva de solubilidade de proteína em função da concentração de sal
pode ser dividida em duas regiões. A primeira é uma região de baixa força
iônica, "salting-in", onde a solubilidade da proteína é maior do que sua
solubilidade em água pura. A segunda é uma região de alta força iônica, onde a
solubilidade da proteína cai e esse fenômeno é chamado de "saltinq-out"
(RICHARDSON et ai., 1990).
A primeira descrição quantitativa do "salting-out" foi feita por COHN
(1925) que propôs uma equação semi-empírica para descrever a precipitação
de proteínas puras com sais, como descrito na Equação 2.1
logS = J3 - Ksl (2.1)
onde S representa a solubilidade da proteína e I representa a força iônica da
solução. O parâmetro J3 é uma constante que representa a solubilidade da
proteína em sistema com força iônica zero e é função do tipo de proteína, pH e
temperatura. O parâmetro Ks é a constante de "salting-out" e é função do tipo
de precipitante, sendo independente do pH e da temperatura.
Posteriormente aos trabalhos de Cohn, diversas tentativas foram
efetuadas para predizer teoricamente a solubilidade da proteína, com relativo
sucesso, empregando teorias de interações eletrostáticas e modelando a
molécula da proteína como um íon dipolar. A hidrofobicidade foi também
considerada, além das interações eletrostáticas, como um fator preponderante
na solublidade de proteínas. MELANDER e HORVATH (1979) aplicaram a
teoria da cavidade de SINANOGLU e ABDULNAR (1965) para descrever o
efeito do sal neutro na solubilidade de proteínas. A baixa solubilidade de
proteínas em elevadas concentrações de sal foi postulada como sendo o
resultado do alto valor de energia livre necessária para abrir uma cavidade no
5
solvente para acomodar uma macromolécula solúvel. Uma descrição teórica da
solubilidade de proteína deve enfocar os parâmetros das interações
termodinâmicas entre protelna-sotvente e proteína-precipitante. Porém, a alta
precisão necessária para medir estes parâmetros tem implicado em limitada
aplicação deste enfoque. A equação de Cohn é, ainda, largamente utilizada em
situações práticas para fracionamento de plasma sangüíneo e isolamento de
enzimas (VAN OSS 1989; RICHARDSON et ai., 1990).
2.3 • "SAL TING OUT"
O "salting out" de proteínas trata-se de uma das técnicas mais
largamente usada na purificação de enzimas, a qual utiliza altas concentrações
de sais (ODA et ai., 1997; SCHAFER et ai. , 1997; OKAMOTO et ai. 1997).
Embora haja uma tendência para proteínas tipo globulina (proteínas que
possuem baixa solubilidade a baixa força iônica próxima de seu ponto
isoelétrico) também apresentar baixa solubilidade em altas concentrações de
sal, há muitas exceções. Assim, as soro y-globulinas, típicas proteínas que são
insolúveis a baixa concentração de sal, mas solúveis na força iônica fisiológica,
precipita com sulfato de amônio numa concentração relativamente baixa
(aproximadamente 1,5 M). Por outro lado, algumas outras soro globulinas (a e
í3), necessitam de concentrações mais altas de sais para precipitação (entre 2,5
e 3,0 M). O "salting out" é largamente dependente da hidrofobicidade da
proteína, ao contrário do "salting in" que depende da distribuição de cargas
superficiais e das interações polares com o solvente (SCOPES, 1994)
Uma molécula de proteína típica possui resíduos hidrofóbicos em sua
superfície (Phe, Tyr, Trp, Leu, lle, Met, Vai). O contato forçado desses resíduos
hidrofóbicos com o solvente aquoso causa uma ordenação nas moléculas de
água ao redor dos mesmos conforme mostrado na Figura 2.1.
6
Resíduos hi drofóbi cos na proteína
Figura 2.1 - Ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos na
superfície da proteína (SCOPES, 1994)
Esta ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos é
termodinamicamente instável, pois representa um grande decréscimo na
entropia comparada com a proteína não solvatada mais a molécula de água
livre.
Deste modo, uma maneira de descrever a agregação de resíduos
hidrofóbicos da superfície das proteínas, quando aplicado uma alta
concentração de sal, é que os sais adicionados são solvatados, tornando
escasso as moléculas de águas livres no meio. Portanto, desfaz-se a camada
de hidratação (facilitado pela instabilidade dessas hidratações) das regiões
hidrofóbicas (Figura 2.1 ), as quais ficam livres para interagirem-se formando os
agregados. Com isso, proteínas com maiores proporções de regiões
hidrofóbicas tendem a insolubilizarem-se mais facilmente frente ao contato com
sais em solução, ou seja, em menores concentrações salinas. Os sais, para
serem utilizados em precipitação, devem possuir algumas características, tais
como: não interagir diretamente com a proteína, pois pode causar sua
7
desestabilização; ser bastante solúvel, tendo em vista que são necessárias
altas concentrações para se efetuar a precipitação; aumentar a tensão
superficial do solvente, pois isso favorece as interações entre solutos como as
proteínas (ânions multivalentes como sulfato e fosfato com cátions tais como
potássio, sódio e amônia são preferidos). Assim, dos sais comuns que são
efetivos em causar precipitação, sulfato de sódio, potássio e amônio, fosfatos, e
citratos são os mais atrativos.
Embora o "salting out" dependa fortemente das interações hidrofóbicas,
outras características afetam a solubilidade das proteínas, tais como o pH e a
temperatura.
Proteínas existentes em fluidos celulares são muitos solúveis em
condições fisiológicas, ou seja, à força iônica gerada por sais na concentração
ao redor de O, 15 a 0,20 M. E como mencionado anteriormente, a agregação
pode ocorrer facilmente próximo do pH do ponto isoelétrico da proteína. Um
exemplo clássico é a precipitação em uma única etapa da gliceraldeído fosfato
desidrogenase extraída de músculo de coelho. A pH 6,0 , esta enzima é solúvel
em sulfato de amônia a 3,2 M, mas se o pH é ajustado para 7,5 ou mais, ocorre
a precipitação ou até mesmo a cristalização do extrato bruto. Seu ponto
isoelétrico medido a baixa concentração de sal é ao redor de 8,5 (SCOPES,
1994).
·- r
Na região do "salting out", a solubilidade de proteínas geralmente
decresce com o aumento de temperatura (SCOPES, 1994)
Na literatura é possível encontrar uma grande quantidade de autores
que se utilizam da precipitação com sulfato de amônia, e exemplos de alguns
destes trabalhos são mostrados na Tabela 2.2.
8
Tabela 2.2 - Enzimas precipitadas por sulfato de amônio
Microrganismo Enzima S.A.1 Rec2 AP3 Referência
(% satur.) (%) (vezes)
fungo termofílico xilanase 20-80 66,4 1,6 ISHIHARA et
HG-1 ai. (1997)
Cephalosporium xilanase 30-80 72,2 1,9 KANG etal.
sp (1996)
Cellulomonas sp xilanase 55 88,9 2,0 CHAUDHARY
e
DEOBAGKAR
(1997)
Aspergillus xilanase 0-40 71,7 2,5 ROGALSKI et
terreus ai. (1983)
Penicillium ~- 0-40 81,7 2,8 ROGALSKI e
nota tum gala:iosdase LOBARZEWS
Kl(1995) 1 Sulfato de Arrâ1o 2 Reo..Jp:ra;fu de~ 3 Aumento de Pureza
2.4-PRECIPITAÇÃO COM SAIS E ÉTERES DE CELULOSE
Partição por um sistema de duas fases aquosas é um método de
separação baseado na diferença de afinidade de células e macromoléculas
para duas fases aquosas imiscíveis (ALBERTSSON, 1986). Duas fases líquidas
imiscíveis são formadas pela mistura de soluções aquosas de dois polímeros ou
um polímero e um sal. Entretanto, um sistema composto de um líquido e um gel
deve ser formado ao invés de duas fases líquidas, sob condições definidas (tipo
de polímero, presença de sais, e concentração de sal e polímero)
(ALBERTSSON, 1986). O termo gel foi usado para descrever uma fase
polímero que é substancialmente menos fluida que a solução inicial, e pode até
conter algum sólido. Polietilenoglicol, dextrana e éteres de celulose
(hidroxipropil metilcelulose e metilcelulose) são exemplos de tais polímeros os
9
quais produzem gel sob a adição de sal (MIRANDA e BERGLUND, 1990,
1995).
Este é um processo de partição que utiliza um polissacarídeo não iônico
e alta concentração de sal, podendo ser, portanto, controlado por interações
hidrofóbicas. Tais interações são conhecidas ser o mecanismo responsável
pela ligação de proteínas a algumas colunas de polissacarídeos, tal como a
Sepharose 48 e celulose, a altas concentrações de sal (ARAKAWA, 1986).
Entretanto, MIRANDA e BERGLUND (1990) contradizem essa afirmativa
quando utilizaram hidroxipropil metilcelulose (HPMC) para particionar albumina
bovina, uma proteína com características hidrofóbicas bem conhecidas, e
obtiveram baixa recuperação na fase gel.
A vantagem de se usar este sistema seria a adição de características
desejáveis de precipitação para o processo de partição, já que o gel assemelha-
se a um precipitado (ALBERTSSON, 1986). A adição de metilcelulose (MC) em
um processo de precipitação por sulfato de amônio pode reduzir a quantidade
de sal necessária para realizar o "salting out" de enzimas, auxiliar na
preservação de sua atividade, além de possibilitar a utilização de flotação como
etapa posterior, devido às características hidrofóbicas do gel (MIRANDA e
BERGLUND, 1990, 1993)
MIRANDA e BEGLUND (1990) utilizaram HPMC e MC para recuperar a
enzima !3-amilase. Os autores afirmam não ter encontrado na literatura
trabaihos anteriores que se utilizam desse sistema para a recuperação de
biomoléculas. A recuperação da a-amilase utilizando combinação de partição
para uma fase sal-HPMC com subseqüente separação sólido-líquido em uma
coluna de flotação, mostrou-se uma técnica viável (MIRANDA e BERGLUND,
1993). CHEN e JANG (1995) purificaram a tripsina utilizando precipitação por
afinidade combinada com extração em duas fases aquosas. Neste sistema, o
inibidor de tripsina foi ligado ao hidroxipropil metilcelulose acetato succinato e
foi purificado em 4,98 vezes do extrato bruto e proporcionou um rendimento de
65%.
10
2.5- PRECIPITAÇÃO COM SOLVENTE ORGÂNICO
Álcool, acetona e outros solventes orgânicos, miscíveis em água, têm
sido usados para precipitar proteínas desde o início deste século (GLA TZ,
1990; ROYER et ai., 1992; BOWER, 1993; PLESZCZYNSKA et ai., 1994;
STRATILOVA et ai., 1996). Esses solventes têm sido especialmente
importantes quando aplicados em escala industrial, em particular no
fracionamento de p!asma sangüíneo (VAN OSS, 1989). Entretanto, seu uso em
escala de laboratório é menos extensivo, embora possua algumas vantagens
quando comparado à precipitação com sulfato de amônio. Como os princípios
causadores da precipitação por esses dois agentes são diferentes, a
precipitação com solvente orgânico não é necessariamente uma alternativa à precipitação com auxílio de sais como sulfato de amônia e de sódio, podendo
ser usado, inciusive, como uma etapa complementar. A adição de um solvente
miscível em água, tal como etanol ou acetona, em um extrato aquoso contendo
proteína, possui uma variedade de efeitos que, combinados, conduzem à
precipitação dessas proteínas. O principal efeito é a redução da atividade da
água. O poder de solvatação da água para uma molécula de proteína carregada
e hidrofílica é reduzido com o aumento da concentração do solvente orgânico.
Isto pode ser descrito em termos de redução da constante dielétrica do
solvente, ou simplesmente pelo deslocamento da massa de água, somado à imobilização das moléculas de água por hidratação do solvente (orgânico). A
estrutura ordenada da água ao redor das áreas hidrofóbicas na superfície da
proteína pode também ser deslocada pela molécula do solvente orgânico,
resultando numa maior solubilidade dessas áreas. Entretanto, o efeito global do
solvente orgânico, em proteínas solúveis em água, é o decréscimo na
solubilidade até o ponto de agregação e precipitação destas biomoléculas. As
principais causas da agregação são, provavelmente. forças eletrostáticas e
dipolares. Atrações hidrofóbicas são menos importantes por causa da influência
solubilizante do solvente orgânico nessas áreas. A precipitação ocorre em
baixas concentrações de solventes e em valores de pH próximos do ponto
isoelétrico das proteínas, o que sugere que a agregação é similar à que ocorre
na precipitação isoelétrica (GLATZ, 1990; DEY-D et ai., 1992; SCOPES, 1994).
11
A influência das forças eletrostáticas na precipitação de proteínas
explica a redução observada na concentração de solvente orgânico necessária
para realizar a precipitação no ponto isoelétrico e com baixa concentração de
sal (estas condições reduzem as forças repulsivas) (GLATZ, 1990).
O solvente orgânico deve ser completamente miscível em água, não
reagir com proteínas e ter um bom efeito precipitante. Os dois solventes mais
largamente utilizados são etanol e acetona. Outros solventes que podem ser
usados incluem o metanol, n-propanol, i-propanol, dioxano, 2-metoxietanol, e
vários outros álcoois, éteres e cetonas. Cuidados com segurança devem ser
tomados por causa da flamabilidade e vapores nocivos derivados de solventes
orgânicos. Por esta razão, dioxano, 2-metoxietanol e outros éteres não são
recomendados (SCOPES, 1994).
