Post on 21-Apr-2015
DNA recombinante in a nutshell
Biologia Molecular Aplicada A tecnologia do DNA recombinante
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Teoria bem fundamentada• Por volta do início da década de
70, os fundamentos básicos da teoria já haviam sido propostos solidamente por Crick, Watson e C&A
• Assim, os cientistas passaram a se perguntar: será que o material genético e o processo de expressão podem ser manipulados?
• Ciência X (Bio)Tecnologia
A descoberta da DNA ligase• 1960: recombinação de
DNA ocorre em células– Reparo de danos ocorridos
por luz UV
• 1967, Martin Gellert– Extratos de E. coli produziam
fagos lambda circulares– Purificação da DNA ligase!
• Circularização de genomas
Paul Berg• Reuniu o fago SV40 ao bacteriófago lambda
– Queria cortar o SV40 e inserir pedaços do fago lambda nele
• Usou enzimas de restrição para cortar os fagos e incubou-os juntos, utilizando DNA ligase– Criou uma técnica, segundo ele mesmo, para ligar covalentemente
moléculas de DNA• Como o bacteriófago era de E. coli e esta bactéria habita nossos
corpos, ele teve medo de gerar um novo e letal vírus
• Posteriormente sugeriu moratória aos estudos em biologia molecular
• Nobel, 1980: “por seus estudos fundamentais em bioquímica de ácidos nucléicos, particularmente com relação ao DNA recombinante”
Paul Berg, 1926-
Fago λ
SV40
Endonucleases de restrição• 1968, Paul Arber sugere a existência de
enzimas existentes em bactérias que atuassem como proteção à infecção por fagos– Essas enzimas cortariam o DNA do fago em sítios
específicas– Endonuclease R
• 1968– Meselson & Yuan: EcoRI
• 1970– Smith & Kelly: nova endonuclease descoberta
em H. influenzae -- HindIII– Confirmação da hipótese de Arber, enzima corta
DNA exógeno mas não DNA celular– Descoberta do sítio específico de corte pela
enzima (AAGCTT)
Mapa de restrição• 1971 - Kathleen Danna and Daniel
Nathans
• Ensaio de digestão: Usam a endonuclease R (EcoRI) para cortar o DNA do fago SV40
• Fragmentos tinham tamanho constante e, logo, podiam ser facilmente separados em uma eletroforese!– Verificado o fato de que a enzima
corta em sítios específicosEc
oRI
EcoR
I
EcoR
I
EcoR
I
EcoR
I
EcoR
I
Hin
dIII
De novo, Berg• 1972, Berg’s lab
– Janet Mertz and Ronald Davis descobrem que a endonuclease R1 produzia quebras espaçadas entre as duas fitas, gerando extremidades coesivas idênticas e complementares
• Extremidades unidas e encubadas com DNA ligase poderiam gerar moléculas de DNA híbridas!
Extremidades cegas
Extremidades coesivas
Ensaio de digestão• Adicione DNA + tampão +
endonuclease de restrição
• Deixe digerindo num banho a determinada temperatura por determinado tempo
• 1 unidade de enzima de restrição digere 1 μg DNA em 1h00
• Caixa de truques do biólogo molecular contém: DNA ligase + enzimas de restrição + ...
Vetores de clonagem• ~1970: Trabalho com plasmídeos
• Peças de DNA circulares e não cromossomais encontradas em bactérias– E às vezes trocadas por elas
• 1970Descobriu um método segundoo qual uma E. coli adquiriria um plasmídeo conhecido como pSC101
• pSC101: contém um gene que confere resistência ao anti-biótico tetraciclina
Stahen Cohen, 1936-
Plasmídeo encontra Endonucleases
• Cohen junta-se a Boyer, especialista em enzimas de restrição
• Trabalharam com dois plasmídeos, – P1 confere resistência a tetraciclina– P2 confere resistência a kanamicina
• Experimento– Corte os dois plasmídeos com enzimas de restrição– Incube-os com DNA ligase– Teste a presença de bactérias duplamente
resistentes no meio• Este talvez tenha sido obtiveram o primeiro
organismo recombinante feito propositalmente por um ser humano
Herbert Boyer, 1936
P1
P1/2
P2
EcoR
I
EcoR
I
EcoR
IEc
oRI
K
K
T
T
Digestão + ligação
Cohen & Boyer
• 1973– Inseriram genes de Xenopus laevis em E. coli e
verificaram que os genes estavam ativos nas bactérias depois de várias gerações
– Como as bactérias reproduziam-se rapidamente, poderiam ser utilizadas para produzir genes de grandes mamíferos em larga-escala
– Constroem um organismo capaz de combinar e replicar a informação genética de diferentes espécies!
O que, então, era possível fazer?
• Era possível pegar o DNA de qualquer espécie, picotá-lo e inseri-lo em uma bactéria que o amplificaria milhões de vezes
• A era da engenharia e da manipulação genética tem início...
• Mas o que se pode fazer? Até onde podemos chegar?– Verdade seja dita: ninguém sabe
ao certo...
Engenharia genética• Pode-se aumentar a expressão de
um gene bacteriano• Pode-se fazer bactérias produzir
genes de qualquer espécie– Expressão em levedura, células
de mamíferos• Produzir vírus transgênicos,
produzir vírus contendo toxinas
• Terapia gênica, knockout gênico• Que medo!?
