CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Iara Terra de OliveiraIara Terra de OliveiraWilian dos AnjosWilian dos Anjos

CromatografiaCromatografia

Cromatografia: grego Cromatografia: grego ‘‘chrchróómatosmatos’’= cor= cor‘‘graphiagraphia’’ = escrita= escrita

MMéétodo ftodo fíísicosico--ququíímico de mico de separaseparaççãoão

Amostra distribuAmostra distribuíída entre duas fases em contato seda entre duas fases em contato selocomovendo uma sobre a outra. locomovendo uma sobre a outra.

fase mfase móóvel vel (FM)(FM)fase estacionfase estacionáária ria (FE)(FE)

Nome: botânico russo Michael Nome: botânico russo Michael TswettTswett (1906)(1906)

primeira separaprimeira separaçção de compostos vegetaisão de compostos vegetais

⇓⇓

mmaanncchhaas s ccoolloorriiddaass

PorPoréém, nem sempre apresentam cor!m, nem sempre apresentam cor!

Os diferentes tipos de Os diferentes tipos de CromatografiaCromatografia

Papel Camada Delgada

F.M. Líquida

Planar

CG

F.M. Gasosa

CCC CLAE

F.M. Líquida

Coluna

CROMATOGRAFIA

CCCCCC

CCDCCD

Consiste na separaConsiste na separaçção de uma mistura atravão de uma mistura atravéés da s da migramigraçção de seus componentes sobre uma camada ão de seus componentes sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estaciondelgada de adsorvente (fase estacionáária) retido ria) retido sobre uma superfsobre uma superfíície plana, geralmente placas de cie plana, geralmente placas de vidro. Isso acontece devido a processos de vidro. Isso acontece devido a processos de adsoradsorçção. Apão. Apóós ocorrido o processo, a placa passa s ocorrido o processo, a placa passa a se chamar cromatograma.a se chamar cromatograma.

•• Facilidade na execuFacilidade na execuççãoão•• VersatilidadeVersatilidade•• Baixo custoBaixo custo

AdsorAdsorççãoão

Consiste em fenômenos fConsiste em fenômenos fíísicos e/ou sicos e/ou ququíímicos que fazem com que uma micos que fazem com que uma substância acumulesubstância acumule--se sobre a superfse sobre a superfíície de cie de outra. Contato/superfoutra. Contato/superfíície cie ≠≠ AAbbsorsorççãoão

•• CoordenaCoordenaçção, ligaão, ligaçções de hidrogênioões de hidrogênio•• DipoloDipolo--dipolo, Van der Waalsdipolo, Van der Waals

TTéécnica Geral da CCDcnica Geral da CCD

•• Escolha da fase estacionEscolha da fase estacionááriaria•• PreparaPreparaçção e ativaão e ativaçção das placasão das placas•• AplicaAplicaçção das amostras nas cromatoplacasão das amostras nas cromatoplacas•• SeleSeleçção da fase mão da fase móóvelvel•• PreparaPreparaçção da cubaão da cuba•• Desenvolvimento do cromatogramaDesenvolvimento do cromatograma•• RevelaRevelaçção ão •• CCáálculo do Fator de Retenlculo do Fator de Retençção (ão (RfRf))

Fases estacionFases estacionááriasrias

•• SSíílica (SiOlica (SiO22):): polaridadepolaridade

•• Alumina (AlAlumina (Al22OO33)) : : substâncias com carsubstâncias com carááter ter áácido/bcido/báásico sico

•• Celulose: Celulose: de acordo com o nde acordo com o núúmero de mero de hidroxilashidroxilas

SSíílicalica

AluminaAlumina

CeluloseCelulose

SSíílicalica•• ÉÉ um sum sóólido amorfo e branco. lido amorfo e branco. ÉÉ o adsorvente mais o adsorvente mais

usado em CCD.usado em CCD.•• preparapreparaçção : ão : 1.1. suspensão em suspensão em áágua gua 2.2. aplicaplicáá--la sobre a superfla sobre a superfíície das placas cie das placas

(Superf(Superfíícies contaminadas podem causar a mcies contaminadas podem causar a mááaderência da saderência da síílica. Geralmente limpalica. Geralmente limpa--se com acetona se com acetona para desengordurar).para desengordurar).

