Post on 21-Jan-2019
caracelli-zukerman
Ignez CaracelliIgnez Caracelli
BioMat – DF – UNESP/Bauru
Bauru, 08 de outubro de 2007
Aula 8Aula 8Proteínas: da extração à estrutura 3D Proteínas: da extração à estrutura 3D
IntroduçãoIntrodução a a BioquímicaBioquímica: : BiomoléculasBiomoléculas
Julio Julio ZukermanZukerman SchpectorSchpector
LaCrEMMLaCrEMM –– DQ DQ –– UFSCarUFSCar
caracelli-zukerman
proteínaproteína purificadapurificada
PassosPassos necessáriosnecessários parapara estruturaestrutura 3D3D
caracelli-zukerman
extração
proteína purificada
?
ISOLAMENTO•material de partida � extrato bruto•desintegração celular
•extração de enzimas solúveis e de membrana
•meio de extração
Obtenção de proteína purificadaObtenção de proteína purificada
caracelli-zukerman
células ou tecidosPellets com células intactas, organelas, membranas e proteínas de membranas
Sobrenadante comProteína solúvel
células ou tecidoscélulas ou tecidos
misturar, agitar, misturar, agitar, homogeneizar, homogeneizar, sonicarsonicar
IsolamentoIsolamento
caracelli-zukerman
extração
proteína purificada
isolamento
PURIFICAÇÃO•métodos e condições experimentais•estratégia na purificação de enzimas.
caracelli-zukerman
purificaçãopurificação
caracelli-zukerman
SeparaSeparaçção de Proteão de Proteíínas nas
�Fracionamento: solubilidade da proteína depende da temperatura, pH, forca iônica
�Diálise
�Ultrafiltração
�Coluna cromatográfica
�Eletroforese
caracelli-zukerman
Coluna cromatogrColuna cromatográáfica fica
reservatório
proteínas
amostra de proteamostra de proteíínana(fase m(fase móóvel)vel)
matriz smatriz sóólida porosalida porosa(fase (fase estacionestacionáária)ria)
suporte porososuporte poroso
efluenteefluente
caracelli-zukerman
• cromatografia por exclusão de tamanho
• proteínas maiores correm mais rápido
• volume de amostra élimitado
• coluna usualmente longa
Cromatografia filtração em gelCromatografia filtração em gel
leito de polímeroporoso
mistura de proteínas éadicionada à coluna
moléculas de proteínas são separadas por tamanho; as
moléculas maiores aparecem nas 1as frações
caracelli-zukerman
Cromatografia filtração em gelCromatografia filtração em gel
caracelli-zukerman
• Separa proteínas por suas especificidades de ligação
CromatografiaCromatografia de de afinidadeafinidade
mistura de proteínas
proteproteíína de interessena de interesse
liganteligante
mistura de proteínas é adicionada à coluna
contendo polímeros com ligantes específicos para
a proteína de interesse
proteínas não-desejadasdeixam a coluna
proteína de interessedeixa coluna com
a solução de ligantes
solução de ligante
caracelli-zukerman
CromatografiaCromatografia de de afinidadeafinidade
caracelli-zukerman
Purificação de uma enzima hipotéticaPurificação de uma enzima hipotética
150004500036cromatografia de afinidadecromatografia de afinidade
6006000010080cromatografia de gel filtração cromatografia de gel filtração
2008000040090cromatografia de troca iônicacromatografia de troca iônica
32960003000280precipitação com sulfato de amônio precipitação com sulfato de amônio
10100 000100001400extrato celular brutoextrato celular bruto
atividade especifica (unidades/mg)
atividade
(unidades)
proteína total
(mg)
volume (mL)etapaetapa
caracelli-zukerman
A280 02520025852000252000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Fraction
#
A280
Fraction #
Peaks
perfil de perfil de eluiçãoeluição
Purificação Purificação
coletor de coletor de frações frações
fração nfração núúmero mero
fração nfração núúmero mero
picos picos
caracelli-zukerman
extraçãoextração
proteína purificadaproteína purificada
isolamento
purificaçãoQUANTIFICAÇÃOMétodos de quantificação de proteína.
CONTROLE DA PUREZAMétodos de controle da pureza.
