Assimilação de nitrogênio:N2, NO3

- e NH4+

Objetivos:

• Identificação das formas de N que efetivamente entram no sistema vegetal.

• Reconhecimento das enzimas chaves dos processos de fixação e assimilação de N nas plantas.

• Formas de mobilização de N entre os tecidos.

• Mecanismos de controle do processo.

N2

NO2-NO3

-

NH3/NH4+

KEGG PATHWAY DatabaseKEGG PATHWAY Databasehttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.htmlhttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html

NO2-

nitriteNO3

-nitrate

N2

NO2-

nitriteNO3

-nitrate

NH3/NH4+

KEGG PATHWAY DatabaseKEGG PATHWAY Databasehttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.htmlhttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html

Anabaena

Shinorhizobium

Arabidopsis

Oryza

Demaisorganismos?

Bacteria Planta

Formas de entrada no metabolismo de plantas

N2

NH3/NH4+

NO2-

nitriteNO3

-nitrate

Formas de entrada no metabolismo de animais

Homo sapiens

trigo

trigo

trigo

gramado

phere

Crust

Nitrogênio; formas e estados de oxidaçãoÚTEIS?????

+5Ácido nítrico, íon nitratoHNO3, NO3-

+4Dióxido de nitrogênioNO2

+3Ácido nitroso, íon nitritoHNO2, NO2-

+2Óxido nítricoNO

+1Óxido nitrosoN2O0Nitrogênio molecularN2

-1HidroxilaminaNH2OH

-2HidrazinaN2H4

-3Ammonia, ion amônioNH3, NH4+

Nível de Oxidação

NomeEspécies

Tamanho dos reservatórios globais de NitrogênioÚTEIS?????

95.61.6 x 1017Mantle and Core 0.21-2.4 0.35 - 4.0 x 1015Solos e Sedimentos 0.78-8.4 0.13 - 1.4 x 1016Crosta

97.71.636 x 1017Geosfera2.33.86 x 1015Atmosfera 0.0142.3 x 1013Hidrosfera 0.00022.8 x 1011Biosfera

% do TotalMetric TonsReservatório/Tipo de

Ciclo do nitrogênio

nitrificação

nitrificação

8%

90% fixaçãobiológica:LIVRES E SIMBIONTES

2% reações fotoquímicas%: fixação natural

Interaçõesessenciais…

Azolla : Anabaena (ciano)

Patógenos Simbiontes vs nutrição

videira : Xylella

feijão : Rhizobium

soja : Bradirhizobium

raíz : micorriza

tomate : nemátodo

tomate : Cladosporium

tomate : Pseudomonas

FIXAÇÂOBIOLÓGICA DE NITROGÊNIO!

Azolla : Anabaena (ciano)

-bact + bact

Gunnera : Nostoc

cana : Acetobacter

Anabaena(arroz)Anaerobiose

NostocAnaerobiose

soja : BradirhizobiumAnaerobiose

Organismos fixadores de N2

• Fixadores de vida livre – Eubacteria

(cianobactérias)– Archaebacteria

• Fixadores em associação com plantas (ou livre)– cooperação metabólica

• N e C

– Eubacteria • cianobactérias• alfa-proteobactérias dos

grupos Rhizobiales e Rhodospirillales

Distribuição filogenética das bactériasfixadoras de N2 (Buchanan, 2000).

Fixadores em associação com plantas

Azolla : Anabaena Glicine : Bradyrhizobium

Simbiose extracelular Simbiose intracelular

Nódulos em Sesbania

Glicine : Bradyrhizobium

Nosso objeto de estudo

Simbiose intracelularRhizobium

Ciclo do Nitrogênio

[N2 + 16 ATP + 8e- + 8H+→2NH3 + 16 ADP + 16 Pi + H2]NITROGENASE

Ex: moléculas com N em plantas

nitrificaçãodesnitrificação

Fixação do N2 atmosférico

• O N disponível para plantas > 90% provém da fixação biológica > ~80% gerado por associações simbióticas.

• A forma atmosférica N≡N não está disponível para a maioria dos organismos.