A precipitação com solvente orgânico também é afetada pelo tamanho
da molécula precipitada. Geralmente é necessário menores quantidades de
solventes orgânicos para precipitar moléculas de massas molares maiores. Ou
seja, se fosse comparada uma série de proteínas de diferentes dimensões
moleculares, mas com hidrofobicidade e pontos isoeléticos semelhantes, a
ordem de precipitação seria da maior para a menor proteína, à medida que se
fosse aumentando o teor de solvente orgânico no meio. Isto é explicado pelo
fato que as moléculas maiores agregam-se primeiramente por terem maior
chance de possuírem uma área superficial carregada que interaja com outra
proteína. Na prática, as diferentes composições das proteínas (zonas
hidrofóbicas, zonas hidrofílicas e grupos ionizáveis) de um dado meio, torna
esta regra apenas uma aproximação da real condição. A Figura 2.2 mostra
resultados experimentais relacionados ao tamanho das moléculas e também ao
efeito do ponto isoelétrico na precipitação com acetona em extratos de músculo
de coelho. Os pontos isoelétricos dos maiores componentes do extrato estão na
faixa de 6,0 a 7,5. Observa-se uma tendência de aumento da quantidade de
solvente orgânico necessário para precipitar as proteínas à medida que se
observa a redução de suas massas molares.
12
6
.. 5.5 (O
õ e 5 ftS ,,, ,,, co 4.5 e e, o ..J 4
3.5 o 20 40 60 80
Concentração de acetona (% v/v)
Figura 2.2 - Concentração de acetona (OºC, pH 6,5) necessárias para precipitar
as seguintes proteínas encontradas em extratos de tecido de músculo:
fosforilase, piruvato quinase, aldolase, lactato desidrogenase, enolase, creatina
quinase, fosfoglicerato quínase, mioquinase, mioglobina, parvalbumina (em
ordem decrescente de massa molar) (SCOPES, 1994).
A Tabela 2.3 mostra alguns dados coletados da literatura com relação à precipitação de enzimas utilizando diferentes solventes orgânicos. É possível
encontrar trabalhos que aplicam esta precipitação como etapa preparatória (ou
pré-purificação) para outras de purificação bem como patentes objetivando a
produção industrial. Etanol geralmente é o solvente orgânico mais empregado.
As interações do solvente com as zonas hidrofóbicas causam por vezes
uma desconformação irreversível da proteína. Esta desconformação resulta na
desnaturação e está relacionada com as interações hidrofóbicas
intramoleculares que ajudam a manter a estrutura protéica. Isto pode ser
minimizado pela redução da temperatura de precipitação até valores próximos a
OºC.
13
Tabela 2.3 - Enzimas precipitadas por solventes orgânicos
Microrganismo Solvente Rec1 AP2 Referência
(%) (vezes)
a- Aspergillus etanol 75 NE3 ANNUNZIATO E
galactosidase oryzae MAHONEY
(1987)
xílanase Tríchoderma etanol NE NE ROYER etal.
longibrachiatum (1992)
a-amilase Bacillus subtilis acetona 90 5.4 EL-HELOWe
etanol 83 5,2 EL-GAZAERLY
isopropanol 65 2,8 (1996)
metanol 62 5,4
n-propanol 66 5,7
xilanase Tríchoderma acetona 55 NE TAN et ai.
harzianum E-58 (1987b)
xilanase Aspergillus acetona 17 3,7 ROGALSKY et
terreus F-413 ai. (1983)
í3- Penícillium etanol+ 85,6 NE ROGALSKY e
galactosidase nota tum acetona a LOBARZEWSKY
3% (1995)
celulase e Tríchoderma etanol NE NE BOWER (1993)
xilanase reesei (patente)
a-amilase Bacillus subtilis acetona 98,5 NE SAFWAT et ai.
metanol 100 NE (1983)
etanol 93,8 NE
isopropanol 92,8 NE 1 Re:u~ de ativdade 2 A.umento de Pureza 3 NãJ Erroitracb
Em temperaturas baixas a flexibilidade da molécula é menor, reduzindo com
isto a capacidade de penetração do solvente. Entretanto, em temperaturas mais
elevadas, pequenas moléculas orgânicas penetram nas "frestas" da superfície
molecular, o que ocorre espontaneamente devido à flexibilidade natural da
estrutura, interagindo com os resíduos hidrofóbicos internos (resíduos de
aminoácidos como Leu, lle, Tyr, Phe, Vai). A temperaturas mais elevadas estas
14
interações hidrofóbicas internas são mais acentuadas e, portanto, mais
importantes na manutenção da integridade da molécula. A perda dessas
interações resulta rapidamente em desnaturação. Somado a isto está a
vantagem de se obter misturas com baixos pontos de congelamento entre água
e solvente orgânico (SCOPES, 1994).
2. 6 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA
Precipitação fracionada é uma importante operação tanto para escala
de laboratório quanto para escala industrial na recuperação e purificação de
proteínas. Esta técnica objetiva fracionar seletivamente uma proteína de
interesse de uma mistura de proteínas bem como de contaminantes não
protéicos como lipídeos e ácido nucléicos (CLARKSON et ai., 1996).
Precipitação fracionada é geralmente utilizada em dois cortes. No
primeiro corte, proteínas contaminantes de baixa solubilidade são removidas
pela fase precipitada e, geralmente, somente uma pequena parcela da enzima
de interesse também se precipita. No segundo corte, a proteína de interesse é
recuperada na fase precipitada, juntamente com algumas proteínas
contaminantes. Proteínas contaminantes de alta solubilidade podem
permanecer em solução. É necessário otimizar os pontos nos quais os cortes
são realizados para a obtenção de um nível aceitável de purificação e um alto
rendimento do processo. Na literatura encontra-se publicações focalizando este
problema que têm sugerido técnicas para melhorar a precipitação fracionada.
Estas técnicas incluem um método empírico para determinar a posição dos
cortes (SCOPES, 1994), o teste da propriedade específica de solubilidade
(FALCONER e TAYLOR, 1946), o método da linha derivativa (DIXON e WEB,
1961) e o diagrama de fracionamento (RICHARDSON et ai., 1990). Os dois
primeiros métodos foram desenvolvidos para sistemas com solubilidade bem
definida, enquanto que os métodos desenvolvidos por SCOPES (1994) e
RICHARDSON et ai. (1990) podem ser usados em extratos brutos, os quais são
mais representativos de processos industriais (CLARKSON et ai., 1996).
RICHARDSON et ai. (1990) removeram 44% de proteínas
contaminantes menos solúveis aplicando o primeiro corte a 40% da
15
concentração de saturação de sulfato de amônio na precipitação da enzima
álcool desidrogenase. No segundo corte, a 60% da concntração de saturação,
20% das proteínas totais permaneceram em solução enquanto que a enzima de
interesse foi recuperada na fase precipitada. Isto proporcionou um fator de
enriquecimento da álcool desidrogenase de até 3, 1 vezes. KANG et ai. (1996)
utilizaram sulfato de amônia na concentração de 30% da concentração de
saturação no primeiro corte da precipitação da xilanase do Cephalosporíum sp
(RYM-202). No segundo corte, elevou-se a concentração de sulfato de amônio
para 80% da concentração de saturação obtendo um rendimento de 72,2% para
um aumento de pureza de 1,9. OKADA e SHINMYO (1988) precipitaram a
xilanase do Bacillus pumílus com 20-60% da concentração de saturação de
sulfato de amônio obtendo 63% de recuperação com aumento de pureza de 3
vezes.
A precipitação fracionada causa uma pequena perda de recuperação
em função da precipitação de parte da proteína de interesse juntamente com as
contaminantes, entretanto, o aumento de pureza pode compensar esta perda.
Esta técnica é, portanto, um artifício que pode trazer vantagens à precipitação
de proteínas.
2. 7 - XILANASES
2.7.1 - Importância e características da xilanase
Matérias primas lignocelulósicas são a maior fonte renovável de
biomassa do mundo, são composta principalmente de lignina, celulose e
hemicelulose. Muitas das pesquisas atuais são no sentido de utilizar a fração de
celulose para a produção de combustível líquido. No entanto, se produtos com
valores agregados significativos forem obtidos a partir da lignina e da
hemicelulose, torna economicamente mais viável o processamento desses
materiais (TAN et ai., 1988).
0-xilanas são os mais abundantes polissacarídeos hemicelulósicos em
madeiras duras (madeira de folhosas) e plantas anuais, equivalendo a 20-35%
do total de peso seco. Em madeiras moles (madeira de coníferas) são
encontradas em menor quantidade, compreendendo aproximadamente 8% do
16
peso seco. A estrutura básica da xilana é uma cadeia principal de resíduos í3-D-
xilopiranosídeo (ligações 1 ~4). Ligadas a esta cadeia linear estão as variadas
cadeias laterais curtas. A composição química dos grupos laterais substituintes
e a frequência de sua ocorrência depende da origem da xilana, bem como do
procedimento usado na sua extração (HALTRICH et ai., 1996; BASTAWDE,
1992; COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).
Tradicionalmente, xilanases em conjunto com enzimas celulolíticas têm
sido utilizadas na bioconversão de materiais lignocelulósicos, especialmente
resíduos produzidos por agricultura e silvicultura, para obtenção de produtos
importantes, tais como os combustíveis (BIEL Y et ai., 1985).
Entretanto, como xilanas podem ser facilmente hidrolisadas por ácidos,
a degradação enzimática torna-se uma alternativa menos atrativa para a
produção de açúcares fermentecíveis. Xilanases podem ser usadas para
propósitos mais específicos, tal como a produção de xilooligossacarídeos de
xilana isolada o qual é feito no Japão em escala comercial (PELLERIN et ai.,
1991). Os xilooligossacarídeos assim produzidos (principalmente xilobiose e
xilotriose) são usados como adoçantes alternativos.
Devido à heterogeneidade estrutural, sistemas enzimáticos de
degradação de xilana incluem diversas enzimas. As mais conhecidas são a
endo-~-D-xilanase, que ataca a cadeia principal das xilanas, e a ~-xilosidase,
que hidrolisa xílooligossacarídeos a D-xilose (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
Somado a essas duas enzimas, diversas enzimas de atividades acessórias são
necessárias para a desramificação de xilanas substituídas (HAL TRICH et ai.,
1986), tais como a-glucuronidase. acetil (xilana) esterase e a-
arabinofuranosidase.
A Figura 2.3 mostra o conjunto de enzimas extracelulares requeridas
para a hidrólise da hemicelulose.
1 -. -- . ~_.,..,
17
Figura 2.3: (A) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. Ac:
grupo acetil; a-4-o-Me-GlcA: Ácido a-4-o-metil glucurônico; a-Araf: a-
arabinofuranose. (8) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela 13-xilosidase
(SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
18
Dentre as enzimas que participam na quebra das cadeias laterais
destacam-se a a-D-glicuronidase e as esterases que participam na liberação
dos substituintes acetil, cumaril e feruloil. Estas enzimas atuam em sinergismo
com as endo-xilanases e as f3-xilosidases (ERICKSSON, 1990; COUGHLAN e
HAZLEWOOD, 1993).
Endoxilanases
13-1,4-Endoxilanase (1,4-j3-xilana xilohidrolase; EC 3.2.1.8) cliva as
ligações internas da cadeia principal heteroxilana resultando num decréscimo
do grau de polimerização do substrato. O ataque não é randômico, e as
ligações a serem hidrolisadas dependem da natureza do substrato (por
exemplo, tamanho e grau de ramificação do substrato ou a presença de
substituintes). Durante o início da hidrólise da xilana, os principais produtos
formados são os xilooligossacarídeos. Com o prosseguimento da hidrólise,
esses xilooligossacarídeos são hidrolisados a xilotriose, xi!obiose e xi!ose
(SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
13-xilosidase
13-D-xilosidases (13-D-xilosídeo xilohidrolase EC 3.2.1.37) são
exoglicosidases que hidrolisam xilooligossacarídeos e xilobiose, da extremidade
não redutora, para liberar xilose. São enzimas capazes de clivar substratos
artificiais como p-nitrofenil f3-D-xilosídeo (COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).
Bactérias e fungos têm sido reportados como fontes produtoras de 13- xilosidases. São enzimas com massas molares maiores que as endoxilanases,
situando na faixa de 60 e 360 kDa, são mono ou diméricas, podendo ser intra
ou extracelular (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997). Geralmente, j3-xilosidases
purificadas não hidrolisam xilana, entretanto, há alguns trabalhos onde registra-
se a ação neste substrato para a produção de xilose. Entre os xilooligômeros,
xilobiose geralmente é o melhor substrato para a ação enzimática da 13- xilosidase. A afinidade da enzima com relação a xilooligossacarídeo decresce
com o aumento do grau de polimerização (DP). Muitas f3-xilosidases têm
19
característica transferase, resultando em produtos de massa molar maior que o
substrato utilizado (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997)
2.7.2 - Aplicações biotecnológicas
Um dos fatores determinantes do uso de xilanases em larga escala
certamente é o custo dos preparados enzimáticos. Consideráveis progressos
têm ocorrido nos últimos anos na identificação de parâmetros de processos que
são importantes para obter altas concentrações de xilanases e produtividade,
influenciando economicamente a utilização desta enzima. O custo das fontes de
carbono, bem como os componentes adicionais do meio, são os principais
fatores de uma produção econômica de xilanases. Substratos purificados, tais
como xilana ou celulose, os quais são vendidos como produtos de química fina,
são freqüentemente utilizados em laboratórios porque geralmente induzem alta
atividade xilanolítica. Já para a produção das enzimas em alta escala, estes
substratos tornam-se muito caros. Alternativamente, a biomassa lignocelulósica
constitue uma fonte de carbono menos dispendiosa, que é disponível em larga
quantidade, como produtos residuais da indústria de processamento de
lignocelulósicos (HAL TRICH et ai., 1996).
