Post on 10-Nov-2018
Cromatografia e os jogos
olímpicos de 2016:
uma corrida contra o doping
Prof. Helvécio Costa Menezes
Conteúdo
Doping no esporte
Substâncias proibidas e seus efeitos
Agências de controle antidoping
Métodos de análise
Cromatografia a gás
Princípios
Componentes
Acoplamento com espectrometria de massas
GCxGC.
Preparo de amostras para GC/MS
Aplicações da GC/MS no controle antidoping.
2
Doping
3
Presença de qualquer substância ou método que
tenha o potencial para aumentar o desempenho
desportivo, que ofereça risco desnecessário a
atletas, ou atue de forma contrária ao espírito
desportivo.
WADA, 2016
Ideal Olímpico
4 Barão de Coubertin, 1896
A coisa mais importante não é vencer, mas participar,
assim como a coisa mais importante da vida não é a
vitória, mas a luta. O essencial não é conquistar e sim lutar
bem”
Motivação
Movere (latim): mover para realizar determinada ação.
Energia que nos impulsiona em direção a um determinado objetivo a fim de satisfazer uma necessidade pessoal.
5
Tipos de indivíduos
Tarefa
Prazer em realizar tarefas
corretamente
(reconhecimento próprio)
Referencial interno
Dificuldades e obstáculos são
desafios
Os fins não justificam os
meios
Realizar uma tarefa de forma
correta encerra a recompensa
Ego
Prazer em conquistar algo ou
vencer alguém
(reconhecimento social)
Referencial externo
Dificuldades e obstáculos não
são desafios
Os fins justificam os meios
Só a vitória é a recompensa
6
Fatores que favorecem o doping
Motivação pessoal
Excesso de cobrança (social, empresarial, e familiar)
Necessidade financeira
Força da mídia
Impunidade
7
Fatores que favorecem o doping
8
O medo da detecção e consequente desgraça e perda de
rendimentos é o maior desincentivo a dopagem para os atletas.
Mais do que o dano pessoal. Em estudo patrocinado pela Sports
Illustrated, 195 de 198 atletas disseram que “TOMARIAM”
drogas promotoras de desempenho se eles tivessem a garantia
de vencer e não serem flagrados.
50% declararam que fariam isso mesmo se MORRESSEM de
efeitos colaterais da droga após 5 ANOS de uma vitória em
competição.
Histórico do uso de substâncias proibidas
9
China (2737 aC)
Efedra, mandragora
Arábia (1000 aC)
Cannabis, Haxixe
Grécia (300 aC)
Cogumelos, ópio
América precolombiana
Coca, mescalina
Europa (1810 dC)
Cafeína, morfina
Japão (1919 dC)
Anfetaminas
Histórico do uso de substâncias proibidas
10
Áustria (1910)
Primeiro teste anti doping
Jogos Olímpicos
de Roma (1960)
heroína
1940
Primeiros métodos por GC
e TLC
Tóquio (1964)
Primeiras Leis e punições
Décadas 60 e 70
Anfetaminas
Década de 80
Anabolizantes
Altetas flagrados no exame antidoping
11
ATLETISMO 2003
Maurren Maggi
(Clostebol -pomada
dermatológica)
VOLEI 2003
Giba
(Maconha)
NATAÇÃO 2007
Rebeca Gusmão,
(Testosterona)
FUTEBOL 2008
Romário
(Finasterida)
MMA 2015
Anderson Silva
(Esteróides)
Altetas flagrados no exame antidoping
12
ATLETISMO 1988
Bem Johnson
(Estanozolol)
VELOCISTA 2007
Marion Jones
(Esteróides)
CICLISMO 1999
Lance Amostrong
(EPO)
FUTEBOL 1994
Maradona
(Efedrina)
CICLISMO, 2006
Floyd Landis
(Testosterona)
13
14
Anabolizantes (S1)
15
Esteróides Anabólicos Androgênicos (EAA)
A testosterona é o principal esteróide anabolizante, é produzida nos testículos,
assim como pelo córtex supra renal em homens e mulheres. Ao atingir o núcleo
celular estimula o DNA a sintetizar proteínas. Quanto mais intenso for o esforço
maior será a produção de testosterona.
Promove o aumento da massa muscular, aumento da hemoglobina, aumento
da deposição de cálcio nos ossos.
Efeitos colaterais
Impotência sexual, e esterilidade
testosterona
Anabolizantes (S1)
16
Esteróides Precursores da testosterona
Desidroepiandrosterona (DHEA)
Androstenediona
Oximetolona,
Oxandrolona,
Metandostrenolona
Estanozolol.