3. Ativa3. Ativaçção:100ão:100ººC 30min C 30min –– 1h.1h.•• CUIDADO! A aspiraCUIDADO! A aspiraçção da são da síílica causa lica causa silicose,silicose,

um tipo de inflamaum tipo de inflamaçção pulmonar crônica!ão pulmonar crônica!

AplicaAplicaçção da amostraão da amostra

•• A amostra A amostra éé aplicada na forma de soluaplicada na forma de soluçção, usando ão, usando solventes mais volsolventes mais volááteis possteis possííveis.veis.

•• AplicaAplica--se a amostra com micropipetas, microsseringas se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.ou tubos capilares.

•• CostumaCostuma--se riscar as placas para que as amostras não se riscar as placas para que as amostras não venham a se misturar durante o processo e para venham a se misturar durante o processo e para melhor visualizamelhor visualizaçção.ão.

•• ÉÉ bom que as amostras estejam a mais ou menos 2,0 cm bom que as amostras estejam a mais ou menos 2,0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto com o solvente durante o entrem em contato direto com o solvente durante o desenvolvimento do cromatograma.desenvolvimento do cromatograma.

AplicaAplicaçção com capilar em CCDão com capilar em CCD

Escolha da fase mEscolha da fase móóvelvel

•• ⇒⇒ boa separaboa separaçção da amostra!ão da amostra!•• No caso de sNo caso de síílica lica ⇒⇒ polaridade.polaridade.•• Se F.M. muito polar Se F.M. muito polar ⇒⇒ toda a amostra no toda a amostra no

topo da placatopo da placa•• Se F.M. muito apolar Se F.M. muito apolar ⇒⇒ toda a amostra na toda a amostra na

basebase

A cubaA cuba

A placa A placa éé colocada, apcolocada, apóós aplicadas as s aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a amostras, numa cuba de vidro contendo a fase mfase móóvel desejada. A cuba deve estar vel desejada. A cuba deve estar saturada com vapor de fase msaturada com vapor de fase móóvel para que vel para que o cromatograma se desenvolva o cromatograma se desenvolva regularmente. Para isso, colocaregularmente. Para isso, coloca--se papel de se papel de filtro na cuba, que ajuda na evaporafiltro na cuba, que ajuda na evaporaçção e na ão e na conseqconseqüüente saturaente saturaçção.ão.

EluiEluiçção (corrida da FM)ão (corrida da FM)

•• TTéérmino: limite de solvente atinge parte rmino: limite de solvente atinge parte superior da placa.superior da placa.

•• Não ultrapassar o limite superior da placa Não ultrapassar o limite superior da placa ⇒⇒ resultados incorretos!resultados incorretos!

•• ApApóós a eluis a eluiçção ão ⇒⇒ revelarevelaçção, se necessão, se necessáário.rio.

Desenvolvimento de Desenvolvimento de cromatogramacromatogramanuma cubanuma cuba

RevelaRevelaççãoão

Muitas substâncias são claras ou incolores. Muitas substâncias são claras ou incolores. Para identificPara identificáá--las, usalas, usa--se o processo de se o processo de revelarevelaçção, constituão, constituíída de três tipos da de três tipos principais:principais:

•• FFíísicosico•• BiolBiolóógicogico•• QuQuíímicomico

Reveladores FReveladores Fíísicossicos

•• radiaradiaçção ultravioleta para compostos ão ultravioleta para compostos fluorescentes. Ex: clorofila.fluorescentes. Ex: clorofila.

Reveladores BiolReveladores Biolóógicosgicos

•• UtilizaUtiliza--se rease reaçções enzimões enzimááticas ou ticas ou bacterianas para tornar a mancha visbacterianas para tornar a mancha visíível.vel.

•• Ex.: para testar se uma amostra contEx.: para testar se uma amostra contéém m substância substância antianti--ffúúngicangica, revela, revela--se o se o cromatogramacromatograma com esporos de fungos. Os com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos não crescerão onde houver essas substâncias.substâncias.