Enzimas degradadoras de xilana têm um potencial considerável em
diversas aplicações biotecnológicas. Em alguns processos. é requerido o uso
de enzimas purificadas, entretanto, em outras aplicações, a presença de
enzima adicional é desejada. Aplicações comerciais sugeridas para as
xilanases envolvem a conversão de xilana, que está presente em detritos da
indústria agrícola e de alimentos, em xilose (BIEL Y, 1985). Similarmente,
xilanases poderiam ser usadas para a clarificação de sucos, para a extração de
café, óleo de plantas e amido. Outra aplicação das xilanases é o uso da enzima
na dieta de aves domésticas. A utilização de xilanase na dieta de galinhas e
pintos melhorou o ganho de peso e a conversão de alimentos. A eficiência da
xilanase em melhorar a qualidade de pães tem sido demonstrada. A introdução
de xilanase e amilase na massa resultou em aumento do volume específico do
pão (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
20
Atualmente, o uso de xilanases no branqueamento de polpa de papel
tem sido considerado uma das mais importantes aplicações biotecnológicas
destas enzimas (VIIKARI et. ai., 1994). O impacto ambiental causado pelas
águas residuais da indústria de polpa e papel, especialmente a formação de
compostos orgânicos cloradas, é uma preocupação atual que vem merecendo a
atenção pública (VIIKARI et ai., 1991, 1994; COUGHLAN e HAZLEWOOD,
1993). O branqueamento enzimático de polpa tem resultado em uma redução
de 20 a 30% do uso de compostos cloradas neste processo (VIIKARI et ai.,
1991 , 1 994).
O reflexo da importância do branqueamento enzimático está no fato que
um significante número de indústrias de papel e polpa dos Estados Unidos e
Escandinávia estão usando xilanase em seus processos de branqueamento
(DANEAULT et ai., 1994; WONG et ai., 1994).
As xilanases do fungo P. jathínellum são capazes de reduzir a carga de
cloro no branqueamento da polpa de eucalipto com um simultâneo ganho de
alvura (DURAN et ai., 1995). Algumas xilanases produzidas por esse fungo
foram estudadas, e apresentaram as seguintes características: massa molar = 54.000 e 20.100 Da; ponto isoelétrico = 5,5; 6,0 e 6,5; estabilidade a variações
de pH de 4,0 a 8,0 e estabilidade à temperatura de até 50°C por 30 min
(MILAGRES e LACIS, 1991, MILAGRES et ai., 1993, RODRIGUES, 1997)
As xilanases já estão sendo produzidas e comercializadas para
diversos fins. HAL TRICH et a/.(1996), em uma pesquisas entre empresas
produtoras de enzimas obtiveram uma relação de quinze enzimas disponíveis
no mercado, dentre as quais três são citadas a seguir como exemplo:
1 - Alltech lnc. (3031 Catnip Hill Pike, Nicholas-ville, KY 40356, USA).
Pentosanase (xilanase) "Allzym PT", produzida por Aspergíllus niger em
fermentação submersa, pó com uma atividade xilanolítica de 600-700 IU/g
analisada pelo método de BAILEY et ai. (1992). temperatura ótima de 65°C (5
min), pH ótimo de 5,3, recomendada como auxiliar na alimentação animal.
2 - Amano Pharmaceutical Co., Ltd (1-2-3 Nishiki Naka-ku, Nagoia 460,
Japan). Hemicelulase "Amano"90, produzida por A. níger em fermentação em
estado sólido em farelo de trigo, pó com uma atividade de 90000 U/g, 100
unidades libera 1 mg de xilose por minuto de xilana (pH 4,5, 40°C) medido pelo
21
método SN, temperatura ótima de SOºC (30 min), pH ótimo de 4,5,
recomendada para uso em indústria de alimentos e farmacêutica.
3 - Genencor lnternational Europe Ltd (Kyllikin-portti 2, P.O. Box 105, 00241
Helsinki, Finland). "Multifect XL", produzido por T. longibrachiatum em
fermentação submersa, preparação líquida com uma atividade de 445 IU/ml,
medido usando xilana de aveia tingida com azul brilhante de remazol (pH 4,5,
40°C), temperatura ótima entre 55-60°C (20 min), pH ótimo entre 5,0-5,5,
recomendada para uso em indústria de alimento.
2.7.3 - Extração e purificação de xilanases
Fungos filamentosos são interessantes produtores de xilanases de um
ponto de vista industrial, devido ao fato que excretam enzimas degradadoras de
xilana para o meio, eliminando assim a etapa de rompimento celular.
Adicionalmente, o nível de atividade xilanolítica de culturas fúngicas são,
tipicamente, maiores que as culturas de leveduras e bactérias (HAL TRICH et
ai., 1996).
0-xilanases têm sido purificadas de várias fontes usando várias
combinações de técnicas, tais como cromatografia de troca iônica,
cromatografia de permeação em gel, focalização lsoelétrica. eletroforese e
cristalização. Na Tabela 2.4 são citados exemplos de diversas técnicas de
purificação utilizadas para purificar enzimas xilanolíticas. No entanto, esses
processos citados são lentos, caros e de difícil aumento de escala, portanto,
ineficientes para uma produção em maior escala (TAN et ai., 1988). Como
alternativa esses mesmos autores propõem a utilização de ultrafiltração para a
purificação da xilanase obtida do fungo Tríchoderma reeseí, com o qual obteve
uma recuperação de 77% e baixa atividade celulolítica (atividade
celulolítica:atividade xilanolítica = 1: 1000).
22
Tabela 2.4 - Purificação de enzimas xilanolíticas
Enzima Microrganismo M Etapa de R, AP2 Autor (kOa) purificação (%) (vezes)
xilanase Thermoascus 32 Cromatografia de 47 3, 1 TAN et ai.,
aurantiacus troca iônica (1987 a)
xilanase Robillarda sp. 18 Foca 1. isoelétrica 31,3 5,8 KOYAMA Y-20 (pH 3-10) et ai.
(1990)
Focal. isoelétrica 13,4 8,8
(pH 8-10,5)
Filtração em gel 8,6 9,0
í3- Neurospora 83 Focal. isoelétrica 87,5 24 DESHPANOE
xilosidase crassa Eletrof. em gel de 41,7 130 et ai.
poliacrilamida (1986)
í3- Aspergi/Jus 180 Q-Sepharose 50 6,3 KUMARe
xilosidase nidulans Cromatografia de 45,2 28,4 RAMÓN
troca iônica (1996)
Filtração em gel 27,2 89,2
Rendimento Aumento de Pureza
Estudos vêm sendo realizados pelo Departamento de Biotecnologia da
Faculdade de Engenharia Química de Lorena para a extração e purificação das
xilanases do P. janthinellum, os quais incluem este trabalho, utilizando-se de
técnicas com potencial para a aplicação industrial (extração líquido-líquido por
micelas reversas, extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas
e precipitação). RODRIGUES (1997) obteve uma recuperação de 73% da
atividade enzimática e um aumento de pureza de 7 vezes para uma
endoxilanase constituinte do complexo enzimático. Os estudos com duas fases
aquosas estão em andamento (COSTA et ai .. 1997), bem como estão iniciando
estudos de extração por micelas reversas da í3-xilosidase pré-purificada por
precipitação fracionada com etanol.
23
3 - OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi realizar a recuperação das
enzimas xilanases totais e ~-xilosidase, obtida do cultivo de Penicillium
janthinellum em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar,
utilizando a técnica de precipitação.
Para alcançar este objetivo, foram desenvolvidas as seguintes atividades:
• Determinação da recuperação das xilanases totais pela precipitação com os
seguintes agentes precipitantes: etanol, sulfato de amônio, sulfato de amônio
em presença de metilcelulose e sulfato de sódio.
• Verificação da influência do pH e da porcentagem de etanol na precipitação
das xilanases totais utilizando um planejamento estatístico.
• Precipitação das enzimas xilanases totais e ~-xilosidase em diversos valores
de pH e verificação das condições para o fracionamento por precipitação
fracionada.
• Execução da precipitação fracionada das enzimas xilanases totais e ~-
xilosidase.
• Avaliação preliminar das constantes cinéticas da enzima í3-xilosidase.
24
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4. 1 • MICRORGANISMO
O microrganismo utilizado no presente trabalho foi o fungo Penicillium
janthinellum CRC 87M-115, isolado de madeira em decomposição em Lorena-
SP por MILAGRES (1988).
4.2 - MEIO DE CULTURA FORMULADO A PARTIR DO HIDROLISADO HEM/CELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR
Para a produção do hidrolisado foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar
proveniente da Usina Nova América S/A, Tarumã/SP.
O procedimento de hidrólise foi realizado conforme descrito por
MILAGRES, LACIS (1991). Foi utilizado 46 mg de H2S04 p.a. por grama de
matéria seca em uma relação de matéria seca:solução ácida de 1: 1 O. O bagaço
foi seco a 80ºC até ser atingida a umidade de 10%, passando em seguida por
um moinho com peneira de 20 "mesh". Posteriormente, foi tratado com ácido
(20 ml de ácido sulfúrico p.a. e 8 L de água para 800 g de bagaço) e
autoclavado a 121 ºC por 45 minutos. A fração líquida, constituída
principalmente por hemiceluloses, foi recuperada por filtração em papel de filtro
e levada a pH 5,5 com NaOH 1 N.
A partir do hidrolisado hemicelulósico foi preparado um meio para
cultivo de P. janthinellum com adição de solução mineral de Vogel (2% v/v) e
extrato de levedura (O, 1 % p/v). O meio foi autoclavado por 15 minutos a 112ºC.
4.3 - PRODUÇÃO DAS ENZIMAS XILANOLÍT/CAS
O meio de cultura usado para obtenção de esporos de P. Janthinellum
.foi composto por 2% de glicose, 0,25% de extrato de levedura, 2% (v/v) de
solução mineral (VOGEL, 1956), e 2% de ágar-ágar, autoclavado por 15
minutos a 112ºC. Cada mililitro de solução mineral continha citrato de sódio
25
dihidratado (O, 125 g), fosfato monobásico de potássio (0,25 g), nitrato de
amônio (O, 1 O g), sulfato de magnésio heptahidratado (O, 1 O g), cloreto de cálcio
dihidratado (0,05 g), ácido cítrico (0,25 mg), sulfato de zinco heptahidratado
(0,25 g), sulfato ferroso amoniacal pentahidratado (0,05 mg), sulfato de cobre
pentahidratado (0,015 mg) e sulfato de manganês dihidratado (0,002 mg)
(MILAGRES, 1988).
Em 100 mL de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar
adicionou-se 1 g de extrato de levedura. Transferiu-se o hidrolisado para uma
proveta, adicionou-se 20 ml de solução de Vogel e completou-se o volume
para 1000 ml. Distribuiu-se o meio em 40 frascos de Erlenmeyer de 125 mL (25
ml medido com pipeta). A produção das xilanases foi realizada com· a
inoculação de 105 esporos/ml nos frascos de Erlenmeyer, com agitação a 60
rpm, 30°C, por 5 dias. O meio fermentado foi filtrado em papel de filtro
(Millipore) utilizando vácuo. As atividades enzimáticas foram determinadas
como descrito no item 4.12.1 e 4.12.2 e foram de 40 a 50 U/mL para as
xilanases totais e de O, 13 a 0,20 U/ml para a !3-xilosidase.
4.4 - ESTOCAGEM DO MEIO FERMENTADO
Após a produção da enzima em frasco de Erlenmeyer, o meio
fermentado foi separado das células por filtração em papel, distribuído em
frascos de vidro no volume de 30 ml e mantido congelado a -18°C.
4.5- PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE AMÔNIO E SULFA TO DE AMÔN/0 COM MET/LCELULOSE
Os experimentos foram conduzidos em tubos "Eppendorf' de 1,5 mL
usando 500 µL de meio contendo xilanases. Em seguida adicionou-se solução
de metil celulose (O, 1 % p/v para todas as amostras) e sulfato de amônio (1 O,
20, 30, 40 , 50 e 60 % da concentração de saturação) ou somente sulfato de
amônio num total de 1,0 ml. A mistura foi homogeneizada em vórtice (marca
PHOENIX, modelo AP 56) e após 1 O minutos de repouso, para se efetuar a
26
nucleação, foi centrifugada a 10000 xg (Centrífuga marca Jouan, Modelo 1812).
Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC. O precipitado foi
redissolvido a 1,0 ml com tampão acetato de sódio pH 5,5, 50 mM e a
atividade enzimática das xilanases totais foi determinada. Os resultados foram
expressos em porcentagem de atividade enzimática recuperada no precipitado
em relação a atividade presente no meio fermentado inicial.
4.6- PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE SÓDIO
Os experimentos foram conduzidos em tubos de centrífuga de 15 ml,
onde adicionou-se o sal na forma sólida sobre o meio fermentado tamponado
no pH 5,5, de modo a atingir as concentações de 5, 15, 25, 40 e 60% (p/p).
Depois da adição do sal os tubos continham 5,0 g da mistura, que foi agitada
por 15 segundos em vórtice à temperatura de 25 ºC. O precipitado foi coletado
por centrifugação (6000xg, 20 min) e então redissolvido em tampão acetato de
sódio pH 5,5, 50 mM para a mesma massa inicial. A atividade enzimática e o
teor de proteínas totais foram determinados no precipitado redissolvido e na
amostra inicial.
