UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP
PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL
Modulação da resposta inflamatória por preparações
homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na
leishmaniose experimental murina
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação
em Patologia Ambiental e Experimental da
Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
FABIANA RODRIGUES DE SANTANA
SÃO PAULO
2013
UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP
PROGRAMA DE MESTRADO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E EXPERIMENTAL
Modulação da resposta inflamatória por preparações
homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na
leishmaniose experimental murina
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação
em Patologia Ambiental e Experimental da
Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental, sob
orientação da Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin
FABIANA RODRIGUES DE SANTANA
SÃO PAULO
2013
Santana, Fabiana Rodrigues de.
Modulação da resposta inflamatória por preparações homeopática
de Timulina e Antimonium crudum na leishmaniose experimental murina /
Fabiana Rodrigues de Santana - 2013.
59 f. : il. color. + CD-ROM.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, São Paulo,
2013.
Área de Concentração: Patologia Experimental.
Orientadora: Profª. Dra. Leoni Villano Bonamin.
1. Leishmania (L) amazonensis. 2. Timulina. 3. Antimonium crudum.
4. Homeopatia. 5. Modelo experimental. I. Título. II. Bonamin, Leoni
(orientadora).
FABIANA RODRIGUES DE SANTANA
Modulação da resposta inflamatória por preparações
homeopáticas de Timulina e Antimonium crudum na
leishmaniose experimental murina
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação
em Patologia Ambiental e Experimental da
Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________ ___/___/___/
Professora Dra. Leoni Villano Bonamin
_________________________________________________ ___/___/___/
Professora Dra. Cidéli Coelho
_________________________________________________ ___/___/___/
Professora Dra. Anete Lallo
DEDICATÓRIA
À minha família, pela dedicação excepcional e apoio em todos os momentos.
Aos meus pais, Esperança e João, e à minha irmã Carla, a minha base.
À minha tia Lourdes e à minha prima Priscila, pelo auxílio em tudo.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Prof. Dra. Leoni Villano Bonamin, pela oportunidade e ricos
ensinamentos como profissional e ser humano.
À Prof. Dra. Elisabeth Cristina Perez Hurtado, pelo aprendizado e dedicação com as
técnicas de citometria de fluxo no Laboratório de Imunologia da Unifesp.
À Prof. Dra. Márcia Dalastra Laurenti, pela oportunidade de estágio no Laboratório de
Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50) do Departamento de Patologia da FMUSP,
contribuindo com seu amplo conhecimento na área de leishmanioses.
À Universidade Paulista, por colocar à disposição o laboratório e apoio financeiro
fornecido pela CAPES-PROSPUP em todo o período do mestrado, além de apoio financeiro
da Fapesp.
Aos funcionários do laboratório de Biologia Molecular da UNIP, pelo incondicional
apoio e amizade: Ph. D. Fabiana Toshie de Camargo Konno, Suzana Bezerra e Cleide
Santana. Aos funcionários do biotério, Wilton Pereira dos Santos, Michelle Sanchez e
Claudemir Duran. Além dos funcionários de limpeza e portaria, especialmente à Marlene
Maria de Jesus.
Aos colegas do curso de mestrado: Renata Iovine, Tatiana Paixão, Ana Lúcia
Aldrovandi, Maria Flávia Guerra e Andreza Santos. À Cidéli Coelho, pela colaboração neste
projeto. Enfim, a todos os que auxiliaram de alguma maneira o meu aprendizado profissional
e pessoal.
RESUMO
A leishmaniose é uma zoonose causada por protozoários intracelulares do sistema
fagocítico mononuclear. A modulação da atividade dessas células pode impactar a relação
hospedeiro/parasita e o prognóstico da doença. O presente trabalho avaliou a atividade dos
medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH na infecção
experimental por Leishmania (L.) amazonensis. Camundongos Balb/c, machos, foram
inoculados com 2x106 promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no coxim plantar e,
após 60 dias, foi feita a análise de citometria de fluxo das células do lavado peritoneal e do
baço, além da colheita da pata com lesão, do linfonodo local e do baço, para análise
histológica. Camundongos tratados com Timulina 5 cH apresentaram aumento de células B-1
no peritôneo e baço (X2, p=0.0001). Além disso, observando-se as lesões plantares coradas
pelo método Giemsa, a quantidade de formas amastigotas diminuiu nos animais tratados com
Timulina 5 cH. No grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH houve redução da resposta
inflamatória local, evidenciada histologicamente, sem alteração no número de parasitas na
lesão. A imuno-histoquímica seguida de histometria do coxim plantar evidenciou redução de
células CD3+, C45RA+ e CD11b+ nesses animais. Portanto, os medicamentos homeopáticos
Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH alteram o perfil de células inflamatórias
envolvidas na resposta cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita
por mecanismos distintos, ora modulando a resposta imune, ora reduzindo a inflamação local
e os sintomas da doença.
Palavras-chave: Leishmania (L.) amazonensis, Timulina, Antimonium crudum, homeopatia,
modelo experimental.
ABSTRACT
Leishmaniasis is a zoonosis caused by an intracellular protozoan that invades the
mononuclear phagocytic system, modulating the activity of these cells, causing impact in the
host/parasite relation and in disease prognosis. This study evaluated the activity of
homeopathic medicines Thymulin 5 cH and Antimonium crudum 30 cH on Leishmania (L.)
amazonensis experimental infection. Balb/c mice were inoculated with 2x106 promastigotes
of Leishmania (L.) amazonensis in the footpad and after 60 days. A flow cytometric analysis
of peritoneal fluid and spleen was made. The footpad with injury, the local lymph node and
the spleen were harvested for histological analysis. Thymulin 5 cH-treated mice showed
increased B-1 cells in the peritoneum and spleen (X2, p=0.0001). Furthermore, observing the
plantar lesions stained with Giemsa, the number of amastigotes in treated animals decreased
after Thymulin 5 cH treatment. The treatment with Antimonium crudum 30 cH reduced local
inflammatory response, as evidenced histologically, and no change in the parasite number of
local lesion. Immunohistochemistry followed by histometry the footpad showed reduction of
CD3+, C45RA+ and CD11b+ these animals. Therefore, homeopathic Thymulin 5 cH and
Antimonium crudum 30 cH alter the inflammatory cells profile involved in the cutaneous
response to Leishmania sp., modulating the host/parasite relation by different mechanisms,
either by increasing the immune response against the parasite, or reducing local inflammation
and disease symptoms.