QuQuíímicosmicos

•• Consiste em utilizar reveladores Consiste em utilizar reveladores ququíímicos que, em contato com as micos que, em contato com as substâncias da amostra, as tornam substâncias da amostra, as tornam coloridas e viscoloridas e visííveis.veis.

Uso de diferentes tipos de Uso de diferentes tipos de reveladores qureveladores quíímicosmicos

•• AlcalAlcalóóides:ides: DragendorffDragendorff, , iodoplatinatoiodoplatinato•• FlavonFlavonóóides:ides: NPNP--PEGPEG•• SaponinasSaponinas, terpenos e ester, terpenos e esteróóides:ides: anisaldeanisaldeíídodo

sulfsulfúúricorico•• AntraquinonasAntraquinonas e e cumarinascumarinas:: vapor de amôniavapor de amônia•• FenFenóólicos, licos, saponinassaponinas e e terpenterpenóóidesides:: vapor de iodo vapor de iodo

e solue soluçção de CeSOão de CeSO44

•• Compostos fenCompostos fenóólicos:licos: FeClFeCl33

RevelaRevelaçção com NPão com NP--PEGPEG

CromatogramaCromatograma revelado com revelado com anisaldeanisaldeíídodo

CCáálculo do lculo do RfRf

•• Divide a distância Divide a distância percorrida pela amostrapercorrida pela amostrapela distância percorridapela distância percorridapelo solvente.pelo solvente.•• RfRf = da/= da/dsds

dada

dsds

CromatogramaCromatograma

AplicaAplicaççõesões

•• Determinar o nDeterminar o núúmero de componentes numa mero de componentes numa misturamistura

•• Monitorar o andamento de uma reaMonitorar o andamento de uma reaççãoão•• Estabelecer a identidade entre dois compostosEstabelecer a identidade entre dois compostos•• Essencial na separaEssencial na separaçção de misturas complexas ão de misturas complexas

como em ancomo em anáálises de alimentos, sangue, drogas, lises de alimentos, sangue, drogas, derivados de petrderivados de petróóleo e vegetais.leo e vegetais.

Desvantagens da CCDDesvantagens da CCD

•• DifDifíícil reprodutibilidadecil reprodutibilidade•• quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada •• obtenobtençção de ão de cromatoplacascromatoplacas com caractercom caracteríísticas sticas

idênticas.idênticas.

•• Baixa sensibilidadeBaixa sensibilidade•• detecdetecçção ão •• difusão da amostradifusão da amostra

•• DifDifíícil determinacil determinaçção exata do ão exata do RfRf..

SubstânciaSubstância Densidade/ Densidade/ g.mLg.mL--11

p.f/p.f/ººCC p.e./p.e./ººCC M.M/ g.molM.M/ g.mol--11 FFóórmula rmula molecularmolecular

ToxicidadeToxicidade

EtanolEtanol 0,7890,789 --114,1114,1 78,478,4 46,0746,07 CC22HH55OHOH Causa nCausa nááusea, usea, vômito e depressãovômito e depressão

ÁÁcido accido acééticotico 1,0491,049 16,716,7 118118 60,0560,05 CC22HH44OO22 Se ingerido causa Se ingerido causa vômito, diarrvômito, diarrééia e ia e

colapso circulatcolapso circulatóóriorio

DiclorometanoDiclorometano 1,3261,326 --2525 39,7539,75 84,9384,93 CHCH22ClCl22 Causa fadiga, Causa fadiga, nnááusea, irritausea, irritaçção nos ão nos

olhos e cabeolhos e cabeççaa

1,2 1,2 --dicloroetanodicloroetano 1,2571,257 --4040 8383--8484 98,9698,96 CC22HH44ClCl2 Depressão do sistema Depressão do sistema nervoso centralnervoso central

AspirinaAspirina 1,401,40 135135 -- 180,16180,16 CC99HH88OO44 NNááusea, vomito e usea, vomito e irritairritaççãoão

AcetaminofenolAcetaminofenol 1,2931,293 170,5170,5 -- 151,16151,16 CC88HH99NONO22 [Anti[Anti--ttéérmico]rmico]

CafeCafeíínana 1,231,23 238238 -- 194,19194,19 CC88HH1010NN44OO22 Estimulante do Estimulante do sistema nervoso sistema nervoso

centralcentral

Acetato de EtilaAcetato de Etila 0,9020,902 --8383 7777 88,1088,10 CC44HH88OO22 IrritaIrritaçção nos olhos, ão nos olhos, pele, nariz e pele, nariz e

garganta.garganta.

