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8!BliOTECA~NST'TUrODE QUíRfliCAUmv€rsidarie de São Paulo
~.~;76
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Instituto de Química
Departamento de Bioquímica
Efeitos de lípides sintéticos na solubilização e
estabilidade coloidaI do miconazol e sobre
células de Candida albicans
Luis Femando~checo Otálora
Tese de Doutorado
ORIENTADORA: Prof. Dra. Ana Maria~Carmona-Ribeiro
São Paulo 2004
íNDICE
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1. - INTRODUÇÃO 2
1.1.- SICAMADAS LIPíDICAS .41.2.- SICAMADA DE ANFIFíLlCOS SINTÉTICOS 51.3.- MEMBRANAS BIOLÓGiCAS 8
1.3. 1. - Parede celular de procariotos.. 131.3.2. - Membrana de eucariotos e parede celular de fungos 151.4.1.- Polienos 21
1.4.1.1.-Formulaçães Lipídicas dos Políênícos 231.4.2.- Azóis 25
1.4.2.1.-Novos azólicos 311.4.3.- Nova Classe de Antifúngicos: os Lipopeptídeo 32
1.5.- lipOSSOMOS COMO CARREADORES DE AGENTES ANTIMICROBIANOS 331.6.- INTERAÇÃO ENTRE BROMETO DE DIOCTADECILMETILAM<JNIO OU DIHEXADECILFOSFATO DE SÓDIO E CÉLULAS 391.7.- PRINCípIOS TEÓRICOS DOS MÉTODOS UTILIZADOS 41
1.7.1.- Isotermas de adsorção 411.7.2.- Mobilidade eletroforética e determinação de potencial zeta 431.7.3.- Espectrofotometria de UV-visível 481.7.4.- Espalhamento de luz dinâmico 49
2. • OBJETiVOS 52
PARTE I: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO DE MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA CATI<JNICO (DaDAS) 52PARTE 11: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO E/OU ESTABILIZAÇÃO COLOIDAL DO MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA
ANI<JNICA (DHP) 52PARTE 111: ASPECTOS FíSICQ-QuíMICOS DA INTERAÇÃO ENTRE ANFIFiLlCOS CATI<JNICOS DE DaDAS E CÉLULAS DE C.
ALBICANS.............. 53
3.- MATERIAIS E MÉTODOS 53
3.1.- REAGENTES 533.2.- EQUIPAMENTOS 54
3.2.1.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus) para determinações de diâmetro médio das partículas emdispersão 543.2.2.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus) para determinações do potencial zeta das partículas emdispersão 553.2.3.- Espectrofotómetro Hitachi-Modelo U-2000 553.2.4.- Espectrofotómetro (Model Spectrascan 2800 CIBA-CaRNING) 563.2.5.- Sonicador Lab-Line UltraTip (Modelo 9100 com tip de titânio) 563.2.6.- Centrífugas 57
3.3.- MÉTODOS PREPARATIVOS PARA OBTENÇÃO DAS DISPERS<JES DE LIPíDIOS, DROGA E CÉLULA 573.3.1.- Dispersão de lípides sintéticos por sonicação com sonda 573.3.2.- Dispersão de lípides sintéticos por injeção clorofórmica 573.3.3.- Dispersão de fosfatidilcolina ou brometo de dioctadecildimetilamônio por injeção etanólica583.3.4.- Dispersão de brometo de dioctadecildimetila-mônio por aquecimento e agitação 583.3.5.- Preparação da solução estoque de miconazol 583.3.6.- Cultivo de Candída albícans, determinação da curva de crescimento e contagem de célulasem câmara de Neubauer 59
3.4.- MÉTODOS ANALíTICOS 613.4.1.- Determinação da concentração de fosfati-dilcolina e dihexadecilfosfato por dosagem defósforo inorgânico 613.4.2.- Determinação da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio por microtitulação
................................................................................................................................................. 633.4.3.- Determinação da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio pelo método de Brij
................................................................................................................................................. 63
3.5.- DETERMINAÇÃO DE TAMANHO E POTENCIAL-ZETA DAS PARTícULAS 673.6.- DETERMINAÇÃO DE ISOTERMA DE ADSORÇÃO DE BROMETO DE DIOCTADECILDIMETILAMÔNIO SOBRE CÉLULAS DE
C. ALBICANS 683.7.- DETERMINAÇÃO DE ADSORÇÃO DE BROMETO DE DIOCTADECILDIMETILAMÔNIO SOBRE C. ALBICANS 693.8.- DETERMINAÇÃO DA MOBILIDADE ELETROFORÉTICA 69
4. - RESULTADOS E DiSCUSSÃO 72
PARTE I: ESTUDO DASOLUBILlZAÇÃO DE MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADACATIÔNICO (DODAB) 724.1.- Características das dispersões de Iípides: 724.2.- Solubilização de miconazol em dispersões de Iípides por espectroscopia de UV-Visível 744.3.- Absorptividade molar (c) do miconazol em algumas dispersões lipídicas 754.4.- Solubilização de miconazol em dispersões de brometo de dioctadecildimetilamônio ou defosfatidilcolina 764.5.- Inserção de miconazol nas bicamadas vista por determinações de diâmetro médio (Oz) epotencial zeta (Ç) 79
CONCLUSÕES 80
Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de bicamada catiônico (OOOAB) 80PARTE 11: ESTUDO DA SOLUBILlZAÇÃO E/OU ESTABILIZAÇÃO COLOIDAL DO MCZ EM FRAGMENTOS DE BICAMADA
ANIÔNICA (DHP) 814.6.- Floculação ou estabilização de dispersões de miconazol por bicamadas de OHP 814.7.- Efeito de concentração de miconazol em pH 6,3 sobre sua agregação em dihexadecilfosfatode sódío 0,05 mM. 824.8.- Efeitos de pH sobre o diâmetro médio (Oz) e potencíal zeta (Ç) de dispersões de droga,dihexadecilfosfato de sódio ou dihexadecilfosfato de sódio e droga 844.9.- Efeito de concentração de dihexadecilfosfato de sódio sobre a cinética de agregação dadroga 0.2 mM, em diferentes pHs 87
CONCLUSÕES 89
Parte 11: Estudo da solubilização e/ou estabilização coloidal do MCZ em fragmentos de bicamadaaniônica (OHP) 89
PARTE 111: ASPECTOS FíSICO-QuíMICOS DA INTERAÇÃO ENTRE ANFIFíLlCOS CATIÔNICOS DE DODAB E CÉLULAS DE C.ALBICANS 90
4.10.- Interação entre bicamadas catiônicas e células de Candida albicans 904.10.1.- Isoterma de adsorção de brometo de dioctadecildimetilamônio em células de Candidaalbicans fixa a concentração de células em 10
8células/mL 91
4.10.2.-Efeito da concentração de células sobre a adsorção de DODAB.................................................................................................................................................................94
4.10.3.- Efeíto da concentração de brometo de díoctadecildimetilamônio sobre a mobilidadeeletroforétíca das células 96
CONCLUSÕES 99
Parte 111: Aspectos físico-químicos da interação entre anfifílicos catiônicos de OOOAB e células de C.albícans 99
5.- PERSPECTiVAS 10O
6.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101
1
Dedico este trabalho à minha família.
Obrigado pela paciência e força
"Escolha um trabalho que você ame e não terás que trabalhar um único dia em sua vida ". (Confúcio)
A minha amiga, amante e se Deus,
quiser, minha esposa Karen.
"O amor talvez seja o único olhar que possamos lançar à eternidade", (Helen Haynes)
AGRADECIMENTOS BIBLIOTECAiNSTiTUTO DE QUíMICAUOlversida,je de São Paulo
À Dra. Ana Maria Carmona-Ribeiro, pela orientação, apoio e incentivo.
Aos colegas do Laboratório, que decisivamente contribuíram para realização
desse trabalho: Edla, Claudia, Débora, Nilton, Felipe, e Sergio. Em especial a
Débora e Sergio pela grande ajuda na digitação da Tese.
A cada uns de vocês pela paciência e compreensão nestes últimos quatro
anos, pelos intermináveis cafezinhos, e as conversas nos corredores que terminavam
em discussões e brigas intelectuais. Bom gostaria de falar de cada uns de vocês mais
eu não terminaria esta tese... , então decidi identificara a cada uns vocês com uma
frase celebre.
Edla. "Nós geralmente descobrimos o que fazer percebendo aquilo que não devemos fazer. E
provavelmente aquele que nunca cometeu um erro nunca fez uma descoberta ".(Samuel Smiles)
Claudia. "Hay que endurecerse sin perder la ternura, jamas ". (Che Guevara)
Débora. "Qualquer um pode zangar-se - isto é fácil. Mas zangar-se com a pessoa certa, na medida certa,
na hora certa, pelo motivo certo e da maneira certa - não é fácil". (Aristóteles)
Nilton. "O importante é o principal. O resto é secundário ".
Felipe. "Eujá não sou o que era: devo ser o que me tornei". (Coco Chanel)
Sergio. "Há duas coisas infinitas: o Universo e a tolice dos homens ". (Alhert Einstein)
suporte financeiro da FAPESP e CNPq que amparou o laboratório de Biocolóides e à CAPES pela
bolsa de Doutorado concedida. Ao Instituto de Química da USP pelas facilidades oferecidas.
A Diego y esposa por la facilidades que me brindaron a mi llegada a Brasil, a
Miguel y Glenda por el apoyo en estos últimos aftos, a los Toribios por sua amistad y apoyo
en todo momento, a Frejol por su amistad y ayuda desinteresada, aI sapito por sus criticas y
comentários en el desarrollo de esta tesis, a papa Celso por su objetividad y ayuda para
resolver problemas aI tigre a coyote por los buenos momentos pasados em CRUSP
AS
[AnB]
ATCC
DODAB
DHP
Dz
BF
GUV
LV
L-AnB
LUV
ME
[MCZ]
MCZ-DODAB
MCZ-DHP
MCZ-BF
MCZ-LV
MCZ-PC
MLV
N s
PC
SUV
TEM
Tc
UFC
UV
ç
Àmax.
LISTA DE ABREVIATURAS
Ágar Sabouraud
Concentração de anfotericina B
American Type Culture Collection
Brometo de dioctadecildimetilamônio
Dihexadecilfosfato de sódio
Diâmetro de partículas obtido por espalhamento de luz dinâmico
Fragmentos de bicamada
Vesículas unilamelares gigantes
Vesículas grandes
Formulação liposomal de anfotericina B
Vesículas unilamelares grandes
Mobilidade eletroforética
Concentração de miconazol
Miconazol solubilizado em DODAB
Miconazol solubilizado em DHP
Miconazol solubilizado em BF
Miconazol solubilizado em LV
Miconazol solubilizado em PC
Vesículas multilamelares
Parâmetro geométrico
Fosfatidilcolina
Vesículas unilamelares pequenas
Microscopia eletrônica de transmissão
Temperatura de transição de fase
Unidade formadora de colônia
Ultra-violeta
Potencial zeta
Comprimento de onda correspondente a um máximo de absorção de
luz
RESUMO
Bicamadas de lípides sintéticos como o brometo de dioctadecildimetilamônio
(DODAB) ou dihexadecilfosfato de sódio (DHP) foram avaliadas como carreadores em
potencial de miconazol (MCZ), uma droga altamente hidrofóbica. A solubilização e/ou
estabilização do MCZ foi avaliada através de métodos de espectrofotometria no UV-visível,
determinações de tamanho por espalhamento de luz dinâmico, determinações de potencial
zeta e cinéticas de agregação da droga por medidas turbidez em presença ou ausência das
dispersões dos anfifílicos. Os resultados mostram que há uma notável capacidade de
solubilização de MCZ em fragmentos de membrana (BF) de dispersões de DODAB, o que
não ocorre para vesículas grandes (LV) dos mesmos anfifilicos. Ainda, demonstrou-se uma
evidente estabilização coloidal do particulado de droga em dispersão aquosa por deposição
de bicamadas aniônicas de DHP sobre os grânulos catiônicos do miconazo1. Em elevadas
proporções molares drogai lípide sintético observou-se um aumento na estabilidade coloidal
do particulado de droga que foi atribuído ao recobrimento do particulado catiônico de droga
com bicamadas aniônicas. Posteriormente, foram avaliadas as possíveis interações
existentes entre células de Candida albicans e fragmentos e/ou vesículas de DODAB.
Isotermas de adsorção foram obtidas em função do método de dispersão, concentração do
anfifílico e densidade numérica de células. Para os fragmentos de bicamada, as isotermas
mostraram-se de alta afinidade (adsorção não-reversivel) não havendo desorção, ao
contrário do resultado obtido para as vesículas grandes, onde foi observada desorção a
partir da superficie celular. A desorção é favorecida pelo aumento da quantidade de
vesículas livres no sobrenadante, sugerindo assim que existe uma significante interação
intervesicular de natureza hidrofóbica entre DODAB adsorvido e as vesículas livres.
Experimentos de mobilidade eletroforética (ME) mostram a mesma tendência. Dois tipos
de interações puderam ser notados. As interações de natureza eletrostática estão presentes
em ambas condições (interação das células com fragmento e/ou vesícula). A interação
ocorre entre a cabeça carregada do anfifilico e a membrana do fungo. Interações
hidrofóbicas possivelmente ocorrem somente em fragmentos de bicamada devido a
interações extra-atrativas entre regiões hidrofóbicas da parede celular e as bordas
hidrofóbicas dos fragmentos.
ABSTRACT
Bilayer of synthetic lipids such as sodium dioctadecyldimethylarnrnoniurn bromide
(DüDAB) or dihexadecylphosphate (DHP) were assessed as potential carriers for
miconazol (MCZ), a very hydrophobic drug. The solubilization anel/or stabilization of the
drug were tested by UV-visible spectrophotometry methods, size deterrninations by
dynamic light scattering, zeta-potential detenninations and drug aggregations kinetics by
turbidity changes in the presence or absence of amphiphiles dispersions. Our results show
an outstanding capacity solubilization of MCZ in bilayer fragrnents (BF) of DODAB
dispersions, what doesn't occur with large vesicles (LV) from the same amphiphiles. Still,
we have demonstrated a colloidal stabilization of drug partic1es in water dispersion by
deposition of anionic bilayers of DHP on the cationic MCZ granules. In high molar ratio
drug/synthetic lipid we observed an increasing colloidal stabilization of drug partic1es that
was attributed to the covering of the drug cationic partic1es with anionic bilayers.
Subsequent1y, were evaluated the possible interactions that existed between Candida
albicans cells and DODAB fragrnents anel/or vesic1es. Adsorption isotherrns were obtained
as a function of the method of dispersion, concentration of the amphiphiles and cells
number density. For the bilayer fragrnents, the isotherrns showed high affinity (irreversible
adsorption) without desorption, in contrast with the isotherrns obtained for large vesic1es,
where we observed desorption of these vesic1es over the cellular surface. The desorption
was favored by the increase of free vesic1es in the supematant, thus suggesting that there is
a significant inter-vesic1e interaction ofhydrophobic nature between adsorbed DODAB and
the free vesic1es. Electrophoretic mobility (ME) experiments showed the same tendency.
Two types of interactions could be observed. The electrostatic nature interactions were
present in both conditions (cellular interaction with fragrnent and/or vesic1e). The
interaction occurs between the charged head of the amphiphilic and the fungus membrane.
Hydrophobic interactions possibly only occur with bilayer fragrnents due the extra
attractive interaction existing between hydrophobic regions of the cell wall and the
hydrophobic borders ofthe fragrnents.
1. - INTRODUÇÃO
Ao longo do tempo, a utilização da maioria dos compostos terapêuticos tem sido
limitada pela impossibilidade do aumento da sua dosagem. A retenção ou degradação
do agente terapêutico; baixa solubilidade e, em especial, os efeitos colaterais inerentes à
sua utilização em concentrações elevadas, tomam muitas vezes difícil à utilização da
dosagem necessária para que este cumpra sua função. Este problema levou, durante o
século XX, e em especial no decorrer das ultimas décadas, que houvesse um grande
esforço no sentido de desenvolver um sistema capaz de carrear um composto
terapêutico (drogas, em especial as dirigidas a tumores, antibióticos, enzimas, agentes
quelantes ou compostos modificadores da célula).
A primeira proposta de um sistema direcionado de carreamento de fármacos data
do início do século XX (EHRLICH, 1906) quando Paul Ehrlich propôs o seu modelo,
que ficou conhecido por "Bala Mágica de Ehrlich" (Ehrlich 's Magic Bullet). Neste
modelo, o fármaco é ligado ao carreador direcionado, e idealmente exibirá a sua
atividade farmacológica apenas no tecido alvo (mecanismos de especificidade, como a
ligação entre antígeno e anticorpo, eram já conhecidos). Assim, os efeitos indesejáveis
resultantes da sua ação em outros tecidos são largamente diminuídos, enquanto o
aumento da eficiência permite o aumento da dose administrada. Porém, por mais
atrativos e simples que possam parecer os conceitos de Ehrlich, são muito poucos os
sucessos até agora obtidos (CAMMAS & KATAüKA, 1996). As primeiras tentativas
para a obtenção de um sistema carreador eficaz tiveram como base o encapsulamento
das biomoléculas a serem transportados em vesículas de nylon e outros polímeros
sintéticos (CHANG, 1964; 1968 e 1971). Contudo, esta abordagem mostrou-se
totalmente inadequada, visto que estas vesículas de material artificial se acumulam no
orgamsmo.
ü primeiro grande passo em frente nesta área deu-se em 1965, com a publicação
por Alec Bangham e colaboradores de um trabalho de investigação fundamental sobre a
difusão de íons através de membranas lipídicas artificiais, embora sem qualquer ligação
imediata aos estudos de sistemas carreadores de fármacos (BANGHAM et al., 1965).
Neste trabalho foi feita a caracterização de um sistema de vesículas fosfolipídicas ao
qual, três anos mais tarde, seria dado o nome de lipossomos (SESSA & WEISSMANN
1968). No entanto, estas estruturas multilamelares obtidas da hidratação de fosfolipídios
SIBlIOI:INSTITUTO DE Ql
já eram anteriormente conhecidas, sendo denominadas "figuras de mielina" Universidade de Sãl
(STOECKENIUS, 1959). Imediatamente após o trabalho de Bangham, os lipossomos
Impuseram-se como um sistema modelo simples para o estudo de membranas
biológicas. O sucesso da incorporação de enzimas em lipossomos (SESSA &
WEISSMANN 1970) despertou também o interesse da comunidade científica para a sua
aplicação médica e farmacológica. Em 1971, Gregory Gregoriadis propôs pela primeira
vez a utilização dos lipossomos como sistema carreadores de fánnacos
(GREGORIADIS et aI., 1971), mantendo desde então um papel preponderante no
desenvolvimento desta área.
Os lipossomos são um caso evidente de um sistema que teve uma passagem
extremamente rápida do campo da investigação para a aplicação comercial
(especialmente na área da cosmética), sem mesmo que as suas propriedades e eficácia
estivessem completamente estudadas (GREGORIADIS, 1994). Este fato ficou a dever
se, fundamentalmente, à euforia desencadeada na década de 70 e início da década de 80
pelo potencial de aplicação dos lipossomos nas industrias médica e farmacêutica, o que
veio mesmo a lançar sérias dúvidas sobre o rigor de alguns resultados relevantes
(LASIC, 1992).
O uso de sistemas artificiais capazes de carrear uma droga, genes, ácidos
nucléicos terapêuticos, como antisense de oligonucleotídeos (ONs), ribozimas e DNA
plasmidial oferecem uma estratégia potencial para alvos específicos de enfermidades
celulares a nível molecular (CEVC, 2004; SCHNYDER, et aI. 2004; SCHIFFELER,
2003; ARIKAN & REX, 2001; STUAR & ALLEN, 2000; AGRAWAL & ZHANG,
1997; HERBRECHT, et al., 2003). No entanto, estas macromoléculas polianiônicas ou
drogas hidrofóbicas possuem algumas características inerentes que restringem sua
utilidade pré-clinica e clinica, na terapia de enfermidades crônicas, devido à dificuldade
destes serem administrados intracelularmente e, sua rápida eliminação pelo sistema
reticulo endotelial, ou degradação e inativação por exo e endo nucleases do plasma ou
da célula (AKHTAR et aI., 1991). A encapsulação de drogas de importância clinica em
vesículas lipídicas ou lipossomos vem sendo avaliada para aumentar a eficiência e
entrega ao órgão alvo (TEMPLETON, 2003; GARCIA-CHAUMONT et aI., 2000;
SEMPLE et aI., 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003; VIEIRA &
CARMONA-RIBEIRO, 2001; LINCOPAN & CARMONA-RIBEIRO, 2003).
Lipossomos catiônicos são comumente os mais usados como sistema de entrega de ONs
ou genes (DASS & SU, 2000; AGRAWAL & IYER, 1997). Três modelos de interação
3
do complexo lipossomos catiônicos/ONs com células são propostos (i) a fusão direta
com membranas lipídicas (ii) endocitose e fusão ou desestabilização com a membrana
do endosomo e (iii) transposição através de poros da membrana plasmática.
A interação eletrostática de lipossomos catiônicos com membranas lipídicas
carregadas negativamente, facilitam o processo de fusão (MONKKONEN & URTTI,
1998). A interação de ONs com lipossomos catiônicos facilita o ingresso dentro da
célula via endocitose (ZELPRATI & SZOKA, 1996; JAASK.ELAINEN et aI., 1998).
Não obstante, a eficiência na encapsu1ação assim como a entrega ao órgão alvo in vivo,
se vê dificultada pela rápida desestabilização dos lipossomos catiônicos por proteínas do
soro ou do sistema imune (CICCARONE et aI., 1993). Melhoras na estabilização assim
como o aumento no tempo de circulação se viu facilitado com o emprego de polímeros
ou 1ipídeos modificados com po1ieti1enog1icol (PEG), tanto como seu direcionamento
com vetores ou anticorpos que reconheçam receptores específicos no endotélio do
cérebro como a transferrina (SINGR, 1999; LI & QIAN, 2002).
Sistemas carreadores de droga, como os 1ipossomos, terão um futuro brilhante
como componentes de fármacos por diversas razões: (i) Aspectos como a entrega
passiva à alvos específicos, podem substancialmente aumentar a quantidade de droga
em sítios infectados. (ii) A tecnologia destes carreadores segue o índice terapêutico para
drogas já previamente estabelecidas. Isto remove alguns dos riscos consideráveis
associados com o desenvolvimento de novas drogas. (iii) Novas drogas com alto
potencial farmacêutico estão surgindo com os avanços da biotecnologia, que podem se
constituir de biomoléculas como proteínas, peptídeos, ONs, e plasmídeos. O
desenvolvimento clínico destes tipos de drogas 7dependem, muitas vezes, da sua
associação à um carreador (ALLEN, et aI., 2004).
1.1.- Bicamadas lipídicas
A bicamada lipídica é a estrutura básica comum a todas as membranas
biológicas e, como nos lipossomos, serve como uma barreira impermeável à maioria dos
íons e moléculas hidrossolúveis. Nas células, as membranas associadas a proteínas,
viabilizam o transporte de determinados solutos, ou seja, as membranas são
impermeáveis a compostos para os quais dispõem de transportadores específicos.
A formação de bicamadas lipídicas é um processo de automontagem. Em outras
palavras, a estrutura de uma lâmina bimolecular é inerente à estrutura das moléculas
4
lipídicas constituintes, e decorrente de seu caráter anfipático. As interações hidrofóbicas
se constituem na principal força diretora da formação de bicamadas lipídicas. Moléculas
de água são liberadas das caudas hidrocarbônicas dos lipídeos quando estas ficam
seqüestradas no interior apoIar da bicamada. Além disso, há forças atrativas de van der
Waals entre as caudas, favorecendo o seu íntimo empacotamento. Finalmente, existem
ainda interações de pontes de hidrogênio entre as cabeças polares dos lipídios e as
moléculas de água. Desse modo, as bicamadas lipídicas são estabilizadas por todo o
conjunto de forças que participam nas interações intermoleculares em sistemas
biológicos.
Outra característica importante das bicamadas lipídicas se deve ao fato desta
formar estruturas cooperativas que são mantidas juntas por interações não covalentes de
reforço. A aglomeração é também favorecida pelas forças atrativas de van der Waals
entre cadeias hidrocarbônicas adjacentes. Esses fatores energéticos possuem três
conseqüências biológicas significativas: (i) as bicamadas lipídicas possuem uma
tendência inerente a serem extensas, (ii) as bicamadas lipídicas tendem a fechar-se sobre
si mesmas para que não haja bordas com cadeias hidrocarbônicas expostas, o que
resultaria na formação de um compartimento e (iii) as bicamadas são autoselantes
porque um orifício em uma bicamada é energeticamente desfavorável (STRYER, 1996).
Em uma situação ideal, a bicamada se estenderia indefinidamente na direção lateral. Na
realidade, amostras finitas, como fragmentos de membrana, mostram defeitos
hidrofóbicos nas bordas (HAMMARSTROM, et aI., 1995), e bicamadas tendem a
fechar sobre si mesmas, formando estruturas conhecidas como lipossomos (EVANS &
WENNERSTRÓM, 1994).
1.2.- Bicamada de anfifílicos sintéticos
Bicamadas formadas por moléculas de anfifilicos têm uma posição central no
estudo de auto-organização, apresentando papel crucial em processos biológicos e
industriais (EVANS & WENNERSTRÓM, 1994). Para formar bicamadas os anfifilicos
devem possuir forma molecular cilíndrica. O tamanho e forma do agregado de anfifílico
são dependentes dos parâmetros moleculares (volume da porção hidrofóbica da
molécula, comprimento de cadeia, e área da cabeça polar) e variáveis intensivas
(temperatura e força iônica). O modelo de auto-associação de Israelachvili prevê o
agregado ótimo para um determinado conjunto de parâmetros moleculares e variáveis
5
Oit.~,_ .._ ...... ,"\
INSTITUTO DE {)UiMICAUniversidade de São Paulo
intensivas usando um critério de minimização de energia livre para o monômero no
agregado (ISRAELACHVILI et a1., 1977).