Keywords: Leishmania (L.) amazonensis, Thymulin, Antimonium crudum, homeopathy,
experimental model.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica ...................................................... 24
Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com
hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.)
amazonensis. Objetiva de 10X. ................................................................................................ 40
Quadro 3 - Fotomicrografias evidenciando macrófagos com citoplasma vacuolizado marcados
com anti-CD11b, após 60 dias de inoculação de Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva
10X. .......................................................................................................................................... 44
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo 7.6.5 para demonstração dos
diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de fluxo. Na
figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população celular do baço,
definida em dois gates distintos denominados “linfócitos” e “linfócitos ativados”. Essas
populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com Leishmania (L.)
amazonensis. ............................................................................................................................. 27
Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de inoculação
com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium crudum 30 cH .......... 28
Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ®), mensurado a
cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no período total de 60
dias. ........................................................................................................................................... 29
Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por citometria de
fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos camundongos com
Leishmania (L.) amazonensis. .................................................................................................. 32
Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de
fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos camundongos com
Leishmania (L.) amazonensis.. ................................................................................................. 32
Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate ¨linfócitos
ativados¨, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de
inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. .......................................... 33
Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por citometria de
fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos camundongos com
Leishmania (L.) amazonensis. .................................................................................................. 33
Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de “linfócitos
ativados” avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de
inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. .......................................... 34
Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço, avaliadas
por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em
camundongos. ........................................................................................................................... 34
Figura 10 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................................... 35
Figura 11 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................................... 36
Figura 12 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................................... 36
Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias após
a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. ........................................ 37
Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de peritônio,
60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. ................... 37
Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão experimental
coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de camundongo tratado
com Timulina 5 cH. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por campo,
analisadas pelo software Image J. ............................................................................................ 38
Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo
adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de Giemsa
(seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas amastigotas por
campo, analisadas pelo software Image J. ................................................................................ 39
Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de
inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do grupo
tratado com Antimonium crudum 30 cH. Na figura B verifica-se o folículo no linfonodo,
dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina 5 cH:
CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo tratado com
Timulina 5 cH. .......................................................................................................................... 41
Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T
positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com
Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Na figura A pata de animal do grupo controle. 42
Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos B
positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com
Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X. Em A pata de animal do grupo tratado com
Timulina 5 cH. .......................................................................................................................... 43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de camundongos
provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares foram caracterizados
fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram compensados para 10.000
eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 cH, A=Antimonium crudum 30 cH, VR: valores
de referência obtidos a partir de um ¨pool¨ de amostras provenientes de três camundongos não
tratados (controle negativo). Valores expressos como média e desvio padrão.. ...................... 31
Tabela 2 - Valores referentes à média e desvio padrão (SD) de células positivas por campo
(pata) e escore (linfonodo e baço) (n=10 por grupo). C=Controle, T=Timulina 5 cH e
A=Antimonium crudum 30 cH, VR= valores de referência de total de células positivas por
campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=3 por grupo) de camundongos não tratados
(controle negativo +PBS). Os traçados indicam que a análise correspondente não foi
possível. .................................................................................................................................... 45
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 12
1. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 14
2. ARTIGO .......................................................................................................................... 19
2.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 20
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 21
2.2.1. Animais ............................................................................................................... 21
2.2.2. Preparação dos medicamentos ............................................................................ 22
2.2.3. Tratamento .......................................................................................................... 22
2.2.4. Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões ............... 23
2.2.5. Histopatológico ................................................................................................... 23
2.2.6. Imuno-histoquímica ............................................................................................ 23
2.2.7. Histometria ......................................................................................................... 25
2.2.8. Citometria de fluxo ............................................................................................. 25
2.2.9. Bioética e conflito de interesses ......................................................................... 27
2.3. RESULTADOS ......................................................................................................... 28
2.3.1. Macroscopia........................................................................................................ 28
2.3.2. Citometria ........................................................................................................... 29
2.3.3. Histometria e imuno-histoquímica ..................................................................... 38
2.4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ................................................................................ 46
2.5. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51
3. ANEXO ............................................................................................................................ 58
12
INTRODUÇÃO
13
INTRODUÇÃO
A leishmaniose é uma zoonose presente em diversos países. As áreas endêmicas são
divididas em Velho Mundo, que compreende África, Ásia e Europa, e Novo Mundo,
pertencente às Américas (GENARO, 2005).
Neste trabalho usou-se um modelo experimental de Leishmania sp. frente a tratamento
homeopático com enfoque na resposta imunológica e efeitos clínicos, sugerindo alternativas
para o tratamento da doença.
A leishmaniose no Brasil é um sério problema de saúde pública, em decorrência da
polêmica sobre a eutanásia de animais soropositivos e o tratamento não autorizado com
medicamentos convencionais preconizados pelos órgãos federais, como Ministério da Saúde e
Conselho Federal de Medicina Veterinária.
Além do mais, a terapêutica convencional de leishmaniose, principalmente com o uso
do Antimonial Pentavalente (Glucantime®), apresenta resistência na cura das lesões, como em
pacientes acometidos com leishmaniose cutânea difusa por Leishmania (L.) amazonensis.
Esses pacientes desenvolvem resposta imunológica anérgica, não apresentando melhora
clínica (GENARO et al., 2005; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007; SILVEIRA et al., 2009;
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).
Cresce o uso de tratamentos de medicina complementar que auxiliam de maneira
adicional o paciente em diferentes enfermidades. Uma dessas opções é a homeopatia,
preconizada por Hahnemann desde 1796 (ADLER et al., 1996; TEIXEIRA, 2006). Sua
eficácia em diferentes situações clínicas e experimentais tem sido demonstrada ao longo dos
últimos anos, com diversos trabalhos publicados na área da medicina, medicina veterinária e
agricultura (PEREIRA et al., 2005; MERLINO et al., 2007; BONAMIN, 2008; RODRIGUES
DE ALMEIDA, et al., 2008; KASSAB et al., 2009; SMIT et al., 2009; RETTAGLIATI et al.,
2012; SATO et al. 2012).
Em face de tais problemas e potenciais alternativas, o presente estudo analisou a
influência dos medicamentos homeopáticos com relação à resposta imunológica, avaliando o
recrutamento celular e as características das lesões histopatológicas na infecção experimental
por leishmaniose murina.
14
1. REVISÃO DE LITERATURA
15
1. REVISÃO DE LITERATURA
As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças
inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por
protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2007).
A classificação taxonômica, o parasito pertence ao gênero Leishmania, ordem
Kinetoplastida, família Trypanossomatidae. Os hospedeiros vertebrados incluem grande
variedade de mamíferos, sendo as infecções mais comuns nos roedores, canídeos e no
homem. Como hospedeiros invertebrados, são identificadas exclusivamente fêmeas de insetos
hematófagos conhecidos como flebotomíneos, ordem Diptera, família Psychodidae,
subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia (MICHALICK, 2005; GENARO et al., 2005).