Decanoato de nandrolona (Deca)
Fenilpropinato de nandrolona
Cipionato de testosterona
Undecilenato de boldenona
Meia vida: 10 a 20 minutos
Metabolizados: fígado
Eliminação: urina
Deca
Estanozolol.
Hormônios Peptídicos (S2)
17
São substâncias reguladoras de diversas funções do organismo. Sua origem se
dá pelo estímulo inicial do SNC, que gera reações químicas para a sua
secreção.
Hormônio de Crescimento (GH)
Secretado pelas glândulas pituitárias, possui função anabólica de diversos
tecidos e sua secreção é ampliada em circunstâncias anaeróbias. A meia vida
sérica do GH é de 20 minutos após secretado ou injetado, o pico de
concentração dá-se de 1 a 3 horas após injetado, tornando-se indetectável
após 24 horas.
Efeitos Colaterais: pode causar o surgimento da síndrome do túnel do carpo,
acromegalia, cardiomegalia, diabetes II e hipertensão arterial
GH acromegalia
Hormônios Peptídicos (S2)
18
Fator de Crescimento tipo Insulina 1 (IGF-1)
possui função estimulante do DNA para a síntese protéica, causando também o
anabolismo muscular, tendo efeitos colaterais similares ao GH .
Eritropoetina (EPO)
Este hormônio é naturalmente secretado pelas glândulas supra-renais (90%) e
pelo fígado (10%). É responsável pelo aumento da proliferação de células
tronco, precursoras da produção de glóbulos vermelhos do sangue, através da
ligação a sítios específicos na medula óssea. Sua meia vida é de 6 a 8 horas.
Efeitos colaterais:
Eleva a densidade sanguínea, pode causar hipertensão, infarto, lesões renais e
doenças cardiovasculares.
Hormônios Peptídicos (S2)
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Gonadotrofina (hCG)
Glicoproteina hormonal produzida durante a gravidez nos líquidos maternos.
Garante a manutenção da gestação, inibindo a menstruação e a ausência de
uma nova ovulação.
Efeitos colaterais:
Tumores hepáticos, retenção de líquidos e de sódio, sobrecarga cardíaca,
diabetes e maior incidência leucemias.
Beta-2 Antagonistas (S3)
20
Atuam nos receptores beta-2 de diversos tecidos, inclusive da
musculatura esquelética. Possuem efeitos broncodilatadores, atuam na
oxidação dos tecidos adiposos.
Diminuem a frequência cardíaca e a pressão arterial, normalmente
usados em esportes que requerem precisão e concentração como tiro e
arco e flecha.
Efeitos Colaterais
Taquicardias,nervosismo, dores de cabeça, tremores, insônia,
hipertensão, patologias morfológicas e funcionais no coração.
Clenbuterol Salbutamol
Moduladores hormonais e metabólicos (S4)
21
Inibidores de aromatase: impedem a formação de hormona estrogénica
Moduladores seletivos de receptores de estrogênios (SERMs): inibição
ou ativação do estrogênio em vários tecidos.
Insulinas: aumento da queima de glicose
Efeitos Colaterais
Dor nos músculos e nas junções
Osteoporose, ossos frágeis e fracturas
Confusão da memória
Hipoglicemia
Aminoglutetimida
Exemestano
Diuréticos (S5)
22
Agem na redução da secreção de renina pelas células dos rins. A renina
tem função precursora na conversão de enzimas que aumentam o volume
de água do organismo.
Redução de peso antes das competições
Camuflagem de outras substâncias na urina
Efeitos colaterais
Redução dos sais minerais e outros nutrientes estocados no tecido muscular,
e redução da capacidade física do atleta.
Furosemida Hidroclorotiazida
Estimulantes (S6)
23
Agem no sistema nervoso central, aumentam o estado de
alerta e capacidade física.
Efeitos
Dilatação das pupilas
Inibição da secreção das glândulas salivares
Aumento da frequência respiratória
Inibição dos movimentos peristálticos
Aumento da glicogenólise
Contração do esfíncter da uretra
Estimulantes (S6)
24
Mecanismo de ação
Estimulantes (S6)
25
Aumenta a secreção de catecolaminas, o que aparentemente
potencializa a capacidade neural muscular.
