1

2

Disciplina: Seminário I

Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira

Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura

Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA

3

Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos

Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira

Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura

Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA

4

INTRODUÇÃO

Proteínas

Estrutural

Transporte

Enzimática

Hormonal

Imunológica

Seres vivos

5

INTRODUÇÃO

Anderson & Anderson (1982)

ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS

6

A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.

Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)

7DegradaçõesProteínas

DNATranscrição

pré-RNAmSplicing

RNAm

Tradução

Modificações

Fatores epigenéticosTemperatura

EstresseDoenças

Alimentação

Dinâmica do proteoma

WITZMANN & LI (2002)

8

OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA

Proteômica

Nível de expressão de proteínas

Modificações Pós-traducionais

Interações entre proteínas

Identificação de Biomarcadores

9

BIOMARCADORES

São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos.

Moore et al., (2007)

10

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES

Amostra

Separação

Identificação

ZHOU et al., (2005)

Coleta

Coleta

11

• Coleta de amostras:– Unicelulares (+ sincronização):

• fase do ciclo celular e condições de cultivo

– Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares

(- sincronização):• Biópsias: ≠ tipos celulares • Cultura de tecidos

– Coleta: Manual X microdissecção a laser

– Fluídos biológicos• Complexidade

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES

12

• Eletroforese Bidimensional (2D) Espectrometria de Massa (EM)

– Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos;• Quantitativos• Qualitativos

• Cromatografia líquida (CL)Espectrometria de massa (EM)

– Recuperação de ptns na forma nativa• Análises funcionais, estruturais e bioquímicas

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES

13

• Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico:

– 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica• pI

– 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE)

• Tamanho (massa molecular)

O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

14

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

(+)

(-)

pI

(menor)

M.M.

SDS-PAGEFocalização Isoelétrica

(maior)

15

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

(menor)

M.M.

SDS-PAGE

(maior)

16

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

(+)

(-)

M.M.

Revelação

• Azul brilhante de Coomassie coloidal

• Fluorescência

pI (+)(-)

Análise do gel

17

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

controle

Tratamento

Gel A

Gel B

≠

ISSAQ & VEENSTRA (2008)

18

ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)

controle

Tratamento

Cy5

Cy5

UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)

19

Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional.

Vantagens Limitações

Quantificar expressão Reprodutibilidade

Analisar modificações pós-traducionais

Tempo de execução

Avaliar várias proteínas

Não é automatizada

Proteínas de membrana

Proteínas: pI e MM extremas

20

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA

Digestão: tripsina

Espectrômetro de massas

m/z

Espectros de massasProgramas: identificar

a proteína

21

Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético.

ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Fonte de Ionização

Analisador Detector

Recipiente com baixa pressão

Amostra

Dados

22

ESPECTROMETRIA DE MASSA

• Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF)

Tempo de vôo Detector

Laser

amostra

Karas & Hillkamp (1998)

23

ESPECTROMETRIA DE MASSA

m/z

Espectros de massaspeptídeos

Programas de Análise e pesquisa em banco

de dados.

Impressão Digital de peptídeos

ProteínaBiomarcador

Espectrômetro de massa

24

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas).

peptídeos

25

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

• Fase líquida:• Solvente: alto grau de pureza

• Fase estacionária:

Troca iônicaAltamente carregada (íons + ou -)

Exclusão molecular Poros com tamanhos controlados

MATT et al. 2008

26

SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Reservatório fase móvel

Bomba de alta pressão

Registro e análise dos dados

Detector

amostra

coletor

27

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

• Métodos de detecção:

– Absorbância (UV)

– Fluorescência

– Espectrometria de massa• CLEM

proteínas

28

CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM

(ES/ES)

• Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)

m/z

Camara de colisão

MATT et al., 2008

29

ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM)

m/z

Espectros de massas

Programas de Análise e pesquisa em banco

de dados.

Sequenciamento de novo da proteína

ProteínaBiomarcador

Espectrômetro de massa(EM/EM)

30

Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance.

Vantagens Limitações

Tempo de execução Custo do equipamento

Automatização Manutenção do equipamento

Versatilidade

31

ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular

Analisar proteomas de condições distintas e identificar as

diferenças

Do particular para o geralAnalisar uma proteína e inferir suas

funções no contexto do todo

Separação de proteínas nas amostras

Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC)

fragmentação

Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação

Impressão digital de peptídeos Sequenciamento de novo

Bioinformática

PROTEINAMANN et al. 2001

32

Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um

modelo ovino de trabalho de parto

Indução de parto

Dexametasona

MS/MS

(+) Bactenecina

YOUNG et al. (2007)

0 h 28 hTrabalho de parto

33

Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa

produção de ovos

corte

poedeira

18 semanas

60 semanas

CLAP-MS/MS

Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3

(HNRPH3)

KUO et al. (2007)

(HNRPH3) (+)

34

Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos

Alta fertilidade

Baixa fertilidade

Purificação

Sequenciamento

identificação

Osteopontina

KILLIAN et al. (1993)

55 kDa; pI = 6,2

AIDA et al. (1999)

GONÇALVES et al. (2008)

sêmen

oócitos

FIV

(+)

35

Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores

• Otimização dos bancos de dados

• Detecção de proteínas em baixas concentrações;

• Automatização das técnicas;

36

Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores

• Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais;

• Seleção de animais de produção;

• Descoberta de novos princípios da fisiologia celular;

• “Metabolômica”;

37

Rodrigo V. De Oliveira

oliveirarv@rocketmail.com