• Quebra da tripla ligação envolve alto gasto energético. [16 ATP ]

• Atividade da nitrogenase é inibida pela presença de oxigênio.

• Evolução de processos simbióticos (interação eucarioto-procarioto).

N≡N

• Fertilização química• Processo de Haber-Bosch

– 1913, os trabalhos de Fritz Haber e Carl Bosch na Alemanha permitiram a síntese química de amônia (NH3).

– Produção anual de 80x1012g/ano

- quebra da tripla ligação

Fixação industrial

N≡N

Um grupo singular... Alpha-proteobacteria

Mesorhizobium

Sinorhizobium

Rhizobium

Árvore filogenética dasalfa-proteobactériasestimada pela comparaçãoda seqüência do 16S RNA

patógenos

RhizobiumSinorhizobiumMesorhizobiumBradyrhizobium

Bradyrhizobium

Associaçãosimbióticaformadorade nódulos

Simbiose intracelular:formação de nódulos

• Como se inicia o processo?• Que respostas são

produzidas nas plantas?• Quais são os genes

envolvidos?• Onde estão os genes de

fixação de nitrogênio?• Quais são os sinalizadores?

Nódulo > Medicago : Sinorhizobium

Como se inicia o processo?1. Raízes liberam substâncias: flavonóides, betaína que são reconhecidos pelo produto do gene NodD na bactériaque induz a expressão dosgenes Nod que irão sintetizar fatores Nod.

2. Bactérias liberam os“fatores” Nod: oligossacarídeos de lipoquitina(particularidades entre diferentes interações)

3. As raízes receptam os fatores Nod, com lectinas e apresentam alteraçãono fluxo iônico, expressam asnodulinas, são infectadas, e seguemo programa para a morfogênesedo nódulo.

Fatores Nod

1

2enzimas

3 Receptor?

oligossacarídeos de lipoquitina

Flutuações de Cálcio nos pelos radicularesquando expostos aos Fatores Nod.

Alterações provavelmente devidasa influência sobre

os canais ou bombas de Ca2+...

...inicia-se a curvatura do pêlo radicular.?

simbiossomo

Nódulo meristemático (crescimentoindeterminado)•região meristemática (1)•região madura, bacteriódes (4)•região de senescência (5)•barreira para oxigênio

Nódulo cilíndrico (crescimentodeterminado)•região madura, bacteriódes (cinza)•região de senescência (preto)•barreira para oxigênio

Que respostas são induzidas na planta? Expressão de nodulinas.

Tecidos afetados pela formação do nódulo:

epiderme, cortex e periciclo Fatores Nod•ativação gênica na planta (nodulinas)•indução de divisão celular

•(18-30 hrs)

Local de formaçãodo nódulo (regiãocortical na frente

dos polosxilemáticos

Quais são os genes envolvidos?

Na planta:

Nodulinas•precoces• ENOD11• ENOD12•ENOD40•genes dim •genes sym

•tardias• leghemoglobina (Lb)•Transportadores do simbiossomo

Fator Nod induz a curvaturaNodulinas auxiliam a invasão

Nódulo ativo• Simbiossomos• Leghemoglobina• Citocromo oxidase de alta afinidade: gerador

do ATP necessário para fixação.• Células “vazias” formam barreira para o

oxigênio.

• Respiração bacteriana usa O2, e o ATP produzido é utilizado na fixação de N2 (citocromo oxidase de alta afinidade).

• A nitrogenase sempre está funcionando emcondições subótimas.

• Se ↑ O2, aumenta a respiração, e consequentemente o ATP, a fixação tambémpode aumentar (consome o ATP) .

• Se ↑ ↑ ↑ O2, a inativação da nitrogenase fazaumentar muito o ATP, a respiração é inibida, menos O2 e consumido e a nitrogenase é maisinibida…..colapso do metabolismo.

Quais são os genesenvolvidos?

Na bactéria:Expressão precoce•Genes nod, nol, noe(síntese e secreção de fatoresnod)•especificidade hospeiro

Expressão tardia•Genes nif(nitrogenase)•Genes fix(regulatórios)

Complexo enzimático da nitrogenase(Heterohexámero)

Polipeptídeo MoFe 4 subunidades (2α e 2β) totalizando 200kDaPolipeptídeo Fe 2 subunidades idênticas totalizando 68 kDa

Notrogenase: Controle da expressão gênica

nif: nitrogenase fixN: ambientemicroaeróbico (?)