Provas de longa duração
Ajuda a reduzir ou retardar a fadiga
Aprimora e amplia o desempenho
Estimulantes (S6)
26
Catecolaminas endógenas
Estimulantes (S6)
Efeitos Colaterais
Palpitações
Perda de apetite
Hipertensão
Sobrecarga do coração e fígado
Problemas renais
27
Narcóticos-Analgésicos (S7)
28
Agem no SNC, ligando-se a receptores específicos, o que impede a
liberação de neurotransmissores responsáveis pela mensagem da dor.
Não melhoram o desempenho físico, mas aliviam e retraem a
sensação de dor como a fadiga. Atletas de maratona e triatlo.
Efeitos Colaterais
Causam entorpecência e perda de sensibilidade, lesões músculo
esqueléticas, náuseas, vômitos, insônia, depressão e dependência.
química.
Papaver somniferum
Canabinóides (S8)
29
São substâncias derivadas da Canabis sativa e atuam como depressores do
SNC. A Canabis sativa possui cerca de 420 substâncias, dentre estas destaca-
se o Δ9THC (Delta 9 Tetra Hidrocanabinol).
Reduz a ansiedade antes e durante a competição.
Efeitos Colaterais: pode causar dependência química, aparente destruição
irreparável de receptores neurais, redução da memória, e da capacidade
intelectual
Δ9THC
Glicocorticóides (S9)
30
São hormônios esteróides que se ligam com o receptor do cortisol.
Afetam o metabolismo dos carboidratos, são usados como anti-inflamatórios,
reduzem a dor, imunosupressores, e provocam euforia.
Efeitos Colaterais: hemorragias, úlceras, glaucoma, e diabetes.
Cortisol
Manipulação do Sangue e seus componentes
(M1)
31
Promove o aumento da concentração de hemoglobina para o melhor
transporte de oxigênio.
Transfusões de sangue
Aplicações intravenosas de perfluorcarbonos
Hemoglobina bovina
Efeitos Colaterais
Reações alérgicas, transmissões virais, choques metabólicos e
sobrecarga de circulação
Manipulação Química e Física (M2)
32
Manipular visando alterar a integridade e validade das amostras
coletadas no Controle de Dopagem.
Infusões intravenosas e/ou injeções maiores que 50 mL por um período
de 6 horas exceto aquelas administradas de forma legítima durante
ocasiões de admissões hospitalares, procedimentos cirúrgicos ou
investigações clínicas.
Manipulação da urina
33
Uso de Probenecida bloqueador da secreção de testosterona e
camuflador de agentes dopantes.
Doping genético (M3)
34
Alteração dos genes responsáveis pela síntese de proteínas.
Dentre os genes capazes de alterar a força e a resistência física destacam-se:
Enzima Conversora de Angiotensina (ECA): agente vasoconstritor
Eritropoetina (EPO): estímulo para a produção de hemácias
Miostatina: proteína bloqueadora da síntese protéica muscular , e
desenvolvimento da musculatura esquelética
Álcool (P1)
35
O etanol atua no SNC e em pequenas doses reduz o nervosismo, tremor,
sensibilidade às lesões, aumenta a sensação de relaxamento e confiança.
Limite: 0,1 g L-1
Efeitos Colaterais
Diminui a capacidade visual, a concentração, e os reflexos motores.
Alterações cardíacas, cirrose, pancreatites, dependência, e teratogênese.
Proibido para as modalidade
Aeronáutica, tiro com arco, automobilismo, karatê, pentatlo, motociclismo,
e motonáutica
Beta bloqueadores (P2)
36
Melhora as arritimias cardiácas.
Reduzem os batimentos cardíacos,
Estabilizam mãos e braços
Precisão nos movimentos
Efeitos Colaterais
Insuficiência cardíaca descompensada
Doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC)
Asma brônquica
Proibido para as modalidade
Arco e flecha, automobilismo, bilhar, dardos, desportos subaquáticos,
golfe, e tiro.
Agências de controle antidoping
37
World Anti-Doping Agency – WADA
(Agência Mundial Antidoping - AMA)
Fundada em 1999 na Suiça
Agentes de controle
38
Fonte: ABCD, 2016
Como é feito o controle antidoping
39
Seleção dos atletas
Fonte: ABCD, 2016
Como é feito o controle antidoping
40
Coleta das amostras
Na Estação de Controle de Dopagem Oficial de Controle de Dopagem (DCO)
informa os direitos e deveres, e registra as informações do atleta.
Urina
O atleta escolhe um copo de coleta, e com a supervisão do DCO faz a coleta
de 90 mL.