Na ocorrência de leishmaniose cutânea, Brasil, Colômbia, Peru, Bolívia e Nicarágua
estão entre os 12 países do mundo que concentram 90% dos casos. Estima-se que ocorram
cerca de 1,5 milhões de casos novos a cada ano (WHO, 2012).
Ao analisar a evolução da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil,
observa-se sua expansão geográfica, sendo que no início da década de 80 foram registrados
casos autóctones em 19 unidades federativas e, no ano de 2003, foi confirmada autoctonia em
todas as unidades federativas do país. No período de 1991 a 2010, a LTA apresentou média
anual de 27.374 casos registrados e coeficiente de detecção médio de 16,4 casos por 100 mil
habitantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).
Uma das espécies causadoras da LTA é a Leishmania (L.) amazonensis, que apresenta
duas formas clínicas denominadas leishmaniose cutânea e leishmaniose cutânea difusa. A
leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou múltiplas confinadas
na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa ocorre infecção
confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação (GENARO et al.,
2005). Adicionalmente, há registros de felinos e cães domésticos como portadores (SOUZA et
al., 2005; TOLEZANO et al., 2007).
No contexto da resposta imune, a Leishmania (L.) amazonensis induz uma resposta
imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008). Em camundongos Balb/c com deficiência da
atividade do sistema complemento, no local da inoculação, há diminuição da resposta
16
inflamatória e aumento de carga parasitária na fase aguda, evidenciando o papel do
complemento no controle da propagação do parasita (LAURENTI et al., 2004). Em estudo in
vitro, com co-culturas de macrófagos infectados com Leishmania (L.) amazonensis murina e
neutrófilos, houve a destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Em outro
experimento com L (L.) amazonensis observou-se a participação de células B e anticorpos na
infecção experimental. Comparando duas linhagens de camundongos, houve aumento na
titulação de anticorpos mais evidente em camundongo Balb/c em relação ao C3H.
Adicionalmente, a severidade da doença parasitária foi significativamente reduzida na
ausência de células B em camundongo JhD, este apresentando lesões cutâneas menores
(WANASEN et al., 2008). Na análise, avaliando os subtipos de células B, durante a infecção
experimental por Leishmania major, os camundongos Balb/c demonstraram aumento
significativo de populações de células B CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo
que as células B-1 seriam ativadas em animais parasitados (BABAI et al., 1999).
Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no
local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imunodeficientes (SCID)
demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T
durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000).
Em relação à suscetibilidade e resistência do hospedeiro, na estimulação CD4+ do tipo
Th1 há produção de IL-2, IL-12, INF-γ e TNF-α para promover a ativação do macrófago e a
eliminação do parasita. No caso de estimulação Th2, as citocinas envolvidas são IL-4, IL-5,
IL-10 e IL-13, inibindo a ativação do macrófago e contribuindo para a sobrevivência do
parasita (ABBAS et al., 2011). Contudo, a competência imunogênica se distingue nas
diferentes espécies causadoras de Leishmaniose Tegumentar Americana, como Leishmania
(L.) amazonensis e Leishmania (V.) braziliensis, apresentando características de perfil
imunológico e sintomas clínicos em humanos diferentemente. Tem-se como exemplo a
característica de hipossensibilidade de células T na infecção por Leishmania (L.) amazonensis
em casos de leishmaniose cutânea difusa anérgica (SILVEIRA et al., 2009). Além disso, os
linfócitos CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma
resposta imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007;
SANABRIA et al. 2007).
A homeopatia é considerada alternativa eficiente e segura ao tratamento de doenças
crônicas, aumentando a eficácia clínica quanto à qualidade de vida, diminuindo os custos e os
17
efeitos colaterais da terapêutica farmacológica convencional (TEIXEIRA, 2006). Os
medicamentos homeopáticos são preparados em doses infinitesimais e dinamizados (ADLER
et al., 1996), sendo aplicados para enfermidades parasitárias, virais, neoplásicas,
psicocomportamentais, entre outras (ULLMAN, 2003; PEREIRA et al., 2005; PILKINGTON
et al., 2005; SUNILA et al.; 2007; KASSAB et al., 2009; FERRAZ et al., 2011; SIQUEIRA
et al., 2013).
Como matéria-prima de produtos homeopáticos utilizam-se substâncias
imunomoduladoras, visando à recuperação do equilíbrio do sistema imunológico, além de
garantir a proteção do indivíduo contra vários agentes de diferentes origens (GARRITANO,
2007). Entre esses produtos, há a Timulina. A ação da Timulina no sistema imune é bem
ampla, em várias espécies. Em aves, observam-se aumento da citotoxicidade de células
Natural Killer (MERLINO et al., 2001) e da analgesia (KANAAN et al., 2002; SAFIEH-
GARABEDIAN et al., 2002; DARDENNE et al., 2006). Além disso, quando em preparações
homeopáticas na potência 5 cH, a Timulina melhora significativamente os índices
zootécnicos, potencializando a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite
viral na semana pré-abate em frangos de corte (SATO et al., 2012).
O princípio de “semelhante cura semelhante” é entendido como a intercorrelação entre
os sintomas manifestados espontaneamente por um paciente e os sintomas provocados por
uma substância de acordo com seus aspectos toxicológicos e patogenéticos (BONAMIN,
2008). Baseado nesse conceito da homeopatia, o Antimonium crudum ocasiona em indivíduo
sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros
(DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita em portadores de Leishmania sp.,
assume-se que a aplicação do princípio de similitude seja estratégia possível para o tratamento
da enfermidade.
São poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de infecções
parasitárias com homeopatia. Contudo, em estudos anteriores, o efeito de medicamentos
homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico em camundongos com infecção
com Trypanosoma cruzi. Nesse caso, o tratamento com Phosphorus gerou aumento no
número de monócitos no 42º dia pós-infecção e ausência de mortes (RODRIGUES DE
ALMEIDA et al., 2008). Em relato de caso, o uso do medicamento homeopático Zincum
Iodatum utilizado em cão portador de Leishmania sp. resultou em melhora clínica
(RETTAGLIATI et al., 2012).
18
O objetivo deste estudo é analisar os mecanismos imunomoduladores da Timulina 5
cH e do Antimonium crudum 30 cH na infecção experimental de camundongos Balb/c com
Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares capazes de
identificar linfócitos e os subtipos como célula B-1 e fagócitos.