4. 7 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE POR ADIÇÃO DE ETANOL
O meio fermentado foi previamente tamponado no pH desejado (4,0,
5,5 ou 7,0, pela adição de nove partes do meio para uma parte do tampão a
1 M), transferido para um frasco de Erlenmeyer (50ml) e resfriado a uma
temperatura de 4°C (em banho de gelo e dentro de uma câmara fria a 6ºC). O etanol também foi previamente resfriado (OºC) e adicionado ao meio sob
agitação (agitador magnético). Foi efetuado o monitoramento da temperatura
durante o desenvolvimento desta etapa para que esta não ultrapassasse 4ºC. O
cálculo do volume de etanol adicionado foi efetuado de acordo com a Equação
4.1.
27
v; x100 %etanol= (4.1)
Vt:a + Vam + Vet
Sendo:
% etanol= concentração de etanol 0/N) Vet= volume de etanol adicionado ao meio fermentado (mL);
ve= volume de tampão adicionado ao meio fermentado (mL);
Vam= volume do meio fermentado (mL).
A adição de etanol foi efetuada através de bureta manual por
gotejamento para· evitar elevação da temperatura do meio causada pela
liberação de calor.
Após a adição do etanol, a mistura foi mantida refrigerada e em repouso
para possibilitar nucleação do precipitado que foi, em seguida, separado por
centrifugação a 2000xg por 30 min numa temperatura próxima de OºC. O precipitado obtido foi redissolvido em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 à temperatura ambiente.
Para confecção da curva de solubilidade, os ensaios foram realizados
diretamente em tubo de ensaio, sob refrigeração em banho de gelo
(temperatura de <4ºC), com adição de etanol do tipo batelada e agitação em
vórtices.
Para o cálculo da recuperação e do aumento de pureza das xilanases
foram analisadas a atividades enzimáticas e os teores de proteínas totais do
meio inicial e do precipitado obtido. Devido à grande quantidade de etanol
presente no meio não foi possível a quantificação da atividade enzimática no
sobrenadante, obtido após a precipitação.
4.8- PRECIPITAÇÃO DA /3-XILOSIDASE POR ADIÇÃO DE ETANOL
Na tentativa de melhorar a recuperação das atividades enzimáticas foi
alterada a metodologia utilizada na precipitação descrita pelo item 4.7. Todos os
28
ensaios realizados a partir da análise das enzimas xilanolíticas, incluindo a 13- xilosidase, foram executados conforme está descrito abaixo.
O meio fermentado contendo as xilanases, previamente tamponado
com o pH desejado, foi adicionado em um becker de 25 ml, o qual, juntamente
com um tubo de ensaio contendo etanol, foi levado a um banho termostatizado
(Marca Heto, modelo CB 15-25) à temperatura de -3° C, e deixado em repouso
por 15 minutos para a estabilização. Este procedimento evita que a temperatura
ultrapasse 4°C quando se adiciona o etanol ao meio fermentado. Com o auxílio
de bomba peristáltica o etanol foi transferido lentamente ao becker contendo o
meio fermentado. A temperatura foi monitorada constantemente e a agitação
executada manualmente com bastão de vidro. Após a adição completa do
etanol, a mistura foi mantida em repouso sob refrigeração (-3ºC) por 15
minutos, e então, levada à centrifugação (2400xg por 15 min, 4°C). Após a
centrifugação o precipitado foi separado do sobrenadante e redissolvido em
tampão acetato de sódio pH 5,5, 50 mM.
4.9 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA
O meio fermentado foi previamente tamponado em pH 4,6 na proporção
de 9 partes de meio fermentado para 1 parte de tampão acetato de sódio 1 M,
pH 4,0, e adicionado em um becker de 200 ml, que foi levado ao banho
termostatizado na temperatura de -3ºC e deixado em repouso por 15 min para
estabilização. Em um tubo de ensaio adicionou-se o etanol em volume
suficiente para atingir a concentração de 20% v/v (20 partes de etanol para 80
partes de meio fermentado) quando adicionado ao meio e em seguida foi levado
ao banho e mantido em repouso por 15 min. Através de bomba peristáltica o
etanol foi transferido ao becker contendo o meio fermentado em uma
velocidade suficiente para que a temperatura no interior do recipiente não
ultrapassasse 4°C. A agitação foi executada manualmente com auxílio de um
bastão de vidro. Após a adição completa do etanol, o meio foi mantido em
repouso e refrigerado (-3°C) por 15 min. Em seguida foi centrifugado a 2400 x g
por 15 min. O precipitado foi separado e em seguida redissolvido em tampão
29
acetato de sódio pH 5,5, 50 mM. Foram analisados o teor de proteínas pelo
método de Bradford, as atividades enzimáticas das xilanases totais e da 13- xilosidase e foi feita a eletroforese em gel de poliacrilamida da amostra obtida.
O sobrenadante foi imediatamente levado ao banho termostatizado
onde todo o procedimento foi repetido para as duas etapas seguintes:
precipitação com etanol na concentração de 60 e de 80%.
4.10 - PRECIPITAÇÃO COM ÁCIDO TRICLOROACÉTICO (TCA)
Cada uma das frações (inicial, 20, 60 e 80% de etanol) foi precipitada
por TCA para que pudessem ser analisadas por eletroforese. À uma alíquota de
1 O ml de cada uma das frações adicionou-se 1 g de TCA. O material foi
mantido em banho de gelo por uma hora e centrifugado a 6700xg por 15
minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram desprezados, o sedimento lavado em
acetona a -20ºC e centrifugado a 6700xg por 15 minutos a 4°C. O sedimento foi
redissolvido em 0,4 ml de NaOH 0, 1 M.
4.11 - INFLUÊNCIA DO pH DO MEIO DE CULTURA NA PRECIPITAÇÃO
Para verificação da influência do pH do meio de cultura na precipitação
das xilanases totais, [3-xilosidase e das proteínas totais, foram realizados
experimentos em meios com diversos valores de pH, utilizando soluções
tampão adequadas (1 M). Uma parte desse tampão (1 M) foi misturada a nove
partes de meio contendo a enzima de tal forma que a molaridade final resultante
da mistura fosse de 0, 1 M.
As atividades enzimáticas e os teores de proteínas totais foram
analisados após a correção do pH.
30
4.12 - MÉTODOS ANALÍTICOS
4.12.1 -Atividade enzimática da xilanase
A atividade da xilanase foi determinada através da quantidade de
açúcares redutores liberados a partir da xilana, de acordo com o método de
BAILEY et ai. (1992). Os açúcares redutores foram dosados pelo método do
ácido 3,5-dinitrosalicflico (DNS) (MILLER, 1959).
A solução de xilana 1 % foi preparada a partir de 1 g de xilana
("birchwood"- Sigma) adicionada em 80 ml de tampão acetato de sódio 0,05 M,
pH 5,5. A mistura foi fervida sob agitação até completa dissoiução e o volume
completado para 100 ml, com o mesmo tampão.
Um volume de 0,9 ml de xi!ana 1 % foi colocado em tubos de ensaio, os
quais foram mantidos em banho termostatizado à temperatura de 50° C. Em
seguida, acrescentaram-se 100 µL das amostras contendo enzima. Após 5
minutos, adicionaram-se 1,5 ml de DNS para dosagem dos açúcares redutores
liberados, e em seguida a reação foi paralisada com o aquecimento da mistura
em banho de água fervente por 5 minutos. Após o resfriamento dos tubos, em
banho de água à temperatura ambiente, foram efetuadas as leituras de
absorbância a 540 nm em espectrofotômetro (Shimadzu modelo UV-150-02),
previamente calibrado com DNS adicionado de solução tampão (tampão
acetato de sódio 50 mM, pH 5,5).
Para detectar as unidades redutoras não provenientes da hidrólise
enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O primeiro, constituído de
xilana, tampão acetato e o DNS, para detectar a presença de açúcares
redutores contidos na solução de xilana utilizada como substrato sem a ação da
enzima. O segundo, constituído de tampão acetato, meio fermentado contendo
a enzima e o DNS (sem a presença da xilana), para detectar a presença de
açúcares redutores no próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com as
amostras são descontadas as absorbâncias verificadas para os controles do
31
substrato e enzima. A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose (Merck),
nas concentrações de 2 a 10 µmol/ml
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de
enzima necessária para liberar 1 µmol de açúcar redutor expresso como xilose
por minuto, a 50°C.
4.12.2 - Atividade enzimática da 13-xilosidase
A atividade da 13-xilosidase foi determinada através da quantidade de p-
nitrofenol liberada após a ação da enzima numa solução de p-nitrofenil-13-0-
xilopiranosídeo (pNpX) em água (KUMAR e RAMÓN, 1995).
Um meio de reação contendo 250 µL de 2 mM de p-nitrofenil-13-0-
xilopiranosídeo (pNpX) em água e 250 µL do meio fermentado devidamente
diluído em tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,5) foi incubado a 50° C por
30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1 ml de solução de carbonato
de sódio 2M. A absorbância do p-nitrofenol liberado após a ação da 13-xilosidase
foi medida em espectrofotômetro a 400 nm e comparada com uma curva
padrão.
Uma unidade de atividade de 13-xilosidase foi definida como a
quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de p-nitrofenol/min/ml nas
condições descritas acima.
4.12.3 - Determinação do teor de proteínas totais
A determinação de proteínas totais foi baseada nos métodos de
BRADFORD (1976) e de LOWRY (1951).
O método de Bradford emprega o reagente "Comassie Brilliant Blue" G-
250 e padrões de BSA ("bovine serum albumin") nas concentrações entre 200 a
1000 mg/L para a construção da curva de calibração. Inicialmente, o "Comassie
Brilliant Blue" (100 mg) foi dissolvido em 50 ml de etanol a 95% sob agitação
vigorosa, sendo depois misturado com 100 ml de ácido fosfórico a 85%. Diluiu-
32
se a mistura com água deionizada para o volume de 1000 ml, e a solução
obtida foi filtrada para remoção de insolúveis formados. As leituras foram feitas
em espectrofotômetro a 595 nm em soluções contendo 5 ml deste reagente e
O, 1 ml da amostra analisada.
A microanálise de Bradford emprega o mesmo reagente contendo
"Coomassie Brilliant Blue" utilizado na análise padrão. Mas, foram utilizados
padrões de BSA nas concentrações de 20 a 200 mg/L. As leituras foram feitas
em espectrofotômetro a 595 nm em soluções contendo 1 ml deste reagente e
O, 1 ml da amostra analisada.
O método de Lowry utiliza o reagente "Folin-Ciocalteau phenol" 1 N, e
como padrão para a curva de calibração, soluções de BSA nas concentrações
de 50 a 1 OOOmg/l. Para essa análise, foi empregado o método de Lowry
modificado onde foram preparadas três soluções estoque, sendo: 1) sulfato de
cobre pentahidratado a 1 %; 2) tartarato de sódio e potássio tetra hidratado a
2% e; 3) carbonato de sódio a 2% em solução O, 1 N de hidróxido de sódio.
Pipetou-se uma alíquota determinada de cada solução estoque (1 ml da
solução 1; 1 ml da solução 2; 88 mi da solução 3), adicionou-se 1 O ml de uma
solução de SOS-Na a 1 %, e essa nova solução foi misturada e agitada com a
amostra a ser analisada (4 ml da solução; 0.4 ml da amostra). Adicionou-se
0.4 ml do reagente de "Folin" sob agitação. Após 30 min a absorbância foi lida
em espectrofotômetro a 578 nm.
4.12.4 - Ensaios eletroforéticos
As massas molares das enzimas foram determinadas através da
mobilidade eletroforética em condições desnaturantes em gel de poliacrilamida
12,5%, contendo SOS de acordo com o método descrito por WEBER et ai.
(1972). A corrida eletroforética foi realizada à temperatura ambiente, utilizando
tampão Tris-glicina pH 8,9 contendo SOS (O, 1%). A coloração dos géis foi
realizada durante 12 horas a 37 ºC com uma solução contendo 100 mg de azul
brilhante de "Comassie Blue" em uma mistura de 45 ml de metanol, 10 ml de
ácido acético glacial e 45 ml de água destilada. A descoloração foi feita com
33
lavagens sucessivas em uma solução contendo 100 mL de ácido acético, 450
mL de metanol e 450 mL de água destilada.
Foram utilizados como padrões as seguintes proteínas: ~-galactosidase
(116 kDa); Fosforilase (97,4 kDa); Albumina de soro bovino (66 kDa);
Ovalbumina (45 kDa); Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (36 kDa); Anidrase
carbônica (29 kDa); Tripsogênio de pâncreas bovino (24 kDa) e Inibidor de
tripsina (20, 1 kDa).
4.13 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
A determinação das variáveis ótimas para a precipitação da xilanase foi
realizada através de um planejamento experimental. Foram testadas duas
variáveis (pH e concentração de etanol) adotando um planejamento fatorial com
2 níveis (valor mínimo e valor máximo) e 1 experimento no ponto central. Para
este tipo de planejamento e para investigar todas as combinações possíveis
foram realizados um número de experimentos igual a 2" (BARROS NETO et ai.,
1995), onde n representa o número de variáveis testadas somadas a duas
repetições no ponto central. Nas Tabelas 4.1 e 4.2 são mostrados os valores
atribuídos para cada variável e o quadro representativo dos ensaios realizados,
respectivamente.
Tabela 4.1 - Níveis das variáveis empregadas no planejamento experimental
ITEM VARIÁVEL NÍVEL MÍNIMO PONTO CENTRAL NÍVEL MÁXIMO o +
A pH 4,0 5,5 7,0
B % ETANOL 40 60 80
Os valores da Tabela 4.1 foram baseados em resultados observados
na literatura. Os valores de pH situam-se dentro da faixa de atuação e de
estabilidade das enzimas xilanolíticas, conforme determinado por MILAGRES
(1994).