Eletroforese
ATIVIDADEEnsaios enzimáticos e fatores que
governam a atividade catalítica.
caracelli-zukerman
controle da pureza
caracelli-zukerman
Eletroforese: SDSEletroforese: SDS--PAGEPAGE
• proteínas migram de acordo com tamanho e forma
• a proteina édenaturada, as subunidades se separam
catodocatodo
anodo anodo
popoçço o
diredireçção de ão de migramigraçção ão
Amostra Amostra
caracelli-zukerman
Eletroforese: SDSEletroforese: SDS--PAGEPAGE
Amostra Amostra
diredireçção de ão de migramigraçção ão
mistura de macromoléculas
gel porosogel poroso
eletroforese eletroforese
caracelli-zukerman
CoomassieCoomassie blueblue
Eletroforese: coranteEletroforese: corante
4 4 subunidadessubunidades
caracelli-zukerman
Eletroforese: curva de calibração Eletroforese: curva de calibração
caracelli-zukerman
• para determinar pI da proteína
• utiliza anfolitospara obter um gradiente de pH
• proteínas param de migrar quando pH = pI
Eletroforese: focalizaEletroforese: focalizaçção isoelão isoeléétricatrica
caracelli-zukerman
Eletroforese: focalizaEletroforese: focalizaçção isoelão isoeléétricatrica
caracelli-zukerman
Eletroforese: FocalizaEletroforese: Focalizaçção isoelão isoeléétricatrica
caracelli-zukerman
Eletroforese: FocalizaEletroforese: Focalizaçção isoelão isoeléétricatrica
caracelli-zukerman
Pontos isoelPontos isoeléétricos de algumas tricos de algumas proteinasproteinas
proteínaproteína pIpIpepsinapepsina < 1,0< 1,0
albumina de ovo albumina de ovo 4,64,6
albumina de plasma albumina de plasma sangsangüüííneoneo 4,9 4,9
ureaseurease 5,0 5,0
ββββββββ--lactoglobulinalactoglobulina 5,2 5,2
hemoglobina hemoglobina 6,8 6,8
mioglobina mioglobina 7,0 7,0
quimotripsinogquimotripsinogêênionio 9,5 9,5
citocromocitocromo C C 10,7 10,7
lisozima lisozima 11,0 11,0
caracelli-zukerman
extração
proteína purificada IC
isolamento
purificação
quantificação atividadecontrole da pureza
caracelli-zukerman
M.S.Almeida e E. Kurtenbach, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 24, jan/fev, 2002
protocolosprotocolos e e procedimentosprocedimentos
caracelli-zukerman
poolproteína pura
ativaconcentração ~ 1 mg/mL
no final no final dada purificaçãopurificação
caracelli-zukerman
proteína purificada ativaproteína purificada ativa
IC
concentração ~ 1 mg/mLbaixa quantidade
concentração ~ 10 mg/mL ou maisquantidade ~ 30 mg
caracelli-zukerman
.evaporação sob vácuo (cuidado com o tampão!!!)
.liofilização (cuidado com o tampão!!!!)
.diálise
.filtração
.centrifugação (centricon)
.eletroforese preparativa
.retenção em suportes cromatográficos
Métodos típicos para concentraçãoMétodos típicos para concentração
caracelli-zukerman
Por que a proteína cristaliza?Por que a proteína cristaliza?