O atleta recebe 3 frascos selados, e escolhe 2 para transferir a amostra
(frasco A 60 mL, e frasco B 30 mL)
Após o DCO checar a densidade da urina, o atleta acondiciona as amostras
para o transporte e confere o formulário de controle..
Fonte: ABCD, 2016
Como é feito o controle antidoping
41
Amostra A: análise imediata
Amostra B: armazenada
Se A for um Resultado Analítico
Adverso (positivo para dopagem) o
atleta decide se pede a análise da
amostra B para contestar o resultado.
Suspensão mínima de 4 anos, Banimento dos Reincidentes
Fonte: ABCD, 2016
Resultados analíticos adversos
42 WADA, 2013
Processo Analítico
Amostragem
(sa)
Armazenamento e transporte
Tratamento da amostra (sp)
Análise (sm)
Resultados
Fonte: Bartley, 1990
sg2
= sm
2 + sa2 + sp
2
sg2
= variância global
sm2 = variância do método
sa2 = variância da amostragem
sp2 = variância do preparo da amostra
Erro em função da concentração do analito
44
Fonte: Horowitz, Anal. Chem., 1982.
Espectro de Massas
Isotopológos
27 28 29 30
CO
13 CO
Int.
+
+
27 28 29 30
CO
13 CO
Int.
+
+
Mesma espécie, com os mesmos elementos mas diferentes isótopos.
Espectros de Massas Isótopos
Elemento Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa
Carbono 12 C 100 13 C 1.1
Hidrogênio 1 H 100
2 H 0.016
Nitrogênio 14
N 100 15
N 0.38
Oxigênio 16
O 100 17
O 0.04 18
O 0.2
Enxofre 32
S 100 33
S 0.78 34
S 4.4
Cloro 35 Cl 100 Â 37 Cl 32.5
Bromo 79
Br 100 81
Br 98
Geralmente o isótopo mais leve é o mais abundante
Espectro de Massas
abundância isotópica
Pico do Carbono 13
Pico monoisotópico
Para se estimar o número de
carbonos em uma molécula:
dividir a intensidade de A+1
por 1.1 (abundância do
Carbono 13 na natureza).
25 / 1.1 = 23,7
~ 24 átomos de
carbono na molécula
Espectro de Massas
Abundância isotópica
Br - CH3 15 u
79Br-CH3 = 94 81Br-CH3 = 96
Informações:
• Relação m/z
• Presença dos isótopos
• Diferença de massa entre os sinais
Espectro de Massas
Abundância isotópica
Espectro de Massas
Abundância isotópica
Cloro
MM = 35,453 u
Isótopos: 75,77 % de 35Cl e 24,23 % de 37Cl
Ciantoxina 7
40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61mass0
100
%
Dani_07 (0.046) Is (1.00,1.00) CH3Cl 1: TOF MS ES+ 7.49e1250.0
52.0
35Cl
37Cl
Espectro de Massas
Regra do Nitrogênio
válida apenas para o modo EI
Número ímpar de átomos de N
Íon molecular [M]+• terá massa ímpar!!
Número par de átomos de N ou não contém átomos de N
Íon molecular [M]+• terá massa par!!
Espectro de Massas
Medida da Massa Molecular
• m/z 249
» C20H9+
» C19H7N+
» C13H19N3O2+
• m/z 249 » C20H9
+ 249.0700
» C19H7N+ 249.0580
» C13H19N3O2+ 249.1479
Sistemas de
Baixa resolução
Sistemas de
Alta resolução
Massa nominal Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopo mais abundante. Ex : M = 249 C20H9
+ ou C19H7N+ ou C13H19N3O2
+
Massa exata Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exata do isótopo mais abundante da cada elemento. Ex : M = 249 C20H9
+ 249.070 C19H7N
+ 249.0580 C13H19N3O2
+ 249.1479 Faixa de massas Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.
Espectro de Massas
Medida da Massa Molecular
Espectro de Massas
Resolução
249 249.0700 249.0580 249.1479
3 compostos diferentes
Mesma massa nominal
Baixa Resolução
3 compostos diferentes
3 massas exatas diferentes
alta resolução
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+ C20H9
+ C19H7N+ C13H19N3O2
+
Medida da capacidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes.