19
2. ARTIGO
20
2. ARTIGO
2.1. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são consideradas grande problema de saúde pública, sendo doenças
inflamatórias crônicas da pele, das membranas mucosas ou das vísceras, causadas por
protozoários do sistema fagocítico mononuclear (KUMAR et al, 2005, MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2007). Uma das espécies causadoras da doença cutânea é a Leishmania (L.)
amazonensis. A leishmaniose cutânea caracteriza-se pela formação de úlceras únicas ou
múltiplas confinadas na derme, com a epiderme ulcerada. Na leishmaniose cutânea difusa
ocorre infecção confinada na derme, formando nódulos não ulcerados e disseminação
(GENARO et al., 2005).
Baseando-se no princípio da similitude, o Antimonium crudum ocasiona em paciente
sadio fraqueza, erupções crostosas, espessas e duras na pele, onicogrifose, entre outros
(DUJANY, 1995). Sendo essa sintomatologia descrita também em portadores de Leishmania
sp., assume-se que a aplicação da homeopatia seja estratégia possível para o tratamento da
enfermidade, embora sejam poucos os estudos descritos na literatura sobre o tratamento de
infecções parasitárias com homeopatia. Em estudos anteriores, o efeito de medicamentos
homeopáticos em doenças parasitárias mostrou-se benéfico clinicamente, tanto em
camundongos portadores de infecção por Trypanosoma cruzi (RODRIGUES DE ALMEIDA
et al., 2008) quanto em um cão tratado portador de Leishmania sp. tratado com Zincum
Iodatum dinamizado (RETTAGLIATI et al., 2012).
Outra possível abordagem homeopática para o tratamento da leishmaniose
experimental murina é o uso de substâncias endógenas imunomoduladoras dinamizadas, como
a timulina. Estudos anteriores demonstram que, quando em preparações homeopáticas na
potência 5 cH, a timulina melhora significativamente os índices zootécnicos, potencializando
a resposta linfoide esplênica e reduzindo a incidência de artrite viral na semana pré-abate em
frangos de corte (SATO et al., 2012). Da mesma forma, a timulina 5cH também foi capaz de
reduzir a infecção murina experimental com BCG, por modular a atividade de linfócitos e
fagócitos (BONAMIN et al., 2013).
A escolha de tais medicamentos como possíveis agentes imunorreguladores na
infecção por Leishmania (L.) amazonensis tem como respaldo o fato desta induzir resposta
21
imune inata e adquirida (PEREIRA et al., 2008), em que se observa o papel do sistema
complemento (LAURENTI et al., 2004), bem como de fagócitos (macrófagos e neutrófilos),
na destruição de formas amastigotas (CARMO et al., 2010). Sabe-se que a severidade da
doença parasitária é significativamente reduzida em camundongo JhD, este deficiente em
células B e anticorpos, apresentam lesões cutâneas menores (WANASEN et al., 2008).
Avaliando os subtipos de células B, durante a infecção experimental por Leishmania major,
os camundongos Balb/c demonstraram aumento significativo de populações de células B
CD5+ e altos níveis de anticorpos naturais, sugerindo que as células B-1 seriam ativadas em
animais parasitados (BABAI et al., 1999).
Na leishmaniose cutânea há o desenvolvimento de nódulos seguidos por ulcerações no
local da infecção. Experimentos relatam que camundongos imuno-deficientes (SCID)
demonstraram lesões cutâneas não ulceradas, sugerindo o envolvimento de linfócitos B e T
durante a formação da ulceração (TERABE et al., 1999; TERABE et al., 2000). Por outro
lado, a infecção por Leishmania (L.) amazonensis em casos de leishmaniose cutânea difusa
anérgica é condicionada à deficiência de linfócitos T (SILVEIRA et al., 2009). Os linfócitos
CD8+ possuem mecanismos efetores por INF- γ e perforina, contribuindo para uma resposta
imune protetora contra os parasitas (COLMENARES et al., 2003; RUIZ et al., 2007;
SANABRIA et al. 2007).
O objetivo deste estudo, portanto, é analisar os mecanismos imunomoduladores da
Timulina 5 cH e do Antimonium crudum 30 cH na infecção experimental de camundongos
Balb/c com Leishmania (L.) amazonensis, tendo como ferramentas marcadores celulares
capazes de identificar linfócitos e os respectivos subtipos, como células B-1 e fagócitos.
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.2.1. Animais
Foram utilizados camundongos de linhagem Balb/c, SPF (Specific pathogen free),
machos e adultos, provenientes do Centro de Desenvolvimento para Modelos Experimentais –
Cedeme, da Unifesp, e mantidos em microisoladores (Techniplast®), no Biotério de
Experimentação Animal - SPF do Centro de Pesquisa da UNIP, onde receberam água e ração
esterilizados ad libtum, sendo mantidos em temperatura e iluminação controlados, com
22
temperatura fixada em 22±2oC, e o período de luz em 12h, das 6h30 às 18h30. O ciclo de
trocas de ar nas caixas foi fixado em 75 ciclos/hora.
2.2.2. Preparação dos medicamentos
A Timulina 5 cH foi preparada a partir da solução estoque 4 cH (Boiron Brasil), a qual
foi obtida de peptídeo sintético livre de zinco (serum thymic factor, peso molecular =
858,85), com pureza de 98.66%, segundo dados do fornecedor. O Antimonium crudum 30 cH
foi preparado a partir de matriz adquirida de farmácia homeopática credenciada pela Anvisa,
na potência 29 cH. A última diluição de ambos os medicamentos foi realizada no momento da
administração em solução hidroalcoólica 30% e sucussionada mecanicamente com o auxílio
de braço mecânico automatizado (Autic®). Os procedimentos de preparo e estocagem
seguiram as normativas descritas na Farmacopeia Homeopática Brasileira (3ª edição). A
solução controle foi feita utilizando apenas o veículo (solução hidro-alcoólica 30%),
submetido aos mesmos procedimentos de diluição e sucussão, até a potência 5 cH.
Para garantir que não houve contaminação com zinco no momento da administração
da Timulina, amostras de Timulina 5 cH e do veículo foram encaminhadas a laboratório
certificado (CBO Análises, Brasil) para mensuração da sua concentração. Não foram
encontradas quantidades significativas de zinco em nenhuma das amostras.
2.2.3. Tratamento
Os animais foram tratados diariamente com Timulina 5 cH (grupo B), Antimonium
crudum 30 cH (grupo C) ou veículo (grupo A), via água de bebida, em cego, durante 60 dias;
0.1mL da preparação A, B ou C foi misturado diariamente a 250mL de água de bebida em
garrafa estéril, de forma que a concentração teórica final de Timulina fosse 4x10-13
M.