Pode-se assumir que a energia livre de auto-associação dos surfactantes em
soluções diluídas é constituída de três termos (EVANS & WENNERSTROM, 1994):
- Uma favorável contribuição hidrofóbica, devido às cadeias hidrofóbicas isoladas no
interior do agregado.
- Um termo de superficie, que reflete duas tendências opostas dos grupos polares: i) a
tendência de se aglomerarem para minimizar o contato entre as cadeias hidrocarbônicas
e a água; ii) a tendência de se manterem separados, decorrente da repulsão eletrostática,
repulsão de hidratação e impedimento estérico.
- Um termo de empacotamento, que no nível mais simples, requer que o interior
hidrofóbico do agregado exclua a água.
Termos de superficie e empacotamento assumem diferentes formas funcionais
para cada agregado geométrico específico. A forma que dá o mínimo de energia livre
para um determinado conjunto de condições determina a estrutura ótima do agregado.
Para soluções diluídas em que interações entre agregados não são importantes,
pode-se assumir essas concepções convenientemente no parâmetro geométrico (Ns), que
é dado por:
N _ vs - .
aol
Eq.1.2.1
onde, v é o volume da porção hidrofóbica da molécula do surfactante; I é o comprimento
da cadeia hidrocarbônica e ao é a área ótima da cabeça polar.
Além dos aspectos energético-estruturais, uma série de outras propriedades se
originam devido às características coloidais destes agregados supramoleculares. Como
já foi dito anteriormente, esses agregados estão dispersos num meio, apresentando uma
interface de separação bem definida. Estas interfaces são geralmente regiões de alta
energia livre onde fenômenos de superficie, tais como adsorção e formação de duplas
camadas elétricas podem ocorrer.
Lipídios que formam bicamadas são aqueles que não podem empacotar em
estruturas micelares devido à sua cadeia hidrocarbônica muito volumosa para se ajustar
em agregados micelares, enquanto mantêm uma área superficial ótima. Para lipídios
formadores de bicamadas, o valor de v/(aolJ deve ser próximo de 1 e, para que isso
ocorra é necessário que a área do grupo polar, ao, e o comprimento da cadeia
6
hidrocarbônica, I, sejam iguais aos valores dos lipídios formadores de micela, e o
volume da cadeia hidrocarbônica, v, deve ser cerca de duas vezes aquele dos lipídios
formadores de micela. (para que v/(ao!) esteja entre 113 e 112). Por essa razão, lipídios
com duas cadeias são prováveis formadores de bicamadas e, de fato, a maioria deles
formam bicamadas. Por exemplo, lisolecitinas formam micelas pequenas, mas não
esféricas, enquanto lecitinas com duas cadeias formam bicamadas.
A Tabela 1.2.1 ilustra a associação entre o parâmetro geométrico e os agregados
supramoleculares formados. À medida que o parâmetro geométrico aumenta, a estrutura
supramolecular formada também aumenta.
Particularmente, o aumento do volume hidrocarbônico afeta as propriedades dos
agregados. Como exemplo tem-se o aumento da hidrofobicidade do lipídio, que diminui
drasticamente sua concentração micelar crítica (CMC). A CMC de lipídios formadores
de micelas é em tomo de 10-2 a 10-5 M, enquanto a CMC de lipídios formadores de
bicamada está entre 10-6 elO-la M. Para lipídios formadores de micelas o tempo 1 de
permanência da molécula dentro do agregado é aproximadamente de 10-4 s, enquanto
que para os formadores de bicamada este tempo é de aproximadamente 10+4 s
(ISRAELACHIVILI, 1992).
7
wl9' I'~""-U i:l...tili:CA
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paula
Tabela 1.2.1 Forma de empacotamento de moléculas anfifilicas e estruturas formadas por esses lipídios
(ISRAELACHVILl, 1992).
Anfifilico
Anfifilico de cadeia simples (surfactantes) com área da cabeça polar
grande: SDS em baixa concentração de sal.
Anfifilico de cadeia simples com área de cabeça polar pequena:
SDS e CrAB em alta concentração de sal, /ipidios não-iônicos.
N,
< 1/3
1/3 - 1/2
Forma do
empacotamento
Cone
fj::::":~__::::~-i:-I----
v /
Tronco de cone
fJ
Estrutura formada
Micela esférica
-Micela cilíndrica
~~\\'I~~~~
Lipídios de cadeia dupla com área de cabeça polar grande, cadeias
fluidas:
Fosfatidi/colina (lecitina), fosfatidilserina, fosfatidi/glicerol,
fosfatidilinositol, ácido fosfatidico, esjingomielina,
diexadecilfosfato, sais de dialqui/dimetilamônio.
1/2 - I
Tronco de cone
r:JBicamadas
vesículas.
flexíveis,
Lipídios de dupla cadeia com área de cabeça polar pequena, lipídios
aniônicos em alta concentração salina, cadeias saturadas rígidas: -1
Fosfatidi/etanolamina,fosfatidil serina J + Ca'·.
Cilindro
bJBicamadas planas
mmilffmmnnmm
Lipídio de dupla cadeia com área de cabeça polar pequena, lipídios
nào iônicos, cadeias poli (eis) insaturadas:
Fosfatidi/etanolamina insa/urada, cardiolipina + Ca'·, ácido
fosfatidico + Ca h, colesterol.
>1
Cunha
C]MiceIas invertidas
~~~1.3.- Membranas biológicas
As membranas biológicas são estruturas lamelares, com tipicamente 75 Á de
espessura, compostas de moléculas de proteínas e de lipídios mantidas juntas por
interações não covalentes. As membranas são barreiras de permeabilidade altamente
seletivas. Criam compartimentos fechados, que podem ser células inteiras ou organelas
dentro de uma célula. Bombas protéicas e poros em membranas regulam as
composições moleculares e iônicas desses compartimentos. As membranas também
controlam o fluxo de informações entre células. Por exemplo, muitas membranas
contêm receptores para hormônios como a insulina. Além disso, as membranas estão
8
intimamente implicadas em processos de transformação de energia, tais como a
fotossíntese e a fosforilação oxidativa (STRYER, 1996).
Membranas biológicas são estruturas indispensáveis para os organismos vivos.
São estas membranas que dão as células a capacidade de se separar do meio externo. A
própria célula também contem membranas internas presentes nas organelas, tais como
lisossomos ou mitocôndria, para separar compartimentos com diferentes funções
fisiológicas. As membranas biológicas funcionam como uma barreira permeável
altamente seletiva nos processos bioquímicos. Assim, uma célula pode se comunicar
com o meio externo através de canais iônicos ou receptores específicos e, portanto, as
membranas têm importante papel na comunicação biológica, necessária para manter a
vida (STRYER, 1996).
As membranas biológicas são compostas principalmente de lipídios e proteínas.
Entretanto, os lipídios, em sua maioria fosfolipídios, são os responsáveis pela formação
espontânea de estrutura de bicamada em meio aquoso, como mostra a Figura 1.3.1,
devido ao caráter anfifilico dessas moléculas, ficando uma parte exposta a água (cabeça
polar) e outra excluída pelo efeito hidrofóbico (cadeia hidrocarbônica).
Macroscopicamente, estas bicamadas podem se agregar formando estruturas lamelares,
separadas por camadas hidratadas da parte hidrofilica dos lipídeos. Elas podem se
organizar em multicamadas planas, ou camadas esféricas que podem ser vesículas
muItilamelares ou unilamelares.
9
I. Bicamada de fosfolípidos2. Lado externo da membrana3. Lado interno da membrana4. Proteína intrínseca da membrana5. Proteína canal iônico da membrana6. Glicoprotéina7. Moléculas de fosfolípidos organizadas
em bicamada
8. Moléculas de colesterol9. Cadeias de carboidratos10. GlicolipídeoslI. Região polar (hidrofilica) da molécula
de fosfolipídio12. Região hidrofóbica da molécula de
fosfolipídio
1
Figura 1.3.1. Modelo de Mosaico Fluido da membrana foi proposto por Singer e Nicolson em 1972.
A bicamada fosfolipídicas, a estrutura básica de todas as membranas celulares, consiste de duas camadas
de moléculas de fosfolipídios, onde as cadeias de ácidos graxos formam o interior hidrofóbico da
bicamada, e as cabeças polares, a parte exterior hidrofilica.
Nos sistemas vivos, os lipídios são raramente encontrados como moléculas
livres; em vez disso, estão associados a outras moléculas, em geral outros lipídios.
Fosfolipídios são abundantes nas membranas biológicas, constituintes das paredes
celulares (Figura 1.3.2). Eles derivam de um glicerol esterificado por dois ácidos
graxos, enquanto um grupo polar é ligado ao terceiro OH do glicerol, constituindo um
triacilglicerol. Nos mamíferos, esse terceiro grupo é fosforilado e então modificado,
formando um fosfolipídio. O intervalo típico de comprimento de cadeia hidrocarbônica
é de 16 a 18 carbonos e o grau de insaturação tende a aumentar com o aumento do
comprimento da cadeia (VOET, 1995; STRYER, 1996).
Figura 1.3.2. Modelo ilustrativo da estrutura química de um fosfolipídio (L-a-
phosphatidyJ ethanolamine).
As variações do tipo de álcool e carga a este associado, ligado ao grupo fosfato
da cabeça polar, e o comprimento e saturação das cadeias hidrocarbônicas, são
determinantes na capacidade de empacotamento das moléculas fosfolipídicas e,
portanto, da fluidez da membrana, que e biologicamente importante. Por exemplo,
certos processos de transporte de membrana e atividades enzimáticas podem ser
interrompidos quando a viscosidade da bicamada é aumentada acima de um
determinado nível. A fluidez da bicamada lipídica depende de sua composição. Porém,
ela também é dependente da temperatura. Se a bicamada de uma membrana sintética,
composta por um único tipo de fosfolipídio resfriar abaixo de uma temperatura
característica, denominada temperatura de transição principal Tc (gel-cristal-liquido),
ela sofrerá uma mudança de fase, passando assim para uma fase gel, onde a bicamada
encontra-se mais empacotada. Acima dessa temperatura (T >Tc), na denominada fase
líquido-cristalina, os fosfolipídios têm maior liberdade de movimento, conferindo a
bicamada um aumento da fluidez. A fluidez e carga das membranas lipossomais podem
ser alteradas para objetivos específicos, como no caso de reconhecimento de
macrófagos, nos quais lipossomos carregados negativamente e com maior fluidez nas
membranas são preferencialmente fagocitados. Normalmente, a incorporação de
esteróides na membrana aumenta a rigidez e estabilidade biológica dos lipossomos
(LüPEZ-BERESTEIN et aI., 1987).
Uma das características mais importante das bicamadas fosfolipídicas e o seu
comportamento ténnico, intimamente relacionada ao estudo de cristais líquidos. Cristais
líquidos são substâncias que apresentam propriedades de líquidos e sólidos, ou seja,
pode ser fluido como a água, ou pode apresentar uma ordem orientacional ao longo de
um eixo local, o eixo diretor. Este comportamento também e característico das
11
bicamadas lipídicas, que pode ser considerado um fluido bi-dimensional anisotrópico ou
um cristal-liquido liotrópico (VOET, 1995; STRYER, 1996).
Um entendimento de transição de fase e fluidez das membranas fosfolipídicas é
importante na preparação e exploração dos lipossomos, desde que a fase de uma
membrana lisossômica determina propriedades como permeabilidade, fusão, agregação
e ligação com proteína; fatores estes que podem afetar a estabilidade dos lipossomos e o
comportamento deles em sistemas biológicos (CEVC, 1987). A permeabilidade da
membrana aos prótons aumenta na temperatura de transição de fase (Tc) e assim
permanece se a temperatura for aumentada, contrastando com os íons sódio e outros
solutos onde a permeabilidade acima e abaixo da temperatura de transição de fase é
mais baixa do que na temperatura de transição de fase. Assim prótons e moléculas de
água, para os quais o transporte é consideravelmente mais rápido do que para íons de
sódio, possuem rotas extras através de membrana que são qualitativamente diferentes,
possivelmente na forma de canais aquosos (PAPAHADJOPOULOS et al., 1991). Isto se
refere a lipossomos nos quais os compartimentos interno e externo estão em equilíbrio.
Na transição de fase, as interfaces entre domínios de membrana em uma e outra fase
representam regiões defeituosas que permitem a passagem de diversos solutos e íons.
A literatura traz relatos da ação de drogas hidrofóbicas e anestésicos locais que
interferem na temperatura de transição de fase dos lipídios (LEE, 1978; ULRICH,
2002). Estudos que avaliaram a transição de fase lipídica por calorimetria diferencial de
varredura, reportaram uma diminuição na Te de vesículas de fosfatidilcolina, causada
pela partição da benzocaína e tetracaína. A perturbação causada por anestésicos locais
sobre o empacotamento dos fosfolipídios, também foi bastante estudada utilizando-se da
técnica ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e outras técnicas espectroscópicas,
como ressonância magnética nuclear (RMN), infravermelho e fluorescência 5, trazendo
enorme contribuição para o entendimento da interação de drogas hidrofóbicas e
anestésicos locais e a membrana (XU et al., 2002).
A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica tem sido muito utilizada no
estudo da estrutura dinâmica de biomembranas. Sua escala de tempo favorável e a
disponibilidade comercial de marcadores de spin facilmente incorporáveis em tais
membranas permitem o estudo das diferentes fases lipídicas e como estas variam em
função de fatores externos (por exemplo, temperatura) e/ou componentes das
membranas (SALGADO et al., 2001; ULRICH, 2002; XU et al., 2002)
12
1.3.1.- Parede celular de procariotos
Os procariotos foram, provavelmente, os primeiros organismos a colonizar a
Terra, e isto ocorreu há cerca de 2,6 bilhões de anos. Todos os procariotos
compartilham três características invariáveis: membrana celular, ribossomos 70 S
citoplasmáticos e região nuclear não limitada por membrana.
Os procariotos são divididos em eubactérias e arqueobactérias. As
arqueobactérias não possuem peptidoglicano, vivem em condições adversas (ex: altas
temperaturas, pH baixo ou elevado teor de sal) e efetuam reações metabólicas pouco
comuns, como a formação de metano. Já as eubactérias são subdivididas baseando-se
nas características da parede celular. Assim, as quatro categorias principais de bactérias
são: Eubactérias Gram-positivas e Gram-negativas com parede celular; Eubactérias sem
parede celular e Arqueobactérias (DANSON & HOUGH, 1998).
• Eubactérias Gram-negativas dotadas de parede celular.
As paredes celulares das bactérias gram-negativas consistem de uma ou algumas
camadas de peptídeoglicano e uma membrana externa. O peptídeoglicano está ligado a
lipoproteínas (lipídeos unidos covalentemente a proteínas) na membrana externa e está
no espaço periplasmático, um espaço entre a membrana externa e a membrana
plasmática. O espaço periplasmático contém uma alta concentração de enzimas de
degradação e proteínas de transporte. As paredes celulares gram-negativas não contem
ácidos teicóicos. Como as paredes celulares das bactérias gram-negativas contêm
somente uma pequena quantidade de peptideoglicano, são mais suscetíveis ao
rompimento mecânico (TORTORA et al., 2002).
A membrana externa da célula gram-negativa consiste de lipoproteínas,
lipopolissacarídeos (LPS) e fosfolipídeos. A membrana externa tem várias funções
especializadas. Sua forte carga negativa é um fator importante para a evasão da
fagocitose e da ação do complemento, dois componentes da defesa do hospedeiro. A
membrana externa também fornece uma barreira para certos antibióticos (por exemplo,
penicilina), enzimas digestivas como a lisozíma, aos detergentes, aos metais pesados,
aos sais biliares e certos corantes. Entretanto, a membrana externa não se constitui numa
má barreira para todas as substâncias do ambiente, pois os nutrientes devem atravessá-la
para manter o metabolismo da célula. Parte da permeabilidade da membrana externa é
devida a proteínas da membrana denominadas porinas, que formam canais. As porinas
permitem a passagem de moléculas como nucleotídeos, os dissacarídeos, os peptídeos,
13
os aminoácidos, a vitaminas B12 e o ferro. Contudo, elas também podem tomar as
bactérias vulneráveis ao ataque, fomecendo locais de fixação para vírus e substanciam
nocivas (TORTORA et aI., 2002) ..
O componente lipopolissacarídeo (LPS) da membrana extema fomece como
uma das características importantes das bactérias gram-negativas o fato da porção
polissacarídica ser composta de açúcares, denominados polissacarídeos O, que atua
como antígenos e são úteis para diferenciar as espécies de bactérias gram-negativas
(TORTORA et aI., 2002).
• Eubactérias Gram-positivas dotadas de parede celular.
Na maioria das bactérias gram-positivas, a parede celular consiste de muitas
camadas de peptideoglicano, formado por uma estrutura espessa e rígida. Esta é uma
razão pela qual as bactérias gram-positivas são mais sensíveis à penicilina do que as
bactérias gram-negativas. Além disso, as paredes celulares das bactérias gram-positivas
contêm ácidos teicóicos, que consistem primariamente de um álcool (como o glicerol ou
ribitol) e fosfato. Existem duas classes de ácidos teicóicos; ácido lipoteicóico que
atravessa a camada de peptideoglicano e está ligado à membrana plasmática, e ácido
teicóico da parede, que está ligado à camada de peptideoglicano (TORTORA et aI.,
2002).
Devido à sua carga negativa (presença de grupos fosfatos), os ácidos teicóicos
podem-se ligar e regular o movimento de cátions para dentro da célula. Eles também
podem assumir um papel no crescimento da célula, impedindo a ruptura extensa da
parede e possível lise celular. Finalmente os ácidos teicóicos fomecem boa parte da
especificidade antigênica da parede; portanto, tomam possível identificar bactérias por
certos testes de laboratório (TORTORA et aI., 2002).
• Eubactérias carentes de parede celular.
Compreendem os micoplasmas, que não possuem parede celular, não sintetizam
os precursores do peptidoglicano e são delimitados por uma membrana plasmática.
Assemelham-se às formas L eubacterianas, nunca podendo, no entanto, reverter ao
estado com parede celular. São altamente pleomórficos e seu tamanho varia desde
formas vesiculares a formas filtráveis muito pequenas. Sua reprodução é por
brotamento, fragmentação ou divisão binária, isoladamente ou em combinação. Formam
colônias em aspecto de "ovo frita" em meio sólido. Podem necessitar de colesterol para
seu crescimento (ex: Mollicutes).
14
• Arqueobactérias.
São microorganismos procarióticos residentes em ambientes terrestres e
aquáticos em condições adversas ou simbiontes do trato digestivo de animais. Têm
formas esféricas, espiraladas, em placa ou bastonete; uni ou multicelulares. Podem ser
aeróbios, anaeróbios e anaeróbios facultativos, que são quimiolitotrójicos,
heterotrójicos ou heterotrójicos facultativos. Podem ser termofilicos, isto é, capazes de
crescer em temperaturas acima de 60°C. Sua multiplicação é por divisão binária,
brotamento, constrição, fragmentação ou através de mecanismos desconhecidos.
Apresentam seqüências características de RNA ribossômico (DANSON & HOUGH,
1998).
1.3.2.
celular de fungos
Membrana de eucariotos e parede
As membranas constituintes das células procarióticas como eucarióticas, são
lâminas finas e deformáveis, mas mecanicamente resistentes; são todas estruturadas de
acordo com o mesmo modelo de arquitetura molecular, ainda que possam apresentar
diferentes espessuras (6 -10 nm), razão pela qual foram designadas membrana unitária
por ROBERTSON J. D.
A composição química das membranas oscila em tomo dos valores médios de
60% de proteínas e 40% de lipídeos. Associados a estes componentes maioritários
identificam-se ainda glucídios, quase sempre em quantidades muito menores e
associados às proteínas e aos lipídeos, constituindo glicoproteínas e glicolipídeos.
As proteínas constituintes da membrana são de tipo globular; entre estas, cerca de
80% são enzimas. Os lipídios das membranas são moléculas longas e anfipáticas:
possuem duas extremidades com propriedades de solubilidade, diferentes. Enquanto que
uma das extremidades é hidrofilica (polar) e, portanto solúvel em meio aquoso; a outra é
hidrofóbica (apoIar), conseqüentemente insolúvel em meio aquoso, mas com afinidade
para outros lipídios. Entre os lipídios mais freqüentes nas membranas celulares,
distinguem-se os fosfolipídeos, com uma representação de 70 a 90%. As membranas das
células animais contêm colesterol, o que não acontece nas células vegetais, que possuem
outros esteróis. Como se verá adiante, quanto maior for a concentração de esteróis,
menos fluida será a membrana. As membranas das células procarióticas não contêm
esteróis, salvo raras exceções (DE ROBERTIS, 1993).
15
C> I B L I O T L J~
INSTITUTO DE tlUíMICAUniversidade de São Paulo
Todas as membranas biológicas têm uma estrutura geral comum: é um filme
muito fino de lipídeos e de proteínas mantidas juntas principalmente por interações não
covalentes. As membranas celulares são estruturas dinâmicas, fluídas, e a maior parte de
suas moléculas são capazes de mover-se no plano da membrana. As moléculas
individuais de lipídeos são capazes de difundirem-se rapidamente dentro de sua própria
monocamada e raramente saltam de uma monocamada para outra. As moléculas
lipídicas são arranjadas como uma dupla camada contínua com cerca de 5 nm de
espessura. Essa bicamada lipídica fornece a estrutura básica da membrana e atua como
uma barreira relativamente impermeável à passagem da maioria das moléculas
hidrossolúveis (DE ROBERTIS, 1993).
Os glicolipídeos são encontrados na metade não citoplasmática da bicamada
lipídica. Na membrana plasmática os seus grupos açúcar estão expostos na superfície
celular, sugerindo que eles desempenham algum papel nas interações da célula com a
sua vizinhança. As membranas plasmáticas de eucariotos contêm quantidades
particularmente grandes de colesterol. As moléculas de colesterol aumentam as
propriedades da barreira da bicamada lipídica e devido as seus rígidos anéis planos de
esteróide diminui a mobilidade e toma a bicamada lipídica menos fluida. A maioria dos
lipídeos que compõem a membrana são fosfolipídeos dos quais predominam:
fosfatidi1colina, esfingomielina, fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina (DE
ROBERTIS, 1993).
Enquanto a bicamada lipídica determina a estrutura básica das membranas
biológicas, as proteínas são responsáveis pela maioria das funções da membrana,
atuando como receptores específicos, enzimas, proteínas transportadoras, entre outras
funções.
Muitas proteínas da membrana estendem-se através da bicamada lipídica: em
algumas dessas proteínas transmembrana a cadeia polipeptídica cruza a bicamada como
uma alfa-hélice única (proteínas unipasso); em outras, inclusive naquelas responsáveis
pelo transporte transmembrana de íons e pequenas moléculas hidrossolúveis, a camada
polipeptídica cruza a bicamada múltiplas vezes, seja como uma série de alfas-hélices,
seja como uma folha beta na forma de um barril fechado (proteína multipasso) (DE
ROBERTIS, 1993).
Outras proteínas associadas à membrana não cruzam a bicamada, mas ao
contrário são presas a um ou ao outro lado da membrana. Muitas dessas são ligadas por
interações não covalentes à proteína transmembrana, enquanto outras são ligadas
16
através de grupos lipídicos ligados covalentemente. Como as moléculas lipídicas na
bicamada, muitas proteínas da membrana são capazes de difundir-se rapidamente no
plano da membrana. Por outro lado, as células têm mecanismos para imobilizar
proteínas específicas da membrana e para confinar moléculas lipídicas e protéicas a
domínios específicos (DE RüBERTIS, 1993).
ü termo cobertura celular ou glicocálix é freqüentemente utilizado para
descrever a região rica em carboidratos na superficie celular. Esses carboidratos
ocorrem tanto como cadeias de oligossacarídeos ligada covalente a proteínas da
membrana (glicoproteínas) e lipídeos (glicolipídeos), e na forma de proteoglicanos que
consistem de longas cadeias de polissacarídeos ligados covalentemente a um núcleo
protéico (DE RüBERTIS, 1993).
As cadeias laterais de oligossacarídeos são extremamente diversificadas no
arranjo de seus açúcares. Essa cobertura de carboidratos ajuda a proteger a superficie
celular de lesões mecânicas e químicas e recentemente descobriu-se que
oligossacarídeos específicos funcionam como intermediários em diversos processos
transitórios de adesão célula-célula, inclusive aqueles que ocorrem em interações
espermatozóide-óvulo, coagulação sangüínea, e recirculação de linfócitos em respostas
inflamatórias (DE RüBERTIS, 1993).
Por outro lado a parede celular é um envoltório rígido que envolve a célula de
bactérias, fungos e plantas. Tem a função de proteger a célula de danos mecânicos e
também evita que a célula arrebente quando mergulhada em um meio hipotônico. A
parede celular é permeável a diversas substâncias; possui constituição química distinta
em vegetais, fungos e bactérias.