• ocorre se o processo for favorável do ponto de vista da termodinâmica
• os precipitantes removem água do meio forçando as moléculas a se associarem
água
Proteína
PEG
sais
açúcares
solventes orgânicos
precipitanteprecipitante
- --
-
++
++
caracelli-zukerman
cristalizacristalizaççãoão precipitaprecipitaççãoão
solubilidadesolubilidade dada macromolmacromolééculacula
diferemdiferem emem suassuas cincinééticasticas
Métodos para cristalizaçãoMétodos para cristalização
caracelli-zukerman
cristalizacristalizaççãoão
diálise (ca. 20%)
precipitaprecipitaççãoão
MÉTODOS BÁSICOS
difusão de vapor (ca. 60%)
difusão em interface livre
batch
Métodos para cristalizaçãoMétodos para cristalização
caracelli-zukerman
DIFUSÃO DE VAPOR
graxa de vácuo
lamínula
gota (10 µl)
(proteína + precipitante)
solução precipitante (1 ml)
“processo de equilíbrio entreduas soluções através dafase de vapor em um meiofechado”
solusoluççãoão inicialinicial menosmenos concentradaconcentrada (GOTA)(GOTA)
�������� perdeperde solventesolvente volvoláátiltil �������� = = potenciaispotenciais ququíímicosmicos
solusoluççãoão inicialinicial maismais concentradaconcentrada ((RESERVATRESERVATóóRIORIO))
caracelli-zukerman
DIFUSÃO DE VAPORDIFUSÃO DE VAPOR
graxa de vácuo
lamínula
gota (10 µl)
(proteína + precipitante)
solução precipitante (1 ml)
Vres >>> Vgota ���� equilíbrio atingido����
pressão de vapor difusão de espécies voláteisgota = reservatório (água ou solvente orgânico)
“processo de equilíbrio entreduas soluções através dafase de vapor em um meiofechado”
caracelli-zukerman
“processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor num meio fechado”
"hanging drop" (gota pendurada)
"sitting drop" (gota sentada)
"sandwich drop" (gota em sanduíche)
DIFUSÃO DE VAPORDIFUSÃO DE VAPOR
caracelli-zukerman
GotaGota tradicionaltradicional: : lisozimalisozima
2µl 2µl
4µl
tampão (precipitantes)30% w/v PEG 50001 M NaCl50 mM AcetatoNa pH 4,5
lisozima (proteína)100 mg/ml50 mM AcetatoNa pH 4,5
lamínula siliconada
caracelli-zukerman
Difusão de vapor: Difusão de vapor: HangingHanging DropDrop
• largamente usado
• gota equaliza com o
reservatório
• volume da gota diminui
lentamente
• concentração da solução de
proteina aumenta
lentamente
A1 A2 A3 A4 A5 A6
B1 B2 B3 B4 B5 B6
C1 C2 C3 C4 C5 C6
D1 D2 D3 D4 D5 D6
[X]
[Y]
reservatório
gotacristaiscristais
caracelli-zukerman
Difusão de vapor: Difusão de vapor: SittingSitting DropDrop
A1 A2 A3 A4 A5 A6
B1 B2 B3 B4 B5 B6
C1 C2 C3 C4 C5 C6
D1 D2 D3 D4 D5 D6
[X]
[Y]
reservatório
caracelli-zukerman
Fases da solução de proteínaFases da solução de proteína
[Proteína]
solu
bili
dad
e
supersaturação supersaturação metaestável
subsaturada
precipitação
cristais
crescimento e nucleação crescimento e nucleação
crescimentocrescimento
barreira de nucleação barreira de nucleação
solução de proteína solução de proteína
caracelli-zukerman
Fatores que afetam o crescimento de cristaisFatores que afetam o crescimento de cristais
• força iônica *
• íons específicos (Ca2+)
• concentração da proteina *
• detergentes
• Inorganic Precipitant
• pH*
• temperatura*
• tempo
• monodispersao*
• vibrações
• pressão
• gravidade
• pureza da proteina*
• Access to water*
• ligantes
• etc....
**mais importantesmais importantes
http://www.hamptonresearch.com/
caracelli-zukerman
INFORMAINFORMAÇÇÕES SOBRE A PROTEÕES SOBRE A PROTEÍÍNANA
PRECIPITANTES
BioquímicaBioquímicaBancos de dadosBancos de dados
Banco de CristalizaçãoBanco de Cristalização
TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Experimentos iniciais de cristalização Experimentos iniciais de cristalização
caracelli-zukerman caracelli-zukerman
INFORMAÇÕES SOBRE A PROTEÍNA
PRECIPITANTES
BioquímicaBancos de dados
Banco de Cristalização
TESTES DE PRECIPITAÇÃO
EXPERIMENTOS INICIAIS DE CRISTALIZAÇÃO
Cristalização de Proteínas Cristalização de Proteínas
caracelli-zukerman
MontagemMontagem do do cristalcristal
caracelli-zukerman
ColetaColeta de Dadosde Dados
caracelli-zukerman
Difração de Raio XDifração de Raio X
caracelli-zukerman
reflexões indexadas (h,k,l)
lista de intensidades
simetria
caracelli-zukerman
Função densidade eletrônica Função densidade eletrônica
caracelli-zukerman
Resultado experimental
= o que você vê
o que você vê +
o que você pensa =
o que você obtém
Mapa de densidade eletrônicaMapa de densidade eletrônica
caracelli-zukerman
ResoluçãoResolução
caracelli-zukerman
caracelli-zukerman caracelli-zukerman