ÁÁcido cido AcetilsalicAcetilsalicíílicolico

-- 152152 -- 300,26300,26 CC1616HH1212OO66 [Anti[Anti--ttéérmico]rmico]

MetanolMetanol 0,78660,7866 --97,897,8 64,764,7 32,0432,04 CHCH44OO Dermatite, dor de Dermatite, dor de cabecabeçça, na, nááusea, usea,

vômitos, anorexiavômitos, anorexia

BibliografiaBibliografia•• COLLINS, Carol H. et al, introduCOLLINS, Carol H. et al, introduçção a mão a méétodos todos

cromatogrcromatográáficos, 6ficos, 6ªª ed, ed. Unicamp,Campinas,1995.ed, ed. Unicamp,Campinas,1995.•• DEGANI, Ana Luiza et al,cromatografia, um breve ensaio. DEGANI, Ana Luiza et al,cromatografia, um breve ensaio.

QuQuíímica nova na escola, nmica nova na escola, nºº7, p.217, p.21--25,1998.25,1998.•• THE MERCK INDEX, 13th, ed. THE MERCK INDEX, 13th, ed. MerckMerck & CO., Inc., Usa, & CO., Inc., Usa,

2001.2001.•• TOMITA, TOMITA, KoychiKoychi et al, Fet al, Fíísicosico--ququíímica geral e mica geral e

experimental II, Unesp.IQ, 2experimental II, Unesp.IQ, 2ºº semestre.semestre.•• http://labjeduardo.iq.unesp.brhttp://labjeduardo.iq.unesp.br•• http://geocities.yahoo.com.br/chemicalnet/cromatografia.http://geocities.yahoo.com.br/chemicalnet/cromatografia.

htmhtm•• http://www.pucpr.br/educahttp://www.pucpr.br/educaçção/ão/academicoacademico//paginaspessoaispaginaspessoais//

professores/professores/organicaorganica/2semestre/apostila.doc/2semestre/apostila.doc

Determinação dos Rf dos padrões

- Riscar em 4 colunas

- Transferir para uma cuba - Colocar uma folha de papel de filtro - Colocar em 3 tubos de ensaio - Deixar saturar - Adicionar 5 mL de etanol/diclorometano 1:1

- Dissolver [banho-maria] - Ativar em estufa a 110ºC por 10 min - Retirar 1,0 mL de cada solução - Misturar num outro tubo - Aplicar cada solução no centro de cada coluna (a 2 cm da base)

- Colocar dentro da cuba - Esperar a fase móvel atingir o limite traçado - Revelar com UV - Revelar numa cuba com vapores de iodo

1,2-dicloroetano/acetato

de etila (12:1)

Cuba saturada

- 0,1g de cafeína - 0,1g de ácido acetilsalicílico - 0,1g de acetoaminofenol

Soluções-padrão Mistura de referência

Placa aplicada

Placa ativada

Cálculo dos fatores de retenção dos padrões

Cromatograma padrão revelado

Cromatograma padrão

Placa riscada

Placa de sílica

Análise de Analgésicos

- Triturar - Transferir para 3 béqueres de 10 mL - Adicionar 5 mL de etanol/diclorometano 1:1 - Dissolver [banho-maria] - Aplicar cada solução em cada coluna da placa juntamente com a MISTURA PADRÃO - Eluir na cuba - Revelar em UV e em iodo - Medir Rf

Determinação das amostras

Cromatograma revelado

Cromatograma

Placa aplicada

Soluções das amostras

3 comprimidos (Amostras)