Elementos de Microscopia e Microanálise

Docente: Profª Drª Maria Tercília V. A. Oliveira

Discente: Bruna Victorasso Jardim

CULTURA CELULAR

Definição Conjunto de técnicas que permitem

cultivar células fora do organismo dadas as condições apropriadas

Tecidos Humanos

Animais

Vegetais

IN VITRO X IN VIVO

Histórico

Wilhen Roux - 1885

Cultivou células de embrião de aves e, solução salina aquecida

Ross Harrison - 1907

Pioneiro no cultivo celular de animais

Hipótese Doutrina do neurônioOrigem do axônio - cada fibra nervosa é o produto de uma única célula nervosa e não da fusão de várias.

• fragmentos de tecido da medula espinhal de anfíbios

• linfas coaguladas como meio de cultura

• armazenadas em câmara úmida e morna

• microscópio – intervalos regulares de tempo

• células nervosas individuais com um axônio cada

Base para a cultura celular

1ª limitação

Burrows – 1910

Desenvolvimento de meios nutritivos

Plasma de aves nutrir explantes de tec. embrionário

Alexis Carrel

-Subculturas para prolongar a vida das células

- utilizando meio nutritivo

Plasma

Extratos de embrião

Rous e Jones - 1916

Tripsina para dissociar células embrionárias

2ª LimitaçãoContaminação

Alexis Carrel - 1913

Desenvolvimento de condições assépticas

- Cultivou células de embrião de aves por + de 30 anos

1940 -

1940 - Surgimento dos antibióticos

Avanços com alguns destaques

Células dividiam indefinidamente extrato de embrião de galinha

George Gey - 1952

1ª linha celular contínua

células HeLa

- Utilizou meios indefinidos e complexos

Plasma de aves

Extrato de embrião bovino

Cordão umbilical humano

Dificuldade para analisar a composição específica para cada tipo celular se desenvolver e funcionar normalmente

Células epiteliais humanas procedentes de carcinoma cervical

Stanley Cohen - 1954

Fator de crescimento nervoso estimula o crescimento dos axónios em cultura de tecidos

Harry Eagle – 1955

Investigou os requerimentos nutritivos das células em cultivo

Sais Glicose AminoácidosVitaminas

Soro de proteínas+

Células cultivadas em condições experimentais

definidas

Meio Basal de Eagle (BME) aa essencias

Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM) + aa

Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM) 4x + aa

Soro fetal bovino

Células morrem após um número finito de divisões em cultura

Leonard Hayflick e Paul Moorhead - 1961

Fibroblastos jovens

Fibroblastos velhos

quimicamente definido

Pequenas moléculas

Proteínas específicas

Sais

Glicose

Vitaminas

Aminoácidos

Sobreviver e proliferar

Transferrina Fatores de crescimento

Possibilitou o estudo de moléculas sinalizadoras extracelulares

Essenciais para sobrevivência, desenvolvimento e proliferação de

tipos de células específicos

Ham -1965 1º meio livre de soro capaz de manter algumas células de mamíferos em cultivo

Harris e Watkins - 1965

1º heterocário de células de mamíferos pela fusão

Humano Camundongo

Mitose crs. no mesmo núcleo células híbridas

Linhagens com composição cromossômica =

Localizar genes no genoma e banco de DNA de crs. específicos

+ =

Augusti- Tocco e Sato - 1969

1ª linhagem celular estável a partir de uma célula tumoral de nefroblastoma de camumdongo eletricamente excitáveis

19751ª linhagem celular produtora de anticorpos monoclonais hibridomas

Cesar Milstein

George Kohler

Linfócitos B do baço com antígeno do anticorpo desejado inoculado

+Células de mieloma que

se reproduzem em cultura indefinitamente

Células produzindo o anticorpo desejado

Hayashi e Sato – 1976

Trabalhos demonstrando: = linhagens celulares

Michael Wigler

Células crescerem em meios livres de soro

= misturas de hormônios e fatores de crescimento

1º introduzir genes de cópias únicas de mamíferos in vitro

Gene que codifica a enzima timidina quinase em células com esse gene deficiente

Richard Axel

1977

Avanço na cultura celular pela possibilidade de produzir proteínas

terapêuticas em grande escala

Martin Evans -1986

Isolaram e mantiveram vivas in vitro células embrionárias humanas

Isolou e cultivou células totipotentes de ratos

James Thomson e John Gearhart – 1998

Bactéria X Células de tecido

Cultivadas em suspensão

Cultivadas em superfície

sólida

Duplicação em 30 min.

