Cromatografia líquida de alta eficiência

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Universidade Federal de Santa Catarina

Departamento de Química

Aula de: Michelle Barcellos

Professor: Ivan Gonçalves de Souza

Cromatografia líquida de alta eficiência

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Modalidades e Classificação

Cromatografia

Gasosa (CG)

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Fase Fase

MMóóvelvel

Líquida

Gás

CromatografiaLíquida

Fator GC HPLC

Requisito p/ amostra Volátil e termicamente estável Solúvel na fase móvel

Tipos de amostra Gases, líquido e sólidos Líquidos e sólidos

Introdução à cromatografia líquida

• Versatilidade

• Sensibilidade

• Resultados quantitativos

• Espécies não-voláteis e termolábeis

• Automatização

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Vantagens da técnica

• Alto custo do instrumento

• Alto custo de operação

• Falta de detector universal sensível

• Necessidade de experiência no seu manuseio

Limitações da técnica

Comparações entre CG e HPLC

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Equipamento de HPLC

Introdução à cromatografia líquida

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Instrumentação para HPLC

Introdução à cromatografia líquida

fase mfase móóvelvelInjetorInjetor

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Instrumentação para HPLC

Introdução à cromatografia líquida

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Instrumentação para HPLC

Fase móvel

Reservatório da Fase Móvel

Características da fase móvel

• Alto grau de pureza ou fácil purificação;

• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;

• Não decompor ou dissolver a fase estacionária;

• Ter baixa viscosidade;

• Ser compatível com o tipo de detector;

• Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.

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Instrumentação para HPLC

Fase móvel

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Bomba

Instrumentação para HPLC

Bomba para HPLC

Sistema de bombeamento

REQUISITOS:

• Vazão contínua, sem pulsos

(ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos);

• Vazões de 0,1 a 10 ml/min

• Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %;

• Inércia química: componentes resistente à corrosão.

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Instrumentação para HPLC

Bomba para HPLC

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Injetor

Instrumentação para HPLC

Inejtor para HPLC

• Loop de 0,5 a 500 µL

• Reprodutível

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Sistema de injeção Loop

Instrumentação para HPLC

Inejtor para HPLC

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Preenchendo o Loop (Load)

Instrumentação para HPLC

Inejtor para HPLC

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Injetando no Loop

Instrumentação para HPLC

Inejtor para HPLC

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Coluna

Instrumentação para HPLC

Colunas para HPLC

• Pequena e de constituição similar à da coluna analítica

• Retém:• Material particulado

• Contaminantes do solvente

• Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária.

• Custo reduzido

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Pré-colunas

Instrumentação para HPLC

Colunas para HPLC

Geralmente em aço inox

Coluna empacotada

Preço: > R$ 1.500,00

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Características das colunas de HPLC

Instrumentação para HPLC

Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

Si

OH

silanol livre

••

Ciano (-C2H4CN)

Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)

Amina (–C3H6NH2)

R =

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Tipos de interação soluto/fase estacionária

Fase normal

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Tipos de interação soluto/fase estacionária

Fase reversa – Fase ligada

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Tipos de interação soluto/fase estacionária

Cromatografia Quiral

Separação de isômeros ópticos

�Fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa;

� Fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais;

A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou

mistura de solventes).

Se um solvente não propiciar uma eluição

suficientemente rápida de todos os componentes, então

pode ser utilizada uma eluição por gradiente.

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação isocrática ou por gradiente

Tipos de eluição

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação isocrática

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação isocrática

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação isocrática

Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação por gradiente

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Separação por gradiente

30% ACN

32% de THF40 % MeOH

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Cromatografia líquida de alta eficiência

Monógrafo

Porcentagem de volume de solvente com mesma força.

29Detector

Instrumentação para HPLC

Detectores para HPLC

A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra.

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Características ideais para o detector

Instrumentação para HPLC

Detectores para HPLC

Detector universal

Detector seletivo:� Permite detectar uma de duas ou mais espécies que coeluam.

� Em geral, melhor linha base.

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Características ideais para o detector

Ampla faixa linear:

� Maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra.

� Analisar em uma mesma corrida cromatográfica espécies de concentrações diferentes.

Instrumentação para HPLC

Detectores para HPLC

Baixo volume internoGrande volume: Alargamento dos picos registrados.

Resposta Rápida� Sinal que represente o exato instante de detecção.

� Detector lento: Picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

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Detector por espectrofotometria UV-visível

Instrumentação para HPLC

Detectores para HPLC

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Detector por arranjo de diodos - DAD

Instrumentação para HPLC

Detectores para HPLC

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Resultado da detecção - Cromatograma

Instrumentação para HPLC

Detector por arranjo de diodos - DAD

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Resultado da detecção – Cromatograma em 3D

Instrumentação para HPLC

Detector por arranjo de diodos - DAD

Referências

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1. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de

Cromatografia. 1ª reimpressão.. Editora da UNICAMP - Campinas:

Editora da UNICAMP, 2007.

2. SKOOG, D. A., WEST, D. N. Fundamentos de Química Analítica.

Barcelona : Reverte, 1974.

3. SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Principles of

instrumental analysis. Philadelphia: Saunders College Publishing ,

c1998