34
Tabela 4.2 - Matriz para um planejamento fatorial 22
com ponto central
EXPERIMENTO VARIÁVEL
A B
1 4,0 40
2 7,0 40
3 4,0 80
4 7,0 80
5 5,5 60
6 5,5 60
7 5,5 60
4.14 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS KM (Constante de
Michaelis/Menten) e Vm (Velocidade máxima) DA /3-XILOS/DASE NO MEIO
FERMENTADO INICIAL E APÓS A RECUPERAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO
FRACIONADA
Foi medida a atividade enzimática (conforme descrito no ítem 4.12 2) da
(3-xilosidase no meio fermentado inicial e após a purificação parcial dessa
enzima através da precipitação fracionada com etanol (ítem 4.9), utilizando as
seguintes concentrações de substrato (pNpX): 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3;0;
4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 15,0 e 20,0 mM. Os valores de~ e Vm foram determinados
pelo método de Lineweaver-Burk (LEHNINGER, 1976).
35
4.15- METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS
Para a avaliação dos processos de recuperação das enzimas foram
analisados os seguintes parâmetros: aumento de atividade específica ou fator
de enriquecimento; recuperação em proteína total e recuperação em atividade
enzimática.
• Definiu-se atividade específica (AE) como:
AE = atividade da enzima (U/mL) I proteínas totais (mg/mL)
Ambas relativas a mesma fase analisada.
• Definiu-se então aumento de pureza (AP) como:
AP = AE2/AE1
Sendo:
AE2 = atividade específica na fase precipitada (U/mg);
AE1 = atividade específica da amostra antes da purificação (U/mg).
• Definiu-se como recuperação em proteína total (RP) como:
RP = P2/P1 X 100
Sendo:
P2 = proteína total na fase precipitada (mg);
P1 = proteína total antes da purificação (mg).
As massas de P1 e P2 correspondem à concentração de proteína multiplicada
pelo volume da fase considerada.
• Definiu-se como recuperação em atividade enzimática (RA) como:
RA = A2 I A1 X 100
Sendo:
36
A2 = atividade na fase precipitada (U);
A1 = atividade antes da purificação (U).
As atividades A1 e A2 correspondem à atividade enzimática multiplicada pelo
volume da fase considerada.
• Planejamento experimental e análise estatística
Os fatores respostas (fator de enriquecimento e recuperação de
atividade) foram medidos em função do pH e da concentração de etanol para
cada um dos dois fatores: nível mínimo (valor codificado: -) e nível máximo
(valor codificado: +). Precipitações representando todas as quatro (22)
combinações foram feitas, assim como, três precipitações representando o
ponto central (valor codificado: O). Todos os fatores foram medidos duas
vezes, assim como o ponto central.
A análise estatística dos resultados foi feita com auxílio do programa
estatístico STATGRAPH 6.0.
37
5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 - ESTUDOS INICIAIS DE PRECIPITAÇÃO
Alguns agentes precipitantes foram inicialmente testados para verificar
as suas influências na precipitação das xilanases presentes no meio
fermentado. Foram testados os seguintes precipitantes: etanol, sulfato de sódio,
sulfato de amônio e sulfato de amônio mais metilcelulose.
5. 1.1- Etanol
A solubilidade da xilanase em meios contendo de 1 O a 80 % em volume
de etanol foi determinada adotando como critério de avaliação as medidas de
atividades enzimáticas e dos teores de proteínas remanescentes na solução
após a precipitação com etanol. O meio de cultura foi tamponado com tampão
acetato pH 5, 5, de tal forma que a concentração final do tampão no meio de
precipitação resultasse em O, 1 M. Os ensaios foram realizados em triplicata,
num volume total de 5 ml. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 5. 1.
Pela curva de solubilidade, pode-se observar que aproximadamente
100% da atividade da xilanase foi precipitada com adição de 80% de etanol.
Com 40% de etanol no meio observa-se, ainda, que aproximadamente 30% da
proteína total é precipitada enquanto que mais de 95% da atividade enzimática
permanece em solução. Isto sugere que a realização de uma precipitação
fracionada nesta concentração de etanol poderá proporcionar um aumento da
atividade específica da enzima.
38
100 90 80 70
(1) 60 > ,::, 50 o
(f) 40 ~ o
30 20 10
o o 1 O 20 30 40 50 60 70 80 90
% etanol
Figura 5. 1 - Porcentagem de proteínas totais (•) e de atividade de xilanase (O)
solúveis após precipitação conduzida em meio tamponado com tampão acetato
100 mM, pH 5,5, em função da concentração de etanol, na temperatura de 4° C
(Os teores de proteínas foram determinados pelo método de Bradford). - ·-
5.1.2 - Sulfato de Amônio
Na precipitação das enzimas xilanolíticas do P. janthinellum com até
20% da concentração de saturação de sulfato de amônio a recuperação da
atividade enzimática foi inferior a 5%. A 30% da concentração de saturação o
resultado é próximo de 10% de recuperação, e a 40% da concentração de
saturação de sulfato de amônio pode-se obter uma recuperação da xilanase de
aproximadamente 30%. Toda xilanase contida no meio fermentado foi
recuperada na precipitação a 50% da concentração de saturação de sulfato de
amônio (Figura 5.2). Em geral é necessário utilizar este sal em concentrações
de 40 a 80% da concentração de saturação para se obter uma boa recuperação
da atividade enzimática. ISHIHARA et ai. (1997) utilizaram 80% da
concentração de saturação de sulfato de amônia para precipitar 66,4% da
atividade da xilanase do fungo termofílico HG-1. CHAUDHARI e DEOBAGl<AR
(1997) utilizaram 55% da concentração de saturação de sulfato de amônia para
39
precipitar 88,9% da atividade da xilanase do Cellulomonas sp. Sendo assim, os
resultados obtidos para a xilanase do P. Janthinellum são satisfatórios, e em
primeira análise, até superiores a muitos outros encontrados na literatura.
100
- ~ 80 o - o 1(0 o- 60 ~ Q) a. ::l 40 (J Q)
o:::
O 1 O 20 30 40 50 60 70
Sulfato de Amônio (% de saturação)
Figura 5.2 - Recuperação por precipitação das xilanases totais em função da
concentração de sulfato de amônio.
Os resultados mostrados na Figura 5.2 sugerem que esta técnica pode
ser aplicada na precipitação da xilanase do P. janthinellum quando se deseja
extraí-la do meio fermentado, pois proporciona boa recuperação da atividade.
Nestes experimentos iniciais não foram analisados os teores de proteínas totais
e portanto, não foi determinado o aumento de pureza proporcionado por esta
precipitação.
5.1.3 - Sulfato de Amônio na presença de Metilcelulose
A adição de metil celulose na concentração de O, 1 %, juntamente com o
agente precipitante (sulfato de amônio), no meio fermentado contendo xilanase,
permitiu obter recuperação mais elevada da enzima no precipitado quando
comparado com a precipitação utilizando somente sulfato de amônio. Na
40
Figura 5.3 observa-se que foi necessário 40% da concentração de saturação de
sulfato de amônio para uma recuperação total da atividade enzimática contra os
50% necessários quando aplicado somente sulfato de amônio ao mesmo meio
fermentado. Resultado semelhante foi encontrado por MIRANDA e BERGLUND
(1990) quando reduziu de 40 para 30% da concentração de saturação de
sulfato de amônio necessário para precipitar 98% da atividade da J3-amilase
quando em presença de 0,2% de metilcelulose. Na precipitação da xilanase do
fungo Termoascus aurantiacus foi necessário utilizar 50% da concentração de
saturação de sulfato de amônio para obter 79% de recuperação da atividade
enzimática na fase precipitada. Os mesmos 79% de recuperação foi obtido com
40% da concentração de saturação de sulfato de amônio quando ao meio
fermentado foi adicionado metilcelulose a O, 1 % (CORTEZ et ai., 1996).
MIRANDA e BERGLUND (1990) propuseram duas possíveis
explicações para a redução de sulfato de amônio necessário para precipitar a J3-
amilase. Primeiramente supõe-se que a J3-amilase e o polímero (metilcelulose)
interajam entre si, formando um complexo que possua solubilidade menor
perante a adição de sal. A segunda explicação é baseada no "salting-out" do
polímero, o qual necessita de no máximo 20% da concentração de saturação de
sulfato de amônia para ocorrer quase 100% de formação da fase gel. A partir
daí, supõe-se que a enzima particione para a fase gel depois da sua formação.
É somado então. o efeito da partição da enzima para a fase gel ao "salting-out",
o que reduz a quantidade de sal necessária à precipitação.
Esta constatação torna-se relevante à medida que pode-se reduzir a
quantidade de sulfato de amônio necessária para obter um mesmo valor de
recuperação. O metilcelulose é de grau alimentício e ainda parece auxiliar na
manutenção da atividade enzimática quando aplicado na precipitação com
sulfato de amônio de uma a-amilase (MIRANDA e BERGLUND, 1993). Este
mesmo autor utilizou o precipitado da a-amilase com sulfato de amônio na
presença de metilcelulose para posteriores etapas de flotação, utilizando-se da
característica hidrofóbica do metilcelulose. Outro fator importante é que o
polímero é utilizado em pequena quantidade (O, 1 % p/v) e pode ser reciclado por
reprecipitação.
41
20
100
~ !?.... 80 o
1g' 60 .....
<D a. :::i 40 o <D a::
o -->-~----~----~---~---------~~~__. O 1 O 20 30 40 50 60 70
Sulfato de Amônio (% de saturação)
Figura 5.3 - Recuperação da atividade das xilanases totais em função
precipitação com sulfato de amônio na presença de O, 1 % de metil celulose (•);
recuperação das xilanases totais em função da precipitação com sulfato de
amônio (D).
5.1.4 - Sulfato de Sódio
O sulfato de sódio pode ser facilmente separado quando em solução
pois cristaliza-se a baixas temperaturas com relativa facilidade, o que possibilita
a sua reciclagem. Sendo assim, torna-se uma alternativa ao sulfato de amônio,
cuja principal desvantagem é justamente o resíduo de sua utilização como
agente precipitante, os quais não são facilmente recicláveis e possuem
propriedades corrosivas.
Verifica-se na literatura que poucos trabalhos utilizam este sal como
agente precipitante de enzimas, quando comparado ao sulfato de amônio (VAN-
ERP-R et ai./, 1991). Talvez isso se deve a sua baixa solubilidade em
42
temperatura ambiente, o que limita a sua aplicação em enzimas estáveis à temperaturas abaixo de 35°C. Outra desvantagem é seu custo mais elevado.
Os resultados apresentados na Figura 5.4 indi~m que a recuperação
máxima da atividade das xilanases totais é de 72% a 25% (p/p) de sulfato de
sódio. Em concentrações mais elevadas deste sal observa-se uma queda na
recuperação da atividade enzimática (64% de recuperação a 40% de sulfato de
sódio; 50% de recuperação a 60% de sulfato de sódio) o que pode ter ocorrido
por desnaturação da enzima.
O máximo de recuperação das proteínas totais foi de 68% em 40%
(p/p) de sulfato de sódio. Analisando o perfil das duas curvas (recuperação de
proteínas totais e recuperação de atividade da xilanase, Figura 5.4) não foi
observado a possibildade de se executar precipitação fracionada com obtenção
de aumento de pureza, pois a solubilidade das proteínas totais é aproximadamente semelhante à solubilidade das xilanases totais, quando
submetidas ao contato com sulfato de sódio. O único benefício desta
precipitação seria, portanto, um fator de concentração.
80
70 - 60 :::R. o - o 50 t(O (.),, co 40 .._ a., a. 30 ::J (.) a., 20 cr.:
10
o o 10 20 30 40 50 60 70
Sulfato de Sódio (% p/p)
Figura 5.4 - Recuperação das xilanases totais (•) e proteínas totais (D) por
precipitação em função da concentração de sulfato de sódio.
43
5.1.5 - Conclusão dos testes com agentes precipitantes
Seguindo a proposta inicial, a precipitação com etanol foi a técnica
escolhida para dar sequência aos trabalhos, visto as seguintes vantagens
observadas: alta recuperação da atividade enzimática na fase precipitada;
solubilidade diferenciada entre as enzimas de interesse e proteínas totais e
facilidade de execução.
A precipitação com sulfato de amônio também mostrou-se atrativa, pois
proporcionou alta recuperação da atividade enzimática no precipitado. Mesclar
precipitação com sulfato de amônio e partição em duas fases aquosas com
metilcelulose também apresentou resultados satisfatórios. Portanto, sugere-se
que as duas técnicas sejam estudadas em trabalhos futuros.
5.2 - SELEÇÃO DO MÉTODO DE DOSAGEM DE PROTEÍNA
O método de Lowry para determinação da concentração de proteínas
totais é um dos mais utilizados devido à sua simplicidade, sensibilidade e
precisão. Porém, suas principais desvantagens são: pouca especificidade e
interferência de diversos compostos (PETERSON, 1979; LOWRY et et., 1951).
O método de Bradford é rápido, mais específico para proteínas, e não
apresenta tantas interferências como o método de Lowry (BRADFORD, 1976).
Para selecionar qual desses métodos de dosagem de proteínas seria
adotado nos experimentos de precipitação com etanol, foram estudadas as
influências nos métodos de Bradford e Lowry ocasionadas pelos reagentes
empregados nas precipitações (tampões e etanol).