A parede celular de um fungo (Figura 1.3.2.3), como a de bactérias, fica do lado
imediatamente externo da membrana limitante do citoplasma e, em algumas leveduras,
está envolvida por um polissacarídeo capsular externo. Contudo, ao contrário das
bactérias, cujas paredes celulares freqüentemente contém unidades estruturais como se
fossem tijolos, as paredes celulares dos fungos parecem ser entrelaçadas. Polímeros de
hexoses e hexosaminas constituem os elementos estruturais fundamentais da parede dos
fungos. Em muitos bolores e leveduras, a principal macromolécula estrutural da parede
é a quitina, que é constituída de resíduos de N-acetil-glicosamina. Esses são ligados
entre si por ligações. l3-l,4-glicosídicas, como os resíduos de glicose em celulose, o
principal material da parede celular de plantas superiores. A quitina também é o
principal material estrutural do esqueleto dos crustáceos. Por isso essa substância
17
representa, em nível molecular, um exemplo interessante de evolução convergente, em
que organismos pouco relacionados desenvolveram, presumivelmente por uma
seqüência evolucionária independente, estruturas semelhantes ou idênticas para servir as
necessidades semelhantes (PEBERDY, 1990).
Nas leveduras, a extração da parede celular com álcalis a quente, resulta numa
glicana insolúvel, formada de resíduos de D-glicose ligados em 13-1-6 com ramificações
ligadas em 13-1,3 surgindo a intervalos freqüentes (a glicana assemelha-se a celulose em
sua insolubilidade e rigidez). Um polissacarideo solúvel adicional é a manana, um
polímero de D-manose ligado em a-I, 6, com ramificações a-I ,2 e a-1,3 (PEBERDY,
1990). Nas leveduras, o componente da matriz é um complexo de manoproteína. As
mano-proteínas de leveduras são divididas em classes distintas, que diferem em
tamanho e característica de ligação. Moléculas maiores, que podem ter peso molecular
de l50kDa, tem uma ramificação polissacaridica no meio, com mais de 150 unidades
manosil. A cadeia principal da molécula é composta de ligações a-(1-6) das quais
emergem cadeias curtas com mistura de ligações a-(1-2) e ligações a-(1-3). Ligações
com o componente protéico ocorrem através de ligações N-glucosídicas, envolvendo
diacetilquitobiose, da região intema do core do polímero. Outro grupo de manoproteinas
são moléculas menores; algumas são compostas de manosídios curtos ligados a-(1-2)/
a-(1-3) e anexados a proteína por ligações O-glicosídicas. Manoproteínas pequenas de
Candida albicans mostram reação cruzada antigênica, sugerindo um grau de
conservação do componente protéico (PEBERDY, 1990; ROSE & HARRlSON, 1991).
Do mesmo modo que nas bactérias, os polissacarídeos da parede celular dos
fungos são sintetizados de vários nucleotídeos de açúcares (UDP-N-acetil-glicosamina,
GDP-manose, etc.) (ROSE & HARRlSON, 1991). A quitina-sintetase está ligada a
membrana celular. In vitro, ela necessita de um iniciador, que deve conter pelo menos
seis ou sete resíduos conectados, como acontece na quitina. Um antibiótico nucleotídico
apoloxina D, é um inibidor seletivo da quitina-sintetase. Ele inibe a incorporação de 14
C-glicosamina na parede celular de Neurospora crassa, o que resulta num aumento do
acúmulo de uridina-difosfato-N-acetil-glicosamina (ROSE & HARRlSON, 1991). As
paredes de várias leveduras contêm complexos de polissacarídeos com proteínas ricas
em resíduos de cistina e a redução reversível de ligações -S-S- tem sido implicada na
formação de brotos. Em algumas leveduras, lipídeos contendo fósforo e nitrogênio
também são abundantes na parede (até 10% do peso seco). As paredes celulares dos
18
fungos podem ser digeridas por enzimas contidas nos sucos digestivos do caracol Helix
pomatia. Esses sucos contêm mais de 30 atividades enzimáticas conhecidas, incluindo
glucanase, quitanase e mananase (PEBERDY, 1990).
Glicoproteínas são também encontradas nas paredes de fungos filamentosos, e
são mais heterogêneas do que aquelas encontradas nas leveduras, em relação ao
componente polissacaridico e ligação proteína-carboidrato. O polissacarídeo pode ser
um homopolímero ou heteropolímeros com ligações N-glucosídicas e O-glicosídicas. a
(1-3)-D-glicanas é o principal polímero da matriz na maioria dos fungos. As a-glicanas
são normalmente encontrada na superficie externa da parede como fibrilas irregulares
compactas (PEBERDY, 1990).
A organização dos polímeros na parede celular esta em forma de camadas.
Normalmente, o componente esquelético está localizado no lado interno da parede e se
encontra imerso em material amorfo da matriz. A superficie interna da parede é,
portanto caracterizada pela sua aparência fibrilar. A superficie externa que é
normalmente constituída do material amorfo é geralmente lisa ou em leve forma de rede
(PEBERDY, 1990).A parede celular de Candida albicans parece conter no mínimo
cinco camadas distintas (começando da membrana plasmática para fora), manoproteína,
,6-glicana/quitina, ,6-glicana, manoproteína, e uma camada fibrilar (RINALDI, 1993).
Na Candida albicans, há uma camada externa indistinta contendo a camada fibrilar, que
é considerada importante para a virulência por afetar a aderência e fagocitose. Os
principais elementos estruturais da parede são as ,6-glicanas, ligadas covalentemente a
quitina, levando a estrutura secundária da parede. O principal componente antigênico é
a manoproteína (PEBERDY, 1990; ROSE & HARRISON, 1991) Figura 1.3.2.3.
19
QUITINA 9.9.9.9.51.9.9.
GLUCANAS ocP~MANOPROTEINAS l(
ENZIMA EXTRA (JCELULAR
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Figura 1.3.2.3 Esquema ilustrativo da parede celular de fungos (cedida por RlNALDü FERREIRA
GANDRA, ICB, USP).
1.4.- Drogas antifúngicas
Sob a denominação geral de antifúngico ou antimicótico, inclui-se uma ampla
variedade de substâncias com diferentes estruturas químicas e mecanismos de ação
(VANDENBOSSCHE et aI., 1989). Entre os principais agentes antifúngicos estão os
poliênicos (anfotericina B, nistatina, pimaricina). Estes antimicrobianos variam
consideravelmente em seu potencial, margem de segurança e efeito sobre diferentes
fungos. Dependendo do modo de ação podem ser fungicidas ou fungistáticos, e podem
agir especificamente contra um fungo em particular ou exibir um amplo espectro de
atividade. A anfotericina B (AnB) e a nistatina são compostos poliênicos que se ligam
aos esteróis nas membranas celulares, resultando em extravasamento dos conteúdos
celulares e a morte celular. Além do mecanismo de ação e a resistência, a interação
sinérgica entre hospedeiro e a droga, as propriedades imunomoduladoras, a
20
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
biodisponibilidade, e a fánnacocinética devem ser consideradas (MCGINNIS &
RINALDI, 1995).
Os azóis constituem uma das famílias de antifúngicos com maior número de
derivados e com grande diversidade de espectros de atividade, potência e toxicidade,
sem que em muitos casos se demonstre grande diferença entre eles
(VANDENBOSSCHE et aI., 1990). Trata-se de moléculas sintéticas com estruturas
químicas e anéis heteropentacíc1icos com dois (imidazóis) ou três (triazóis), átomos de
nitrogênio unidos por átomos de carbono a outros anéis aromáticos (BORGERS, 1980).
Eles atuam sobre a célula fúngicas impedindo a síntese do ergosterol (BORGERS,
1986; VANDENBOSSCHE, 1986), principal componente da membrana plasmática dos
fungos, ao inibir a enzima lanosterol demetilase dependente do citocromo P-450
(VANDENBOSSCHE et aI., 1987; RINGEL, 1990; SAAG, 1988; GRAYBILL, 1989;
DROUHET, 1987). Seu efeito é fungistático e não fungicida.
As drogas mais comumente usadas para infecções fúngicas sistêmicas e locais
são anfotericina B e agentes azóis (BEN-JOSEF et aI., 1997). A anfotericina B é ainda a
droga de escolha em muitas micoses sistêmicas, devido a seu amplo espectro e atividade
fungicida, contudo ela é nefrotóxica e é administrada intravenosamente (BEN-JOSEF et
aI., 1997). A introdução de antifúngicos como fluconazol (LOUIE et aI., 1998) e
itraconazol, de amplo espectro de atividade e com menor toxicidade, tem fornecido aos
clínicos alternativas orais à anfotericina B, marcando um significante avanço na terapia
antifúngica (ERNST et aI., 1996). Porém, o recente aumento da resistência entre
espécies, bem como a natureza fungistática dos azóis, levou a procura por novos agentes
fungicidas (ERNST et aI., 1996).
1.4.1.- Polienos
Historicamente a AnB tem sido a droga de escolha para o tratamento de
infecções fúngicas graves, por ser o único agente fungicida de amplo espectro. Este
antifúngico produzido por algumas cepas de Streptomyces nodosus age em nível de
membrana na célula eucariótica, exercendo seu efeito tóxico pela fonnação de
complexos com o ergosterol, colesterol ou derivados, com os quais fonna uma espécie
de canal transmembrana produzindo a liberação de íons e componentes celulares vitais,
para a manutenção da integridade celular (ANDREOLI, 1973; GONDAL et aI., 1989;
21
BRAJTBURG & BOLARD, 1996). Esta ligação preferencial ao ergosterol em
detrimento do colesterol é a base da toxicidade seletiva.
Adicionalmente, a toxicidade da droga tem sido associada a sua insolubilidade,
conseqüência direta da sua hidrofobicidade (LEGRAND et al., 1992) (Figura 1.4.1.1).
HQ
OH
o
ftJHP ...NH.
° OH
OH
CO,H
Anfotericina
Figura 1.4.1.1 Estrutura da anfotericina B, um antifúngico fungicida poliênico, produzido por algumas
cepas de Streptomyces nodosus.
A baixa solubilidade da AnB nos diferentes solventes orgânicos tem dificultado
sua manipulação para fins terapêuticos, sendo comumente administrada em associação
ao sal biliar desoxicolato de sódio - Fungizon® -, detergente com O qual forma um
complexo micelar instável altamente tóxico (BRAJTBURG & BOLARD, 1996;
SCHREIER, 2000). Pelo fato da AnB ser altamente lipofilica, modernas tecnologias
baseadas em sistemas de liberação controlada de drogas tem diminuído sua toxicidade
por incorporá-la em carreadores lipídicos, sejam estes lipossomos, emulsões lipídicas ou
coc1eatos, entre outros. Porém, a incorporação nos sistemas citados requer
administração de doses muito mais elevadas para atingir a mesma efetividade que a
formulação comercial Fungizon® (DOCIAnB), além de encarecer o valor do produto, o
que finalmente pesa na relação custoibeneficio (LOPEZ-BERESTEIN, 1985; GONDAL
et al., 1989; CLARK et al., 1991; BRAJTBURG & BOLARD, 1996; BEKERSKY et
al., 1999; SOUZA et aI., 1993; SOUZA & CAMPA, 1999; DUPONT, 2002; ZARlF et
al.,2000).
22
1.4.1.1.- Formulações Lipídicas dos Poliênicos
A solubilização de anfotericina B em lipossomos parece reduzir os seus efeitos
tóxicos e melhorar a eficácia clinica, permitindo que dosagens maiores possam ser
dadas (JANKNEGT et a1., 1992). A solubilização da anfotericina B em lipossomos
resulta em um decréscimo da toxicidade e melhora no índice terapêutico da droga, no
tratamento e profilaxia de candidíase sistêmica em camundongos (LOPEZ-BERESTEIN
et a1., 1984). A solubilização de anfotericina B em lipossomos (L-AnB), reduz os efeitos
imunossupressivos exercidos pela droga livre, e é menos tóxico a macrófagos e
linfócitos T, os principais componentes imunes responsáveis pela resistência do
hospedeiro ao fungo e outros patógenos (MEHTA et a1., 1985).
A droga de origem das formulações lipídicas é a anfotericina B, que na sua
formulação clássica apresenta um estreito índice terapêutico. As formulações lipídicas
de anfotericina B apresentam toxicidade bem menor (tabela 1.4.1.1).
Tabela 1.4.1.1 Poliênicos
Nome genérico
Anfotericina B
Anfotericina B liposomal
Anfotericina B dispersão coloidal (ABCD)
Anfotericina B complexo lipídico (ABLC)
Nome comercial
Fungizone
Ambisome
Amphotec ou Amphocil
Abelcet
Quando nos referimos genericamente ao grupo das fOffi1Ulações lipídicas de
anfotericina B deveríamos empregar o termo "formulação lipídica de anfotericina B" ou
LFAB e não apresentação liposoma1. O uso do termo liposomal pode trazer confusão,
pois apenas um dos produtos é um verdadeiro liposoma. Este composto tem o nome
genérico de anfotericina B liposomal e o nome comercial é Ambisome. Os outros dois
produtos, anfotericina B complexo lipídico (ABLC; nome comercial é Abelcet) e
anfotericina B dispersão coloidal (ABCD; nome comercial é Amphotec, Amphocil), não
são liposomas verdadeiros. O ABCD é associado com uma maior toxicidade à
administração e não oferece vantagens quando comparado com os outros dois produtos.
(DE MARIE S, 1996)
Todos os três, porém, geralmente são menos nefrotóxicos que a anfotericina B.
Todas as formulações lipídicas da anfotericina B ainda causam aumento dos níveis
23
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
séricos de creatinina e distúrbios nos eletrólitos, podendo raramente nos casos mais
graves, devido a hipocalemia ou hipomagnisemia, desestabilizar o sistema de condução
cardíaco, provocando fibrilação ventricular e óbito durante a infusão. Por isso, é crítico
monitorar os eletrólitos nos pacientes que recebem qualquer forma desta droga.
Um estudo randomizado, publicado no The New England Journal ofMedicine,
demonstrou eficácia comparável e a mesma taxa de sobrevivência entre pacientes
neutropênicos que receberam anfotericina liposomal e anfotericina convencional na
terapêutica antifúngica empírica. (WALSH et aI., 1999)
Porém, os pacientes que receberam a droga liposomica tiveram
significativamente menos reações relacionadas à infusão, como febre (17% vs 44%) e
calafrios (18% vs 54%). A nefrotoxicidade também foi significativamente menor (19%
vs 34%). Em um outro estudo, a anfotericina convencional demonstrou-se menos
efetiva que a anfotericina liposomal no tratamento de aspergilose disseminada em
pacientes imunossuprimidos (LEENDERS et aI., 1998).
Pacientes que receberam a formulação liposomal tiveram uma melhor resposta
(50% vs 20%, nas infecções confirmadas; 52% vs 29%, nas suspeitas de infecção) e
uma menor letalidade (22% vs 38%). O complexo lipídico de anfotericina B foi
estudado em pacientes intolerantes à anfotericina convencional. Uma resposta completa
ou parcial foi demonstrada em 42% de pacientes com aspergilose, 67% de pacientes
com candidíase disseminada, 71% de pacientes com zigomicose e 82% de pacientes
com fusariose. Apesar destes dados não serem comparativos, eles sugerem que as
formulações lipídicas de anfotericina B podem ser efetivas contra várias micoses.
Comparado-se com a droga convencional, as formulações lipídicas podem ser
administradas em dose mais alta para a eficácia terapêutica (OTSUBO et aI., 1999,
CICOGNA et aI., 1997). A droga convencional normalmente é empregada até 1
mg/kg/dia, já as doses dos LFABs podem variar de 3 a 6 mg/kg/dia. A atividade
antifúngica melhora com doses crescentes do agente (ALLENDE et aI., 1994).
Mas, o LFABs oferecem um índice terapêutico muito mais amplo que a
anfotericina B e sua toxicidade é menos provável até mesmo com as doses mais altas
administradas por períodos de tempo mais longos. Estes agentes são indicados para
tratar infecções fúngicas invasivas em pacientes que são refratários ou intolerantes à
formulação convencional. A anfotericina B liposomal (Ambisome) apresenta também
uma indicação específica para uso como terapia empírica para possíveis infecções
fúngicas em pacientes neutropênicos.
24
Os LFABs são drogas de alto custo. Enquanto a dose de um dia de tratamento
com a anfotericina convencional sai nos EUA por cerca de $20, uma formulação
lipídica pode chegar a $1000 por dia. O diferencial de custo exige para o clínico um
rigoroso balanço entre os beneficios do maior índice terapêutico contra o aumento do
custo. Poderíamos prever quando um paciente recebendo anfotericina convencional vai
desenvolver nefrotoxicidade? O risco pode ser quantificado? Quando tomar a decisão
entre droga convencional e as formulações lipídicas de anfotericina? Geralmente as
LFABs são indicadas para os pacientes refratários ou intolerantes à droga convencional,
mas pode haver uma predição da nefrotoxicidade em alguns pacientes. Por exemplo, eu
acredito que um paciente diabético com proteinuria e uma creatinina sérica pré-existente
de 2.5 mg/dL deve receber já inicialmente um formulação lipídica. Este conceito é
apoiado por um estudo de 239 pacientes imunossuprimidos, com creatinina superior a
2,5 mg/dL, que receberam anfotericina B convencional e pioraram sua função renal,
evoluindo para insuficiência renal e diálise, o que aumentou sua mortalidade
(WINGARD et aI., 1999). Outra situação é a associação de drogas nefrotóxicas em um
único paciente, como os aminoglicosídeos a ciclosporina, que apresentam sinergismo
nesta ação tóxica. Nestes casos, Gubbins e coI., recomendam em recente publicação,
que seja introduzido uma formulação lipídica da anfotericina. (GUBBINS et aI:
Antifungal agents. In: PISCITELLI, S.C, RODVOLD, KA(ed): Drug Interactions in the
Infectious Diseases. Totowa, Humana Press, Pag 185-217,2001).
1.4.2.- Azóis
O principal mecanismo de ação dos azólicos é a inibição da biossíntese do
ergosterol, trazendo como conseqüência alterações na fluidez e permeabilidade da
membrana citoplasmática do fungo (BODEY, 1992). Na célula fúngica íntegra, a
biossíntese do ergosterol envolve a participação da enzima 14a -demetilase, que é
dependente da citocromo P-450. Em termos moleculares, um nitrogênio disponível (N-3
nos imidazólicos e N-4 nos triazólicos) estabelece uma ligação com o ferro do grupo
heme na sexta posição de coordenação. O restante da molécula do antifúngico interage
com a apoproteína da citocromo P-450, onde, a estrutura de cada azol determinará sua
especificidade na dependência desta ligação (VANDENBOSSCHE et aI., 1987). Esta
ligação inibe a atividade da enzima 14-a-demetilase e, como conseqüência, se observa
25
acúmulo de esteróis metilados comprometendo a fluidez e permeabilidade da
membrana, o que se traduz por inibição do crescimento fúngico.
Os azólicos, atualmente considerados como a principal classe de antifúngicos,
surgiram primeiramente para uso tópico, como o clotrimazoI. Posteriormente, foram
lançados os de uso sistêmico, como o miconazol e cetoconazoI. Mais recentemente, a
sub-classe dos triazólicos tem recebido maior destaque; sobretudo o fluconazol,
disponível para uso oral, e o itraconazol, ambos com largo espectro de ação e efeitos
tóxicos bastante reduzidos (BENSON & NAHATA, 1988; BODEY, 1992;
RICHADSON & WARNOCK, 1993). O espectro de ação dos azólicos inclui grande
variedade de fungos, e os casos de resistência natural, são raros e/ou pouco
evidenciados pela literatura (RICHADSON & WARNOCK, 1993) ver tabela 1.4.2.1.
Tabela 1.4.2.1.- Os azólicos
Imidazóis
Cetoconazol
Miconazol
Triazólicos
Fluconazol
Itraconazol
Segunda geração dos triazólicos
Voriconazol (derivado do fluconazol)
Ravuconazol (derivado do fluconazol)
Posaconazol (derivado do itraconazol)
Os imidazóis (Figura 1.4.2.1) rapidamente induzem danos à membrana, com
perda de cátions, proteínas, aminoácidos, nucleotídeos intracelulares e troca no
metabolismo da glicose. Sistemas de modelo de membrana, contendo ácidos graxos
insaturados livres, são muito susceptíveis aos imidazóis. Fungos e bactérias Gram
positivas são susceptíveis aos imidazóis, porque são ricos em ácidos graxos livres,
enquanto, células de mamíferos e bactérias Gram-negativas são resistentes a eles,
porque contêm níveis mais baixos de ácidos graxos livres (KURODA et aI., 1978; SUD
et aI., 1979; YAMAGUCHI, 1978).
26
oA ±>-CH-O-o- ~\Nv
N-
CH2o 2 ~ /; N~N-COCH3
~ _CI
~I
CI
Ketoconazol
CI
~ CH O-CH"N- '21~ ~_CI
~I
~CI
Miconazol
Figura 1.4.2.1.- Estrutura de imidazáis Ketoconazol e Miconazol.
o miconazol é um derivado imidazólico, pertencente a um grande grupo de compostos
sintéticos, e apresenta-se na forma de pó cristalino branco. É muito pouco solúvel em
água, pouco solúvel em clorofórmio, solúvel na maioria dos solventes orgânicos,
principalmente em metanol com um pKMcz 6.5 (BEGGS, 1988; CLARKE'S 1989), e foi
o primeiro composto azol introduzido para terapia de infecções fúngicas sistêmicas.
Em altas concentrações, o miconazol também interage com triglicerídios e
interfere na síntese de ácidos graxos, em adição aos seus efeitos sobre a biossíntese do
ergosterol sobre a membrana citoplasmáticà do fungo, levando ao acúmulo de l4a metil
esteróis (BORGERS, 1980). Estes esteróis metílicos podem romper o íntimo
agrupamento das cadeias acil dos fosfolipídios, alterando as funções de certos sistemas
enzimáticos ligados à membrana, inibindo o crescimento celular e, eventualmente, à
destruição e morte das células (GEORGOPAPAKOU, 1998).
O efeito de miconazol sobre as membranas fúngicas decolTe da inibição de
síntese ergosterol conforme ilustrado na Figura 1.4.2.2
Outros sítios de ação também colaboram na inibição, de onde se conclui que é
na heterogeneidade dos mecanismos de ação dos azólicos, que se obtém a inibição do
crescimento, permitindo então, a ação dos leucócitos e macrófagos (SAAG &
DISMUKES, 1988).
27
Nos últimos dez anos, o uso de novas e mais efetivas drogas antibacterianas e
imunossupressoras, os transplantes de órgãos, os tratamentos do câncer e da AIDS, etc.,
aumentaram a sobrevida dos pacientes com diversas enfermidades. No entanto, tais
pacientes tomaram-se mais susceptíveis às infecções fúngicas, refletindo na maior
permanência hospitalar e aumento de taxas de morbidade e mortalidade (BODEY,
1992; JOHNSON & WARNOCK, 1995; ODDS, 1993; REX et aI., 1995).
Allylamine
~
"\
SQUALENE
1Epoxidase (ERG1)
1Cyc1ase (ERG7)
LANOSTEROLOH
Azoles
Morpholines
Azoles
Morpholine
OH
14 a demethylase (ERG11)~ 14 reductase (ERG24)4 a demethylase (ERG25)-24 methyltransferase (ERG6)7 ~8 isomerase (ERG2)5,6 desnaturase (ERG3)22·23 desnaturase (ERG5)
ERGOSTEROL
Figura 1.4.2.2.- Biossíntese do ergosterol em fungos. À esquerda estão indicados alguns agentes
antifúngicos atuando em diferentes etapas da biossíntese do ergosterol (Georgopapakou, 1998).
28
BI8l,iOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
A resistência secundária dos fungos aos azólicos se manifestaram como um
problema clínico importante, a partir do lançamento do fluconazol que, por ser menos
tóxico e melhor absorvido, passou a ser utilizado rotineiramente. Nos tratamentos de
curta duração parece não haver problemas de resistência, sobretudo, em pacientes
imunocompetentes. Entretanto, nos imunocomprometidos submetidos a longos
tratamentos, ocorre a substituição das espécies sensíveis ao azólico, por aquelas
naturalmente resistentes, especialmente C. krusei e C. glabrata (VANDENBOSSCHE,
1997). Desta nova situação, emergiu em dimensões ainda não avaliadas, o fenômeno da
resistência de Candida a estes antifúngicos, com aproximadamente quatro dezenas de
relatos até 1996 (JOHNSON & WARNOCK, 1995; REX et aI., 1995; D'ANTONIO et
aI., 1996; WARNOCK, 1992).
Em menor proporção, a resistência ao fluconazol também tem sido observada
em outras espécies como: C. albicans, C. tropicalis (ODDS, 1993), C. parapsilosis
(TUMBARELLO M. et aI., 1996), ocorrendo predominantemente como conseqüência
ao tratamento com este triazólico. Cabe ressaltar, que nos pacientes aidéticos com
candidíase de orofaringe, 9 - 11 % dos isolados evidenciam resistência a este triazólico
(TUMBARELLO et aI., 1996).
Até recentemente, os testes de susceptibilidade aos antifúngicos não eram
julgados necessários, porque a maioria dos fungos clinicamente importantes
evidenciavam sensibilidade à anfotericina B. Entretanto, nas situações acima referidas,
a possibilidade do desenvolvimento de cepas resistentes aos antifúngicos passou a ser
considerada, requerendo assim, o estudo de novas drogas antifúngicas com amplo
espectro de ação. Por estes motivos, justifica-se o interesse em se comparar um
anfifílico inócuo para a célula como o DHP, com um anfifílico antimicrobiano e
bactericida como o DODAB, tanto isoladamente quanto em conjunto com a droga
dirigida, sendo ambos os anfifílicos de baixo custo em comparação com os lipídios
convencionais que usualmente constituem os lipossomos transportadores de drogas.