Discussões éticas• 1974
– Paul Berg (juntou SV40 com fago lambda ese arrependeu) alerta para o perigo da biotecnologia e sugere uma moratória
• 1975– Conferência Asilomar– Moratória de 16 meses ao DNA recombinante– Bomba atômica da biologia?
• Watson acha que a natureza já fez muitos mais experimentos, por muito mais tempo e muitos mais jeitos do que podemos imaginar e nada de muito significativo aconteceu...
– Se fosse causar algum dano, a natureza per se já teria causado...
Joshua Lederberg
• 1958, Nobel com Beadle e Tatum (um gene, uma enzima) • 1960
Enquanto as discussões giravam sobre clonagem humana, sugeriu que a biotecnologia se desenvolveria através da microbiologiaLederberg defendia a terapia gênica e a engenharia de fenótipos
• 1974, AsilomarDefendia a tecnologia para diagnose de doenças, medicina terapêutica, produção de proteínas humanas em larga escala, processos de fermentação, produção maciça de antibióticos
• 1978, GenentechProdução da primeira insulina humana
O DNA recombinante hoje• Há centenas de vetores de clonagem comerciais, cada um
com vantagens específicas (encontrar promotores, descobrir interações entre genes, expressar proteína em larga escala, etc)
• DNAs das mais variadas espécies são clonados a todo instante em laboratórios de biologia molecular em todo o mundo
• Parece que nada de muito anormal aconteceu... Ainda...– Será que Watson está certo?
Plantas transgênicas• Genes de resistência a patógenos
– Resistência a inseticidas (Roundup)– Aumento da produtividade, desequilíbrio
ecológico
• Aumento nutricional– Adição de determinado aminoácido torna
alimentos mais nutritivos– Banana vacina
• Rotulação!
• Prejuízo ecológico da monocultura– A maior parte do prejuízo ecológico vem
da simples monocultura– A engenharia genética adiciona um nível
de prejuízo ecológico ligeiramente maior
• É preciso diferenciar a tecnologia de transgênicos de seu abuso pela indústria do capital– Produção de insulina, hormônio de
crescimento, etc.
Clonagem de genes
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Pra quê clonar genes?• Amplificar milhares de vezes apenas este gene• Realizar um estudo individual da função de genes• Identificar mutações que modifiquem a função deles• Entender a ação enzimática da proteína produzida • Verificar com quais outros genes ele interage• Produzir a proteína em larga-escala• Montar genomas completos• Produzir organismos transgênicos de interesse• Etc etc etc etc
Clonagem de fragmentos de DNA• Enzimas
– enzimas de restrição– DNA polimerases– DNA ligase/Topoisomerases– Fosfatases
• Vetores– Plasmídios– Fagos– Cosmídeos– BACS/YACS– Vírus, bacteriófagos
• Hospedeiros– Escherichia coli– Levedura– Células animais– Células vegetais
Vetor plasmidial• Origem de replicação• Gene repórter• Sítio múltiplo de clonagem
Ligação do DNA exógeno ao plasmídeo
• Produção da molécula de DNA recombinante
• Plasmídeo + DNA cortado do organismo de interesse
• Ligação das extremidades coesivas
DNA Ligase
• Realiza a ligação fosfodiéster• E agora, quem dirá de qual organismo é esta molécula?
Ensaio de digestão e subclonagem
Kb 1 2 PM
0,5
1,0
2,0
Clivagem do inserto clonado no vetor com enzima de restrição
- + EcoRI
Clonagem de fragmentos de DNAINSERTO: Fragmento de DNA
VETOR ou veículo de clonagem:-plasmídeo-bacteriófago-cosmídeo-cromossomo artificial de bactéria (BAC)-cromossomo artificial de levedura (YAC)
Ligação enzimática: Ligase de DNA
Amplificação do clone em bactérias
insertofragmento de DNA ligado ao vetor
bactéria transformada
introduzir nas células: transformação e seleção
construção
Objetivo:Obter muitas Cópias do gene pretendido
Transformação
• Inserção do plasmídeo em bactérias
• Replicação bacteriana
• Produção em massa da proteína recombinante!
Métodos de transformação bacteriana
A transformação natural descrita por Griffiths, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro.
Permeabilização com CaCl2-- Choque térmico
Eletroporação-- Choque elétrico
Gene gun-- Bombardeamento
• Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente.
• DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.
Seleção de clonesSerá que entrei?
• Bactérias são colocadas em meio nutritivocom antibiótico para que cresçam e amplifiquem nosso DNA do inserto
• Gene repórter– Reporta se a
transformação aconteceu
– Bactérias não-transformadasnão sobrevivem
– Gene de resistênciaa algum antibiótico
Seleção de recombinantesDurante a clonagem de fragmentos, a DNA ligase pode fechar o plasmídeo sem que nenhum inserto tenha sido clonado. Para evitar a análise de um vetor fechado é preciso um novo teste de gene repórter.
Keywords
• Conceitos-chave para a tecnologia do DNA recombinante:– Vetor
• Sítio múltiplo de clonagem• Genes repórteres
– Inserto– Endonucleases de restrição sítio-específicas– Digestão, ligação, clonagem
http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o&feature=related
Material Suplementar• Várias técnicas de biomol podem ser escolhidas aqui para a
realização do trabalho de fim de curso: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/
• http://www.nature.com/milestones/miledna/timeline.html
• http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_biotechnology• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Recombinant-
DNA-Technology-and-Transgenic-Animals-34513
• http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545