Duplicação em 18 - 24

hrs

Células

Componentes específicos da Matriz Extracelular

Colágeno Laminina

Tipos de cultura celular

Cultura primária – preparada diretamente do tecido de um organismo, com ou sem fracionamento inicial das células

Cultura secundária – a partir de células retiradas da placa de cultura primária Subcultivos

Promove nova fonte de nutrientes e espaço para o crescimento contínuo de linhagens celulares

Linhagem de células

Células morrem após um nº finito de divisões em cultura

Mutação Células imortais – proliferam indefinidamente

linhagem de células

Podem ser armazenadas em N líquido e continuarem viáveis

Linhagem de células podem ser preparadas a partir de células de câncer

Proliferam-se em altas densidades

Crescem sem se fixarem a uma superfície

• Linhagem de células normais transformadas

Vírus indutor Substâncias químicas

Linhagens celulares são importantes na pesquisa celular alta quantidade de células de um determinado tipo

Não são idênticas

Clonagem celular

• Uma célula isolada origina a cultura

• Células geneticamente idênticas

Importância = linhagens de células mutantes com defeito em um gene específico

Função da proteína em células normais

Aplicações

Reproduzir fenômenos que ocorrem in vivo mas que são inacessíveis

Estudo da fisiologia e metabolismo de células específicas Estudar interações entre vários tipos de células – culturas mistas Estudo de neoplasias Testar drogas ou compostos químicos Possibilidade de gerar tecidos artificiais Produção de proteínas terapêuticas

adicionar ou remover moléculas específicas

Vantagens Reprodutibilidade dos resultados

-Linhagem de células clonais

-Controle das condições ambientais

Possibilidade de selecionar uma população de células específicas

Conhecimento do comportamento e função das células selecionadas

Desvantagens Perda das características – cultivo longo Necessidade de marcadores Confiabilidade dos resultados in vivo – ex: drogas Contaminação

Cuidados

Biossegurança Sala separada especial Esterilizar todos os materiais e equipamentos com álcool 70 Luz UV Usar: luvas estéreis, máscara... Não reutilizar materiais Material biológico lixo separado

Protocolo para cultivo celular

Cultivo de celulas de câncer de mama

• Biopsia do tecido

• meio de congelamento meio de cultura + DMSO + antibiótico

• 2 horas em geladeira

• 30 min a 5 cm do N liquido (p congelar aos poucos)

• armazenar em N Liquido

Protocolo para cultivo celular

Cultivo de células de câncer de mama

Biópsia do tecido Coletada e armazenada em meio de transporte

Preparação inicial limpeza com álcool e UV 20 min Meio de cultura, PBS, tripsina – banho maria a 37ºC

- 100 ml meio RPMI - 1 ml de antibiótico

3 ml -Tubo falcon

                          

Preparo do meio de cultura

20 ml soro fetal bovino 1 ml antibiótico/antimicótico 1 ml L-glutamina 100 ml de meio de cultura RPMI 1640

Processamento do fragmento tumoral Lavar o tumor com PBS (4x – 2 min) Tesoura ou bisturi 1 ml de meio RPMI 1640 no frasco T-25 Estufa 37ºC – 5% CO2

1 ou 2 dias depois adicionar 1ml de meio lentamente para não soltar as células

Trocar o meio de cultura a cada 2 dias Retirar o meio com a pipeta 4ml de meio – frasco T-25 8 ml de meio – frasco T-75 O meio deve ser descartado com hipoclororito

Subculturas Retirar o meio de cultura Lavar com PBS 1X Retirar o PBS Adicionar 2 ml de tripsina Aguardar 4 –10 min o desprendimento das células Passar todo conteúdo do frasco para outro frasco Adicionar 2 ml de meio de cultura Colocar na estufa 37ºC – 5% CO2

Placa six-wells

Capela de fluxo para cultura celular

Congelamento de células

Tripsinizar Colocar em tubo falcon Centrifugar a 1600 rpm – 5 min Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 900 ul

de meio e 100 ul de DMSO Passar para criotubo Geladeira por 30 min Frezeer – 80ºC – 24 hrs Nitrogênio líquido

Descongelamento das células

Retirar o criotubo do N líquido Banho maria a 37ºC – 90 seg. Transferir para tubo falcon 15ml contendo: 10 ml de meio Centrifugar – 5min Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em

meio de cultura Transferir para frasco T-25 Estufa

Invertoscópio

4x

10x

10

40x

4x e 10xFungo

Obrigada