O itraconazol é uma droga triazólica (Figura 1.4.2.3) que esteve durante muito
tempo disponível em cápsulas e, mais recentemente, em solução. Tem um amplo
espectro de atividade com eficácia e segurança. Não é mais eficaz para candidíase que a
anfotericina B, mas atua sobre outras micoses sistêmicas como histoplasmose,
blastomicose e aspergilose (VAN'T WOUT, 1991; DISMUKES, 1994; SINGH, et aI.,
2004).
29
A absorção oral a partir da cápsula de itraconazol é variável e melhora quando
administrada próxima às refeições, mas atualmente uma formulação líquida está
disponível, conferindo 30% a mais de biodisponibilidade. Esta formulação, uma solução
com ciclodextrina deve ser administrada preferencialmente à cápsula, para todos os
pacientes imunocomprometidos com micoses sistêmicas. A ciclodextrina é um anel de
moléculas de glicose que estabiliza o medicamento e aumenta sua absorção, resultando
em maiores níveis séricos e teciduais do itraconazo1.
N OH N? \ ± f ~I N-CH CH-N IN0 2 2 ~N
?" _F
F
Fluconazol
° CH3
0\ -O- \\ tHN ;-CH O r-\ - /-W'" I
~\N-C±HO 2" ~!Í N"-----JN-o-N~N C(H2
r- .CI CH3
CI
Itraconazol
Figura 1.4.2.3.- Estrutura dos triazáis Fluconazol e ltraconazol
A utilidade clínica de itraconazol esteve previamente limitada pela falta de
formulação de parenteraI. Uma formulação intravenosa da droga, também solubilizada
em ciclodextrina, há pouco tempo está disponível, oferecendo maiores absorção e nível
sérico, comparada com qualquer preparação oral. A droga é indicada como uma agente
de segunda linha contra aspergilose e como agente de primeira linha para histoplasmose
e blastomicose.
A administração intravenosa durante 2 semanas, seguida por administração oral
de itraconazol durante 12 semanas demonstrou ser efetiva em cerca da metade dos
pacientes imunocomprometidos com aspergilose pulmonar invasiva. (GRYSCZYK et
aI., 2002).Os níveis de itraconazol excederam 250 mg/mL em 91% dos pacientes.
30
Porque o itraconazol é metabolizado pelo fígado e a ciclodextrina é excretada pela
urina, a droga deve ser usada com precaução em pacientes com função renal reduzida;
inclusive, dados sobre a sua utilização em pacientes com insuficiência renal ainda não
estão disponíveis. Portanto, esta droga é contra-indicada na presença de nefrotoxicidade
(clearence de creatinina menor que 30 mLlmin).
Os efeitos adversos ao itraconazol incluem náusea, dor abdominal, insuficiência
hepática e, a doses muito altas, hipocalemia e edema. Como seu metabolismo esta
ligado ao sistema enzimático do citocromo P-450, o itraconazol é associado com
múltiplas interações com outros medicamentos.
1.4.2.1.- Novos azólicos
Novos azólicos, uma segunda geração de triazólicos, estão sendo desenvolvidos.
Eles oferecerão um espectro mais amplo de atividade comparado aos triazólicos
atualmente disponíveis. Em particular, eles são ativos contra Candida krusei, uma
espécie freqüentemente resistente ao fluconazo1. Voriconazol é um derivado de segunda
geração de fluconazol ativo contra várias espécies de Candida (DRAGO, et al., 2004)
(Figura 1.4.2.1.1), apresentando atividade mais potente que o fluconazol contra as
espécie de Candida, inclusive a C. krusei (FRATTI et a1., 1998) Ele também
demonstrou in-vitro atividade contra espécies de Aspergillus resistentes à anfotericina B
(BATTEGA et a1.,2003), como também contra uma variedade de fungos filamentosos
(DIEKEMA, et a1., 2003). Um estudo em pacientes com aspergilose invasiva
demonstrou resposta completa ou parcial à administração intravenosa, seguida pela oral,
de voriconazol. Também apresenta um perfil de segurança satisfatório. Estará
disponível para administração duas vezes ao dia por via oral ou intravenosa.
Ravuconazol (BMS-207,147) também é um derivado de segunda geração do
fluconazo1. Tem um largo espectro de atividade, particularmente contra espécies de
Candida (YAMAZUMI et a1., 2000). Esta droga apresenta biodisponibilidade oral
adequada. Ensaios clínicos deste agente estão sendo realizados no momento.
Posaconazol é atualmente um derivado do itraconazol sob investigação. Tem um
perfil de segurança excelente e é eficaz in-vitro contra muitas espécies de Candida
(HERBRECHT, 2004) e também apresenta ação contra o Mucor ssp, em camundongos
imunossuprimidos (SUN, et aI., 2004). Este agente está na fase de ensaios clínicos
avançados.
31
FOH "~H ",,-N l.'? "_'\r I .~ "
;---" \ "
N-CH+CH-(.", .. r'JN:::J F "r:"j-!ll
F
Voriconazol
Figura 1.4.2.1.1.- Estrutura do azol de segunda geração Voriconazol
peptídeos
1.4.3.- Nova Classe de Antifúngicos: Os lipo-
Pela primeira vez em muitos anos, uma nova classe de antifúngicos, as candinas,
está sendo desenvolvida. Elas inibem a síntese da parede celular do fungo, sendo
chamada analogamente de "penicilina para fungos". O seu alvo de ação, a enzima (1,3)
beta-D-glucan sintase, (DENNING; HOSPENTHAL, 2004) não está presente nas
células dos mamíferos. Pelo contrário, tanto os poliênicos, como os azólicos agem em
uma membrana celular comum aos fungos e mamíferos, explicando assim, a toxicidade
destes agentes.
As candinas em desenvolvimento incluem a caspofungina (antigamente MK
991) e o equinocandina LY-303,366 e FK-463. Todos são fungicidas contra todas as
espécies de Candida, (PFALLER, et al., 1999) sendo também ativas contra o
Aspergillus (ODDS F.C, et aI., 2004).
A caspofungina é o primeiro agente em desenvolvimento (Figura 1.4.3.1). É
ativa contra espécies de Candida e Aspergillus, (DUPONT B. 2003, ODDS F.C, et al.,
2004) inclusive as cepas resistentes aos azólicos de primeira geração. (MASCHMEYER
& RUHNKE, 2004) Em camundongos também foi eficaz contra o histoplasma e o
Pneumocystis (KOHLER, et al., 2000). Não apresenta atividade in-vitro contra
Fusarium (ARIKAN, et aI., 2001). Por apresentar uma baixa biodisponibilidade por via
oral, só estará disponível como medicamento por via parenteral. Esta droga está
atualmente nas fases II e III dos ensaios clínicos. A LY-303,366 e a FK-463 são duas
32
equinocandinas sob investigação. Seus espectros de ação são semelhantes ao da
caspofungina.
H2N~~o '. ..oH
Hd~Nr-\. oH'~
H2N ~yo HN ~.OH H,C
H6 NH o h CH3
CH3
tH
=< 'cH3
HO N N'. W .., ·2H3CCO H"O 'o 2
_ OH H
~ !JHO
Caspofungina
Figura 1.4.3.1.- Estrutura de uma echinocandina.
1.5.-
microbianos
Lipossomos como carreadores de agentes anti-
Desde 1965, quando Bangham descreveu pela primeira vez os lipossomos, se
conhecem cada vez mais aplicações no uso destas vesículas como transportadores de
agentes antimicrobianos ou drogas (BANGHAM et aI., 1965). Eles, pelas suas
propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas, podem ser usados para incorporar compostos
aquosos e lipofílicos (Figura 1.5.1) (LOPEZ-BERESTEIN, 1987).
Lipossomos são vesículas microscópicas ou submicroscópicas constituídas de
bicamadas concêntricas simples ou múltiplas, resultantes da auto-associação de
moléculas anfifílicas, tais como fosfolipídios em meio aquoso. Os grupos de cabeça
polar estão localizados na superfície das membranas em contato com o meio, enquanto
as cadeias hidrocarbônicas formam o centro hidrofóbico das membranas, protegidos da
água. Estas vesículas possuem parte da fase aquosa no seu interior e, conseqüentemente,
podem capturar e segregar moléculas polares. Além disso, por causa das propriedades
fisico-químicas de seus constituintes, podem também dissolver moléculas hidrofóbicas
em suas bicamadas (SCHUBER et aI., 1998). Os lipossomos têm sido usados como
modelos de membrana celular e como transportadores de cosméticos, de aditivos
alimentares e de drogas. Neste ultimo caso, as vantagens dos lipossomos incluem a
33
biodegradabilidade, a baixa toxicidade, a possibilidade de dissolver substancias
lipofílicas (nas bicamadas lipídicas) ou hidrofílicas (na fase aquosa de seu interior), a
possibilidade de direcionar o local ou de controlar a velocidade de liberação de uma
determinada droga (LIU, 2000).
Figura 1.5.1 Esquema ilustrativo de um lipossomo.
~I Cabeça polar
Cauda. \ hidmcarbônica
Como seria de esperar, os lipossomos têm sido o tema de inúmeros artigos de
revisão, quer em termos gerais (LASIC, 1989; TYRRELL, et aI., 1976; LASIC, 1998),
quer focados especialmente nas suas propriedades físicas, preparação (SZOKA &
PAPAHADJOPOULOS, 1980; HOPE et aI., 1986; NEW, 1990), mecanismos de
formação e fusão (LASIC, 1988; PAPAHADJOPOULOS, et aI., 1990), gradientes de
pH e transporte de membrana (CULLIS et aI., 1991), métodos de caracterização (NEW,
1990), aplicação genérica em medicina (GREGORlADIS, 1976;
PAPAHADJOPOULOS & GABIZON, 1987) utilização como carreadores (JULIANO,
1981; GREGORlADIS, 1976), técnicas de encapsulamento de agentes bioativos
(MAYER et aI., 1986), interação com células (MARGOLIS, 1984), utilização em
vacinas (KERSTEN, 1995), aplicações veterinárias (SALLOVITZ, 1998), utilização em
substituição de eritrócitos (CHANG, 1999; WINSLOW, 1999) ou aplicações cosméticas
(GREGORlADIS, 1994).
Os lipossomos podem ser definidos como associações coloidais de lipídios
anfipáticos, que se organizam espontaneamente em estruturas fechadas tipo concha
esférica. Podem ser preparados a partir de misturas lipídicas naturais extraídas e
purificadas, ou a partir de lipídeos sintéticos, disponíveis comercialmente. Confonne é
indicado na Figura 1.5.2, os lipossomos podem ser classificados em termos de tamanho,
34
número de lamelas (e sua posição relativa), constituição lipídica (o que também
condiciona a sua carga), estabilidade e modo de preparação (UCHTENBERG et aI.,
1988).
Durante muito tempo, a classificação estrutural dos vários tipos de lipossomos esteve
rodeada de uma grande falta de uniformização e coerência, o que originou alguma
confusão na literatura desta área. Devido, em parte, à falta de uma correta caracterização
das diversas estruturas, o tipo de lipossomo era indicado pelo seu processo de
preparação (e.g., sonicação, congelação e descongelação, evaporação em fase reversa),
pelo nome do investigador que caracterizou pela primeira vez o seu processo de
preparação (e.g., "Banghamossomas", "Huangomossomas") ou simplesmente omitido
(UCHTENBERG et aI., 1988).
35
Sistema modeloAplicações industriais,de membranacosméticas e agrícolas.
Física química Outras aplicaçõesbiomédicasde lipídeos
Interações Sistema de transportecelulares
Utillzacao
I~------------------I
: Lipossomos :I I
'--------1---------:
Caracterização
Numero debicamadas
Constituição damembrana
Presença deesteráis
Figura 1.5.2.- Esquema representativo das várias utilizações dos Iipossomos e inter-relação entre os
diversos parâmetros que os caracterizam. Adaptado de LICHTENBERG et aI., 1988.
A partir do início da década de 80, foi definitivamente adotada uma
nomenclatura para os lipossomos baseada no seu número de bicamadas lipídicas
(lamelas) e tamanho (SZOKA & PAPAHADJOPOULOS, 1980). Assim, para os
lipossomos de preparação mais imediata, utilizados em todos os primeiros estudos,
ficou consagrado o nome de vesículas multilamelares ou MLV ("multilamellar
vesicles"). Como o nome indica, estas vesículas são constituídas por várias bicamadas
lipídicas, aproximadamente concêntricas, podendo o seu diâmetro variar entre 400 e
3500 nm (JULIANO, 1981). Para muitas das aplicações dos lipossomos, toma-se
36
BIBLIU II:.\,H
INSTITUTO DE QUíMICAUnIversidade de São Paulo
importante a utilização de um sistema de interpretação mais simples e melhor definido
em termos estruturais. Deste modo, em grande parte dos estudos, as MLV foram
substituídas por lipossomos unilamelares. Destes lipossomos, os mais utilizados são as
vesículas unilamelares grandes ou LUV ("large unilamellar vesicles"), de diâmetro
superior a 100 nm, bem como as vesículas unilamelares pequenas ou SUV ("small
unilamellar vesicles"), com diâmetro entre 20 e 50 nm (UCHTENBERG et al., 1988).
Para além destas vesículas unilamelares, devem-se ainda considerar as vesículas
unilamelares gigantes ou GUV ("giant unilamellar vesicles"), com dimensões superiores
a 1 )lm, podendo chegar às dezenas de )lm (LASIC & NEEDHAM, 1995), tamanho
comparável ao de uma célula eucariótica. Alguns autores definem ainda uma classe de
vesículas unilamelares médias ou MUV ("medium-sized unilamellar vesicles"), com
dimensões compreendidas entre os SUV e os LUV (UCHTENBERG et al., 1988). De
menor importância, mas também caracterizados (LASIC & NEEDHAM, 1995),
encontram-se os lipossomos multivesiculares ou MVL ("multivesicular liposomes") e as
vesículas oligolamelares ou OLV ("oligolamellar vesicles") que, à semelhança das
unilamelares, podem ser subdivididas em pequenas, grandes e gigantes (SOV, LOV e
GOV).
Para além do tamanho e número de lamelas, outro fator essencial para a
caracterização de um lipossomo é a constituição das bicamadas lipídicas. A composição
fosfolipídica, a presença de esteróis, a proporção destes componentes e a inserção de
outras moléculas nas bicamadas vão condicionar vários parâmetros da membrana e do
próprio lipossomo; como, a sua carga, estabilidade, curvatura da(s) bicamada(s), fase da
membrana e formação de domínios lipídicos (BAGATTOLU & GRATTON, 2000).
Os lipossomos são conhecidos como carregadores de agentes antimicrobianos
(LOPEZ-BERESTEIN, 1987), estes reduzem a toxicidade de drogas no órgão alvo pela
modificação na distribuição destas, aumentam a ação terapêutica de vários antimoniais
(LOPEZ-BERESTEIN et al., 1984, LOPEZ-BERESTEIN et al., 1985),
imunomoduladores (LOPEZ-BERESTEIN 1987), agentes antifúngicos e antibióticos
(LOPEZ-BERESTEIN et al., 1984; LOPEZ-BERESTEIN et al., 1985). Lipossomos
carregados positivamente mostraram-se mais eficientes na incorporação de antibióticos
comparados aos lipossomos carregados negativamente, possibilitando o tratamento de
infecções por Pseudomonas. (OMRI et al., 1995).
O uso do carreamento de antibióticos por lipossomos tem sido extensivamente
estudado, principalmente para aumentar a eficácia na tentativa de diminuir a toxicidade.
37
Um exemplo desta aplicação foi um estudo feito com os aminoglicosídios amicacina,
netilmicina e tobramicina, incorporados em lipossomos aniânicos e catiânicos
preparados por sonicação, que foram utilizados para avaliar a influência das cargas
lipídicas sobre a eficiência de encapsulamento dos lipossomos e aumento da atividade
bactericida em infecções pulmonares causadas por Pseudomonas aeruginosa (OMRI et
aI., 1995). Lipossomos carregados positivamente mostraram-se mais eficientes na
incorporação de antibióticos comparados aos lipossomos carregados negativamente
(OMRI et aI., 1995).
Lipossomos catiânicos sintéticos compostos de brometo de
dioctadecildimetilamânio bromide (DODAB) podem ter múltiplos usos (CARMONA
RIBEIRO, 2000). Partículas de sílica (RAPUANO & CARMONA-RIBEIRO, 2000).
Microesferas de poliestireno podem ser funcionalizadas pela cobertura com bicamadas
de DODAB ou monocamadas de fosfolipídios (LESSA & CARMONA-RIBEIRO,
1996; CARMONA-RIBEIRO & HERRINGTON, 1993). Os lipossomos catiânicos
podem agir como agentes antimicrobianos, causando morte de bactérias e fungos em
concentrações que não afetam células de mamífero em cultura. (CARMONA-RIBEIRO,
2000).
Desde 1994, a citotoxicidade de dispersões de DODAB e outros lipossomos
catiânicos, vem sendo descrita contra espécies bacterianas e cultivos de células de
mamíferos, (MARTINS et aI., 1997; CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997; TÁPIAS et aI.,
1994; SICCHIEROLLI et aI., 1995; CAMPANHA et aI., 1999; CARMONA-RIBEIRO,
2000), como também, sua habilidade para solubilizar drogas hidrofóbicas como o
miconazol (MCZ) e a anfotericina B (CARMONA-RIBEIRO, 2000; VIEIRA &
CARMONA-RIBEIRO, 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003;
LINCOPAN et aI., 2003). No entanto, a atividade antifúngica dos imidazóis derivados
de miconazol e cetonazol mostrou-se reduzida em decorrência do encapsulamento dos
mesmos em lipossomos, ocorrendo diferenças significativas de atividade para
encapsulamento por vesículas unilamelares pequenas (SUV) ou por vesículas
multilamelares (MLV). A associação de imidazol-colesterol-fosfolipídios induziu um
efeito inibidor sobre a atividade antifúngica, sendo essa redução, maior para MLV do
que para SUV (DE LOGU et aI., 2000).
38
Citotoxicidade diferencial de DÜDAB
.Tipo de célula [Cel/mL]Células viável [DüDAB]mM 50%Referências.
sobrevida
Balb-c3T3 104 1.0 Caml0na, 1997
(Fibrob1astos)
SV40- 104 1.0 Caffi1ona, 1997
Transfoffi1ado
C. albicans 106 0.010 Campanhã, 2001
E. CoZi 107 0.028 Martin, 1997
S. typhimurium 107 0.010 Campanhã, 1999
P. aeruginosa 107 0.005 Campanhã, 1999
1.6.- Interação entre brometo de dioctadeci/-
meti/amônio ou dihexadeci/fosfato de sódio e células
Desde sua introdução como compostos sintéticos fOffi1adores de bicamada
(FENDLER, 1980), dihexadeci1fosfato de sódio (DHP) ou as sais de
dioctadecilmetilamônio (DODA) (Figura 1.6.1), têm encontrado diferentes usos em
áreas estratégicas (CARMONA-RIBEIRO, 1992). Em particular lipossomos catiônicos
de sais de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), têm sido satisfatoriamente
empregados para interagir com superfícies carregadas negativamente tais como: células
procariontes (TÁPIAS et aI., 1994; SICCHIEROLLI et aI., 1995; MARTINS et aI.,
1997; CAMPANHÃ et aI., 1999), eucariotes (CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997;
CAMPANHÃ et aI., 2001), proteínas séricas (CARVALHO & CARMONA-RIBEIRO,
1998), polímeros sintéticos como látex (CARMONA-RIBEIRO & MIDMORE, 1992;
VIEIRA et aI., 2003) e superfícies minerais (RAPUANO & CARMONA-RIBEIRO,
1997; MOURA & CARMONA-RIBEIRO, 2003).
39
CH2' /CH3N+ Sr"
CH2/ "CH3
DODAB
o o'\ ~
P0/ '\ ONa+
DHP
Figura 1.6.1.- Estrutura molecular de dihexadecilfosfato de sódio (DHP) e brometo de
dioctadecilmetilamônio (DODAB).
Uma outra propriedade promissora bastante explorada tem sido a liberação
controlada de ácidos nucléicos (DNA ou RNA) para células mamíferas, como uma
estratégia para imunoterapia e proteção antiviral (KIKUCHI et aI., 1999; 2000; LASIC,
et aI., 1997; VAN ROOIJ et aI., 2002; NANTES et aI., 2003). Porém, a principal
utilidade terapêutica tem sido associada a sua intrínseca atividade imunoadjuvante e
interação com proteínas antigênicas, potencial amplamente estudado por mais de 35
anos (GALL, 1966; VERONESI et aI., 1970; STANFIELD et aI., 1973; SNIPPE et aI.,
1980b; HILGERS & SNIPPE, 1992; KATZ et aI., 1995; TSURUTA et aI., 1997;
KLINGUER-HAMOUR, 2002; DASCHER et aI., 2003; HOLTEN-ANDERSEN et aI.,
2004; LARSEN et aI., 2004), já sendo utilizado em humanos em combinação com o
toxóide tetânico (STANFIELD et aI., 1973; VERONESI et aI., 1970).
Por outro lado, anfifilicos catiônicos, de modo geral, são reconhecidamente
tóxicos tanto para células procarióticas como para as eucarióticas (SALT &
WISEMAN, 1970). TÁPIAS et aI. caracterizaram o efeito bactericida de vesículas de
brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) usando Escherichia calí, como modelo
(TÁPIAS et aI., 1994, SICCHIEROLLI et aI., 1995). Essa investigação foi estendida ao
efeito do DODAB sobre a viabilidade de fibroblastos normais e transformados em
cultura (CARMONA-RIBEIRO, et aI., 1997). Após meia hora de interação com células
eucarióticas em monocamada subconfluente, observou-se morte celular a partir de
O,lmM de DODAB tanto para as células normais quanto para as transformadas
(CARMONA-RIBEIRO et aI., 1997).
40
A interação de anfifilicos sintéticos de DODAB com propriedades
antibacterianas, foi avaliada para uma concentração fixa de bactérias viáveis (2,5 x 107
bactérias viáveis/mL) de E. coZi, S. typhimurium, P. aeruginosa, e S. aureus. A
susceptibilidade frente ao DODAB aumentou de E. coZi para S. aureus na ordem acima.
A viabilidade celular diminui para 5% com tempo de interação de até 1 h em
concentrações de DODAB iguais a 50 e 5 j.tM para E. coZi e S. aureus, respectivamente.
Para bactérias e C. albicans, a determinação simultânea de viabilidade celular e
mobilidade eletroforética em função da concentração de DODAB, mostraram uma
correlação muito boa entre carga da superfície celular e viabilidade celular. Células
carregadas negativamente são 100% viáveis, enquanto, células carregadas positivamente
não sobrevivem (CAMPANHÃ et aI., 1999; 2001).
1.7.- Princípios teóricos dos métodos utilizados
1.7.1.- Isotermas de adsorção
o contato de uma substância tensoativa diluída em solução aquosa com uma
grande superfície absorvente, poderá levar a uma adsorção extensiva com uma redução
contínua na concentração da solução. Para se ter uma superfície grande para adsorção, o
sólido - que é chamado de adsorvente - deve ser finamente dividido. A partir de dados
analíticos que descrevem a mudança de concentração na solução, assim como o
conhecimento da quantidade total de sólido da solução equilibrada, é possível
determinar a quantidade de soluto adsorvido, que é chamado de adsorbato, por unidade
de peso do sólido. Se a área específica do sólido é conhecida, então os resultados podem
ser expressos como quantidade adsorvida por unidade de área. Esses estudos são
geralmente conduzidos a temperatura constante, e os resultados, que relacionam a
quantidade de material adsorvido com a concentração de equilíbrio em solução, definem
uma isoterma de adsorção (HIEMENZ, 1986).
Isotermas para adsorção de solutos orgânicos são divididas em quatro classes
principais, de acordo com a natureza do coeficiente angular da porção inicial da curva.
As principais classes são:
curvas S, indicativas de orientação vertical de moléculas do adsorbato na
superfície;
41
BII:SLIV I L:;Vn,
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
curvas L, isotermas normais ou de "Langmuir", usualmente indicativas de
adsorbatos "deitados" sobre a superficie, ou às vezes, adsorbatos iônicos orientados
verticalmente com atração intermolecular particularmente forte;
curvas H, ("alta afinidade") (começando de um valor positivo no eixo de
concentração adsorvida sobre o sólido), freqüentemente resultando da adsorção de
solutos como micelas iônicas, ou de troca iônica de alta-afinidade com íons de baixa
afinidade;
curvas C ("partição constante"), curva linear, resultando da adsorção de solutos
que adsorvem no sólido mais rapidamente do que o solvente (GILES et aI., 1960).
Os subgrupos destas classes estão arranjados de acordo com a forma das curvas
depois do ponto de origem e da posição do platô. Assim, se as moléculas do soluto que
estão adsorvidas na nova superficie apresentam baixa atração por mais moléculas, a
curva apresenta um longo platô. Se as moléculas que estão adsorvidas na superficie
apresentam alta afinidade por mais soluto, a curva cresce continuamente e não apresenta
platô.
Um dos tipos mais comuns é a isoterma de Langmuir, importante por ser
facilmente entendida teoricamente, e largamente aplicada aos mais diferentes dados
experimentais. Uma das fórmulas deste modelo pode ser expressa por:
2xska~
ka~ +1
Eq. 1.7.1.1
onde x; é a fração molar do soluto na superficie, a~ é a atividade do soluto na solução,
e k é uma constante. Tal isoterma decorre do fato de se considerar a adsorção do soluto
segundo a Equação 1.7.1.2.