↓O2

Fatores de transcrição

Via NOD

Assimilação doNH4+

Assimilação de NO3 - e NH4

+

• Absorção do solo– transportador do tipo

simporte (alta afinidade, induzida e baixa afinidade, constitutivo)

• Que vias enzimáticas são utilizadas?– NR/NiR– GS/GOGAT– GDH

• Localização nos tecidosArabidospsis mutante para transportador de nitrato.

Cofatores:FeS, siroheme

Cofatores:Mo, HemoFe, FAD

NO3- a NH4

+: duas reaçõesReações dependentes de NR e NiR ocorrem em folhas e raíze

6e-/NH4

2e-/NO2

Citoplasma de folhas e raízes•Dependendo da espécie: folha ou raíz•Dependendo da disponibilidade de NO3: extensão da expressão

↑NR ↑↑↑NiRNR regulaNiR impede aúmulo de NO2

NO2

Platídios de folhas e raízes

nia mRNA (tomate)Plântulas de cevada (exp. NO3)

– Transcricional:nitrato ↑, ritmo circadianosacarose ↑glutamina ↓luz (fitocromo) ↑

Regulação da atividade da Nitrato redutase

Fosfatase

cinase

Regulação da atividade da Nitrato redutase

– Pós-transcricional (rápida e reversível)

• fosfoliração: inativa• defosforilação: ativa

EscuroBaixo CO2

Citocinina

ABA

Gene nr

mRNAda NR

NR inativa

degradação

NR ativa

NiR ativa

Gene nir

mRNANiR

NO3- NO2- NH4+

Resumindo...

Baixo CO2escuro

-

luz

sacarose

tran

scri

cion

alpó

s-tr

ansc

rici

onal

Assimilação de NH4+

GS GOGATFolha: (cp e cit) (cp)Raiz: (cit) (plastos)

transaminação

CarbohidratosLuz

+ trans

Luz+ trans

+ atividade

CarbohidratosLuz

-Trans- atividade

Alfa-cetoglutarato

Assimilação de NH4+

GS GOGATFolha: (cp e cit) (cp)Raiz: (cit) (plastos)

X X

X

X

Interação NO3- e

metabolismo de C:

1-↑ NO3- desvia C de amido →aa

↓

↑

2- ↑luz e carbohidratos:Ativa GC-GOGAT e inibe AS para acumular N em compostos ricos em carbono: glutamina (1/4) e glutamato (a partir dos quais muitas outras rotas surgem)Baixa Energia:Acumulo de N em compostos com alta relação N/C e estável para o transporte: asparagina(2/4)

1

1

2

Translocação de esqueletos contendo N a partir das raízes pode variar entre diferentes

plantas:

Amidas: gln, asp, purinas (nódulos de alfafa, ervilha e outras espécies)

Ureídas: derivados de ácido úrico como ác. Alantóico e alantoina (feijão, soja e

vigna)Nitrato

Aminoácidos

RAÍZ

Comparação dos processos de incorporação de N ao metabolismo

Planta não nodulada Planta nodulada(feijão, soja)

Assimilação Nem raiz e folha

N translocadopreferencialmentecomo nitrato

Altos teores denitrato no solo

Assimilação Nem raiz.

N translocadoGln, Asn ou ureídes

Baixos teores deNitrato no solo

Referências bibliográficas e sítios

• Buchanan, Gruismen and Jones (2000) Capítulo 16 pg: 786-824.

• Kerbauy (2004) Capítulos 3 e 4.• Taiz (2002) Capítulos 12 pg: 260-272.• Forde (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53: 203-224.• Geurts and Bisseling (2002) The plant Cell, Supplement:

S239-S249.• Kistner and Parniske (2002) Trends in Plant Science, 7: 511-

518. • http://academic.reed.edu/biology/Nitrogen/• http://www.genome.ad.jp/kegg/metabolism.html