Para o procedimento em cego, os frascos contendo Timulina 5 cH, Antimonium
crudum 30 cH e veículo foram identificados aleatoriamente com as letras A, B e C por um
funcionário do laboratório não envolvido em nenhuma etapa do processo experimental. Os
códigos foram revelados somente após a análise estatística.
23
2.2.4. Inoculação de Leishmania (L.) amazonensis e observação das lesões
A inoculação na dose de 2x106
promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis
MHOM/BR/73/M2269 foi no coxim plantar esquerdo dos camundongos Balb/c, em volume
de 50 microlitros de inóculo total. As cepas de Leishmania (L.) amazonensis foram fornecidas
pela Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - FMUSP. Os parasitas provinham
de cultura mantidos em meio RPMI (10 ml), 25ºC, suplementados com 10% de soro fetal
bovino, 1% de penicilina (100U/ml) e gentamicina (0.1mg/ml).
2.2.5. Histopatológico
Aos 60 dias após a inoculação, 10 animais de cada grupo foram eutanasiados em
câmara de CO2, necropsiados e fragmentos histológicos da lesão, do linfonodo poplíteo
ipslateral e do baço foram colhidos e fixados em paraformaldeído 8%. Os fragmentos dos
tecidos foram cortados com micrótomo, desparafinizados e corados pelo método Giemsa e
pela imuno-histoquímica.
2.2.6. Imuno-histoquímica
Para preparar os cortes histológicos para a imuno-histoquímica, todas as amostras de
tecido subcutâneo de pata esquerda, local onde foram inoculadas formas prosmatigotas de
Leishmania (L.) amazonensis, foram preparadas de forma a obter cortes de 5 microns de
tecido incluído em parafina.
Para remover a parafina, foram feitas duas lavagens de aproximadamente 2 minutos
cada, com xilol absoluto, seguidas de duas passagens em álcool absoluto por 3minutos cada.
Os cortes foram então lavados em água corrente. Para o desmascaramento antigênico por
calor úmido foi utilizado tampão citrato próprio para essa finalidade (DAKO), preparado
segundo as instruções do fornecedor. As lâminas foram incubadas em panela elétrica aquecida
a 80ºC (PANASONIC) por 30 minutos, lavadas em PBS, pH = 7.2 (SIGMA), durante 5
minutos em agitação, secas com papel fino, e as amostras de tecido foram delimitadas com
Pap-pen (AbCAM).
24
A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação das lâminas com
H2O2 5% em metanol, durante 15 minutos. Após nova lavagem com PBS, pH = 7.2 (SIGMA),
os cortes histológicos foram incubados com soro heterólogo de equino (VECTOR) durante 20
minutos, para bloqueio dos sítios inespecíficos. Os tecidos foram imediatamente tratados com
os anticorpos primários anti-IgG de rato cujas diluições, feitas em diluente próprio para
redução de fundo (DAKO), estão descritas no Quadro 1. Essa incubação foi realizada em 4oC,
durante toda noite, em câmara úmida. O controle negativo das reações foi feito pela
substituição do anticorpo primário pelo diluente.
No dia seguinte, os cortes foram lavados em PBS, pH = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos e
tratados por 30 minutos com anticorpo secundário (anti-IgG de rato) conjugado a polímero
(VECTOR). Após nova lavagem em PBS, pH = 7.2 (SIGMA) por 5 minutos, os cortes foram
incubados com DAB (DAKO) por alguns segundos. As lâminas foram lavadas em água
corrente, contracoradas com hematoxilina de Harris, lavadas novamente e montadas com
lamínula e resina (VECTOR).
As observações referentes à atribuição de escores para a análise dos cortes
histopatológicos marcados com anti-CD3, CD45RA e CD11b por imuno-histoquímica foram
feitas por dois observadores diferentes, a fim de evitar vieses de interpretação de positividade.
Quadro 1 - Marcadores utilizados na imuno-histoquímica
Marcador Célula Fabricante Alvo Clone Espécies de
origem e alvo Diluição
Anti-CD3
Linfócitos T
Serotec
CD 3
CD3 -12
Rato-
camundongo
1:40
Anti-CD11b
Fagócitos
Serotec
CD11b
M1/70.15
Rato-
camundongo
10%
Anti-CD45RA
Linfócitos B
apenas
Serotec
LCA
(proteína de
superfície)
RA3-6B2 Rato-
camundongo 0,5%
25
2.2.7. Histometria
A quantificação das células marcadas foi feita pela determinação do número de células
positivas por campo microscópico, sendo avaliados 5 campos por corte. O grau de infecção de
fagócitos corados pelo método Giemsa foi determinado por escores, sendo dois observadores
diferentes, para evitar vieses de interpretação. A proporção entre parênquima e folículo, nos
órgãos linfoides, foi determinada em pixels pelo software Image J. Por se tratar de célula
majoritária, a quantificação dos fagócitos CD11b+ no baço e linfonodo foi feita por escores
de zero a três. No coxim plantar, a incidência destas células foi avaliada de forma descritiva.
2.2.8. Citometria de fluxo
Dos camundongos eutanasiados após 60 dias de inoculação houve a retirada de lavado
peritoneal e a suspensão de células do baço. Assim, 5ml de PBS, pH = 7.2 (SIGMA),
adicionados a 1% de soro fetal bovino foi injetado na cavidade peritoneal, seguido de leve
massagem para permitir o desprendimento celular. O lavado peritoneal foi colhido usando
pipeta Pasteur de plástico, sendo transferido para tubos plásticos de Falcon imersos em gelo.
Cada tubo correspondeu ao lavado de dois animais (pool), sendo analisados três tubos por
grupo (N=6). A cavidade peritoneal foi aberta e o baço retirado, sendo macerado em solução
de PBS, pH = 7.2 (SIGMA) adicionado a 1% de soro fetal bovino para produzir uma
suspensão celular homogênea, a qual foi igualmente transferida para tubos de Falcon imersos
em gelo. Ambas as amostras (peritônio e baço) seguiram as mesmas etapas definidas a seguir.