Solvente adsorvido + Soluto em solução !:; Soluto adsorvido + Solvente em Eq. 1.7.1.2
adsorção
A constante de equilíbrio para essa reação pode ser definida como:
42
aS b
k =--.J!!:..LaS b1 az
Eq. 1.7.1.3
Nesta teoria é suposto que uma solução em que ambos solvente (componente 1)
e soluto (componente 2) possuem moléculas que ocupam a mesma área ao adsorverem à
superfície. Assumindo que a solução na superfície bidimensional é ideal, podemos
substituir atividade na superfície por fração molar na superfície XS definida como:
kxSab
= _Z_~I
xS b1 az
Eq. 1.7.1.4
Uma forma equivalente da equação de Langmuir expressa em variáveis
ligeiramente diferentes é obtida multiplicando ambos x; e x~ na equação 1.7.1.4 pela
área total da superfície. Como foi postulado que tanto o solvente como o soluto ocupam
áreas iguais sobre a superfície, então, x: A é igual a fração da superfície ocupada pelo
componente i ,81 . Desde que 81 + 82 =1, a relação 81/82 rearranja da mesma maneira
que x~ /x; para dar:
8 2 kab
s = __ 2
ka~ +1
Eq. 1.7.1.5
Nesta forma a equação de Langmuir mostra como a fração dos sítios de adsorção
da superfície ocupada pelo soluto aumenta com a atividade do soluto em soluções com
concentrações crescentes.
1.7.2.- Mobilidade e/etroforética e determina-
ção de potencial zeta
A maioria das substâncias adquire uma carga elétrica superficial quando
colocada em um meio polar, como o aquoso, por exemplo. Os possíveis mecanismos de
obtenção dessas cargas são a ionização, a adsorção de íons e a dissolução iônica. Esta
43
carga superficial adquirida influencia a distribuição de íons próximos, no meio polar.
Íons de carga oposta (contra-íons) são atraídos para a superficie e íons de mesma carga
(co-íons) são repelidos. Incluindo a isso ao movimento térmico, tem-se a formação de
uma dupla camada elétrica feita pela superfície carregada e um excesso neutralizante
de contra-íons sobre os co-íons, distribuídos de uma maneira difusa no meio polar.
A teoria da dupla camada elétrica trabalha com esta distribuição de íons, assim
como com a intensidade dos potenciais elétricos na superfície carregada e no restante do
melO.
A dupla camada elétrica pode ser considerada como consistindo de duas regiões:
uma região interna que pode incluir além da superfície carregada, íons adsorvidos sobre
esta e uma região na qual íons estão distribuídos de acordo com a influência das forças
elétricas e do movimento térmico.
o modelo de Gouy e Chapman, para a parte difusa da bicamada, (Fig. 1.7.2.1)
considera que:
_ A superfície carregada é plana, de comprimento infinito e uniformemente carregada.
_ Os íons na parte difusa, são consideradas cargas pontuais, distribuídos segundo a
distribuição de Boltzman.
_ O solvente influencia a bicamada somente através de sua constante dielétrica, a qual é
considerada constante em toda a parte difusa.
Ge e.f.I:\ e\Ve (i) . e e
e G· eee ~
ee $ e e $
Distância
~oc:
~
.;.
n.
Figura 1.7.2.1 Representação esquemática de uma dupla camada difusa
_ <Po é O potencial elétrico na superfície plana e <p é o potencial em uma distância x da
superfície na solução eletrolítica.
44
Aplicando a distribuição de Boltzman temos que:
n+ = no exp (-ze<p/kT) e n_ = no exp(ze<p/kT ), onde -ze<p e ze<p representam as energias
potenciais e n+ e lL são os respectivos números de íons positivos e negativos por unidade
de volume em pontos onde o potencial é <p e no é a correspondente concentração de cada
espécie no seio da solução.
Seja p, a densidade volumétrica resultante de carga: p = ze(n+ + n.) Aplicando a
Equação de Poisson para o potencial: 82<p182x = - P lê, e adotando as condições de
contorno: <p=<po, x=O e <p =0 e d<p/dx =0, quando x -7 00 e a aproximação de Debye
Huckel: ze<p/2kT ~ I, temos para o potencial: <p = <po exp(-kx), onde k = ( 2e2NAcz2 I
êkT )1/2 e <po o potencial na superfície.
A dupla camada Stern propôs um modelo no qual a dupla camada é dividida
em duas partes separadas por um plano (plano de Stem), localizado acerca de um raio
hidratado de íon da superfície carregada, considerando também a possibilidade de
adsorção de íons neste plano (Fig. 1.7.2.2).
11.( Distância
(j)
eEf)
e
e
Ef)
Ef)
eCamadadJfusa
\ Camada de Stem
(ij"o2 Y,doo..
Figura 1.7.2.2 Representação esquemática da estrutura da dupla camada elétrica, segundo a teoria de
Stem.
Onde <Pd é o potencial no plano de Stem, onde os íons adsorvidos (por interação
eletrostática e/ou por forças de van der Waals, suficientes fortes para vencer a agitação
45
térmica), ficam na região entre a superfície e o plano de Stern.Àqueles que têm centros
além do plano formam a parte difusa da dupla camada onde o modelo de Gouy
Chapman é aplicado. 8 é a largura da camada
Um pouco além do plano de Stern, incluindo a solução eletrolítica, fica o plano
de cisalhamento ("shear plane") que define a unidade eletrocinética que é constituída
por partículas, moléculas e íons ligados à superfície, e que se move com ela quando é
deslocada por movimento browniano ou sob a influência de força elétrica. O potencial
eletrocinético é chamado de potencial-zeta, ç .Percebe-se que ele é um pouco menor que
o potencial <Pd. Geralmente, se considera o potencial-zeta igual ao potencial de Stern,
com uma pequena margem de erro. O mesmo não acontece em altas concentrações
eletrolíticas e altos potenciais.
O ZetaPlus trabalha com o fenômeno da eletroforese, que corresponde ao
movimento da unidade eletrocinética (superficie carregada + íons ligados) em relação
ao líquido estacionário, sob a ação de um campo elétrico externo.Na Figura 1.7.2.3
mostramos o esquema ótico usado na determinação do potencial Zeta.
Laser diodo
M2Modulador
Raio de referência
/ YSIDivisor de raio
Eletrodos
I I 11-1) YMIEspelho
Figura 1.7.2.3 Sistema ótico utilizado na medição do potencial Zeta
Como já vimos anteriormente, partículas dispersadas em um líquido,
freqüentemente adquirem uma carga superficial. Se aplicarmos um campo no líquido, as
partículas carregadas mover-se-ão na direção do pólo positivo ou negativo deste campo
(Eletroforese). A direção selecionada pelas partículas é uma clara indicação do sinal da
carga que elas carregam. A velocidade com que estas cargas se movimentam sob a ação
do campo, numa certa faixa de tamanho, depende da quantidade de carga que elas
apresentam.
46
Ao se aplicar um campo pulsado de baixa intensidade no líquido, teremos que as
partículas se movem ora para um lado ora para o outro .lado. Ao incidir um feixe de luz
laser com freqüência devidamente ajustada em 250 Hz (MANUAL DE INSTRUÇÕES,
BROOKHAVEN, 1997) tem-se espalhamento de luz, cuja freqüência (Efeito Doppler)
será proporcional à velocidade da partícula, que por sua vez será proporcional à carga,
considerando uma certa faixa de tamanho.
Seja Vef- velocidade eletroforética ou velocidade de deslocamento, então:
Vef = ).tef E, onde ).tef- mobilidade eletroforética.
E - intensidade do campo elétrico aplicado
Com o campo dado, mede-se a velocidade eletroforética e calcula-se a
mobilidade. A partir da mobilidade eletroforética e a aproximação de Smoluchowski
abaixo, o potencial Zeta é determinado.
Equação de Smoluchowski _ ).tef = ErEo ç /11 ~ ç = 11 ).!ef / ErEO, ka» I
).tef = mobilidade eletroforética
Er = permissividade elétrica relativa do líquido
Eo = permissividade elétrica do vácuo
ç =Potencial Zeta, onde o limite ka» I corresponde à aproximação da partícula
ter um raio muito grande o que leva a supor que tanto a dupla camada quanto a
própria partícula são planas.
Para medidas de pequenas mobilidades eletroforéticas, o ZetaPlus utiliza a
análise de fase de luz espalhada-CPALS), para determinação da mobilidade
eletroforética, ).ter e, a partir disso, usando a aproximação de Smoluchowski calcular o
potencial. Na Figura 1.7.2.4 apresentamos o esquema PALS.
47
BIBLiOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
Análise de Fase de Luz Espalhada (PALS)
q=iL-q.
1_'1 4ltno ' eq = q = -----SIII-
"o 2
-1 ~.. ~r--Ê(l) ~ Ê. ';11«" r, t)
(Q(t) - Q(O») == ~Q(t)
tlQ( t) = (/l.)q • [E( t) / (O E - "\ t]
Figura 1.7.2.4 Esquema PALS
Onde, E(t) é o campo oscilante dado, ~Q(t) é a variação de fase sofrida pela luz
espalhada ,q o vetor de onda, com I q I= 4 rr no /À<J sen 8/2, onde:
no é o índice de refração do líquido
À<J comprimento de onda da luz laser no vácuo e 8 é o ângulo de espalhamento.
A partir da aplicação do campo E(t) oscilante, mede-se a diferença de fase ~Q(t)
da função e, através de ajustes feitos internamente pelo sistema ótico do aparelho (de
modular cada novo ciclo para remover termo linear Vc, ajustar a função retificada para
termo residual linear mais termo oscilante) determina-se a mobilidade eletroforética
média. e finalmente, calcula-se o potencial Zeta.
O potencial Zeta é útil na determinação de:
_cargas sobre partículas.
_mudança da carga sobre as partículas com o tempo
_medida do ponto isoelétrico e estabilidade
_efeito de força iônica e PH m líquidos polares etc
1.7.3.- Espectrofotometria de UV-visível
A espectroscopia para o bioquímica ou biofísico, geralmente significa a
observação de espectros de absorção. A maior parte dos estudos realiza-se em soluções,
geralmente diluídas. Em tais circunstâncias, a lei de Lambert-Beer governará os
processos de absorção,
II = Ioe -&1e = 10 10 -&1e I Eq. 1.7.3.1 I
48
Onde lo é a intensidade de radiação incidente e I a intensidade da radiação
transmitida através de uma célula de I cm de espessura, contendo uma solução de
concentração c moles/litro. A quantidade E é coeficiente de extinção, em unidades de
litro por moI por centímetro. Freqüentemente os dados são apresentados em transmissão
porcentual (I/Ia x 100) ou em absorbância [A = log (IIIo)]. Esta última é particularmente
conveniente, pois, da equação 1.7.3.1, pode ser escrita a equação abaixo:
'- ----'-I_A_=_Elc_____ Eq.1.7.3.21
Um espectro de absorção no ultravioleta obtido diretamente de um instrumento
nada mais é do que um gráfico da intensidade de absorção (absorbância ou
transmitância) versus o comprimento de onda ou (freqüência). Para a medição dos
espectros de absorção exige-se a produção de uma luz monocromática de comprimento
de onda conhecido a medição do decréscimo em intensidade que ocorre quando a luz
passa através de uma espessura conhecida de solução.
1.7.4.- Espalhamento de luz dinâmico
Espectroscopia de correlação de fótons (PCS) é uma técnica de espalhamento
dinâmico quase-elástico de luz, comumente usada para caracterizar partículas coloidais
de tamanhos na faixa de submícrons a nanômetros. Radiação a laser em partículas
coloidais em movimento Browniano produz flutuações desordenadas no sinal de
intensidade de luz espalhada, com um procedimento temporal dependente do tamanho e
forma da partícula. A dependência temporal das flutuações pode ser determinada por
autocorrelação do sinal de intensidade espalhada. Para partículas esféricas, a função de
autocorrelação decai exponencialmente com uma constante de decaimento rproporcional ao coeficiente Browniano médio de difusão, Do, das partículas , que por
sua vez está relacionado com o seu tamanho (raio hidrodinâmico). No limite de baixa
concentração de partículas, interações hidrodinâmicas podem ser desprezadas, e o
diâmetro médio da partícula, d, pode ser calculado, usando a equação de Stokes
Einstein (HANUS; PLOEHN, 1999):
49
IDo = kb T /3 7t 1](t) d---------
Eq. 1.7.4.1 I
onde kb é a constante de Boltzmann (1.38054 x 1O-16ergs/deg), T é a temperatura
em °K, 1](t) (em centésimos de poise) é a viscosidade do solvente. As partículas, fontes
secundárias de luz espalhada, estão em movimento Browniano, assim à distância
percorrida pelas ondas espalhadas até o detector varia com o tempo. As ondas
eletromagnéticas podem interferir construtivamente ou destrutivamente, dependendo da
distância ao detector. O tempo de decaimento das flutuações está relacionado com a
constante de difusão, Do, das partículas, que por sua vez depende do raio hidrodinâmico.
As partículas pequenas com coeficiente de difusão maior produzem flutuações com
decaimentos mais rápidos que as partículas maiores que se movem mais devagar.
No espalhamento quase-elástico de luz, o tempo de decaimento dessas
flutuações é medido, usando um correlator, cuja função de autocorrelação é formada
pela média dos produtos das intensidades espalhadas medidas em pequenos intervalos
de tempo (delay time), comparados com o tempo necessário para a flutuação voltar
(decair) ao valor médio de intensidade espalhada. Quando t aumenta a correlação é
perdida, e a função aproxima-se de um valor médio B. Para tempos pequenos a
correlação é alta.
Para uma suspensão monodispersa de partículas esféricas, globulares, rígidas, a
função de autocorrelação é dada por:
C(t) = A e-Lfl· + B Eq. 1.7.4.2 ]
onde A é uma constante ótica, determinada pelo aparelho e r é relacionada ao
tempo de relaxação das flutuações por:
2r =Doq Eq. 1.7.4.31
Com Do = coeficiente de difusão das partículas; q vetor de onda da luz
espalhada, dado por: I q I= 4 7t n/l..on sen8/2.
A partir de medidas da função de autocorrelação ,determina-se r através do
ajuste da função à C(t). Com isso, calcula-se o coeficiente de difusão, Do, a partir de 1..0,
n e 8 dados.
50
INSTITUTO DE UUIMIIA\
Universidade de São Pa:.ilO
Finalmente, obtêm-se o diâmetro da partícula, usando a relação de Stokes
Einstein:
Do=kb T /3 7t YJ(t)d Eq. 1.7.4.41
o software, MAS OPTION (Manual de Instrução - Potencial Zeta, Brookhaven,
1999), instalado no Zeta Plus, faz as medidas das intensidades espalhadas nos pequenos
intervalos de tempo, ajusta a função C(t), calcula Do e d automaticamente.
A função de autocorrelação é mais complexa que a apresentada na equação
(1.7.3.3), a qual é adotada para sistemas monodispersos de partículas rígidas esféricas.
Quando a amostra é constituída de esferas de tamanhos variáveis, um sistema
polidisperso, a função C(t) da equação 1.7.3.4 é modificada. Cada tamanho de partícula
contribui com sua própria exponencial, de tal forma que para a amostra temos a seguinte
função:
g(t) = fG(t) e-r tdt Eq. 1.7.4.5]
A solução desta equação, Equação da Transformada de Laplace, não é trivial.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para obtenção da solução de g(t), utilizando
diversos modelos para as distribuições de partículas. Entre elas podemos citar: Ajuste
para uma Distribuição Conhecida, Análise de Cumulantes.Transformada Inversa de
Laplace, entre outras. O Zeta Plus, através do software, MAS OPTION, utiliza para seus
cálculos da função de autocorrelação o método mais geral, análise de cumulantes,
(BERNE & PECORA, 1988; INSTRUCTION MANUAL, BROOKHAVEN, 1995).
Neste método nenhuma hipótese é feita acerca da forma da função de distribuição. A
exponencial da equação 1.7.3.5 é expandida em uma série de Taylor em tomo do valor
médio. A serie resultante é integrada para dar um resultado mais geral, o qual mostra
que o logaritmo da função de autocorrelação pode ser expresso como um polinômio no
tempo (delay time). Os coeficientes das potências de t são chamados de cumulantes da
distribuição, os quais durante uma medida com o, MAS OPTION, geram os resultados
cumulantes que são: diâmetro efetivo e índice de polidispersidade. que por sua vez são
usados para calcular os dois parâmetros da distribuição Lognormal, escolhida pelo
programa para representar a distribuição por peso dos diâmetros das partículas.
51
Grabowski e Morrison (GRABOWSKI & MORRISON, 1983) formularam uma
aproximação mais complexa para g(t), denominado algoritmo de mínimos quadráticos
não negativos (NNLS), aplicada a análise de distribuições multimodais de tamanho
(MSD).a qual encontra-se como opção para determinação de tamanho no, MAS
OPTION (INSTRUCTION MANUAL, BROOKHAVEN, 1995).
2. - OBJETIVOS
Objetivo geral:
• Estudos fisico-químicos da interação entre miconazol e lípides
sintéticos catiânicos ou aniânicos e da interação entre os lípides
sintéticos e as células de C. albicans.
Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de
bicamada catiônico (DODAS)
Objetivos específicos:
• Determinar tamanhos médios e potenciais zeta das dispersões de lípides
Solubilização de miconazol em dispersões de lípides por espectroscopia de UV
Visível.
• Determinar absorptividade molar (E) do miconazol em algumas dispersões
lipídicas.
• Determinar a inserção de miconazol nas bicamadas vista por determinações de
diâmetro médio (Dz) e potencial zeta (Ç) nas dispersoes de DODAB e Pc.
Parte 1/: Estudo da solubilização e/ou estabilização co/oidal do
MCZ em fragmentos de bicamada aniônica (DHP)
Objetivos específicos:
• Determinar a floculação ou estabilização de dispersões de miconazol por
vesícula de carga oposta.
52
• Avaliar o efeito de concentração de miconazol em pH 6,3 sobre sua agregação
em dihexadecilfosfato de sódio 0,05 mM.
• Avaliar o efeito de pH sobre o diâmetro médio (Dz) e potencial zeta (Ç) de
dispersões de droga, dihexadecilfosfato de sódio ou dihexadecilfosfato de sódio
e droga
• Avaliar o efeito de concentração de dihexadecilfosfato de sódio sobre a cinética
de agregação da droga 0.2mM, em diferentes pHs.
Parte 11/: Aspectos físico-químicos da interação entre
anfifílicos catiônicos de DODAB e células de C. albicans
Objetivos específicos:
• Avaliar o efeito da concentração de células sobre a adsorção de DODAB.
• Determinar as isotermas de adsorção de brometo de dioctadecildimetilamônio
em células de Candida albicans fixa a concentração de células em 108
células/mL.
• Avaliar o efeito da concentração de brometo de dioctadecildimetilamônio sobre
a mobilidade eletroforética das células.
3.- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.- Reagentes
•
•
•
•
•
•
•
•
Água Milli-Q ultrapura.
Brometo de dioctadecilmetilamônio (DODAB) foi obtido de Sigma, 99,9% de
pureza.
Dihexadecilfosfato de sódio (DHP) foi obtido de Sigma, 99,9% de pureza.
L-a Fosfatidilcolina : solução etanólica (solução mãe) 100 mglmL, produzida
pela Sigma Chemical Co.
Miconazol nitrato. Obtido de Janssen Research Foundation, 99,9% de pureza.
Metanol. 95,5% de pureza marca Merck.
Etanol p.a 99,8% de pureza marca Merck.
Clorofórmio 99,0% de pureza marca Merck.
53
•
•
•
•
•
•
•
•
Solução tampão tris HCI IOmM
Solução de molibdato de amônio 1,25%
Solução de ácido ascórbico 5%
Ácido perclórico marca Quimex.
Membrana de celulose para diálise marca Sigma.
Solução padrão de fosfato de sódio (NaH2P04) ImM
Solução indicadora de difenilcarbazona em etanol
NaCI p.a 99,5% de pureza, marca Merck.
3.2.- Equipamentos
3.2.1.- Zeta Potential Analyzer (Zetaplus)
para determinações de diâmetro médio das partículas em
dispersão
o Zeta Plus Analyzer aparelho utilizado para a medida de tamanho médio de
partículas. A técnica empregada - Espectroscopia de correlação de fótons de
espalhamento quase-elástico de luz dinâmico (QELS).
Especificações:
Faixa de tamanhos medidos:
Controle de temperatura:
Volume da amostra:
Resultados:
2 nm a 3 Jlm
5°C a 75°C
0.5 a 3 mL
Diâmetros médios (Dz) e desvio médio são calculados
para a distribuição de tamanho por peso, assumindo
uma distribuição lognormal.Análise de distribuição
multimodal de tamanho (MSD) é opcional.
54
3.2.2.- Zeta Potential Ana/yzer (Zetaplus)
para determinações do potencial zeta das partículas em
dispersão
Zeta Potential Analyzer ZetaPlus aparelho utilizado para a medição de potencial
zeta das partículas. Utiliza a técnica de espalhamento eletroforético de luz, e está
baseada na análise das diferenças de fase da luz espalhada (PALS).
Especificações:
Faixa de potencial Zeta:
Faixa de tamanhos:
Precisão:
Reprodutibi Iidade:
Fonte de luz:
Controle de temperatura:
Volume da amostra:
Tempo de medida:
Resultados:
3.2.3.-
2000
-150 a + 150 mV
10 nm a 30 ~m (dependendo da densidade
partícula)
±2%
±2%
laser de 30 mW , estado sólido, de À = 532 nm
6 DC a 74 DC em passos de 0.1 DC
1.5 mL
tipicamente de 1 a 2 minutos.
valores modais para potencial Zeta e mobilidade
eletroforética e distribuições de potencial Zeta
Espectrofotõmetro Hitachi-Mode/o U-
Aparelho utilizado para medidas de absorbância e espectros ópticos das
dispersões. O equipamento é acoplado ao registrador gráfico para registro contínuo de
medidas de absorbância em função do tempo ou comprimento de onda.
Especificações:
Fonte de luz:
Precisão na absorbância:
Reprodutibilidade:
Na faixa de UV-VIS (190-1100 nm) com precisão de
±OAnm
Na escala de 0.0 a 0.5 ± 0.002
Na escala de 0.5 a 1.0 ± 0.004
0.001 de absorbância na escala de Oa 0.5
0.002 de absorbância na escala de Oa 1.0
55
3.2.4.- Espectrofotómetro (Model Spectrascan
2800 CIBA-CORNING)
. Aparelho utilizado para medições de absorbâncias das dispersões em
temperatura controlada. Aparelho equipado com um sistema óptico de feixe duplo de
luz monocromática.
Especificações:
Fonte de luz Lâmpada de deutério (200 a 350 nm)
Lâmpada de Iodo-Tungstênio (330 a 1100 nm)
Precisão na absorbância Na escala de 0.0 a 0.5 ± 0.002
Na escala de 0.5 a 1.0 ± 0.004
Reprodutibilidade ± 0.001 de absorbância na escala de Oa 0.5
± 0.002 de absorbância na escala de Oa 1.0
3.2.5.- Sonicador Lab-Line UltraTip (Modelo
9100 com tip de titânio)
Aparelho desenvolvido para romper, através de ondas sonoras emitidas de um
ultra-som, as paredes ou membranas celulares de células em experimentos
microbiológicos. Aqui ele foi utilizado para formar vesículas e fragmentos de vesículas
de anfifílicos pelo mesmo princípio de ultra-som.
Especificações:
Requerimento elétrico 120 VAC, 60 Hz, 400 Watts
Energia acústica (do Tip) Gerador de freqüência de Oa 200 watts
Emissão de nível do sonido 97 d BA's a 150 watts
99 d BA's a 200 watts
56
3.2.6.- Centrífugas
• Centrífuga refrigerada-modelo Himac SeR 20B da Hitachi,
com velocidade de rotação entre O a 2000 rpm e temperatura
entre -10 e 40°C.
• Microcentrífuga-Eppendorf-modelo 540, refrigerada, com
velocidade de rotação entre 1000 e 14000 rpm e temperatura
entre -9 e 40°C.
3.3.- Métodos preparativos para obtenção das
dispersões de lipídios, droga e célula
3.3.1.- Dispersão de /ípides sintéticos por
sonicação com sonda
As vesículas e/ou pequenos fragmentos de dihexadecilfosfato de sódio (DHP),
brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), cujas fórmulas estruturais se
encontram nas Figuras 3.3.1.1, foram preparadas de uma maneira geral, calculando-se a
massa necessária para a concentração final desejada, utilizando um balão volumétrico
para a pesagem e completando com água Milli-Q para obter o volume pré-estabelecido.
Em seguida, a mistura é colocada no ultra-som, em um béquer de 10 mL, apropriado
para o encaixe da sonda (tip) de titânio (MORTARA et al., 1978; KANO et al., 1979) a
uma temperatura entre 60 e 80 °e durante 15 minutos, em uma potência média nominal
de 80 watts. Para precipitação do titânio ejetado da sonda e possíveis vesículas
multilamelares produzidas durante a sonicação, procedeu-se a uma centrifugação em
10000 g por 1 hora a 25°C. (FENDLER, 1980).
3.3.2.- Dispersão de /ípides sintéticos por
injeção c/orofórmica
Vesículas grandes foram preparadas por injeção c1orofórmica de DODAB e
DHP em água. O DHP e o DODAB foram pesados para uma concentração 10 vezes
maior que aquela desejada, e diluído em 1 mL de clorofórmio, que foi injetado a uma
57
velocidade de aproximadamente 0,2 mL/min em 10 mL de uma solução termostatizada
a 70 ± 0,5 °C, e borbulhada com nitrogênio para facilitar a vaporização do clorofórmio.