Espectro de Massas
Resolução
FWHM = Full Width at Half Maximum
Espectro de Massas
Resolução
319.8 319.9 320.0 320.1 Mass
%
0
20
40
60
80
100
Resolução = 1.000
319.8 319.9 320.0 320.1 Mass
%
0
20
40
60
80
100 319.8965 319.9329
Resolução = 10.000
Espectros de Massas
Alta Resolução
57
C11H12Cl2N2O5: C11 H12 Cl2 N2 O5 pa Chrg 0
322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive A
bundance
322,0123
324,0094
323,0157 326,0064325,0127
327,0098 328,0107 329,0140 330,0174 331,0183 332,0216
C11H12Cl2N2O5
Cloranfenicol
Massa Nominal = 322
Massa Exata Monoisotópica = 322,0123
Espectros de massas
Alta Resolução
58
Espectro de Massas
Exatidão de massas
Exatidão da informação de massa fornecida pelo espectrômetro de massas
mexatidão = mreal - mmedida
ppm = 106 * mexatidão/ mmedida
Auxilia na eterminação da fórmula molecular de compostos
desconhecidos
Pode indicar a presença de um íon particular em um
composto conhecido
mexatidão
Espectro de Massas
Exatidão e Resolução
Espectro de Massas
Sensibilidade e Resolução
Diminuição da resolução implica em aumento de sensibilidade!
Análise qualitativa Identificação de Eluatos
TEMPO
CO
NTA
GE
NS
MASSA / CARGA
CO
NT
AG
EN
S
1 Seleção manual ou automática do espectro de massa correspondente a um eluato.
2 Interpretação manual do espectro e / ou comparação automática com biblioteca de espectros padrão do equipamento.
Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação
estatística ( Probability Based Matching )
BIBLIOTECA DE ESPECTROS
ESPECTRO DESCONHECIDO
PBM
Lista com possíveis
candidatos + porcentagem de confiabilidade
# NOME FÓRM. %
1 1-dodeceno C12H24 99
2 1-dodecanol C12H26O 91
3 ciclododecano C12H24 91
4 2-dodeceno C12H24 66
5 1-undeceno C11H22 35
6 8-metil-3-undeceno C12H24 32
PBM de um eluato
“desconhecido” (1-dodeceno)
LIMITAÇÕES:
Identificação pouco confiável de espectros muito simples
Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000
espectros)
Diferenças entre espectros gerados por diversos EM
Espectrometria de Massas no Controle Antidoping
Critérios de identificação
WADA , 2016
Diferença máxima de ± 0,5 Da entre as massas do íon
alvo e a massa do mesmo íon adquirido a partir de
uma amostra enriquecida.
A razão sinal/ruído (S/N) dos íons de identificação
deve ser maior do que 3
Em MS1 usar pelo menos três íons de identificação.
Em MSn usar pelo menos dois íons precursores.
Espectrometria de Massas no Controle Antidoping
Critérios de identificação
WADA , 2016
Abundância Relativa (%)
no MR*
Tolerância máxima para a Abundância Relativa na
amostra
Exemplos
Abundância Relativa (%)
No MR
Tolerância Máxima
50 – 100 ±10 (absoluto) 60 50 - 70
25 – 50 ±20 (relativo)
40 32 - 48
1- 25 ±5 (absoluto)
10 5 - 15
* MR = material de referência analisado nas mesmas condições
Espectrometria de Massas no Controle Antidoping
Critérios de identificação
=
MR = material de referência
Am = amostra
(MR)
MDMA= metiletilenodioximetanfetamina
(Ecstasy)
(Am)
Espectrometria de Massas no Controle Antidoping
Critérios de identificação
MR = material de referência
Am = amostra
(MR)
MDMA= metiletilenodioximetanfetamina
(Ecstasy)
(Am)
Técnicas de separação no controle antidoping
68
Separação
SPE LLE SPME
Extração em Fase Sólida (Solid Phase Extraction - SPE)
Woolfenden E. J. Chrom. A. 1217(16): 2674-2684, 2010. 69
Princípio: passagem da amostra por sorventes adequados, onde ocorre partição entre duas fases (solido-liquido).
Mecanismos de retenção: Força de van der Waals, ligações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, e interações iônicas.
Modos:
ATIVO: bombeamento;
PASSIVO: difusão.
Extração em Fase Sólida
70
Amostra bruta
Amostra após
extração com SPE
Extração em Fase Sólida
71
Sorventes comerciais para extração em fase sólida
SORBENTE COMPOSIÇÃO APLICAÇÕES
Tenax TA
Poli (oxido de 2,6-difenil-p-fenileno)
Aromáticos exceto Benzeno, apolares PE < 100°C e polares PE < 150°C
Chromosorb 106 Estireno-divinilbenzeno Compostos oxigenados.