Com os tubos de Falcon imersos em gelo, os mesmos foram centrifugados em 2000
rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em
tampão hemolítico (GIBCO®). Novamente essas células foram centrifugadas e suspensas em
PBS (GIBCO®) a 4oC. O número de células viáveis foi avaliado pelo Azul de Tripan e
contado em câmara de Neubauer modificada (HAUSSER SCIENTIFIC). Após nova
centrifugação (2000 rpm, 5 min.), as células foram suspendidas em 100µl de PBS adicionados
a 10µl de anticorpo antimouse CD16/CD32 (INVITROGEN) 1:100, para bloqueio de Fcγ II e
III, sendo incubadas a 4oC por 30 minutos. Após nova lavagem das células em PBS, as
amostras foram suspendidas em 200µl de 1% PBS/BSA e divididas igualmente em três
microtubos, um sem anticorpos, outro contendo 1% anti-CD19 PE Cy5.5, anti-CD23 FITC,
anti-CD5 PE e anti-CD11b PB (INVITROGEN) e um terceiro tubo contendo 1% anti-CD25
26
AF488, anti-CD4 PE, anti-CD19 PE Cy5.5 e anti-CD8 AF 405, sendo todos incubados por
cerca de 40 minutos a 4oC. A última centrifugação foi realizada e as células fixadas em 400µl
de paraformaldeído 1% misturados em 100µl de PBS, sendo mantidas a 4oC até o momento
da leitura em citômetro, não mais que 48h depois do processamento. No momento da leitura,
as amostras sofreram nova centrifugação, foram suspendidas em 1ml de PBS e transferidas
para tubos FACS (BD). A leitura das amostras foi feita em citômetro FACS CANTO (BD)
realizado no laboratório de Imunologia da Unifesp – São Paulo.
A análise dos dados foi feita utilizando o software Flow Jo 7.6.5. Na análise dos
dados, inicialmente o tamanho e a granulosidade das células foram selecionados para
determinar as populações celulares de linfócitos. A fluorescência obtida pelos marcadores foi
usada para estabelecer os gates de células positivas. As amostras de baço apresentaram duas
populações distintas de linfócitos, sendo uma delas de linfócitos ativados. As amostras de
lavado peritoneal apresentaram uma única população homogênea dessas células (Figura 1).
As subpopulações foram determinadas no gate de linfócitos pela expressão ou não de
CD19 PE Cy5.5 (INVITROGEN), sendo as células positivas caracterizadas como linfócitos B
e as células negativas caracterizadas como linfócitos T. A partir da população de linfócitos B,
aquelas tidas como duplo-positivas (CD19 PE Cy5.5 + e CD11b PB +) foram consideradas
como células B-1, e aquelas positivas apenas para CD19 PE Cy5.5 foram consideradas como
B-2. Para analisar as subpopulações de B-1, B-1a e B-1b, utilizou-se a expressão de CD5
como critério, sendo as positivas B-1a e as negativas B-1b. As células positivas apenas para
CD11b foram consideradas como fagócitos. A partir da população de células T (CD19 PE
Cy5.5 negativas), identificaram-se as subpopulações de células CD4+ e CD8+.
A compensação de cada fluorocromo foi realizada pela marcação simples para cada
anticorpo utilizado. A positividade e negatividade de cada marcador foram determinadas a
partir da fluorescência natural das células não expostas aos anticorpos.
A transposição de dados para análise estatística foi feita para os softwares EXCEL
2007, INSTAT 3.0 e PRISM 5.04.
27
Figura 1 - Gráfico de dispersão obtido pelo programa flow-jo 7.6.5 para demonstração
dos diferentes gates e suas populações, a partir dos procedimentos de citometria de
fluxo. Na figura 1A tem-se a população celular do peritônio, e na figura 1B a população
celular do baço, definida em dois gates distintos denominados “linfócitos” e “linfócitos
ativados”. Essas populações foram analisadas 60 dias após a infecção experimental com
Leishmania (L.) amazonensis.
2.2.9. Bioética e conflito de interesses
Este projeto foi autorizado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da Universidade Paulista
- UNIP, conforme legislação vigente de proteção aos animais, com o protocolo nº 026/11
CEP/ICS/UNIP. Não há conflitos de interesses relacionados a este trabalho de pesquisa.
A B
28
2.3. RESULTADOS
2.3.1. Macroscopia
A evolução macroscópica da lesão foi feita pela medida da espessura da pata,
utilizando um micrômetro digital (Mitutoyo ®). As medidas foram feitas antes da inoculação
e a cada 10 dias, durante 60 dias. Nesse período, os coxins já apresentavam sinais de necrose
(Figura 2).
Figura 2 - Aspecto ulcerado de lesão em pata de camundongo, após 60 dias de
inoculação com Leishmania (L.) amazonensis do animal tratado com Antimonium
crudum 30 cH
Os animais do grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH apresentaram aumento
na espessura da pata 60 dias após a inoculação do parasita (Figura 3). Dado que a análise
histológica revelou redução no número de células e maior dispersão das estruturas, atribui-se
esse efeito à evolução da lesão para edema tardio (Quadro 2).
29
Figura 3 - Diâmetro da pata (mm) utilizando micrômetro digital (Mitutoyo ®),
mensurado a cada 10 dias, após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis, no
período total de 60 dias.
2.3.2. Citometria
Análise das células do baço
As análises celulares do baço foram definidas em 2 gates, como demonstrado na
Figura 1B. Os gráficos do gate de “linfócitos” e “linfócitos ativados” foram ainda divididos
nas populações celulares de linfócitos B (CD19+), linfócitos T (CD19-) e fagócitos
(CD11b+). Apenas traços de células B-1b (CD5-) foram identificados, o que impossibilitou a
análise estatística. As amostras para a análise de citometria foram provenientes de um “pool”
de 2 animais, essas amostras foram adicionadas em um tubo de Falcon identificados de
acordo com o grupo, controle, Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH, respectivamente.
Um resumo dessa análise por fluxo de citometria foi demonstrado na tabela 1.
A análise do número médio de células e sua comparação entre os grupos (ANOVA)
não demonstraram significância estatística; contudo, os desvios de proporções entre subtipos
30
celulares mostraram haver predomínio de linfócitos B-1 em ambos os grupos experimentais
em relação ao controle (Figuras 4 a 9).
Comparando-se as populações celulares de B-1 e B-2 houve aumento de B-1 nos
grupos tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH em relação ao controle
(Figura 4); contudo, essa diferença não foi observada no gate de linfócitos ativados. Por outro
lado, os animais tratados com Timulina 5 cH apresentaram aumento da população de
fagócitos (CD11b + / CD19 -) em relação à população de linfócitos B (CD11b- / CD19+)
(Figuras 5 e 6).
A análise das populações de linfóficos T e B e suas proporções nos diferentes grupos
mostrou aumento na proporção de linfócitos B em relação aos linfócitos T nos animais
tratados com Antimonium crudum 30 cH, nos dos dois gates (linfócitos e linfócitos ativados).
Nos animais tratados com Timulina 5 cH esse aumento foi significativo apenas na população
de linfócitos ativados (Figuras 7 e 8, respectivamente). A comparação das proporções entre
células T CD4+ e CD8+ mostrou desvio para CD8+ nos animais tratados com Timulina 5 cH
(Figura 9).