Quando todo o clorofórmio evaporou, a dispersão foi então retirada da coluna com uma
pipeta. A dispersão assim obtida corresponde às vesículas unilamelares grandes de
DODAB e DHP. Seguiu-se com a microtitulação de DODAB e a dosagem de fósforo
inorgânico de DHP.
3.3.3.- Dispersão de fosfatidilcolina ou
brometo de dioctadecildimetilamônio por injeção etanólica
Vesículas pequenas unilamelares de fosfatidilcolina, PC, cuja fórmula estrutural
se encontra na Figura 3.3.3.1, foram preparadas por injeção etanólica (BATZRI &
KORN, 1973; KREMER et a1., 1977) em água, seguida por 4 horas de diálise em água
pura para eliminar o etano1. O diâmetro médio obtido foi de 70 nm (CARMONA
RIBEIRO & HERRINGTON, 1993).
3.3.4.- Dispersão de brometo de dioctadecil-
dimetilamônio por aquecimento e agitação
Vesículas grandes de DODAB foram obtidas pelo o método do SNIPPE - por
aquecimento (KATZ et a1., 1995). Os sais foram pesados analiticamente e transferidos
para um frasco, onde foi adicionada quantidade suficiente de água Milli-Q para a
concentração desejada.A dispersão dos lípides se deu por aquecimento em banho, a uma
temperatura média de 50°C, valor acima da temperatura de transição de fase dos sais,
durante 30 minutos. Em seguida foram homogeneizadas por agitação.
3.3.5.-
miconazol
Preparação da solução estoque de
Foi pesado miconazol para preparar a concentração desejada em metanol 96 %
(lOmg/mL solução mãe). A seguir, vortexou-se para a completa dissolução dos cristais
da droga.
58
3.3.6.-
BIBLIOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUnlversid.de de São Paulo
Cultivo de Candida albicans, determina
ção da curva de crescimento e contagem de células em
câmara de Neubauer
Candida albicans ATCC 90028 isolada em ágar Sabouraud dextrose 4%, foi
semeada em ágar Sabouraud dextrose 4%. Partindo desta cultura de 24 h, foi preparado
um inoculo que inicialmente apresentou uma turbidez compreendida entre 0,080 e 0,100
de absorbância num comprimento de onda de 625 nm. O inóculo foi incubado em
shaker a 30°C, 160 rpm, durante 6 h. Posteriormente, 30 mL foram centrifugados a 5000
rpm, por 15 min; centrifugados mais duas vezes com água Milli-Q esterilizada, a 5000
rpm, por 10 min, para lavagem. O sedimento foi suspenso em 30 mL de água Milli-Q
estéril.
A curva de crescimento da Candida albicans foi realizada para tentar reproduzir
as condições anteriormente padronizadas no laboratório, comparando-se o tempo
necessário ao crescimento exponencial (fase log da levedura). Os métodos escolhidos
foram de dosagem de fosfato (ROUSER, et aI., 1970) e determinação da turbidez a 625
nm.
A suspensão foi separada em tubos eppendorf estéreis e conservadas até o seu
uso (l mL de cada amostra). Para a determinação de fosfato, todas as amostras foram
centrifugadas a 5000 rpm, 4°C, durante 30 minutos. Os sedimentos foram então
suspendidos com 1 mL de água Milli-Q estéril, com exceção das amostras de O e 3h,
que foram suspensas com 0,2 mL de água Milli-Q estéril. A concentração de fosfato foi
colocada em gráfico, em função do tempo (Figura 3.3.6.1).
59
2.0 .. g,,---I"rg
~ 1.5 Ig
E~
o.. 1.0.....!!"E.,()c 0.5 1o /gu
O
I .,i i , I , I /,. IO 4 8 12 23 24
Tempo de cultivo (h)
Figura 3.3.6.1 Crescimento de C. albicans monitorado por dosagem de fosfato inorgânico (P j , em mM)
em função do tempo de cultivo (h). Inóculo inicial com turbidez compreendida entre 0,080 e O, I00 de
absorbância a 625 nm foi cultivado em ágar Sabouraud, lavado e suspendido em água Milli-Q antes das
determinações.
Alternativamente, o crescimento foi seguido por medidas de turbidez a 625 nm em
função do tempo de cultivo. Alíquotas dos cultivos foram centrifugadas a 5000 rpm e
lavadas duas vezes com água Milli-Q e depois resuspendidas também em água Milli-Q.
O branco era constituído de água Milli-Q. A turbidez a 625 nm foi colocada em gráfico,
em função do tempo de cultivo (Figura 3.3.6.2).
16
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Tempo de cultivo (~
Figura 3.3.6.2 Turbidez relacionada com a concentração de células, em função do tempo de cultivo
(h). A leitura de turbidez foi realizada após o cultivo da levedura em caldo Sabouraud, lavagem e
suspensão em água Milli-Q, em comprimento de onda de 625 nm, espectrofotômetro Hitachi U-2000.
60
Para a contagem das células utilizou-se um hemocitômetro (câmara de
Neubauer) - que possui duas redes quadriculadas, permitindo a contagem de duas
amostras na mesma lâmina. Cada rede é formada por 9 quadrados grandes (separados
por traços), os quais, por sua vez, estão subdivididos em 16 quadrados menores. O
volume de cada quadrado grande é igual a 10-4 mL. Contou-se todas as células do
quadrado grande central (16 quadrados menores) com aumento 100x. Se o número de
células ficasse entre 100 e 200, bastava contar 1 quadrado grande. O cálculo da
concentração de células na suspensão é dado por numero de células contadas x 104 e
igual a número de células/mL. Se o número de células em cada quadrado grande for
menor que 100 contar dois ou mais quadrados dependendo do número de células. Neste
caso a concentração será dada por número de células contadas x 104 dividido entre o
numero de quadrados grandes contados que e igual número de células/mL.
3.4.- Métodos analíticos
3.4.1.- Determinação da concentração de
fosfati-dilcolina e dihexadecilfosfato por dosagem de
f6sforo inorgânico
O método da dosagem de fósforo inorgânico (ROUSER et aI., 1970) se aplica
tanto ao PC quanto ao DHP. Neste método alíquotas da solução problema (50, 75 e 100
~L) e da solução padrão (O, 10, 30, 50, 70, 90 e 100 ~L) são colocados em tubos de
ensaio reservados para dosagem de fosfato e então secos em estufa (~l00 0c). Em
seguida, são adicionados 0.3 mL de ácido perclórico concentrado aos tubos secos, sendo
então colocados em um banho na capela, a 180°C por 4 horas, com os tubos tampados.
Depois disso, espera-se esfriar e adiciona-se 1 mL de água pura e 0.4 mL de
molibdato de amônio, agitando-se em seguida. Após isso, adiciona-se em cada tubo 0.4
mL de ácido ascórbico e agita-se novamente. Em seguida, os tubos são colocados em
banho de água fervente, fechados, por 5 minutos, e depois disso a absorbância é lida a
795-797 nm contra o ponto zero da curva padrão.
61
A partir dos valores obtidos de absorbância é feito um ajuste linear no qual é
possível se determinar o valor de concentração da solução analisada como mostrado na
Tabela 3A.1.1.
Tabela 3.4.1.1.- Curva padrão de fosfato
Fosfato de sódio Absorbância
(nrnolar) (795 nrn)
O O
10 0.177
30 0.356
50 0.627
70 0.845
90 1.060
100 1.184
Na Tabela 3A.1.l, apresentadas as concentrações de fosfato e as respectivas
leituras espectrofotométricas para a construção da curva padrão de fosfato da Figura
3A.1.1.
Neste caso, através da curva padrão de fosfato, obteve-se a equação da reta y = 0.00565
+ 0.01186 x, onde.
x = teor de fosfato (nmolar)
y = leitura de absorbância na amostra
1.2 T,----------------ni.'
..0'
ê 0.9
=In0\r--:;- 0.6....=(~
,Qlooo.c 0.3-<
..0"
.c/
,/0'
o·'/
~~,/' Y:::A+B"X
Parlllmeter Vlllue Error
0.00565 0.010170.01186 0.00017
50 N
0.99951 0.01568 7 <0.0001
o f' I I , I20 40 60 80 100
Concentração de fosfato (nrnoles)
Figura 3.4.1.1 Curva padrão de fosfato.
62
3.4.2.-
3.4.3.-
Determinação da concentração de
brometo de dioctadecildimetilamônio por microtitulação
Este método é empregado quando as dispersões estão em água, e consiste em
uma microtitulação da solução em estudo com o titulante nitrato de mercúrio
[Hg(N03)2] 10 mM utilizando-se como indicador a difenilcarbazona (SCHALES;
SCHALES, 1941), tendo-se o cuidado de adicionar etanol absoluto à dispersão para
garantir a solubilização das moléculas de DODAB que compõem a bicamada.
[DODAB] = 2x[(HgN03)2]X~HgNOJ), Eq.3.4.2.1
VCDODAB)
Onde, [(HgN03)2] = Concentração (M)
V = Volume (L)
(limite de detecção na ordem de micromoles).
Determinação da concentração de
brometo de dioctadecildimetilamônio pelo método de Brij
Este método é empregado quando o DODAB esta disperso em uma solução
aquosa salina de KCl ou tampão Tris que contém algum haleto como cloreto, brometo
ou iodeto, os quais poderiam interferir com a determinação do brometo, contraíon do
anfifilico DODAB (STELMO et aI 1987). O método baseia-se na formação de
complexos estáveis entre o Orange G e íones de DODAB que podem ser solubilizados
em soluções aquosa contendo micelas neutras de Brij 35. As variações na absorbância,
devido à formação do complexo na presença de Brij 35, foram usadas por STELMO et
aI. Para desenvolver este método para análise quantitativa de anfifilico de cadeia longa
de alqui1amônios, baseou-se na diminuição de leituras de absorbância do complexo
colorido ao interagir com as micelas de Brij. A solução de Brij foi preparada da seguinte
maneIra:
• 0.0271 g de orange G,
• 0.0718 g de Brij 35,
63
• 5.844 g de NaCl,
• e 1 litro água Milli-Q; agitação até solubilização total.
ü método de Brij consiste na obtenção da curva padrão de DüDAB através de
uma dispersão já padronizada do mesmo anfifilico, assim, para uma dispersão de
DüDAB 2mM, foram tomadas alíquotas de O a 100 p,L, variando de lOuL cada ponto.
Da amostra a ser analisada, foram tomadas três alíquotas de 100 f.lL. Foram adicionados
2 mL da solução de Brij em cada alíquota de padrão ou amostra e foram deixados em
banho-maria a 50°C por 30 minutos. Depois, foram transferidos para banho-maria a 37
°C e, após estabilização da temperatura, os padrões e as amostras que interagiram com a
solução de Brij, foram submetidas às leituras de absorbância a 480 nm no
espectrofotômetro CIBA-CüRNING 2800, com o controle de temperatura a 37°C para
este experimento. Como branco, foi utilizada a solução de NaCI 0.1 M.
A seguir mostramos um exemplo do doseamento de fosfato pelo método de Brij
Tabela 3.4.3.1.- Leituras e correção de leituras de absorbância pelo método de Brij para curva padrão de
DüDAB.
DODAR ABS480 ABSCORRlGIDA MBS [DODAR] mM
padrão (J..lL)
10 1.077 1.082 0.011 0.008
20 1.060 1.071 0.022 0.016
30 1.036 1.052 0.041 0.024
40 1.019 1.039 0.054 0.031
50 0.996 1.021 0.072 0.039
60 0.978 1.007 0.086 0.047
70 0.957 0.990 0.103 0.054
80 0.936 0.973 0.120 0.062
90 0.914 0.955 0.138 0.069
100 0.891 0.936 0.157 0.076
64
<0.0001
P
0.001060.01201
N
Value Error
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0.07
0.06
Ec 0.05OCO"<:tCf) 0.04ll)
<t:<l 0.03
0.02
0.01
0.160.140.120.100.080.060.040.020.00 ~ i I I I I I i I i I i I i I i I I
0.00
[OOOAB]mM
Figura 3.4.3.1 Curva padrão de DODAB obtida pelo método de Brij
Pela interpolação na curva padrão ou pela equação da reta foram retirados os
parâmetros A e B, com os quais, foi obtida a concentração no sobrenadante.
Onde:
ABSCORRlG =ABS (V + 2000)iDA 480
V
Eq.3.4.3.l
MBS = ABSBRANCO - ABSCOÚIGIDA Eq.3.4.3.2
Da equação da reta da curva padrão, foi obtida a concentração em cada tubo (YJ -
[DODAB]mM)
7]=Y-A
B
Eq.3.4.3.3
Tabela 3.3.4.2.- Doseamento da dispersão de DODAB obtidas por sonicação com tip em presença de C.
albicans, para um tempo de interação de uma hora ver tabela 3.3.4.3. Leituras e correção de leituras de
absorbância pelo método de Brij.
65
N° doV deABS ABS (ABS CDODAB Conc_tubo COOOAB noCOOOAB N° deN° de
tubo DODAB(480nm) corrigida BR. -adicionado(mM) s.obre. adsorvidamoléculas moléculas
(llL) AbscOR)(mM) (mM) adsorvidas Icélulas.
100 1.028 1.079 0.014 0.480 0.Ql O 0.212 0.268 1.61E+17 5.38E+08
100 1.029 1.080 0.013 0.480 0.010 0.201 0.279 1.68E+17 5.60E+08
100 1.031 1.083 0.Ql0 0.480 0.009 0.180 0.300 1.81E+17 6.02E+08
2 100 1.030 1.082 0.011 0.528 0.009 0.191 0.337 2.03E+17 6.77E+08
2 100 1.023 1.074 0.019 0.528 0.013 0.265 0.263 1.58E+17 5.28E+08
2 100 1.018 1.069 0.024 0.528 0.015 0.318 0.210 1.26E+17 4.22E+08
C n Eg.3.4.3.4SOBRENADANrE = TUBO
VAMOSTRA (mL)
onde: VAMOSTRA = volume da amostra (100 ,uL), nTUBO = [DODAB]mM,
CADSORVJDA =CADlCfONADA - CSOBRENADANrE
NADSORVJDAS =60.22xl023
XCADSORVJDAXVMfSTURA(L)
N ADSORBJDAS = número de moléculas adsorvidas
Eg. 3.4.3.5
Eg.3.4.3.6
N= N ADSORVJDAS
Eg. 3.4.3.7 1
ADSORBJDAYcCELULA 7:- celulas tubo
CI~ =C2V2 = [DODAB]PADRÃOXVDODABPADRÃo/V2 Eg.3.4.3.8
Onde C 2 e (DODAB] adicionado em cada eppendorf em mM. 2000,uL e volume de
Brij, V volume de DODAB padrão em ,uL V2 = (Brij + VDODAB PADRÃO), UFC = Unidade
formadora de colônias.
66
Tabela 3.4.3.3.- Interação de células de C. albicans e dispersões de DODAB feitas por sonicação com
tipo Tempo de interação Ih.
N° de tubos V DODAB (rnL) Células (rnL) Água (rnL)
0.03 0.50 0.47
2 0.06 0.50 0.44
3 0.09 0.50 0.41
4 0.12 0.50 0.38 B1BLIOTE.CA5 0.15 0.50 0.35 INSilnJTO DE QUIMICA
6 0.18 0.50 0.32Universidade de Sáo Paulo
7 0.21 0.50 0.29
8 0.24 0.50 0.26
9 0.27 0.50 0.23
10 0.30 0.50 0.20
1I 0.33 0.50 0.17
12 0.36 0.50 0.14
13 0.39 0.50 0.11
14 0.42 0.50 0.08
15 0.45 0.50 0.05
16 0.48 0.50 0.02
17 0.50 0.50 0.00
3.5.-
partículas
Determinação de tamanho e potencial-zeta das
As medidas de tamanho, Dz, e potencial-zeta, r , foram feitas com um -Zeta
Potencial Analyzer (BROOKHAVEN INSTRUMENTS CORP., HOLTSVILLE,NY),
equipado com um laser estado sólido de 630 nm e ângulo de detecção de 90 0.
Para as medidas das distribuições de tamanho das vesículas, fragmentos de
membranas e das formulações, PC/miconazol, DHP/miconazol, DODAB/miconazol, e
miconazol, foram adicionados 2 mL de cada preparação descrita no item 3.3.1 ao 3.3.5,
em cubetas de poliestireno. As leituras foram feitas à 25°C no caso das vesículas,
fragmentos de membrana e formulação mantida em interação à temperatura ambiente,
sempre observando se os parâmetros do aparelho estavam dentro do recomendado pelo
fabricante.
Devido à insolubilidade do miconazol em água, há ocorrência de agregados, isto
é, grânulos ou partículas insolúveis, tomando possível a medida de tamanho de seus
67
agregados. Foram adicionados a 2,7 mL de água, 0.3 mL de miconazol em metanol 96
%.
Para as medidas de potencial-zeta para as vesículas, fragmentos de membranas,
formulações, PC/miconazol, DHP/miconazol, DODAB/miconazol e miconazol em
água, foram adicionados 2 mL de cada preparação descrita no item 3.3.1 ao 3.3.5, em
cubetas de poliestireno. As leituras foram feitas à 25°C, sempre observando se os
parâmetros do aparelho estavam dentro do recomendado pelo fabricante.
3.6.- Determinação de isoterma de adsorção de
brometo de dioctadecildimetilamônio sobre células de C.
albicans
A interação entre vesículas e C. albicans foi induzida pela adição de vesículas às
células e vortexadas por alguns minutos em eppendorf fechados. Em seguida deixar
interagir por uma hora à temperatura ambiente, logo depois centrifugar por 30 minutos a
5000 rpm e 4 cC em uma centrifuga Eppendorf 5402, retirar o sobrenadante com ajuda
de uma micropipeta sem remover o pelet, analisá-lo pelo método de colorimetria (Brij).
As misturas de células e vesículas de 1 ou 2 mL continham 0.5 mL de células y volumes
crescentes de vesículas 0.03 a 0.5 mL.
Os resultados foram expressos como o número de moléculas de DüDAB
adsorvida por célula de Candida albicans em função do numero de células.
Como as isotermas seguem o modelo de Langmuir, estas foram linearizadas
utilizando a seguinte equação:
c
xlm
c 1---+----(xl m)máx k(xl m)máx
Eq.3.6.1
onde x/m é o número de moles de anfifílico adsorvidos, c é a concentração de anfifílico
no sobrenadante e k é a constante de afinidade entre o anfifílico e a célula.
A partir do gráfico de _c_ versus c podemos obter a adsorção máximaxlm
(x/m)max pelo coeficiente angular e a constante de afinidade k pelo coeficiente linear da
reta obtida.
68
3.7.- Determinação de adsorção de brometo de
dioctadecildimetilamônio sobre C. albicans
As vesículas de DODAB foram preparadas por sonicação com tip, e por
agitação, para depois serem medidas com o ZetaPlus para a determinação de tamanho
dos lipossomos e dosadas por microtitulação; tomou-se 1.00 mL das dispersões de
DODAB para misturá-la com volumes crescentes de fungo (0.1 a 1 ml) de concentração
de células 2.0xl08 e completadas com água Milli-Q estéril até 2 mL, volume final das
mistura no epperdorf. Em seguida deixar interagir por uma hora à temperatura ambiente,
logo depois centrifugar por 30 minutos a 5,000 rpm e 4 °C em uma centrifuga
Eppendorf 5402, retirar o sobrenadante com ajuda de uma micropipeta sem remover o
pelet, analisá-lo pelo método de colorimetria (Brij).
3.8.- Determinação da mobilidade eletroforética
Um aparelho Mark II/ Rank Brothers (CAMBRIDGE, ENGLAND), para
microeletroforese de partículas com configuração para cela chata foi utilizado, para
determinação da mobilidade eletroforética das células.
Foi registrado o tempo que um fungo leva para atravessar uma distância
conhecida, em um campo, à temperatura media de 25°C. A amostra foi colocada na
célula de eletroforese, os eletrodos da platina foram conectados e aplicou-se uma
diferença de potencial de ± 60 V. Para cada célula, a velocidade eletroforética foi
medida nos dois sentidos, tanto para + 60 V, quanto para - 60 V. A média das
velocidades eletroforética foi calculada para pelo menos 20 células de cada amostra e,
depois, aplicada na fórmula a seguir:
ME=(_I) di'lV x t
Onde:
I = distância intereletrodos (6.606cm)
d= distância percorrida pela partícula monitorada (120 ~m)
t = tempo gasto pela partícula para percorres "d "
tlV= ± 60V
Eq.3.8.l
69
Para as leituras, foi utilizado o equipamento de Rank Brothers Mark li
(Microelectroforesis Apparatus) aplicando voltagens de -60 ou +60 V sucessivamente
para cada partícula, à temperatura de 25°C e no nível estacionário (NE) determinado
pela seguinte formula:
NE = (d x 1,333 x 0,194) + di l
Onde:
NE = posição do nível estacionário
d = distancia entre as paredes internas da cela do aparelho (em)
di I = posição da Ira parede interna
1,333 = índice de refração do sistema
0,194 = constante da cela chata
Eg.3.8.2
Para cada mistura, a velocidade eletroforética foi determinada para, pelo menos
20 partículas e determinada uma media para 15 melhores medições e mobilidade
eletroforética (ME) calculada segundo a equação 3.8.1.
Tabela 3.8.1.- Exemplo de cálculo de mobilidade eletroforética (ME) para uma densidade de células 1
x 106 células /mL e uma concentração de 0,05 mM de DODAB'na mistura para percurso de 60 Jlm e
aplicação de ±60 V de diferença de potencial.
N° de
partículas te td lIte lItd medía lIt ME (em. J.lm. V·I.S·I)
7.21 7.18 0.1387 0.1393
2 4.81 4.92 0.2079 0.2033
3 5.26 5.36 0.1901 0.1866
4 7.29 7.31 0.1372 0.1368
5 6.23 6.31 0.1605 0.1585
6 5.48 5.55 0.1825 0.1802
7 7.03 7.11 0.1422 0.1406
8 7.24 7.31 0.1381 0.1368
lO 5.04 5.12 0.1984 0.1953
11 6.91 6.89 0.1447 0.1451
12 6.21 6.39 0.1610 0.1565
13 4.33 4.44 0.2309 0.2252
14 6.55 6.48 0.1527 0.1543
15 5.16 5.21 0.1938 0.1919
0.1699 0.1679 0.1689 2.232
te~ Tempo para a vesícula percorrer 60 Jlm ao aplicar +60 V
td = Tempo para a vesícula percorrer 60 Jlm ao aplicar -60 V
70
Tabela 3.8.1 apresenta um exemplo de calculo de mobilidade eletroforética
(ME). Na primeira etapa, foram medidos os tempos da cada partícula para percorrer a
distancia de 60 Ilm ao aplicar o potencial de ± 60 V. Quando a polaridade das cargas
dos eletrodos era trocada, a direção de movimento mudava conforme a localização do
eletrodo negativo, isto é, as partículas estavam carregadas positivamente e se moviam
para o sentido do eletrodo carregado negativamente.
Na segunda etapa, foram obtidas as velocidades, ou seja, o inverso dos tempos.
Em seguida, foram calculadas as medias das velocidades, Cada valor de velocidade foi
aplicado na equação 3.8.1 para obtenção dos valores de ME. E finalmente, a ME para
cada partícula a resultante da media destes dois valores de ME.
71
4.- RESULTADOS E DISCUSSÃO
BIBLIOTECAINSTiTUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paul.
Parte I: Estudo da solubilização de MCZ em fragmentos de bicamada catiônico
(DODAB)
4.1.- Características das dispersões de Iípides:
Na Tabela 4.1.1, pode-se observar características das dispersões lipídicas
dependentes do método de dispersão. Foram determinados tamanho e o potencial zeta
para cada uma das preparações a serem avaliadas como possíveis candidatas à
solubilização e/ou estabilização coloidal para o miconazoI.
Tabela 4.1.1.- Diâmetro médio (D) e potencial zeta (C;) para dispersões de Iípides em água pura a 25 o
C. õ é desvio padrão médio.
Conceotração/lipide Método de dispersão D±õ ç±õ Tipo de bicamada
[mM] (om) (mV)
DODAB/l,34 Injeção etanólica <10 27 ± 1 Aberta (fragmento)
DODAB/l,30 Sonicação com tip 107 ± 1 41 ± 2 Aberta (fragmento)
DODABII,OS Injeção c\orofórmica 492±6 68± 3 Fechada (vesícula)
PC/O,84 Injeção etanólica 61 ± 1 O Fechada (vesícula)
DHPII,20 Sonicação com tip 153 ± -67±4 Aberta (fragmento)
Fragmentos de bicamada de DODAB e DHP podem ser gerados pelo método de
sonicação com tip (Figura 4.1.1). Evidências experimentais que comprovaram a
existência destas estruturas estão na ausência do compartimento aquoso (ausência de
resposta osmótica da dispersão diante de gradientes de concentração de substâncias que
não permeiam a bicamada) (CARMONA-RIBEIRO & CHAIMOVICH, 1983;
CARMONA-RIBEIRO et aI., 1984), microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
(CARMONA-RIBEIRO et aI., 1991), crio-TEM (HAMMARSTRÓM et aI., 1995),
espalhamento de luz quase elástico (QELS) e espectroscopia de ressonância
paramagnética eletrônica (EPR) (PANSU, et aI., 1990; FEITOSA & BROWN, 1997);
solubilização de anfotericina B em dispersões com fragmentos e ausência de
solubilização em vesículas integras do mesmo material lipídico (VIEIRA &
CARMONA-RIBEIRO, 2001). Possivelmente, fragmentos de bicamada de DODAB
72
também podem ser gerados pelo método de injeção etanólica. O fato de considerar que
o método de injeção etanólica produz fragmentos de bicamada de DODAB se deve à
solubilização de anfotericina B nessas dispersões obtidas por injeção etanólica (VIEIRA
& CARMONA-RIBEIRO, 2001). Outra evidência se deve à possível restrição
geométrica de raio de curvatura para a formação de agregados tão pequenos quanto
aqueles obtidos por injeção etanólica (menores do que 10 nm de diâmetro médio)
(Tabela 4.1.1).