C5 a C12
Porapak N Polivinilpirrolidona Nitrilas, piridina e álcoois. C5 a C8
Carbotrap C Carbono grafitizado Hidrocarbonetos até C20 , alquil benzenos
Carbotrap X Carbono grafitizado BTEX
Spherocarb
Pirólise de PVC
Óxido de etileno, CS2 , CH2Cl2 , metanol, etanol, acetona
Carboxen 1000 Pirólise de PVC Hidrocarbonetos ultra-voláteis, C2 a C3
Ras, M.R. et al. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 28, No. 3, 2009. 72
Sorventes suportados em sílica para SPE
73 Rodriguez et al. Intech, 2013
Carbono grafítico para SPE
Ferenc et al. Polish J. of Environ. Stud, 2006
Area superficial específica: 100 m2 g-1
Funcionalização: grupos oxigenados
Nomes comerciais: Carbopack, Carbograph
Aplicações: espécies neutras, ácidas e básicas.
Carbono grafítico Poroso para SPE
Ferenc et al. Polish J. of Environ. Stud, 2006
Area superficial específica: 120 m2 g-1
Diâmetro médio dos poros: 250 Å
Porosidade: 75%
Funcionalização: grupos oxigenados
Nome comerciaL Carb GR
Aplicações: espécies polares e apolares
Grafenos para SPE
Wang et al. J. Chromatogr. A, 2014
Nanocompósitos de Grafeno
Wang et al. J. Chromatogr. A, 2014
Nanocompósitos de Grafeno com sílica
Zhang et al. J. Chromatogr. A, 2013
1-(3-dimetilaminopropil)-
3-etilcarbodiimida hidrocloreto (EDC)
N-hidroxisuccinamida (NHS)
Nanotubos de carbono para SPE
Multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)
Elevada área superficial específica (200 a 400 m2 g-1)
Elevados fatores de enriquecimento (2000 a 4000 vezes)
Estabilidade química
Estabilidade térmica
Hidrofobicidade
Funcionalização
Funcionalização não covalente dos CNT
Forças envolvidas:
Interações pi
Van der Walls
Eletrostáticas
Grupos:
Polímeros
Surfactantes
Carboidratos
Proteínas
Enzimas
DNA
Estratégias
Mistura física em solução
Polimerização na superfície dos CNT
Funcionalização covalente dos CNT
Forças envolvidas
Ligações covalentes
Grupos
Halogênios
Radicais(alquila, arila)
Ciclicos
Hidroxila
Carboxila
Estratégias
Tratamento dos CNT com agentes oxidantes fortes a temperaturas elevadas
Oxidação em fase gasosa (hidroxila e carbonila)
Oxidação em fase líquida(carboxila)
Funcionalização covalente dos CNT
MWCNT não oxidado MWCNT após tratamento com NaClO 7% m/v
Socas et al. J, Chrom. A, 2014
Extração dispersiva em fase sólida (Dispersive solid-phase extraction - DSPE)
Rastkart, et al. J, Chrom. A, 2013 Análise
Mecanismos em SPE
Fase Normal
Fase Reversa
Analito
Polar Apolar
Sorvente
Polar Apolar
Solvente (matriz) Apolar Moderadamente Polar
Solvente (Eluição)
Polar Apolar
Interações (Analito/sorvente)
Dipolo-dipolo
Van der Walls
84
Extração com cartuchos SPE
Cartuchos de 1 a 50 mL.
Diâmetro médio das partículas 40 a 60 μm
Volume médio da amostra 500 mL
Eluição sequencial em SPE
86
Extração SPE automatizada
Gerstel, 2015
Extração com discos SPE
88
Sorvente impregnado em fibra de vidro ou PTFE
com espessura média de 0,5 mm.
Diâmetro médio das partículas 8 a 40 μm
Diâmetro médio dos discos 5 a 93 mm.
Extração em fase sólida com ponteira descartável (Disposable Pipette Extraction – DPX)
89
Eluição: 0,1 a 0,5 mL
Tempo: 1 a 2 min
Extração DPX de drogas em urina equina e determinação por GC/MS
90
amostra eluato Lerch et al . Gerstel, 2012
Extração em fase sólida com ponteira descartável (Disposable Pipette Extraction – DPX)
91
Vantagens
Mínimo uso de solventes
Baixos LD e LQ
Elevada precisão
Uso em diversas matrizes
Descartável
Baixo custo
Automação
Vantagens e desvantagens SPE
Vantagens
Baixo custo
Simples operação
Grande variedade de sorventes
Elevada seletividade
Potencial para automação
Desvantagens
Restrições de vazão
Entupimentos
Uso de solventes
Exposição a solventes.