31
Tabela 1 - Contagem de subtipos celulares presentes no baço e peritônio de
camundongos provenientes de diferentes grupos experimentais. Os subtipos celulares
foram caracterizados fenotipicamente por citometria de fluxo, cujos valores foram
compensados para 10.000 eventos do total. C=Controle, T=Timulina 5 cH,
A=Antimonium crudum 30 cH, VR: valores de referência obtidos a partir de um ¨pool¨
de amostras provenientes de três camundongos não tratados (controle negativo). Valores
expressos como média e desvio padrão. ANOVA.
Baço
Gate
Linfócitos
Baço
Gate
Linfócitos ativados
Peritônio
Célula C T A C T A VR C T A VR
B total Média
SD
2707,6 910,2
2466,5 520,3
2399,7 335,2
3847 719,6
4298 1357,4
4249 900,3
5197,5 101,1
6254,5 638,1
4592,3 1576,1
5366,3 853,6
4497,5 50,2
B-1 Média
SD
41,6
28,6
117,5
76,9
88,7
112,4
45
34,5
67,2
48,8
35,5
32,3
37
11,3
1703,7
1316,8
1458
1052,9
1686,3
1021,1
1323
790,5
B-1a Média
SD
11,6
18,4
53
33,5
44,5
62,8
14,6
22
36,2
26,5
14
18,6
16
0,0
16
12,6
229,6
224,1
110
182,7
396
411,5
B-1b Média
SD
traços traços Traços traços traços traços 19 9,8
1409 1054,7
1014,6 698,7
1373 708,7
866 335,1
B-2 Média
SD
1008,3
427,6
948,5
183,6
1013,5
312,7
2105,6
722,9
2452,7
1399,5
2374,2
870,2
1571
639,2
2364,2
458,2
1054
510,8
1948,3
757,5
2109,5
163,34
T total Média
SD
1204
417,7
934,6
362,6
824
285,1
1114
563,8
1190
402,4
1069
317,5
6734,5
509,82
1327
309,1
1283,3
832,8
764
324,2
5638
391,7
CD4+ Média
SD
569 162,4
499,3 151,9
446,7 81,9
446,6 198,1
585,3 284,8
611,2 149,6
1075,5 338,7
821,5 163,5
387,3 147,5
400,3 150,2
201,5 14,8
CD8+ Média
SD
363
169,5
404,6
215,5
275,2
75,3
183
115,9
229,3
151,6
231,2
91,8
433,5
111,0
153
34,3
76,3
29
102,3
44,1
107,5
13,4
Fagó-
citos
Média
SD
679
488
788
375,3
555,2
356,7
569,6
558,7
1198,2
880,1
703,2
685,6
2864
548,7
579,7
573,3
404,3
297,2
363
345,6
453,5
473,7
32
Figura 4 - Gráfico representando as populações celulares do baço, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2 após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo (p≤0.05)
na proporção de B-1 no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001) e Antimonium
crudum 30 cH (X2, p=0.0001).
Figura 5 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na
proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001).
4%
96%
Cont (baço)
B1
B2
11%
89%
Thym (baço)
B1
B2
X2, p=0.0001 rel cont
8%
92%
A crud (baço)
B1
B2
X2, p=0.0001
80%
20%
Cont (baço)
B
FAGO
76%
24%
Thym (baço)
B
FAGO
X2, p=0.0001 rel. cont
81%
19%
A crud (baço)
B
FAGO
33
Figura 6 - Gráfico representando as populações celulares do baço, no gate ¨linfócitos
ativados¨, avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60
dias de inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento
significativo na proporção de fagócitos no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2,
p=0.0001).
Figura 7 - Gráfico representando as populações celulares do baço avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na
proporção de células B em relação às células T no grupo tratado com Antimonium
crudum 30 cH, comparado ao grupo controle (X2, p=0,01).
87%
13%
Cont (ativ)
B
FAGO
78%
22%
Thym (ativ)
B
FAGO
X2, p=0.0001 rel. cont
86%
14%
A crud (ativ)
B
FAGO
31%
69%
Cont (baço)
LINF T
LINF B
27%
73%
Thym (baço)
LINF T
LINF B
26%
74%
A crudum (baço)
LINF T
LINF B
X2, p=0.001
34
Figura 8 - Gráfico representando as populações celulares do baço no gate de “linfócitos
ativados” avaliadas por citometria de fluxo, comparando células B e T após 60 dias de
inoculação dos camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Os dados apresentaram
aumento significativo da população de linfócitos B em relação aos linfócitos T, nos
grupos de animais tratados com Timulina 5 cH e com Antimonium crudum 30 cH (X2,
p=0,001).
Figura 9 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos CD4+ e CD8+ do baço,
avaliadas por citometria de fluxo, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.)
amazonensis em camundongos. Os dados apresentaram aumento significativo de células
CD8+ em relação às células CD4+ nos grupos de animais tratados com Timulina 5 cH
(Fisher, p=0,01).
61%
39%
Cont (ativ)
LINF T
LINF B
47%
53%
Thym (ativ)
LINF T
LINF B
X2, p=0.001
54%
46%
A crudum (ativ)
LINF T
LINF B
X2, p=0.001
61%
39%
Cont (baço)
CD4
CD8 55%
45%
Thym (baço)
CD4
CD8
Fisher, p=0.01
62%
38%
A crudum (baço)
CD4
CD8
35
Análise das células do peritônio
O resultado global da análise da média das populações celulares do peritônio está
expresso na Tabela 1.
Considerando-se o balanço entre as diferentes subpopulações, observa-se que os
animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH apresentam predomínio de
células B-1 peritoneais em relação às células B-2 (Figura 10), em especial células B-1a, (12 a
18%) é constatado em ambos os grupos tratados (Figura 11).
Os animais tratados com Antimonium crudum 30 cH igualmente apresentaram
predomínio de linfócitos B totais em relação aos fagócitos (Figura 12). Houve aumento de
linfócitos T no grupo tratado com Timulina 5 cH e aumento de linfócitos B no grupo tratado
com Antimonium crudum 30 cH (Figura 13). Dentre as células T, nota-se predomínio de
linfócitos CD8+ nos animais desse grupo (Figura 14).
Figura 10 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B-1 e B-2, após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na
proporção B-1/B-2 no grupo tratado com Timulina 5 cH (X2, p=0.0001) e Antimonium
crudum 30 cH (X2, p=0.0001) em relação ao controle.