Foi testado etanol porque no sobrenadante resultante da precipitação,
este reagente pode ser encontrado em concentração de até 80% (v/v). Foi
observado valores baixos de absorvância (item 1 da Tabela 5.1) quando este
reagente foi submetido às duas técnicas (análise padrão) o que correspondeu a
baixos valores de massa de BSA. Isto está de acordo com a literatura, na qual
44
verifica-se que etanol não registra absorvância quando sumetidos a essas
análises (BRADFORD, 1976; LOWRY, 1951).
Os tampões acetato de sódio pH 4,0 e pH 5,5, fosfato pH 7,0, também
foram testados. Neste trabalho estes tampões foram utilizados no preparo e
tamponamento do meio fermentado nos diversos valores de pH. Para o método
de Lowry foi testado somente o tampão acetato de sódio pH 4, o em função da
escolha do método de Bradford para continuação dos trabalhos.
Com os baixos valores de absorvância obtidos (itens 2, 3 e 4 da Tabela
5. 1) pode-se afirmar que estes tampões não interferem nos métodos de
Bradford e de Lowry.
Verificou-se também a influência dos tampões e etanol quando os
mesmos são misturados em igual volume com uma concentração conhecida de
BSA (itens 5, 6, 7 e 8 da Tabela 5.1). Os valores de massa de BSA
determinados por essas análises aproximam-se do valor real. Podemos afirmar,
portanto, que não ocorreu interferência nos métodos testados. A pequena
variação ocorrida pode ser interpretada como erro experimental
Os valores apresentados na Tabela 5.1 foram obtidos quando O, 1 ml
de cada substância potencialmente interferente foi analisada pelo método de
Bradford, análise padrão, ou 0,2 ml de cada substância foi analisada pelo
método de Lowry.
Após a realização de testes para verificar a influência de vários
prováveis interferentes (principalmente dos componentes presentes nos
tampões utilizados nas precipitações) nos métodos de análise de proteína, foi
escolhida a técnica de Bradford para dar continuidade aos trabalhos devido à sua maior simplificidade e rapidez de execução.
Porém, em função do baixo teor de proteína presente no meio
fermentado contendo as enzimas xilanolíticas, ficou definida que as
determinações seriam feitas utilizando a microanálise de BRADFORD (1976),
pois esta detecta proteínas com concentrações na faixa de 20 a 200 mg/L.
45
Tabela 5.1 - Efeito do etanol e tampões no método de Bradford e Lowry
Absorvância Massa de BSA
Teste Substância Bradford Lowry Bradford Lowry Real
595 nm 578 nm µg
1 Etanol 0,042 0,027 4,2 -1 o 2 Tampão acetato de sódio 50 mM, 0,012 -0,012 1,4 -44 o
pH4,0
3 Tampão fosfato 50 mM, pH 7,0 0,008 NR 1,1 NR o 4 Tampão acetato de sódio 50mM, 0,017 NR 1,9 NR o
pH5,5
5 Sol. BSA 1000 mg/L + etanol (1: 1) 0,455 0,546 48 57 50
6 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,514 0,490 55 51 50
acet. de sódio 100 mM pH 4,0
(1: 1)
7 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,519 NR 56 NR 50
fosfato 50 mM pH 7,0 (1:1)
8 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,495 NR 51 NR 50
acetato de sódio 50 mM, pH 5, 5
(1:1)
NR - não realizado
Para se fazer um balanço de massa que melhor representasse o
comportamento das proteínas totais durante as precipitações resolveu-se
determinar as concentrações dessas proteínas tanto na fase precipitada como
na fase sobrenadante. Primeiramente alguns testes foram realizados para
verificar a influência da concentração de etanol na microanálise de Bradford. A
Figura 5.5 apresenta esses resultados com etanol nas concentrações de 20, 40,
60 e 80% v/v.
46
50
-. 40 ...J - O>
-S 30 ro -~ ~ 20 e o.
10
o 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)
Figura 5.5 - Interferência (em mg/L) na concentração de proteínas totais
causada pelo etanol na microanálise de Bradford.
Como se pode verificar, em concentrações mais elevadas de etanol a
sua interferência sobre o método torna-se mais significativa (ao contrário da
análise padrão) atingindo quase 50 mg/L de proteína quando a concentração de
etanol é de 80%. Portanto, no sobrenadante obtido após uma precipitação,
onde há altos teores de etanol (até 80%) e também baixas concentrações de
proteínas, torna-se difícil quantificá-las utilizando a microanálise de Bradford.
Sendo assim, nos experimentos conduzidos neste trabalho, a
quantidade de proteínas existentes, a exemplo do que ocorreu com as
determinações das atividades enzimáticas, foi determinada somente no
precipitado, onde não se observou interferência do etanol residual nos métodos
analíticos.
47
5.3 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Segundo a literatura, vários são os fatores que influenciam a
precipitação de proteínas por etanol, como concentração do solvente, pH,
velocidade de adição de etanol, temperatura e concentração de sais (força
iônica) (SCOPES, 1994). Mas, de acordo com resultados apresentados por
LUCARINI (1996) os dois fatores que mais influenciaram a precipitação com
etanol de amiloglicosidade foram o pH e a concentração de etanol. Em função
disso esses dois parâmetros foram aqui estudados para verificar as suas
influências na recuperação das xilanases através da precipitação por etanol
com auxílio de um planejamento experimental 22 + ponto central (Tabela 5.2).
As condições das precipitações do planejamento experimental 22 +
ponto central foram as seguintes:
• concentração de etanol: 40, 60 e 80% 0/N) • pH: 4,0, 5,5 e 7,0
Os valores de pH foram selecionados em função da estabilidade e do
ponto isoelétrico (pi = 5,5) de uma isoenzima (endoxilanase) produzida pelo P. Janthinel/um nas mesmas condições deste trabalho e isolada por MILAGRES
(1994). As concentrações de etanol foram definidas de acordo com a literatura
(ROGALSKI et ai., 1995, LUCARINI, 1996).
Após a análise estatística (Tabelas 5.3 e 5.4) os resultados indicaram
que, para esta série de experimentos o fator "pH" não interferiu na variável
resposta testada (% recuperação de enzimas). Nem mesmo a sua interação
com o outro fator "concentração de etanol" foi significativa. Uma análise
estatística para a variável resposta "Aumento de Pureza" (Tabela 5.2) também
foi realizada e apresentou resultados semelhantes aos das Tabelas 5.3 e 5.4.
48
Tabela 5.2 - Resultados do planejamento experimental expresso em
recuperação de atividade (RA) e em aumento de pureza (AP).
Fator
Experimento pH %Etanol RA(%) 1 AP2
1 3, 1 0, 1
2 + 2,7 0, 1
3 + 70,4 1,2
4 + + 64,6 1,2
ponto central
5 o o 37, 1 0,8
6 o o 33,0 0,7
7 o o 22.6 0,6
1 RA = Recuperação em atividade 2AP = Aumento de Pureza
Os efeitos individuais dos fatores experimentais e suas interações
sobre as variáveis respostas estão mostrados na Tabela 5.4. Como pode ser
observado pelo teste t, o pH e suas interações com a concentração de etanol
não apresentaram influência significativa ao nível de 5% de probabilidade.
Somente a porcentagem de etanol (fator 8) mostrou-se significativa (p<O, 05) na
variação da resposta. Isto contradiz a literatura, a qual menciona o pH como
fator significativo na precipitação. Segundo SCOPES (1994), o pH do ponto
isoelétrico deve ser o mais favorável na precipitação de enzimas. Isso pode ter
ocorrido pelo fato que o meio fermentado contém um complexo enzimático com
diferentes isoenzimas de diferentes valores de pontos isoelétricos.
A Figura 5.6 mostra como os níveis dos fatores estudados interferem
na precipitação da xilanase. Variando-se o fator A (de -1 para +1), observa-se
na Figura 5.6 que não ocorre uma variação significativa da variável resposta
(de 1,25 para 0,88 ou de 68,55 para 62,75). Esta variação é muito pequena em
relação às encontradas quando se varia o fator B (de 1,25 para 68,55 ou 0,88
para 62,75). Portanto, os níveis mais altos de porcentagem de etanol produzem
melhores resultados, independente do pH utilizado.
49
Tabela 5.3 -Análise de Variância (ANOVA) para as variáveis A e B
Efeito Soma dos Grau de Média dos Fator F p
quadrados liberdade quadrados
Fator A 9,52 1 9,52 0,20 0,6902
Fator B 4171,22 1 4171,22 87, 17 0,0026
AB 7,37 1 7,37 O, 15 0,7248
Total (erro) 143,55 3 47,85
Total (corr.) 4331,66 6
R2= O 96 R2 (ajust. grau de liberdade) = 0,93 f
Tabela 5.4 - Efeitos Estimados para variáveis 1 e 2
Variáveis Estimativa dos efeitos Erro Padrão t
média 33,36 +/- 2,61 12,79
Fator A -3,08 +/- 6,91 0,45
Fator B 64,58 +/- 6,91 9,34*
AB -2,71 +/-6,91 0,40
*Significativo ao nível de 5% de probabilidade (t1ab=3, 182) Para t>t1ab mostra que a variável é significativa
1 68,55 62,75
Fator B
-1 1,25
-1 Fator A
0,88
1
Figura 5.6 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre
concentração de etanol e pH no planejamento 22.
50
O coeficiente de determinação (R2 = 0,96) obtido na análise de
variância (Tabela 5.3) permitiu a determinação de um modelo estatístico
polinomial de primeira ordem, representado pela Equação 5.1:
y = 33,4 + 32,3 8 (5.1)
onde: y corresponde à recuperação da xilanase prevista em percentagem (%) e B
corresponde ao valor codificado para a variável porcentagem de etanol.
O modelo estatístico para a recuperação das xilanases totais foi
determinado através de urna regressão linear pelo método dos Mínimos
Quadrados em função da variável B (% de etanol) a qual se mostrou
significativa ao processo. A validade deste modelo foi verificada através de uma
Análise de Variância (Tabela 5.5) onde pode ser observado que a regressão
obtida foi estatisticamente significativa (p< 0,05) com coeficiente de
determinação R2 = O, 96.
Tabela 5.5 -Análise de Variância do modelo
Fonte Somados Grau de
quadrados liberdade
Média dos
quadrados
Fator-F Valor de P
Modelo 4171,22 1
Erro 160,43 5
4171,22
32,08
129,99 0,0001
Total(corr.) 4331.66 6
R = 0,96 R2 (ajustado por grau de liberdade) = 0,95 Erro padrão= 5,66
A recuperação da xilanase foi da ordem de 65% para uma
concentração de 80% de etanol obtida nos experimentos 3 e 4 (Tabela 5.2), e
não confirmou os dados anteriormente mostrado na curva de solubilidade
(Figura 5. 1 ), onde foi constatado 100% de recuperação de xilanase para essa
mesma concentração de etanol. É bem provável que esta alteração seja
resultante da diferente forma de condução dos experimentos.
51
5.4 PRECIPITAÇÃO DAS XILANASES E fJ-XILOSIDASES
Apesar do pH ter sido verificado como uma variável não significativa na
precipitação com etanol das xilanases, novos experimentos foram realizados
onde se variou o valor do pH inicial das precipitações. Nesta série de
experimentos foi incluída a análise da recuperação da 13-xilosidase, uma
isoenzima que foi detectada no meio fermentado do P. janthinelfum em
trabalhos prévios realizados por MILAGRES (1994). As Figuras 5.7, 5.8, 5.9 e
5.1 O mostram o perfil da recuperação para xilanases totais, 13-xilosidase e
proteínas totais, quando se adicionou etanol ao meio fermentado nas
concentrações de 20, 40, 60 e 80% (v/v), para valores de pH de 4,6, 5,9, 6,3 e
7,0. O que pode ser verificado é uma acentuada diferença de solubilidade entre
as xilanases totais, 13-xilosidase e proteínas totais. Este resultado está de
acordo com a literatura, onde verificou-se que, as 13-xilosidases, são enzimas
com massas molares mais elevadas (60 a 360 kDa) (SUNNA e ANTRANIKIAN,
1997) que as endoxilanases, e que nesta técnica, precipita-se primeiramente as
enzimas de massas molares maiores, à medida que se aumenta o teor de
etanol (SCOPES, 1994).
Nas precipitações com etanol em concentrações na faixa de 20 a 60%
a xilanase total apresenta uma recuperação baixa na fase precipitada.
Resultado semelhante foi reportado por ROGALSKI et ai (1983) onde
constataram 11 % de recuperação da atividade na fase precipitada com 50% de
etanol em trabalhos realizados com a xilanase do Aspergillus terreus F-413. O
autor demonstra ainda que 55% da xilanase foi recuperada com 75% de etanol.
EL-HELOW e GAZAERL Y (1996) obtiveram 46% de recuperação com 66% de
etanol da xilanase produzida por Bacillus subtilis enquanto que TAN et ai. (1987
b) utilizaram 80% de etanol para recuperar 63% da atividade da xilanase do
fungo Trichoderma harzianum E58.
Como se pode observar nas Figuras 5.7, 5.8, 5.9 e 5.10, o máximo de
recuperação da atividade da !3-xilosidase foi com 60% de etanol.
52
pH 4,6
100
o 80 iro o, ro J-o- lCÍIEIUISe .... 60 (l) a. 1-beta-xilosidase ::i o 40 ; ......,._ proteínas totais (l)
o::: ~ o 20
o o 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)
Figura 5. 7 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases e
proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6.