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
93 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
5,0 mL de urina
1,0 mL de tampão pH=5,2
50,0 μL β-glucuronidase
55 °C por 2 h
KOH até pH=9,0
Centrifugação
Extração SPE
Lavagem com 2,0 mL MeOH
E 2,0 mL água e 1,0 mL tampão pH=4,0
Eluição com 2,0 mL
CHCl3/i-propanol 4:1
100,0 μL MSTFA, 60 °C por 5 min
Secagem com N2
20,0 μL MBTFA 60 °C por 10 min
GC/MS
MBTFA = N-metil-bis-(trifluoroacetamida)
MSTFA= N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
95 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
96 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
97 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
98 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Determinação de Sibutramina e metabólitos em urina por SPE-GC/MS
99 Sardela V.F.. et al. J. Chromatogr. B. 2009
Matrizes biológicas e tempo de detecção
100 Bulcão et al, 2011
Estrutura do cabelo
101 Pragst & Baliková, 2006
Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS
102
50 mg cabelo
SPE
Condicionamento
SPE
Lavagem
SPE
Eluição
Derivatização
GC/MS
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS
103
A: Diazepan
B: Diazepan-d5
C: Nordiazepan
D: Oxazepan
E: Aminoclonazepan
F: Clordiazepóxido
G: Temazepan
Cromatograma dos benzodiazepínicos no cabelo após extração por SPE
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS
104
Limites de detecção e quantificação
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS
105
Pantaleão,L.N., 2012
Resultados para amostras de cabelo (6 a 9 cm) de usuários de benzodiazepínicos.
Amin: aminoclonazepan, Dzp: diazepan, Nzp: nordiazepan
Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME)
Princípio: equilíbrio do analito entre uma micro fase de coleta e a matriz.
19
Microextração em Fase Sólida (Solid Phase Microextraction – SPME)
Modos
Fibra exposta
Fibra recolhida
19
Fibras para SPME
Sorbente ESP.
(μm)
T(°C) USO
100 200-270 COV
PDMS 30 200-270 COSV ap
7 200-270 COSV semi-p
PDMS/DVB 65 200-270 V p
CX/PDMS 75 240-300 COV traço
CW/DVB 65 200-260 p
DVB/CX/PDMS 50/30 230-270 p
CW/TPR 50 - p
PA 85 220-310 COSV p
Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 108
Tabela 4. Características das principais fibras comerciais
Escolha da Fibra para SPME
Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 109
Tabela 4. Características das principais fibras comerciais
Reuso das fibras para SPME
Parreira, F.V.; Cardeal, Z. L. Química Nova, 28, 646-654, 2005 110
Tabela 4. Características das principais fibras comerciais
PDMS/DVB Após 20 ciclos de
extrações em suco de uva
PDMS Após 100 ciclos de
extrações em suco de uva
Bojko, et al. Anal. Chim. Acta, 2012
Extração com SPME no modo Headspace (HS-SPME)
111
Extração com SPME no modo de Imersão Direta (DI-SPME)
112
Aplicações da SPME em química Forense
Furton, K. G. J. Chrom. Sci., 2000
Extração de Drogas ilícitas por HS-SPME em diversas matrizes e determinação por GC/MS
Fujii.. H. J. Forensic. Toxicol., 2015
100 μm PDMS
Extração a 300°C de 30 s a 7 min
Extração de Drogas ilícitas por HS-SPME em diversas matrizes e determinação por GC/MS
α-PVP: alfa-Pirrolidinapentiofenona
PV9: 1-Fenil-2-(pirrolidina-1-il)octan-1-one
MN18: N-1-Naftalenil-1-pentil-1H-indazol-3-carboxamida
Fujii.. H. J. Forensic. Toxicol., 2015
Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS
116
Souza, D.Z. et al., 2011
1,5 mL urina
75 mg Na2CO3 + 150 mg Na2SO4 + 5 μL PRCL
Vortex
SPME
PDMS 30μm, 1200 rpm por 20 min
GC/MS
PRCL= propilcloroformato
Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS
117 Souza, D.Z. et al., 2011
DIE: dietilpropion
AMP: anfetamina
MET: metanfetamina
FEN: fenproporex
MPH: metilfenidato
PROPYL: propilcarbamato (derivatizante)
Determinação de anfetaminas em urina por SPME-GC/MS
118 Souza, D.Z. et al., 2011