Vesículas fechadas de DHP podem ser fom1adas pelo método de injeção
c1orofórmica (CARMONA-RIBEIRO et aI., J 984) e vesículas fechadas de PC, por
injeção etanólica (BATZRI & KORN, 1973; KREMER et aI., 1977). Os valores médios
de diâmetro (D) e ç para as diferentes dispersões são mostrados na Tabela 4.1.1. Os
valores de potencial ç foram determinados por medidas de mobilidade eletroforética J..l. e
equação de Smoluchowski ç = J..l.T]/ê, onde T] é a viscosidade e ê é a constante dielétrica
do meio.
b
. Cabeça polar
\Caudahidrocarbônica
Figura 4.1.1.- Micrografia crio-TEM (Hammarstrom, 1995) em (a) de DHP sonicado a 80°C em
solução aquosa. No mesmo sistema, o caráter de fragmentos de bicamada obtidos por sonicação com tip
foi identificado e caracterizado pela primeira vez por Carmona-Ribeiro et aI., 1991. Observa-se
fragmentos de bicamada vistas de forma lateral "edge-on" (I), frontal "face-on" (2) e em conjunto com
estruturas maiores e irregulares (3). (b) Esquema ilustrativo do fragmento de bicamada, a barra em (a)
representa 100 nm.
73
4.2.- So/ubiJização de miconazo/ em dispersões de
lípides por espectroscopia de UV-Visíve/
A Figura 4.2.1 mostra espectros ópticos de absorção de luz para o miconazol em
metanol que é seu melhor solvente e permite obter a droga em sua forma monomérica
ou em presença de DODAB disperso pelos métodos de sonicação com tip e injeção
etanólica (Figura 4.2.1 B e 4.2.1 C). Observando-se estes espectros, vemos que estes
apresentam espectros ópticos muito similares aos obtidos pela solubilização da droga
em metanol (Figura 4.2.1 A).
D
320
FP C disperso porinjeçãoeianólica
B
A
Jl.>letanol
2.80 320 240 280
Comprimento de onda. (nm)
o 240
1
.~
(~-eol;'l
~llid~~- i llili~ I
Figura 4.2.1.- Espectros ópticos do miconazol nas seguintes concentrações a 25°C: 0.1 (a), 0.2 (b), 0.3
(c), 0.4 (d) e O.5mg/mL MCZ (e). a miconazol foi disperso em metanol (A), DaDAB 1,34mM, (B),
DaDAB 1,30mM, (C), em água (D), DaDAB 1,08 mM, (E), e PC 0,84mM, (F). a método de dispersão
de DaDAB está indicado na figura. Como branco foram utilizadas as dispersões correspondentes dos
anfifilicos.
No entanto, espectros ópticos de miconazol em presença de vesículas grandes de
DODAB obtidas por injeção clorofórmica (Figura 4.2.1E) apresentaram espectros
similares aos obtidos para a droga em água, devido à tendência que droga possui em
formar agregados (Figura 4.2.1D). Por outro lado, pode-se observar que vesículas
fechadas de lípides zwitteriânicos como PC que estão formando bicamadas no estado
líquido-cristalino, mais fluidas, solubilizam um pouco mais a droga que as vesículas
74
grandes de DODAB, possivelmente, devido ao estado físico tipo gel das bicamadas de
DODAB à temperatura ambiente (comparar Fig. 4.2.lE e F).
Em água, o aparecimento de agregados de droga, isto é partículas ou grânulos
insolúveis, geram um espectro composto decorrente da superposição de dois espectros:
o espectro de espalhamento de luz devido à presença de particulado de droga e o
espectro de absorção de luz com seus picos característicos. Os dois fenômenos
contribuíram para o espectro composto obtido (Figura 4.2.1 D, E, F). Comparando-se os
espectros ópticos para a droga em água (Figura 4.2.lD), em seu melhor solvente (Figura
4.2.1 A) ou em diferentes dispersões de lípides (Figuras 4.2.1: B, C, E, e F) nota-se
claramente que a melhor solubilização ocorreu em Fig. 4.2.1 B e C, que corresponderam
a dispersões lipídicas em forma de fragmentos de bicamada. Possivelmente, espaços ou
bordas hidrofóbicas nos fragmentos ofereceu sítios adicionais para solubilização da
droga. A natureza hidrofóbica do miconazol desprotonado permitiria adesão da droga às
bordas hidrofóbicas dos fragmentos de bicamada, com a conseqüente estabilização dos
mesmos. Cálculos de absorptividade molar em 271 nm foram feitos apenas para
espectros da Figura 4.2.1 de caráter simples (não-composto) e assumindo-se que o
espectro derivou somente da absorção de luz sem qualquer contribuição do
espalhamento de luz, uma vez que não ocorreram grânulos insolúveis de droga. Abaixo,
os valores de absorptividade molar para miconazol em metano1 ou em fragmentos de
bicamada de DODAB revelam-se bastante próximos, fornecendo mais uma evidencia da
solubilização da droga nos fragmentos de bicamada.
4.3.- Absorptividade molar (8) do miconazol em
algumas dispersões lipídicas
Na Tabela 4.3.1 estão os valores calculados de absorptividade molar (8) das
dispersões lipídicas que produziram espectros ópticos semelhantes àqueles da droga
monomérica solubilizada em seu melhor solvente, o metano!. Alíquotas de 10-50 uL de
uma solução estoque de nitrato de miconazol 10 mg/mL em metanol (ca. 24 mM MCZ)
foram adicionados em 1 mL de água ou em dispersões de lípides. A droga em presença
de fragmentos de bicamada de DODAB feitos por sonicação com tip, ou por injeção
etanólica apresentou absorptividades molares em 271 nm próximas às da droga em
metano1(595 ± 61 M -lcm-1).
75
Anterionnente, em nosso grupo, mostrou-se solubilização
BIBLiOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUnly.ersidade de São Paulo
em dIspersões de
DüDAB ou DHP compostas por fragmentos de bicamada de uma outra droga de
importância clínica, a anfotericina B, AnB (VIEIRA & CARMüNA-RIBEIRü, 2001) ..
Estudos físico-químicos similares foram realizados para o MCZ através da obtenção de
espectros ópticos de espalhamento de luz e detenninações de distribuições de tamanho
por espalhamento dinâmico quase-elástico de luz (QELS).
Tabela 4.3.1.- Absorptividades molares (E) calculadas a partir do máximo de absorção de luz do
miconazol (À,máx) em dispersões de DODAB e PC em água pura ou em CH30H.
Meio de Método de Comprimento de onda para À,Max. E±Õ
solubilização dispersão absorbâncias máximas (nm) (om) (M'I em'l)
À,I ~ À,3
Água milli-Q 264 271 278 271
CH30H 264 271 278 271 595 ± 61
DODABIl,30mM Sonicação com tip 264 271 278 271 531 ± 75
DODABIl,34mM Injeção etanólica 264 271 278 271 455 ± 44
DODABIl,08mM Injeção c1orofórmica 264 271 278 271
PC/O,84mM Injeção etanólica 264 271 278 271
4.4.- So/ubilização de miconazo/ em dispersões de
brometo de dioctadecildimetilamônio ou de fosfatidilcolina
A Figura 4.4.1 mostra as distribuições de tamanho para a droga (Figura 4.4.1 A),
dispersões de lipídeos (Figura 4.4.1B e 4.4.1D) e droga adicionada às dispersões
lipídicas (Figura 4.4.1 C e 4.4.1E). Vesículas de PC foram dispersas em água pelo
método de injeção etanólica e fragmentos de DüDAB foram obtidos pelo método de
sonicação com tipo ü efeito da adição da droga nas dispersões lipídicas foi o notável
desaparecimento dos agregados grandes de MCZ que ocorrem em água pura.
76
A
Dl = 319mn
I
MCZ
•ri!\. itllRl
B
Dl = 93mll
I l~ PC1Q)
"C C('a
"C
iJM~VI D, • 104nm +t:Q) PC-t:
D
Dl = 107mn
E
Dl = 101nIn
5 50D (nm)'
500
Figura 4.4.1.- Distribuição de diâmetros (D) e diâmetros médios (D), das dispersões da droga, lipídio
ou droga/lipídeo em água pura a 25°C. (A) 0,4 mM de miconazo! em água; (B) 0,84 mM dispersões de
PC feito por injeção etanólica; (C) mistura de (A) + (B); (D) 1,30 mM dispersões de DODAB feito por
sonicação com tip; (E) mistura de (A) + (D).
A Figura 4.4.1 também apresenta o deslocamento da distribuição de tamanho
entre os limites de 280 - 500 nm (típicos dos agregados de drogas sozinho em água
pura) para os limites de 50 - 100 nm (típicos das dispersões de lipídeos sozinhos) como
mostrado na Fig 4.4.1 C e 4.4.1E. Estes resultados estão consistentes com os dados
espectrais para a droga em fragmentos de bicamada de DüDAB que indicaram sua
solubilização (Figura 4.2.1C). No entanto, espectros para droga em vesículas de PC, que
não mostraram ser tão eficiente para a solubilização de MCZ pelos espectros ópticos
(Figura 4.2.1. F), evidenciaram um comportamento similar aos fragmentos de DüDAB
quanto ao desaparecimento dos agregados grandes de MCZ, indicando uma certa
77
solubilização (Figura 4.4.1. C). No entanto, o diâmetro médio para o MCZ + PC (104
nm), foi maior que o diâmetro para vesículas de PC sozinha. Isto contrastou com a
redução do tamanho médio para MCZ + DODAB (101 nm) em comparação com
DODAB sozinho.
Devido à ocorrência de agregados da droga em água foi possível medir a
distribuição de tamanho da droga sozinha (Figura 4.4.1 A), dos fragmentos de
membrana de DODAB (Figura 4.4.1 D) e dos fragmentos de membrana com a adição da
droga (Figura 4.4.1 E). O efeito da adição dos fragmentos de membranas à solução
contendo a droga, causa o desaparecimento dos agregados desta. O diâmetro (D) e o
potencia1-zeta (n para todas as preparações estão indicados na Tabela 4.5.1 apresentada
adiante.
No estado liquido cristalino da bicamada do PC a temperatura ambiente
favoreceu a solubilização de MCZ até certo ponto, onde a droga dispersa em vesículas
de PC produziram espectros de espalhamento de luz similares aos da água (Figura 4.2.1
D) e não similares ao melhor solvente para a droga (Figura 4.2.1 A), o que sugere que a
droga se mantém agregada, possivelmente como pequenos agregados dentro da
bicamada de PC. Assim a intercalação de monômeros de MCZ entre as caudas
hidrocarbônicas da vesícula de PC não se mostra tão simples como se havia pensado
preliminarmente nas caudas hidrocarbônicas de qualquer lipídeo, que nem sempre são
bons candidatos para solubilizar drogas hidrofóbicas. O MCZ é um bom exemplo da
competência para ocupar sítios hidrofóbicos, como os oferecidos pelas bicamadas do
PC. Como já relatado na literatura, as drogas hidrofóbicas passariam a estar dentro da
bicamada não só como monômeros assim como também como agregados
(BRAJTBURG & BOLARD, 1996; SCHREIER et al., 2000). A Figura 4.4.1 A, B e C
confirmam a interpretação da solubilização de MCZ em bicamadas de PC,
possivelmente pela intercalação de monômeros entre as caudas da bicamada da vesícula
do Pc. O pequeno aumento do tamanho da mistura de PC + MCZ (11 nm) quando
comparado com a vesícula sozinha, podem explicar a inserção dos pequenos agregados
de droga.
Levando-se em consideração esta discussão feita até aqui, a solubilização de MCZ
obtida graças aos fragmentos de bicamada sintética, pode ser considerada importante
(Figura 4.4.1 E), não só pelo desaparecimento dos agregados de MCZ quando misturado
com a dispersão de DODAB (Figura 4.4.1 E), como também pela redução no tamanho
da mistura foi menos em 6 nm quando comparado com os fragmentos de bicamada
78
sozinhos. Analisando em conjunto os dados espectrais mostrados na Figura 4.2.1B e as
distribuições de tamanhos da Figura 4.4.1 E sugere-se que a solubilização da droga em
sua forma monomérica é dependente dos espaços hidrofóbicos disponíveis nas bordas
dos fragmentos de bicamada.
4.5.- Inserção de miconazol nas bicamadas vista por
determinações de diâmetro médio (DzJ e potencial zeta (ÇJ
Na Tabela 4.5.1 observa-se a diminuição dos tamanhos das dispersões da droga
quando estas são misturadas com vesículas fechadas de PC ou fragmentos de bicamada
de DODAB. A solubilização de miconazol em PC resultou em potencial ç de +20 mY.
Assim, a inserção de MCZ em bicamadas de PC deve corresponder à forma protonada
(MCZ+).
O pK da droga é 6,5 (BEGGS, 1988; COPE, 1980). Em água, a pH 6,3, a droga
estará predominantemente em sua forma positivamente carregada. Pelos resultados da
Tabela 4.5.1, podemos afirmar que droga carregada positivamente msere-se em
vesículas fechadas de Pc. Não obstante, houve pouca solubilização do MCZ em
vesículas fechadas de DODAB. Uma possível explicação estaria no fato da fluidez da
bicamada facilitar a inserção de partículas de droga, pois bicamadas de PC encontram
se no estado líquido-cristalino enquanto que as de DODAB estão no estado gel menos
fluido (maior rigidez da bicamada dificulta a inserção de droga desprotonada).
A solubilização da droga em fragmentos de bicamada de DODAB gera um
potencial ç igual a 20 mV que é menor do que aquele da droga sozinha +32 mV ou do
lipossomo sozinho +52 mY. Assim, a inserção da droga na bicamada de DODAB deve
corresponder à forma deprotonada do MCZ (MCZO). Nesta mesma tabela observa-se a
agregação espontânea da droga induzida por fragmento de bicamada de carga oposta
como DHP que foram monitorados por distribuições de tamanho e potencial ç .O aumento na distribuição do tamanho do agregado (MCZ + DHP) é devido às
interações eletrostáticas entre bicamadas de DHP aniânicas e agregados de miconazol
catiânicos (MCZ+). A adição de fragmentos aniânicos de bicamada de DHP induz à
agregação de droga. Nos agregados de (DHP + MCZ) é possível observar-se uma
mudança do potencial ç quando comparados com a dispersão do lipídio sozinho -67 mV
tomando-se um potencial positivo de + 18 mV.
79
Tabela 4.5.1.-Diâmetro médio (D) e potencial zeta (Ç) para dispersões de
lipídios catiânicos, aniânicos e zwitteriânicos, droga e droga/lipídio em água pura, pH
6,3 a 25°C.
Concentração de lipídio ou Método de dispersão D ±çdroga (mM)
ç±ô
MCZIO,48
DODAB/I,30
MCZIDODAB
PCIO,84
PC/MCZ
DHPIl,20
DHP/MCZ
CONCLUSÕES
Agua 334 ± 3
Sonicação com tip 107±1
102±1
Injeção etanólica 93 ± 1
104 ± 1
Sonicação com tip 154 ± 3
717± 13
32 ± 2
52 ± 6
20±2
O
20 ± 3
- 67 ± 5
18±4
Parte I: Estudo da solubilização
fragmentos de bicamada catiônico (DODAS)
de MCZ em
• Fragmentos de bicamada de DüDAB oferecem excelentes sítios para.
solubilização de uma droga hidrofóbica como o miconazo1.
• Solubilização de drogas hidrofóbicas em dispersões aquosas, lipídicas ou
não, pode ser monitorada por distribuições de tamanho
• Absorptividade molar da droga em dispersões de DODAB obtidas por
sonicação com tip ou por injeção etanólica é próxima àquela da droga em
metano1.
80
Parte lI: Estudo da solubilização e/ou estabilização coloidal do MCZ em fragmentos de
bicamada aniânica (DHP)
4.6.- Agregação ou estabilização de dispersões de
miconazo/ por bicamadas de DHP
A estratégia para induzir a formação de partículas de miconazol em água foi
adicionar água ao MCZ solubilizado em sua forma monomérica em seu melhor solvente
(metanol). Na ausência de qualquer lipídeo a pH 6.3, a formação de agregados de
miconazol em água foi praticamente instantânea, com tamanhos de agregados quase não
variáveis com o tempo sobre a primeira hora depois de adicionar água (Figura 4.6.1).
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O
Tempo (min)
Figura 4.6.1.- Efeito de adição de fragmentos de bicamadas aniânicas sobre o diâmetro médio D (A),
de agregados da droga lmM, em presença de água Milli-Q (6), DHP (O) ou NaCl (o) O.OSmM, e a
turbidez 400nm (B), ante a água Milli-Q (-), DHP (---) ou NaCI (...). A cinética se inicia por adição de
SO~L de MCZ (20mM) em lmL de solução aquosa ou em lmL de dispersão de DHP.
A Figura 4.6.1 mostra o efeito de fragmentos de bicamada de DHP 0.05 mM sobre a
cinética de agregação de MCZ 1mM. O MCZ agrega espontaneamente em água ou em
81
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INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
NaCl 0.05 mM em pH 6.3. Os dados observados estão apresentados na Figura 4.2.1 e
Tabela 4.5.1. Observa-se maior agregação da droga induzida por DHP em água quando
comparados com os resultados obtidos na ausência de DHP (Figura 4.6.1). Em 1 mM de
droga, turbidez e diâmetro médio dos agregados do miconazol aumentam com o tempo
após adição de 0,05 mM de fragmentos de DHP previamente disperso por sonicação
com tipo
4.7.- Efeito de concentração de miconazoJ em pH 6,3
sobre sua agregação em dihexadecilfosfato de sódio 0,05 mM
Observou-se o efeito da concentração final de MCZ sobre a turbidez de
dispersões da droga induzida por adição de 0.05 mM de DHP (Figura 4.7.1). Nota-se
dois efeitos opostos na concentração de miconazol sobre a agregação da droga. O
primeiro efeito é o aumento na velocidade e extensão de agregação em função da
concentração do miconazol (0.05-0.3 mM) (Figura 4.7.1 A); e o segundo efeito é a
diminuição de velocidade e extensão de agregação em outra faixa de concentrações de
droga (0.4-1.0 mM) (Figura 4.7.1 B).
Os experimentos foram realizados em água pura, condição na qual encontram-se
duas formas de miconazol (MCzo/MCZ+), conforme mostrado na Figura 4.6.1.
Partículas de cargas opostas induzem a floculação do miconazo1. Este aumento na
floculação dos agregados MCZ+ induzida por partículas de DHP (0.05 mM) se deve
possivelmente a uma rápida agregação do MCZ+, com a conseqüente floculação dos
agregados de droga atraídos pelos fragmentos de bicamada (Figura 4.7.1 A). Entretanto,
um aumento da concentração da droga na faixa 0.4-1.0 mM, notas-se a estabilização
destes agregados. A possível explicação para este fenômeno é que os fragmentos de
bicamada de DHP estão estabilizando os agregados do MCZ+.
Possivelmente, acima dos valores maiores da concentração de droga (> 0.4 mM),
grandes agregados de MCZ com baixa proporção de superfície-volume foram formados,
para depois serem recobertos por uma pequena quantidade de fragmentos de bicamada
aniônica de DHP. Isto induz uma alta estabilidade coloidal dos agregados de droga com
a conseqüente diminuição da velocidade de agregação com o aumento da concentração
de MCZ (Figura 4.7.1B). Na Figura 4.7.2 tentou-se mostrar uma possível explicação
para a floculação induzida por DHP em baixa concentração de MCZ (Figura 4.7.1A) e
estabilização em alta concentração de MCZ (Figura 4.7.1 B), baseado sobre a alta e
82
baixa proporção superfície-volume para as partículas de droga, respectivamente. Uma
possível explicação para este fato seria que com o aumento da concentração de MCZ, o
tamanho dos agregados pode haver aumentado e como conseqüência a relação
superfície-volume dos agregados de droga diminuiu em presença de uma pequena
quantidade constante de DHP (Figura 4.7.1B).
0.45 A 0.30 ______..---/'........-
0.30/
/0.25
--'-
----_._- ------
0.20_ j.---
0.4 ...............
...-'
//
I _....... 0.05~:I===--===-
0.45-1 B
0.15 -I iF'i // 0.15/ -----_.~._------------ --
0.10
.-_r'---~
0.30 -I 0.6,// -//
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/// 0.8
//
0.15j i' /.' .i /.' 1.0
... / .
s=
QQ~
NQ)
"C....~~=~
o 5
Tempo (mio)10
Figura 4.7.1.- Efeito da concentração de miconazol sobre a cinética de turbidez induzida por
fragmentos de bicamada de DHP 0,05 mM em água em função do tempo. Concentrações crescentes de
miconazo! (0,05- 1,0 mM) são mostradas para cada curva de floculação.
INTERAÇÃO ENTRE PARTÍCULAS DE DROGA HIDROFÓBICA E BICAMADAS
SINTÉTICAS DE CARGA OPOSTA EM DISPERSÃO.
A Figura 4.7.2 mostra um modelo que explica a floculação ou a estabilização
coloida1 dos agregados da droga em solução aquosa por fragmentos de bicamadas
aniânicas de DHP. Até um limite critico de concentração de MCZ, a velocidade de
agregação pode ser diminuída com o aumento da concentração do MCZ (Figura 4.7.1),
83
por exemplo, fragmentos de bicamada de DHP começaram a diminuir a velocidade de
agregação de MCZ (Figura 4.7.1B). No esquema abaixo mostrado, tenta-se explicar este
efeito em associação com a área total da superficie dos agregados da droga, permitindo
assim um recobrimento pelos fragmentos de bicamada de DHP com a conseqüente
estabilização coloidal. Está área seria maior para agregados de droga, menores que em
baixas concentrações de MCZ, que para agregados de droga maiores que ocorrem em
altas concentrações de MCZ.
FLOCULAÇÃO ESTABILIZAÇÃO
+ ++.+ +
+ +
+.++ ++
+++.++
+
+++0+
+
+ +- +-++
t
O,OSmMOHP
+.++++ +
+
+ +
+.++ +
+
+.++++ +
+
1
0,OS-0,3 mM
MCZ
0.4-1,0 mM
MCZ
Figura 4.7.2.- Esquema de interação entre miconazol e fragmentos de bicamada sintética aniânica de
DHP. A agregação ou estabilização coloidal de partículas de droga insolúvel depende da proporção entre
a densidade numérica de fragmentos de bicamada e partículas de droga.
4.8.- Efeitos de pH sobre o diâmetro médio (DzJ e
potencial zeta (Ç) de dispersões de droga, dihexadecilfosfato de
sódio ou dihexadecilfosfato de sódio e droga
Sabe-se que o pKa para o miconazol é igual a 6,5 (BEGGS, 1986,1992). Em
valores de pH abaixo de 7,3; encontram-se agregados de drogas positivamente
carregados (Figura 4.8.1 B). Só que a positividade da carga decresce com o aumento do
valor de pH, devido à diminuição da concentração de droga positivamente carregada
84
(MCZ), ou seja, aumento da concentração da droga desprotonada (MCZO). Com o
aumento da proporção de [MCZO]/[MCZ+], temos um aumento no diâmetro médio dos
agregados (Figura 4.8.1 A), que aumentam ainda mais de tamanho quando ocorre a
desprotonação total da droga, em valores de pH acima de 7,3. A agregação do MCZ em
água ocorre possivelmente devido à existência de interações hidrofóbicas geradas entre
moléculas de MCZo. Tem-se assim que uma maior estabilidade coloidal dos agregados
dependem da presença de miconazol positivamente carregado. Uma possível explicação
para a estabilização destes agregados de droga em água seria o rearranjo de MCZ+ sobre
os agregados do MCZo dando certa estabilidade aos agregados já formados.
Os fragmentos de DHP apresentaram carga negativa para todos os valores de pH
testados (Figura 4.8.1 B). No entanto, vemos um aumento nestes valores. Em pH 6,3, os
fragmentos apresentavam um potencial de -66,6 mV, aumentando seu valor para -31, 5
mV em pH 8,8(Tabela 4.8.1). Esta diminuição no tamanho pode ser explicada devido à
ocorrência de maior repulsão eletrostática entre as cabeças adjacentes com o aumento de
pH e conseqüente aumento da dissociação das cabeças polares dos fosfatos (pKa 5.8
6.3) (CARMONA-RIBEIRO & HIX, 1991).
Quando se adicionou DHP 0,5 mM em uma solução aquosa contendo MCZ 1 mM,
observou-se uma maior estabilização coloidal dos agregados de droga (diminuição do
tamanho do agregado) para valores acima de pH 7,8; onde a droga já se encontrava
totalmente sem carga. Uma explicação possível se deve ao fato de que os agregados de
MCZ sozinhos são instáveis do ponto de vista da estabilidade coloidal. Porém, quando
se adicionou uma quantidade mínima de fragmentos de bicamada de DHP, os agregados
neutros de MCZ se tomam negativamente carregados e notavelmente estáveis,
apresentando-se em tamanhos menores que aqueles que tinham antes de se adicionar
DHP. Nota-se que fragmentos de DHP induzem à diminuição dos agregados de MCZ
em valores de pH fisiológicos (7.3-7.8). O potencial zeta negativo obtido para as
partículas de (MCZ-DHP) concorda com a hipótese de que existe um recobrimento de
bicamada sobre as partículas de droga em valores de pH acima de 7.