100
o 80 ,ro o, ~ 60 (l) a. ::i o 40 (l)
o::: ~ o 20
o o 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)
pH 5,9
-O- xílanase
--- beta-xilosidese --à- proteínas totais
Figura 5.8 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases e
proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5,9
53
pH 6,3
100
o 80 iro o ro 1-0-xilatase I ..... 60 (!) -beta-xilosidase I Q.
::J o 40 -6-protefnas totais I
(!) o::: ~ o 20
o o 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)
Figura 5.9 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases e
proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3.0
pH 7,0
100
o 80 1(0 o --·-------·---- ro --0-xilanase ..... 60 (!)
- beta-xilosidese Q. :::, -6- proteínas totais o (!) 40 o::: ~ o 20
o o 20 40 60 80 100
% etanol (v/v)
Figura 5.1 O - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, 13-xilosidases e
proteína totais em experimentos conduzidos no pH 7,0
54
Em resumo, p-xilosidase precipita quase totalmente a 60% de etanol,
enquanto que as xilanases totais precipitam a 80% de etanol. Portanto, é possível executar uma separação destas enzimas aplicando-se uma
precipitação fracionada com etanol nessas concentrações.
A Figura 5. 11 representa a recuperação das xilanases isoladamente
mediante a precipitação com etanol nos valores de pH indicados. Pode-se
verificar uma solubilidade semelhante, independente do pH, até 40% de etanol.
A 60% de etanol ocorre uma ligeira queda de solubilidade, ou seja, um pequeno
aumento de recuperação na fase precipitada. A 80% de etanol há uma queda
brusca de solubilidade das xilanases totais. Observa-se também uma
recuperação de aproximadamente 85% para os valores de pH de 4,6 e 7,0 e
uma recuperação de aproximadamente 95% para os valores de pH 5,9 e 6,3.
Esta diferença pode ser explicada em termos de desnaturação das enzimas, à medida que as recuperações mais baixas são obtidas com os valores de pH
mais extremos (4,6 e 7,0)
100
..- 80 :::,'i?. o - ------ o ---pH 4.6 ,ro 60 -0-pH 5.9 o, ro -+-pH6.3 ~ <D -0-pH 7,0 a. 40 ::, ------
o <D e:::
20
o o 20 40 60 80
% Etanol (v/v)
Figura 5.11 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade das
xilanases totais em diversos valores de pH
55
Na Figura 5. 12 verifica-se a recuperação da J.3-xilosidase isoladamente
mediante a precipitação com etanol. Ao contrário das xilanases, a J.3-xilosidase
já apresenta uma expressiva recuperação (aproximadamente 80%) a 40% de
etanol. Entre 20 e 40% não é possível verificar uma tendência de maior
recuperação para um determinado pH. Já a 60 e 80% de etanol verifica-se uma
recuperação ligeiramente superior para os valores de pH centrais (5,9 e 6,3). A
exemplo das xilanases totais, supõe-se que haja uma maior desnaturação da J.3- xilosidase para os valores de pH extremos (pH 4,6 e pH 7,0).
100
.......... 80 ::R. o .._... o ·--pH4,6
1r3. 60 .-0-pHS,9 ~ -e-pH6,3 Q)
-&-pH 7,0 e.. 40 ::::, o Q)
o:: 20
o o 20 40 60 80
- --
% Etanol (v/v)
Figura 5. 12 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade da (3-
xilosidase em diversos valores de pH
Com a Figura 5.13 pode-se observar como ocorre a recuperação das
proteínas totais mediante a variação do pH. Para os valores de pH 5,9, 6,3 e
7,0 o perfil das curvas são semelhantes, ou seja, a recuperação de proteínas
totais é praticamente a mesma na precipitação com etanol entre 20 e 80% (v/v).
No entanto, ao utilizar-se do pH inicial de 4,6, ocorre uma precipitação
significativa das proteínas totais aplicando-se somente 20% de etanol, o qual
56
corresponde a quase 80% do valor quantificado pelo método de Bradford. Este
fato resulta num efeito desejado, ou seja, a 20% de etanol não ocorre
precipitação sigificativa da í3-xilosidase e também das xilanases totais, o que
implica num aumento de pureza dessas enzimas pela precipitação de
contaminantes. Sendo assim, esse pH foi escolhido como o inicial para a
precipitação fracionada.
100
80 - ~ o - o 60 iro (..), ro '- Q) o. 40 :::i o Q)
o::: 20
o o 20 40 60 80
% Etanol (v/v)
-pH4,6 --<rpH 5,9 -+-pH6,3 -e-pH 7,0
Figura 5.13 - Recuperação por precipitação com etanol das proteínas totais em
diversos valores de pH
Com o intuito de se verificar qual o efeito da concentração de etanol no
pH do meio tamponado para a precipitação, alguns experimentos foram
realizados. A Tabela 5.6 mostra a variação do pH com a adição de etanol no
meio fermentado, tamponado com o devido tampão (tampão acetato de sódio
para pH 4,5 e 5,9 e tampão fosfato para pH 6,3 e 7,0) a 100 mM. Quando
adiciona-se 20% de etanol (v/v), observa-se uma pequena variação de 0,3 a 0,4
no valor de pH do meio, mas ao adicionar 60% esta variação alcança valores
de 1,0 a 1,2. A 80% de etanol as variações são de 1,3 a 1,9 do valor do pH.
Assim, uma precipitação iniciada no pH 4,6, pode, ao final da adição de 80% de
etanol, possuir um pH de 6,5. Torna-se, portanto, difícil de se executar uma
57
precipitação com etanol em pH fixo, utilizando estes tampões na concentração
de 100 mM. Sendo assim, não é possível otimizar a recuperação através do
ponto isoelétrico das enzimas xilanolíticas do P. janthine/lum, baseando-se nos
trabalhos de RODRIGUES (1997) e MILAGRES (1994), as quais isolaram e
caracterizaram 3 enzimas produzidas por este fungo nas mesmas condições
deste trabalho. Isto pode explicar a falta de influência do pH no planejamento
experimental (item 5.3).
Tabela 5.6 - Variação do pH mediante a adição de etanol ao meio fermentado
pH inicial % etanol pH após adição de
etanol
4,5 5,9 6,3 6,9
20
4,8
6,2
6,6
7,3
4,5 5,9 6,3 6,9
60
5,7
6,9 7,3
7,9
4,5 5,9 6,3 6,9
80
6,4
7,3
7,6
8,5
A Tabela 5. 7 apresenta os resultados da precipitação em uma única
etapa a pH 5, 9, onde foi calculado o aumento de pureza obtido para as enzimas
xilanases totais e para a í3-xilosidase. Como se pode verificar, a precipitação
em uma só etapa não proporciona aumento na pureza das enzimas analisadas,
pois os melhores resultados são de aumento de pureza próximo a 1. A
precipitação com etanol, desta forma aplicada, pode ser utilizada apenas como
técnica para concentrar as enzimas presentes no meio fermentado.
58
Tabela 5. 7 - Aumento de pureza das enzimas xilanases totais e 13-xilosidases
em função da concentração de etanol aplicada na precipitação do meio
fermentado.
Atividade específica (U/mg) Aumento de pureza (AP)
Fração xilanase 13-xi losidase xilanase 13-xilosidase
Inicial 280,66 1, 13 1,00 1,00
20% etanol 13,80 0,23 0,05 0,21
40% etanol 12,09 0,94 0,05 0,84
60% etanol 35,58 1,25 O, 13 1, 11
80% etanol 250,29 1,04 0,90 0,92
5.5 PRECIPITAÇÃO FRACIONADA DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS
Em função do perfil de recuperação, por precipitação com etanol, da 13-
xilosidase, xilanases totais e proteínas totais foram definidos os cortes para
realização de precipitação fracionada nas concentrações de 20, 60 e 80% de
etanol (v/v). Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 5.8.
Para o fracionamento inicial das enzimas foi escolhido o pH 4,6. Nesse
valor de pH, com a adição de 20% de etanol, obtém-se uma precipitação de
proteínas totais na ordem de 70% do total presente no meio fermentado antes
do fracionamento.
Juntamente com os contaminantes precipita-se 13-xilosidase e xilanases
totais em quantidades inferiores a 10% da atividade determinada inicialmente,
ou seja, há uma perda da ordem de 10% das enzimas presentes após
precipitação com etanol a 20%. Isto proporciona, portanto, a eliminação de
partes dos contaminantes presentes no meio fermentado por intermédio do
precipitado, com pequena perda de atividade das enzimas xilanolíticas.
59
Tabela 5.8 - Resultados obtidos pela precipitação fracionada
BETA XILOSIDASE
Amostra Proteína RP1 Ativ. RA2 AE3 p.p4
(mg) (%) (U) (%) (U/mg) (AE/IAI=.;~
Inicial 2,94 2,84 0,96 1,00
20% etanol 2,09 71 0,22 8 O, 11 O, 11
60% etanol 0,36 12 2,09 74 5,77 5,98 80% etanol 0,54 18 0,18 6 0,33 0,35
XILANASE
Amostra Proteína RP Ativ. RA AE AP
(mg) (%) (U) (%) (U/mg) (AEr/AEini)
Inicial 2,94 433,37 147, 17 1
20% etanol 2,09 71 25,70 6 12,32 0,08
60% etanol 0,36 12 29,40 7 80,99 0,55
80% etanol 0,54 18 351,55 81 646,04 4,39 1 R90.l~ de pcteína L R~ de Ativrl:de 3.Ativda:je Especffica 4Aurnento de p..ireza
5Ativdade Especffica final 6Ativdade Especffica incial .. ~_.,.,.
O segundo passo do fracionamento consiste em adicionar etanol ao
sobrenadante para que este atinja uma concentração de 60%. Nesta etapa
recupera-se aproximadamente 70% da 13-xilosidase presente no meio
fermentado e ocorre uma pequena precipitação das xilanases totais (perda
inferior a 10%), além da precipitação de aproximadamente 10% das proteínas
totais. A recuperação da !3-xilosidase é inferior às recuperações anteriormente
citadas (Figura 5.12), mas com um aumento de aproximadamente 6 vezes na
pureza em relação ao meio inicial. O precipitado desta etapa, enriquecido em 13-
xilosidase, ao ser dissolvido em tampão acetato de sódio (pH 5,5, 50 mM), em
igual volume ao anterior à precipitação (meio fermentado inicial), possui uma
condutância de aproximadamente 3 mS, bastante inferior à condutância da
amostra inicial (13 mS). Isto pode ser útil em etapas posteriores de purificação,
tal como extração líquido-líquido por micelas reversas, para a qual é necessário
uma condutância em torno de 7 mS para sua execução.
Na 3ª etapa, o sobrenadante recebe quantidade adicional de etanol
para atingir a concentração final de 80%. Desta forma, precipita-se
60
praticamente toda xilanase remanescente no meio fermentado, obtendo-se uma
recuperação de aproximadamente 80% e um aumento de pureza de 4,39 vezes
em relação ao meio inicial. Esta fração apresenta baixa atividade da enzima ~-
xilosidase (aproximadamente 6% da inicial) o que comprova o fracionamento
proporcionado pela precipitação com etanol das enzimas xilanolíticas
produzidas pelo fungo P. janthinellum.
Na Tabela 5.9 verifica-se o balanço de atividades enzimáticas das
xilanases totais e 13-xilosidase, e proteínas totais, da precipitação fracionada. O
balanço fecha em aproximadamente 100%, ou seja, a soma das proteínas
determinadas nas fases precipitadas é praticamente igual à proteína do meio
inicial. Portanto, as porcentagens de perdas de atividades enzimáticas de 6,2%
para as xilanases totais e 12,3% para a ~-xilosidase devem corresponder às
perdas de atividades causadas pelo etanol durante a precipitação.
Tabela 5.9 - Balanço de atividades enzimáticas e proteínas totais da
precipitação fracionada
Amostra Atividade (U) Proteínas - "
totais
xilanase ~-xilosidase (mg)
inicial 433,37 2,84 2,94
20% etanol 25,70 0,22 2,09
60% etanol 29,40 2,09 0,36
80% etanol 351,55 O, 18 0,54
Total 406,65 2,49 2,99
Perdas(%) 6,2 12,3 -1, 7
5. 6 - ELETROFORESE
Na eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foram
analisados os precipitados de cada etapa da precipitação fracionada,
juntamente com a amostra inicial, e possibilitou a constatação do fracionamento
das enzimas, como pode ser observado na Figura 5. 14. O meio fermentado
61
inicial analisado, linha 2 da eletroforese, permite verificar a presença de
proteínas com massas molares na faixa de 20, 30 e 100 kDa.
Na linha 3 (precipitação conduzida com 20% de etanol) foi observado
apenas uma leve impressão de proteínas na faixa de 30 kDa e 100 kDa. Isto
confirma os resultados obtidos mediante as medidas das atividades enzimáticas
citadas na Tabela 5.8, ou seja, pouca atividade xilanolítica foi precipitada nesta
etapa. Embora não haja bandas nítidas nesta fração, a análise de Bradford
indicou que ocorreu por volta de 70% de recuperação de proteínas totais. Isso
pode ser explicado pelo forte arraste observado nesta linha, o qual deve
corresponder à proteína determinada pelo método de Bradford.
Na linha 4 verifica-se bandas fracas na faixa de 20 e 30 kOa,
contrastando com bandas nítidas na faixa de 100 e 11 O kDa. Analisando esses
dados e comparando-os com os dados observados na Tabela 5.8, conclui-se
que essas bandas nítidas correspondem à í3-xilosidase, pois é esta fração que
apresenta o melhor aumento de pureza e recuperação desta enzima. Estes
resultados são semelhantes aos observados por VAN-PEIJ-N-N-M-E et ai.