Extração Líquido-Líquido (Liquid-Liquid Extraction - LLE)
Equilíbrio de distribuição ou partição
KD = [A(org)] / [A(aq)]
Concentração do Analito que permanece na fase aquosa [A(aq)]i
Onde:
[A(aq)]o = conc. Inicial do A
Vaq = volume da fase aquosa
Vaq = volume da fase organica
i = número de extrações
119
Extração Líquido-Líquido (Liquid-Liquid Extraction - LLE)
Vantagem
Baixo custo
Desvantagens
Elevado consumo de solvente
Risco de contaminações
Baixo fator de concentração
120
Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS
121
Wójtowicz ,M. et al., 2015
2-etilamino-1-fenilbutane (EAPB)
Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS
122
5,0 mL urina
20 μL Difenilamina 150 mg L-1 (P.I)
Ajuste pH = 9
1,3 mL
T-butil-metil éter
LLE
GC/MS
PI= padrão interno, Wójtowicz ,M. et al., 2015
Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS
123
Cromatograma do EAPB após extração LLE
Padrão
Interno
EAPB
Wójtowicz ,M. et al., 2015
Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS
124
Espectro de massas do EAPB
Wójtowicz ,M. et al., 2015
Determinação de anabolizante em urina por LLE-GC/MS
125
Concentração de EAPB em urina de voluntário após a ingestão de 10,8 μg de EAPB em um suplemento alimentar
Wójtowicz ,M. et al., 2015
Microextração com gota (Single Drop Microextraction - SDME)
126
Headspace (HS-SDME) Imersão direta (DI-SDME)
1 a 8 μL
Microextração com gota (Single Drop Microextraction - SDME)
127
Fatores
Tipo e volume do solvente de extração
Temperatura e tempo de extração
Força iônica
pH
Agitação
Vantagens
Baixo custo
Simplicidade
Elevada recuperação
Elevado fator de enriquecimento
Desvantagens
Baixa seletividade
Baixa precisão
Cinética lenta
Microextração em fase líquida (Liquid phase microextraction - LPME)
Diâmetro interno = 600 µm
Espessura das paredes = 200 µm
Poros = 0,2 µm
128 10:24
Microextração em fase líquida (Liquid phase microextraction - LPME)
Psillakis, E., Kalogerakis, N. TrAC, 2003
Solução aceptora (organica)
Paredes da fibra Agulhas
Fibra imersa na solução
aquosa (doadora)
Solução doadora
129 10:24
Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS
130 Lorena, 2012
Propriedades das principais anfetaminas
131 Pragst & Baliková, 2006
Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS
Biotransformação do MDMA
Determinação de anfetaminas em urina e sangue por LPME-GC/MS
132
1,0 mL da amostra em pH 13
Extração com tolueno em HF de 4 cm
por 15 min a 30°C e 500 rpm100 μL
LD: 0,5 a 3 ng/mL
Methamphetamine hydrochloric (MA),
Amphetamine sulfate (AM),
3,4-methylenedioxymethamphetamine hydrochloric (MDMA),
3,4-methylenedioxyamphetamine hydrochloric (MDA),
Methcathinone hydrochloric (MACT),
Ketamine hydrochloric (K),
Meperidine hydrochloric,
Methadone hydrochloric.
Meng, L. et al. J. Chromatogr. B. 2015
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
133
Propriedades das principais anfetaminas
Pantaleão,L.N., 2012
134 Pragst & Baliková, 2006
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
Biotransformação do MDMA
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
135
50 mg cabelo
HF-LPME
Derivatização
GC/MS
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
136
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
137
Espectro de massas da anfentamina derivatizada
Determinação de benzodiazepínicos em cabelo por SPE-GC/MS
138
Lorena, 2012
Espectro de massas do diazepan
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
139
Limites de detecção e quantificação
Pantaleão,L.N., 2012
Determinação de anfetaminas em cabelo por LPME-GC/MS
140
Resultados para amostras de cabelo (6 a 9 cm) de usuários de anfetaminas.
Anf: anfetamina, Femp: femproporex Pantaleão,L.N., 2012
141 Website: http://cmca.qui.ufmg.br/
Obrigado!
A Consciência é um singular para o qual não existe plural.
[Erwin Schrödinger]
142