85
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-60
-80
o DHPMCZ
6. MCZ+ DHP
-100 I i I i I o I I I I6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
pU
Figura 4.8.1.- Efeito do pH sobre diâmetro médio e potencial zeta (Ç), dos agregados de MCZ (O),
dispersões de DHP (o) ou mistura de ambos (6), em Tris-HCl, IOmM, em diferentes valores de pHs,
com concentrações finais de 1 e O.OSmM de MCZ e DHP respectivamente.
A medida para as partículas de droga em ausência ou presença de 0,05 mM de
DHP para os distintos valores de pH testados são uma evidencia de que o tamanho e
potencial ç dos agregados do MCZ mudam significativamente em função ao pH (Figura
4.8.1 e Tabela 4.8.1). Os agregados de MCZ são menores abaixo de seu pK (120 nm em
pH 6.0) onde a forma de MCZ+ se encontra em maior número. Observa-se também que
há um aumento destes agregados em função do aumento de pH alcançando um máximo
de 750 nm acima de pH 7.5, onde a maior parte da droga encontra-se na forma MCZO.
Mais detalhadamente, a Tabela 4.8.1 mostra uma diminuição do tamanho dos
fragmentos de bicamada de DHP de 153 nm para 64 nm.
86
Tabela 4.8.1.- Diâmetro médio (D) e potenciais ç pra dispersões de DHP feitas por sonicação com tip
em tampão Tris-HCl 10 mM, em diferentes valores de pH, õ significa desvio padrão médio.
DHP MCZ MCL-DHPpH
D ± õ (nm) DZõ(rnV) D ± õ (nrn) ç± õ (rnV) D ± õ (nrn) ç± õ (rnV)
6.3 153,3 ± 2,8 -66,6 ± 4,4 269,7 ± 2,6 31,9±2,2 716,8 ± 12,9 18,2 ± 3,7
6.8 134,5 ± 2,2 -54,6 ± 3.4 369,7 ± 14,9 10,8 ± 1,8 1122 ±41,2 32,3 ± 2,6
7.3 80 ± 1,7 -48,5 ± 1,3 584,4 ± 39,8 5,1 ± 0,98 345,1 ± 3,2 -36,9 ± 0,6
7.8 72,5 ± 0,6 -37,9 ± 3,5 710,5 ± 11,6 O 478,8 ± 3,1 -44,6 ± 1,3
8.3 64,5 ± 1,0 -34, I ± 8,5 805,5 ± 57,5 O 477,7 ± 2,6 -44,3 ± 1,2
8.8 64,5 ± 0,4 -31,5 ± 8,8 710,5 ± 11,8 O 514,7 ± 5,1 -38,7 ± 1,7
4.9.- Efeito de concentração de dihexadecilfosfato
de sódio sobre a cinética de agregação da droga 0.2 mM, em
diferentes pHs.
o efeito da concentração de DHP sobre a turbidez de 0,2 mM dos agregados de
MCZ em três valores diferentes de pH está na Figura 4.9.1. A pH 6,3 observa-se que a
variação de velocidade e extensão das agregações registradas como turbidez a 400 nm
diminui com o aumento de concentrações de DHP (Figura 4.9.1 A). O mesmo efeito foi
também observado em pH 6,8 e 7,3 (Figura. 4.9.1 B e C). Um aspecto em comum para
os três valores de pH é a ausência de agregação a concentrações altas de DHP (0,25
0,50mM).
87
BIBLiOTECAiNSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
B 0.010pH 6.8
~S
0.050
..Q..251l
0.500I
C0.025pH 7.3 -0.050-0.150--
0.250--
0.500i
105Tim e (m in.)
pH 6.3 A 0.025
~0.050
0.150
0.250
0.5
0.4
0.3
0.2
1.0
S=oo"!'N 0.5c.l
"'O:c...:=
E-<
0.01.0
0.5
Figura 4.9.1.- Turbidez a 400nm de agregados de droga em função ao tempo, depois da adição de
concentrações variáveis de vesículas de DHP (O.025-0.5mM), preparadas por sonicação com tip, em
tampão Tris-HCl IOmM, a pH 6.3, 6.8 e 7.3. A cinética se inicia por adição de IOI-lL de MCZ estoque
(20mM) a ImL de dispersões de DHP.
A invariância de turbidez de dispersões de droga e DHP em função do tempo
ocorreu em duas situações extremas: (i) baixa concentração de droga e alta
concentração de DHP (como nas cinéticas descritas nessa seção); (ii) alta concentração
de droga e baixa concentração de DHP (como na seção 4.7). A explicação para esses
dois grupos de resultados baseia-se respectivamente na solubilização da droga (baixa
proporções molares droga/lípide) e na estabilização coloidal de grânulos grandes da
droga por fragmentos de bicamada em quantidades mínimas (altas proporções molares
droga/lípide).
88
CONCLUSÕES
Parte 11: Estudo da solubilização e/ou estabilização
co/oidal do MCZ em fragmentos de bicamada aniânica (DHP)
Neste trabalho duas importantes conclusões são essenciais para a
formulação de drogas:
A solubilização de drogas esta restringida pela concentração dos fragmentos de
bicamada (O.25-0.5mM DHP).
A estabilização coloidal de partículas de drogas insolúveis podem ser
estabilizadas contra uma agregação posterior de pequenas quantidades de
fragmentos de bicamada com carga oposta (O.05mM DHP)
89
Parte UI: Aspectos fisico-químicos da interação entre anfifilicos catiônicos de DODAB
e células de C. albicans
4.10.- Interação entre bicamadas catiônicas e
células de Candida albicans.
Bicamadas catiônicas sintéticas têm recebido atenção crescente como potenciais
sistemas para de entrega de drogas, gene e vacinas devido à sua capacidade de interagir
com biomoléculas e estruturas biológicas de cargas opostas como, por exemplo, as
membranas celulares (CARMONA-RIBEIRO, 2003). DODAB é interessante quanto à
entrega de drogas a microorganismos devido à sua atividade antimicrobiana (TÁPIAS et
aI., 1994; SICCHIEROLLI, et aI., 1995; MARTINS et aI., 1997; CAMPANHÃ et aI.,
1999; CAMPANHÃ et aI., 2001). Além do mais, fragmentos de bicamadas de DODAB
solubilizaram drogas antifúngicas como a anfotericina B (VIEIRA & CARMONA
RIBEIRO, 2001; CAMPANHÃ et aI., 2001; LINCOPAN et aI., 2003) e miconazol
(CAMPANHÃ et aI., 2001; PACHECO & CARMONA-RIBEIRO, 2003) e melhoraram
a estabilidade coloidal de particulados hidrofóbicos de drogas (VIEIRA & CARMONA
RIBEIRO, 2001; LINCOPAN et aI., 2003) permitindo também uma terapia contra
infecções fúngicas in vivo (LINCOPAN et aI., 2003). Decorre daí o grande interesse em
se definir os fatores fisico-químicos que estão envolvidos na interação entre bicamadas
catiônicas de DODAB e células de C. albicans.
As bicamadas catiônicas usadas para estudos de interação com as células de C.
albicans foram fragmentos de bicamada (BF) e vesículas fechadas (LV) de DODAB. A
Tabela 4.10 mostra características de tamanho e potencial-zeta em água para as
dispersões utilizadas.
Tabela 4.10.- Diâmetro médio e potencial-Zeta para as dispersões de DODAB.
Concentração
(mM)
2.0
2.1
Método de dispersão
sonicação com tip
SNIPPE por aquecimento
Diâmetro±õ
(nm)
74 ± 1
S09±4
Potencial-Zeta ±õ
(mV)
41 ± 2
90
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
4.10.1.- Isoterma de adsorção de brometo de
dioctadecildimetilamônio em células de Candida albicans
fixa a concentração de células em 1()8 célulaslmL
A Figura 4.10.1 mostra uma isotenna de adsorção de DODAB obtida a partir de
DODAB BF sobre células de Candida albicans. Assemelha-se a isotenna do tipo de
Langmuir e demonstra ser de alta afinidade (adsorção não-reversível) com limite
máximo de adsorção obtido no platô da curva correspondente a 1.7 x 109 moléculas por
célula. Para fragmentos de bicamada (BF), observou-se uma maior adsorção sobre a
célula de Candida albicans quando comparada com as vesículas fechadas (LV), nas
quais observa-se uma típica isotenna de adsorção competitiva. Uma explicação para
este fato seria o surgimento de uma competição, acima de uma dada concentração, entre
as vesículas para se adsorverem na superfície celular ou fundirem-se ou agregarem-se
umas com as outras, já que o número de moléculas adsorvidas sobre a célula diminui
com o aumento da concentração de DüDAB.
'" 2.0'o....
><,-..co:] 1.5.(1)<:Jl-ooC.~ 1.0
-=<:J.(1)
Õ8 0.5<I)
~
z'-'
O
í00
r
/""'c' o
BF T
~ LV~
O 0.5 1.0Concentração de DODAB no sobrenadante (mM)
Figura 4.10.1.- Isoterma de adsorção de DODAB a partir de DODAB BF ou LV sobre I,OxIOs células/
mL de C. albicans em água pura a 25°C.
A diferença entre as isotennas de adsorção para BF ou LV possivelmente ocorre
porque no método de sonicação com tip, obtêm-se fragmentos de membrana possuem
sítios hidrofóbicos expostos e livres, que possivelmente não ocorrem em vesículas
91
fechadas tipo LV, podendo ligar-se a sítios hidrofóbicos das diversas espécies protéicas
que habitam a parede celular da célula de C. albicans.
Desde que é a superficie celular microbiana que fortemente determina o
processo de interação com as dispersões lipídicas, faz-se necessária a descrição da
organização típica da parede celular. A parede celular dos fungos é composta
basicamente de polissacarídeos, que podem encontrar-se como homo ou
heteropolímeros. Em alguns fungos, proteínas são também componentes significantes
da célula e freqüentemente estão associadas com alguns constituintes polissacarídeos
(CüPE, 1980). Lipídios e melaninas encontram-se em quantidades menores na parede
de muitos fungos, mais isso não diminui suas respectivas importâncias, como exemplo
da melanina, que confere resistência ao ataque e lise por enzimas e irradiações. Os
principais lipídios apoIares são os triacilgliceróis e os esteróis, e os polares são os
diacilglicerofosfocolinas e diacilgliceroctanolaminas (PEBERDY, 1990).
Um tipo de interação pode ser reconhecido entre os anfifilicos estudados e as
células de Candida albicans. Esta interação se dá possivelmente através de interações
eletrostáticas ou iônicas, já que a vesícula é carregada positivamente e a célula
negativamente (TÁPIAS et aI., 1994; REBülRAS, 1997). Fragmentos de bicamada com
tamanhos médios de 74 nm têm maior afinidade por C. albicans, explicada por
interações hidrofóbicas adicionais entre BF e a célula chegando a um máximo de
adsorção de 1.9xl09 moléculas/célula. Dispersões de DODAB feitas por vortexação,
com tamanho médio de 500 nm, têm menor valor de adsorção máxima pela C. albicans,
adsorvendo 9.5x108 moléculas/célula no pico de adsorção (Figura 4.10.1). Ainda, o
aumento da concentração de DODAB livre para as LV, favorece a desorção sugerindo
que a interação DüDAB-cé1ula é de caráter reversível e que a interação vesícula
adsorvida-vesícula livre pode competir com a interação vesícula-célula.
Para as isotermas que se caracterizaram como isotermas de adsorção com um
platô de adsorção máxima, foi possível obter parâmetros de adsorção como constantes
de afinidade (k) e adsorção máxima (x/m) máx através de linearização das isotermas.
A Tabela 4.10.1 mostra a linearização da isoterma obtida para DODAB BF e
mostrada na Figura 4.10.1.
92
BI8LIOTECA,
INSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São P.wIQ
Tabela 4.10.1.- Linearização das curvas pelo plot da 5" coluna em função da 4" coluna.
Método de n ad,l célula Cone. DODAB no DODAB adsorvido DODABsobrelladallte
dispersão sobrenadante (moVcélula) /OODABAdsor\"ido
(moI/L) (célula/L)
2.67 x 109 1.4 X 10,5 4.43 x 10- 15 3.16x 109
2.94 x 109 2.2 X 10'5 4.88 X 10-15 4.51 X 109
3.01 X 109 2.5 X 10-5 5.00 X 10-15 5.00 X 109
3.06 X 109 2.7 X 10'5 5.08 X 10'15 5.31 X 109
sonicação com tip 3.08 x 109 3.0 X 10-5 5.12 X 10-15 5.86 X 109
3.14 X 109 3.2 X 10,5 5.22 X 10-15 6.13 X 109
3.15x 109 3.5 x 10-5 5.23 x 10-15 6.69x 109
3.20 x 109 3.8 X 10'5 5.32 X 10,15 7.14 X 109
3.24 X 109 4.0 X 10-5 5.38 X 10,15 7.43 x 109
Através da equação da reta (y = a + bx), por comparação com a equação (3.6.1
de método analíticos), temos que: x corresponde a c; a = intercepto = l/k(x/m)máx; y
correspondendo a c/(x/m) e b correspondendo a 1/(x/m)máx,
A Tabela 4.10.2 contém os coeficientes lineares (a) e coeficientes angulares (b),
para a linearização de DODAB sonicado.
Tabela 4.10.2.- Coeficiente linear (a) e angular (b) da reta obtida a partir da linearização da isoterma de
adsorção de BF sobre C. albicans (Figura 4.11.2).
Método de dispersão
sonicação com tip
Coeficiente linear (a)
8.55x101l
Coeficiente angular (b)
1.65 x 1014
A Tabela 4.10.3 contém uma comparação entre parâmetros de adsorção para as
isotermas de adsorção das de DODAB BF sobre algumas superficies-modelo, incluindo
sobre as células de Candida albicans.
Determinação de isotermas de adsorção de lipossomos sobre látex (CARMONA
RIBEIRO.; MIDMORE, 1992) e bactéria (TÁPIAS, et aI., 1994), seguidas de
linearização para a obtenção dos parâmetros de adsorção foram realizadas. A ocorrência
de cargas opostas entre lipossomo-superficie pode dirigir para uma deposição na forma
de bicamada sobre a superfície. Um exemplo desta interação pode ser vista quando se
põe para interagir vesículas grandes ou pequenas de DODAB que são carregados
positivamente com a superfície negativa de partículas de poliestireno sulfato.
93
Entretanto, células de E. coZi que são carregadas negativamente, interagem com as
vesículas de modo que ocorre apenas uma mera adesão devido à complexidade e
rugosidade da parede da bactéria (MARTINS, et aI., 1997).
A Tabela 4.10.3 contém os parâmetros de adsorção para as isotermas de
adsorção das vesículas lipídicas sobre algumas superfícies-modelo, incluindo sobre as
células de Candida albicans.
Tabela 4.10.3.- Afinidades (k) e adsorção máxima (x/m)max para DüDAB a partir de diferentes
dispersões sobre superficies orgânicas ou biológicas. Modelos de superficies orgânicas sintéticas foram
partículas de látex (poliestireno sulfato, PS) de dois diferentes diâmetros, 100 e 277 nm, e para superfícies
de células de E. coli e Candida albicans.
Superfície Afinidade (x/m)Max Método de dispersão do DODAB
k(M-1) (l0- 17 moléculas.m-2
)
célula de C. albicans 19.2 x 104 606 sonicação com tip
célula de C. albicans 32.4 x 104 291 injeção etanólica
célula de C. albicans 3.5x 104 189 vaporização clorofórmica
célula de E. coZi 23.1 X 104 200 sonicação com tip
PSI00 35.6 x 104 36 sonicação com tip
PS277 2.6 x 104 43 vaporização clorofórmica
4.10.2.- Efeito da concentração de células
sobre a adsorção de DODAB
Na Figura 4.10.2 observa-se o efeito da adsorção de DODAB 1 mM sobre a
concentração de células de Candida albicans. Observou-se uma diminuição da adsorção
de DODAB em função da concentração de células tanto para BF quanto para LV.
Uma possível explicação para este fato seria que a suspensão de células está
possivelmente mais agregada à medida que se aumenta a densidade numérica de células
em suspensão, como mostra o Esquema 4.10.2 (B). Dessa forma, a agregação celular
diminuiria a área superficial total de células disponível para adsorção das bicamadas
catiônicas.
94
5
0\
o"'"""~ 4..-~-=-'aJ 3C.J-l:'l<~ 2O~
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'" 1:::'-"
BF
LV
o 246
(Número de células/mL) x 108
Figura 4.10.2. Efeito da densidade numérica de células sobre a adsorção de I mM de DODAB BF ou
LV. A interação célula-dispersão de DODAB ocorreu por uma ho~a antes de se centrifugar as misturas e
se dosar DODAB no sobrenadante.
A adsorção por célula é maior para a situação de maior área de interação
disponível: aquela em que as células estão menos agregadas na suspensão como
mostrado no Esquema 4.10.2 (A). Efeitos similares a este já foram observados para
bactérias de E. coli (TAPJAS, et a!., 1994) ou para outras dispersões lipídicas sobre C.
a/bicans (REBülRAS et a!., 1997).
o
n1
o
o
o
A
o
n2
Cf]
c§co
Cf)
B
08
Esquema 4.10.2.- Ilustração da agregação celular em função da densidade numérica de células menor
(A) ou maior (B). A área superficial por célula na situação (A) seria maior do que aquela em (B).
95
4.10.3.- Efeito da concentração de brometo de
dioctadecildimetilamônio sobre a mobilidade e/etroforética
das células
o efeito da concentração de DODAB sobre a mobilidade eletroforética das
células está na Figura 4.10.3. A Figura também mostra o efeito do tipo de dispersão de
DODAB, BF ou LV, sobre a mobilidade eletroforética das células de C. albicans de
concentração fixa lxl06 UFC/mL. Observa-se que neutralização da carga superficial da
célula ocorre em concentração mais baixa de BF que as de LV de DODAB. Convem
ressaltar que, quando as LV interagiam com as células e as mobilidades celulares foram
medidas em função do DODAB adicionado, não foi possível diluir as misturas de LV
com células sem modificar o equilíbrio de adsorção, então não foi possível eliminar o
aumento de mobilidade induzido pelo DODAB. O efeito da concentração de DODAB
na mobilidade e1etroforética da C. albicans foi parecido para BF e LV acima do regime
de baixas concentrações com algumas diferenças significativas ocorreram acima de 0.1
mM de DODAB: mobilidades foram maiores para as misturas com LV do que para
aquelas com BF.
6
4-~
rn
'>2
S 0- - --u
-3 1
- --
(.Ll - 2~o
;:;s-4
10°10-3 10-2 10-1
[DODAB]mM
-6 I10-4 ' , "''', """"1 """"1 """",'
Figura. 4.10.3.- Curvas de mobilidade eletroforética (ME) para Candida albicans (l x106 células/mL)
em função da concentração das dispersões de DODAB para fragmentos de bicamada (BF) ou vesículas
grandes (LV).
A fim de eliminar o efeito de concentração nas mobilidades das LV, a curva de
mobilidade eletroforética foi extrapolada a diluição infinita em ausência virtual de
96
interações intervesiculares. A mobilidade eletroforética aumentou em função da
concentração de DODAB para DODAB LV na ausência de células. A Figura 4.10.4
mostra mobilidades eletroforéticas para DODAB LV apenas, em ausência de células.
7
A ()LV sozinhas ~,
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1 " )
o 0.0125 0.0250
o 0.5 1.0
[DODAB]mM
Figura 4.10.4.- Efeito da concentração de DüDAB LV sobre a ME em água e em ausência de células
(A). Extrapolação a diluição infinita permitiu obtenção dos valores de mobilidade mostrados na Figura
4.10.3. (B).
No inserto (Figura 4.l0.4B), para uma faixa de baixas concentrações de
DODAB, as mobilidades aumentaram linearmente em função da concentração de
DODAB. Este efeito foi previamente explicado como devido à repulsões eletrostáticas
LVILV acelerando as mobilidades em uma densa população de vesículas grandes livres
(CARMONA-RIBEIRO & MIDMORE, 1992). A fim de eliminar este efeito de
concentração nas mobilidades das LV, conforme explicado, a curva de mobilidade
eletroforética foi extrapolada até uma concentração de DODAB de zero, uma situação
onde infinitas diluições iriam produzir a ausência de interações intervesiculares.
Entretanto, quando as LV interagiam com as células e as mobilidades celulares foram
medidas em função do DODAB adicionado, não foi possível diluir as misturas de LV
com células sem modificar o equilíbrio de adsorção, então não foi possível eliminar o
aumento de mobilidade induzido pelo DODAB. Portanto, nas misturas DODAB
LV/células (Figura 4.10.4 A), os maiores valores de mobilidade eletroforética para as
LV em comparação com BF acima do maior valor de concentração de DODAB
poderiam muito bem ser devidos a um aumento na concentração de LV livres. Os
maiores valores de mobilidade eletroforética para as LV em comparação com BF acima
do maior valor de concentração de DODAB poderiam muito bem ser devidos a um
97
aumento na concentração de LV livres. Deve-se relembrar da adsorção competitiva
obtida para LV (Figura 4.10.1); o LV livre possivelmente seqüestra o LV adsorvido nas
células e o que contribui para uma concentração maior de DODAB livre e, portanto, a
um aumento da mobilidade.
A porcentagem de vazamento dos conteúdos internos das células a 1 mM de
anfifilico é mostrada na Tabela 4.10.4. As porcentagens para anfifilicos de uma cadeia,
formadores de micelas ou de lipídios catiônicos de duas cadeias foram similares,
chegando a 4-10% depois de se desconsiderar o controle. Isso poderia ser compreendido
pela baixa concentração de anfifilico empregada, então 1 mM de CTAB ou SDS
induziram quase o mesmo vazamento que 1 mM de DODAB BF ou LV. Ao menos
esses resultados foram consistentes com as porcentagens de vazamento de 5-8%
previamente determinados para duas espécies de bactérias, E. coli e Staphylococcus
aureus, usando o mesmo método para a mesma concentração final de anfifilico para os
três anfifilicos utilizados (MARTINS et aI., 1997). De fato, grandes porcentagens de
vazamento como 50-60% foram obtidas previamente para os anfifilicos formadores de
micela somente acima dos limites de 4-10 mM de concentração de SDS ou CTAB, ou
seja, nas concentrações bem acima da concentração micelar crítica para cada surfactante
(MARTINS et aI., 1997). Basicamente, as células (106 células/mI) atingiam carga zero
acima do limite micromolar de DODAB, mas no caso de LV, a desorção de LV
interferiu com as medições de mobilidade eletroforética causando superestimações das
mobilidades das células. Em 1 mM de anfifilicos, nenhuma diferença significativa entre
o vazamento de células induzido por anfifilicos formadores de micelas ou de bicamadas
pode ser detectada não tendo ocorrido vazamento dos conteúdos intracelulares.
Tabela 4.10.4.- Efeito de ImM de anfifilico OOOAB LV ou BF, CfAB e SOS sobre a porcentagem de
vazamento do conteúdo interno de células de C. albicans 2x l08células /mL depois de Ih de interação.
Amostra
C. albicans (controle)
OOOAB + LV + C. albicans
OOOAB + BF + C. albicans
CfAB + C. albicans
SOS + C. albicans
Porcentagem de vazamento
4
12
14
14
8
98
CONCLUSÕES
Parte 11/: Aspectos físico-químicos da interação
entre anfifílicos catiônicos de DODAB e células de C. albicans
• Houve uma grande afinidade entre DüDAB BF ou LV e células de C. albicans;
entretanto, houve desorção de DüDAB LV com o aumentá da concentração de
DüDAB no sobrenadante, a desorção de LV ocorreu, ao passo que a adsorção
de BF alcançou um máximo. Esta diferença no comportamento foi
compreensível pelos menores tamanhos de BF e a maior interação hidrofóbica
com os componentes da superfície celular.
• ü efeito da elevação da concentração celular foi a diminuição da adsorção de
DüDAB possivelmente devido à redução da área superficial celular disponível
para a adsorção decorrente de agregação celular.
• Alta afinidade entre dispersões de DüDAB e células foi reconfirmada pelo
efeito da concentração de DüDAB na mobilidade eletroforética; células (106
células/ml) obtiveram carga zero acima do limite micromolar de concentrações
de DüDAB, mas no caso de LV, a desorção de LV interferiu com as medições
de mobilidade eletroforética, causando valores superestimados de mobilidade
eletroforética das células.
• A adsorção de DüDAB nas células de C. albicans foi parecida com a
previamente descrita para bactérias relativa à alta afinidade e a ausência de lise
celular.
99
BIBLIOTECAINSTITUTO DE QUíMICAUniversidade de São Paulo
5.- PERSPECTIVAS
• Determinar a permeabilidade da membrana do fungo através de determinações
de vazamento de compostos fosforados, e viabilidade celular em presença dos
anfifilicos aniônicos ou catiônicos carreando miconazol, ou não, e do miconazol
sozinho.
• Determinar doses fungicidas mínimas para as formulações de miconazol/BF,
miconazollLv.• Determinação da transição de fase das vesículas fechadas em presença de
miconazol
• Determinar cinéticas de floculação de C. albicans induzida pelas vesículas.
• Testes in vivo em modelos de candidíase sistêmica desenvolvida em animais,
com as novas formulações de miconazol através de avaliação de sobrevida dos
animais e de recuperação de C. albicans em órgãos dos animais.
100
6.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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