(1997) que purificou e identificou por SDS-PAGE uma í3-xilosidase (massa
molar 11 O kOa) proveniente do Aspergillus niger cultivado em arabinoxilana. A
literatura indica que as í3-xilosidase são enzimas de massas molares na faixa de
60 a 360 kDa, embora algumas de tamanhos inferiores são reportadas.
Na linha 5 praticamente não é observado bandas na faixa de 100 e 11 O
kDa, e sim bandas nítidas entre 20 e 30 kDa. Conforme a Tabela 5.8 isto
corresponde à fração onde ocorre o enriquecimento da atividade de xilanases
totais e uma fraca atividade de í3-xilosidase. RODRIGUES (1997) constatou em
trabalhos de purificação das enzimas xilanolíticas produzidas pelo P.
janthinellum através da técnica de extração líquido-líquido por micelas reversas
que há no meio fermentado uma enzima, provavelmente uma endoxilanase, de
massa molar 20, 1 kDa. Possivelmente trata-se da mesma enzima citada neste
trabalho. MILAGRES (1994) purificou e caracterizou uma í3-xilosidase do meio
fermentado produzido por este mesmo fungo. A autora utilizou filtração gélica
em Coluna Sephacryl 300 S e ultrafiltração para obter uma banda em SDS-
PAGE, e através da mobilidade eletroforética relativa calculou a massa molar
como sendo de 74,3 kDa. Sendo uma glicoproteína, a maior massa molar da í3-
62
xilosidase deste trabalho ( 104 e/ou 11 O kDa) em relação à purificada por
Milagres (74,3 kDa), pode ser explicada pela perda de unidades de glicose
ocorrida durantes as etapas de purificação da enzima. VAN-PEIJ-N-N-M-E et ai.
(1997) isolou e caracterizou uma ~-xilosidase de massa molar de 85 kDa, a
qual, quando glicosilada, possui massa molar de 11 O kDa (possui 15 sítios de
glicosilação).
Na literatura pode-se encontrar xilanases com diversos valores de
massas molares, porém, uma quantidade expressiva são apresentadas na faixa
de 20 a 40 kDa.
Os resultados aqui obtidos mostram que a técnica de precipitação
fracionada com etanol apresenta boa seletividade mediante a diferença de
solubilidade apresentada pelas enzimas encontradas no meio fermentado. Esta
diferença de solubilidade pode ser explicada parcialmente devido às diferenças
apresentadas pelas massas molares, pois como já citado, a precipitação ocorre
com menores teores de etanol com as enzimas de maiores massas molares,
isso considerando que há semelhança de hidrofobicidade e de ponto isoelétrico
entre as enzimas fracionadas. Estes dois útimos parâmetros não foram
determinados neste trabalho.
63
2 3 4 5
Figura 5.14 - Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) das
etapas da precipitação fracionada: linha 1 - marcador de massa molar (66 kDa,
45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa e 20, 1 kDa); linha 2 - fração inicial; linha 3 -
precipitado obtido após precipitação com 20% de etanol; linha 4 - precipitado
obtido após precipitação com 60% de etanol (massas molares de 11 O e 104
kDa); linha 5 - precipitado obtido após precipitação com 80% de etanol (31, 30 e
20 kDa)
64
5. 7 - CONSTANTES CINÉTICAS DA /3-XILOSIDASE INICIAL E DA
RECUPERADA POR PRECIPITAÇÃO
Na Figura 5.15 verifica-se a atividade enzimática da enzima í3- xilosidase em função da concentração do substrato (pNpX) para a enzima
presente no meio fermentado e a enzima pré-purificada com precipitação
fracionada (20-60% de etanol). Não há diferenças significativas entre os perfis
das curvas da Figura 5.15, o que indica não haver alterações na cinética da
enzima quando precipitada por etanol. A Figura 5. 16 corresponde ao inverso
dos valores das atividades em função do inverso das concentrações do
substrato (Lineweaver-Burk), e foi construída para a determinação dos valores
de KM e Vm (Constante de Michaelis-Menten e Velocidade máxima,
respectivamente). A regressão linear dos pontos da Figura 5.16 permite obter
as equações das quais extraem-se os valores de KM e V m , que são
apresentados na Tabela 5.10.
0.40 • 1 0.35 • o o
• o 0.30 - o - o _J •~o E 0.25 ,P - :::> -------
(1.) 0.20 o Inicial
"O ,f • Precipitada (O o -------- "O 0.15 ·5 ~ ! ~ 0.10
O.OS !
0.00 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
pNpX (mM)
Figura 5. 15 - Atividade da í3-xilosidase presente no meio inicial (D) e após
precipitação fracionada com etanol(•) em função da variação da concentração
de substrato (pNpX) .
65
16.0
14.0
12.0 - ..J 10.0 E - :::> 8.0 - > y = 2,7409x + 2,6516
~ 6.0 R2 = 0,9955
..... 4.0
2.0
O.O-+---...----+--+--+--+--------- ........ -~ O.O 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
1/pNpX (mM)
Figura 5. 16 - Inverso dos valores da atividade da 13-xilosidase presente no meio
inicial (O) e após precipitação fracionada com etanol (•) em função do inverso
das concentrações do substrato (Lineweaver-Burk)
Tabela 5.10 - ~ e Vm da 13-xilosidase
Enzima ~(mM) Vm (U/ml)
meio fermentado
precipitada (20-60% etanol)
1,07 1.03
0,35
0,38
RISTROPH E HUMPHREY (1985) calcularam a velocidade de reação
da 13-xilosidase do caldo fermentado produzido por Thermomonospora e
obtiveram um~ de 0,82 mM e uma Vm de 0,0085 U/ml, utilizando pNpx como
substrato nas concentrações de 0,049 a 8,9 mM. O autor citou ainda ~
encontrados na literatura nos valores de 0,22, 1,43 e 3,01 respectivamente para
Arpergillus, Bacillus e Malbranchea. Isto implica que o l<M da ~-xilosidase, deste
trabalho (Tabela 5.1 O), é de um valor consistente com a literatura.
Outro valor semelhante para ~ da 13-xilosidase foi encontrado por
KUMAR e RAMÓN (1996) utilizando a mesma metodologia de medida de
atividade citada neste trabalho. O autor utilizou pNpX nas concentrações de 0,2 a 3,0 mM para uma 13-xilosidase purificada do Aspergillus nidulans, obtendo um
66
i<M de 1, 1 mM e uma Vm de 2,56 U/ml. A v,« citada neste trabalho (Tabela
5. 1 O) encontra-se num valor inferior a este, porém, bastante superior (44 vezes)
ao citado por RISTROPH E HUMPHREY (1984), e assim, como o KM ,
compatível com os dados da literatura.
Estes valores de KM e V m podem ser diferentes do que seria
encontrado se a enzima estivesse pura, pois trata-se de dados extraídos do
meio fermentado e da enzima parcialmente purificada. Entretanto, são valores
com uma boa aproximação das reais condições em aplicações industriais, pois
enzimas xilanolíticas normalmente não são aplicadas na forma pura.
67
6 - CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho levaram às seguintes conclusões:
1. As técnicas de precipitação por adição de etanol e por adição de sulfato de
amônio mostraram-se satisfatórias na recuperação da atividade das xilanases
totais. A adição de metilcelulose no meio fermentado possibilitou diminuir a
quantidade de sulfato de amônio necessário para a precipitação. A precipitação
com sulfato de sódio apresentou resultados inferiores ao etanol e ao sulfato de
amônio.
2. O pH não interferiu na recuperação da atividade das enzimas xilanolíticas por
precipitação com etanol.
3. As xilanases totais, 13-xilosidase e proteínas totais apresentaram
solubilidades diferenciadas após a adição de etanol, o que possibilitou a
realização de precipitação fracionada com obtenção de aumento de pureza das
enzimas. A diferença de massa molar das !3-xilosidases, quando comparada
com às outras enzimas xilanolíticas, deve ter contribuído para esta diferença de
solubilidade.
4. As xilanases totais possuem massa molar entre 20 e 30 kOa, segundo a
eletroforese em gel de poliacrilamida da precipitação fracionada por etanol,
enquanto que a !3-xilosidase possui massa molar entre 104 e 11 O kDa.
5. Os parâmetros cinéticos da 13-xilosidase (KM e Vm) após precipitação
fracionada com etanol (20-60 % v/v) foram semelhantes à enzima antes da
recuperação.
68
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78
APÊNDICE
Apêndice 1
Tabela 1- Referente à Figura 5.1. Porcentagem de proteínas totais e de
atividade de xilanases solúveis após a precipitação conduzida em meio
tamponado com tampão acetato 50 mM, pH 5,5, em função da concentração de
etanol, na temperatura de 4°C.
% de etanol atividade (%) proteínas totais(%)
o 100 100
10 96 76
20 96 73
30 95 69
40 96 69
50 93 66
60 73 60
70 31 52
80 1 32
Tabela 2 - Referente à Figura 5.2. Recuperação das xilanases totais em função
da precipitação com sulfato de amônio
% sulfato de amônio (saturação) recuperação da atividade (%)
o 10
20
30
40
50
60
4
4
5 8
27
105
101
Tabela 3 - Referente à Figura 5.3. Recuperação da atividade das xilanases
totais em função da precipitação com sulfato de amônio e com sulfato de
amônio na presença de 0, 1% de metilcelulose
% sulfato de amônio rec. da ativ. (%)
(saturação) (com metilcelulose)
rec. da ativ. (%)
(sem metilcelulose)
O 8 10 9
20 10
4
4
5 30
40
50 60
15
104
111
104
8
27 105 101
Tabela 4 - Referente à Figura 5.4. Recuperação das xilanases totais e
proteínas totais em função da precipitação com sulfato de sódio
% sulfato de sódio (p/p) recuperação da atividade recuperação das proteínas
(%) totais (%)
5 19 19
15
25 40 60
33
72 64 50
40 58
68
63
Tabela 5 - Referente à Figura 5.5. Interferência em mg/L na concentração de
proteínas totais causada pelo etanol na microanálise de Bradford
% etanol proteína (mg/L)
20 4
40 11
60 20 80 31
100 49
Tabela 6 - Referente à Figura 5.7. Recuperação (%) das enzimas xilanases
totais, f3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6
etanol(%) rec. xilanase (%) rec f3-xilosidase(%) rec. prot. tot. (%)
20 5 10 78
40 5 78 60
60 11 91 61
80 82 89 89
Tabela 7 - Referente à Figura 5.8. Recuperação (%) das enzimas xilanases
totais, 13-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5, 9
etanol(%) rec. xilanase (%) rec 13-xilosidase(o/o) rec. prot. tot. (%)
20 2 8 24
40 --
3 55 38 - - 60 11 95 44
80 97 99 91
Tabela 8 - Referente à Figura 5.9. Recuperação (%) das enzimas xilanases
totais, !3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3
etanol(%) rec. xilanase (%) rec f3-xilosidase(%) rec.prot. tot.(%)
20
40
60
80
2 1 24
6 83 38
10 99 44
95 99 91
Tabela 9 - Referente à Figura 5.10. Recuperação (%) das enzimas xilanases
totais, í3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 7,0
etanol(%) rec. xilanase (%) rec ~-xilosidase(%) rec. prot. tot. (%)
20 3 5 24
40 4 75 38
60 17 89 51
80 83 94 97
Tabela 1 O - Referente à Figura 5.11. Recuperação por precipitação com etanol
das xilanases totais em diversos valores de pH.
etanol(%) rec. xilanase (%)
pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0
5 2 2 3
5 3 6 4
11 11 10 17
82 97 95 83
20
40
60
80
Tabela 11 - Referente à Figura 5.12. Recuperação por precipitação com etanol
da ~-xilosidase em diversos valores de pH.
etanol(%) rec. í3-xilosidase (%)
pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0
10 8 1 5
78 55 83 75
91 95 99 89
89 99 99 94
20
40
60
80
Tabela 12 - Referente à Figura 5.13. Recuperação por precipitação com etanol
das proteínas totais em diversos valores de pH.
etanol(%) rec. proteínas totais(%)
pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0
20 10 8 1 5
40 78 55 83 75
60 91 95 99 89
80 89 99 99 94
Tabela 13 - Referente à Figura 5.15. Atividade da J3-xilosidase presente no meio
inicial e após a precipitação fracionada com etanol (20-60% v/v) em função da
variação da concentração de substrato (pNpX)
concentraçaõ de atividade meio inicial
pNpX (mM) (U/ml)
0,25 0,07
0,50 O, 11
1,00 0, 17
1,50 0,20
2,00 0,23
2,50 0,24
3,00 0,25
4,00 0,27
5,00 0,28
6,00 0,29
8,00 0,31
10,00 0,33
12,50 0,35
15,00 0,36
20,00 0,38
atividade precipitado
(U/ml)
0.07
0.12
0.18
0.23
0.25
0.26
0.28
0.28
0.33
0.35
0.38
0.38
Tabela 14 - Referente à Figura 5.16 - Inverso dos valores da atividade da f3- xilosidase presente no meio inicial e após a precipitação fracionada com etanol
em função da variação da concentração de substrato (pNpX)
1 1
cone. pNpX (mM) ativ. Meio inicial (U/mL)
4,00 14,72
2,00 9,17
1,00 5,91
0,67 5,06
0,50 4,33
0,40 4,10
0,33 4,01
0,25 3,69
0,20 3,63
0, 17 3,39
0, 13 3,19
0, 10 3,05
0,08 2,85
0,07 2,79
0,05 2,64
1
ativ. precipitado (U/mL)
13,34
8,66
5,41
4,41
4,08
3,83
3,60
3,52
2,99
2,87
2,63
2,61