42%
58%
Cont (perit)
B1
B2 58%
42%
Thym (per)
B1
B2
X2, p=0.0001 rel. cont
46%
54%
A crud (per)
B1
B2
X2, p=0.0001 rel. cont
36
Figura 11 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B-1a e B-1b após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na
proporção células B-1a (CD5+)/B-1b (CD5-) nos grupos tratados com Timulina 5 cH e
Antimonium crudum 30 cH (X2, p=0.0001).
Figura 12 - Gráfico representando as populações celulares do peritônio, avaliadas por
citometria de fluxo, comparando células B e fagócitos após 60 dias de inoculação dos
camundongos com Leishmania (L.) amazonensis. Houve aumento significativo na
proporção células B (CD19+)/fagócitos (CD11b+) no grupo tratado com Antimonium
crudum 30 cH (X2, p=0.0001).
1%
99%
B1a
B1b
Contr (perit)
18%
82%
B1a
B1b
Thym (perit)
X2, p=0,0001 rel cont
12%
88%
B1a
B1b
X2, p=0,0001 rel cont
A crudum (perit)
92%
8%
Cont (perit)
B
FAGO
92%
8%
Thym (perit)
B
FAGO
94%
6%
A crud (perit)
B
FAGO
X2, p=0.0001 rel. cont
37
Figura 13 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T e B de peritônio, 60 dias
após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos. Os dados
apresentaram aumento de linfócitos T (X2, p=0.0001) no grupo tratado com Timulina 5
cH comparado aos demais grupos. Houve aumento de linfócitos B (X2, p=0.0001) no
grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH em relação ao grupo tratado com
Timulina 5 cH e Controle.
Figura 14 - Gráfico apresentando as populações de linfócitos T CD4+ e CD8+ de
peritônio, 60 dias após a inoculação com Leishmania (L.) amazonensis em camundongos.
Os dados apresentaram aumento significativo de CD8+ em relação ao CD4+ no grupo de
animais tratados com Antimonium crudum 30 cH (Fisher, p=0,03).
82%
18%
LINF B
LINF T
Contr (perit)
78%
22%
LINF B
LINF T
Thym (perit)
X2, p=0,0001 rel cont
88%
12%
LINF B
LINF T
A crudum (perit)
X2, p=0,0001 rel cont
84%
16%
Cont (perit)
CD4
CD8 84%
16%
Thym (perit)
CD4
CD8 80%
20%
A crudum (perit)
CD4
CD8
Fisher test, p=0,03 rel controle
38
2.3.3. Histometria e imuno-histoquímica
Análise de formas amastigotas de pata e linfonodo
Na histometria foram analisadas de maneira quantitativa e semi-quantitativa a resposta
inflamatória e a carga parasitária dos fagócitos. Em relação à carga parasitária da pata,
verificou-se diminuição de formas amastigotas intracelulares dos fagócitos no grupo tratado
com Timulina 5 cH comparado aos demais grupos, avaliado 60 dias após a inoculação do
parasita (Figura 15). Dados similares foram apresentados no linfonodo poplíteo ipsilateral
(Figura 16). Não foram avaliadas formas amastigotas no baço, por causa de a Leishmania (L.)
amazonensis apresentar apenas comprometimento cutâneo.
Figura 15 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na lesão
experimental coradas pelo método de Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação, de
camundongo tratado com Timulina 5 cH. Objetiva 100X. (B) Número de formas
amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, * p=0.05.
A phago
B
39
Figura 16 - (A) Formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis no tecido adiposo
adjacente a linfonodo poplíteo, de animal do grupo controle, coradas pelo método de
Giemsa (seta), após 60 dias da inoculação. Objetiva 100X. (B) Número de formas
amastigotas por campo, analisadas pelo software Image J. ANOVA, **p<0.01,
***p<0.001.
Coloração hematoxilina/eosina
Em uma segunda análise, cortes histológicos de pata, baço e linfonodo foram corados
pelo método hematoxilina/eosina. No grupo controle, observou-se infiltrado inflamatório
predominantemente mononuclear, apresentando intensa vacuolização citoplasmática e
distribuição difusa no subcutâneo, com grande concentração de células na intersecção derme-
epiderme. Diferentemente, o grupo tratado com Timulina 5 cH apresentou células
inflamatórias vacuolizadas e organizadas em camadas no tecido subcutâneo, concentrando-se
na derme profunda. O grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH mostrou reduzido
recrutamento celular e edema subcutâneo (Quadro 2).
A phago
B
40
Quadro 2 - Fotomicrografias representando cortes histológicos de patas coradas com
hematoxilina/eosina em camundongos, após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.)
amazonensis. Objetiva de 10X.
Grupo descrição fotomicrografia
Controle Processo inflamatório difuso
com a presença de vacúolos
citoplasmáticos.
Timulina 5 cH Infiltrado inflamatório
evidente na derme profunda,
com células vacuolizadas e
organização em camadas no
tecido subcutâneo.
Antimonium
crudum 30 cH
Processo inflamatório
discreto, com evidência de
planos profundos de camada
muscular. Notar dispersão
das estruturas vasculares e
nervosas no tecido
subcutâneo (edema).
musculatura
41
Diâmetro de área folicular e total de baço e linfonodo
A razão entre a área folicular sobre a área total de linfonodo e baço foi calculada em
pixels, pelo software Image J, porém sem resultados significativos entre os grupos, conforme
Tabela 2. A figura 17 (A) representa um corte histológico de baço, sendo circundada a área de
polpa branca; em B nota-se um folículo de linfonodo e suas respectivas áreas: CG=centro
germinativo, ZM=zona do manto e região paracortical.
Figura 17 - (A) Baço e seus folículos (polpa branca) foram delimitados após 60 dias de
inoculação com Leishmania (L.) amazonensi, esta foto representa um dos animais do
grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH. Na figura B verifica-se o folículo no
linfonodo, dividido conforme suas regiões, de um animal do grupo tratado com Timulina
5 cH: CG=Centro Germinativo, ZM=Zona do Manto e PR=Paracortical do grupo
tratado com Timulina 5 cH.
A phago
B
B
42
Imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica confirmou os dados estabelecidos no Quadro 2, com
diminuição de células positivas para CD3, CD45RA e CD11b por campo nas patas dos
camundongos após 60 dias de inoculação com Leishmania (L.) amazonensis no grupo tratado
com Antimonium crudum 30 cH, conforme resultados mostrados nas figuras 18 e 19, e
Quadro 3. A contagem de macrófagos por campo não foi possível em função do número
incontável de células por campo.
Figura 18 - Imuno-histoquímica para CD3 (linfócitos T) (A), contagem de linfócitos T
positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com
Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (** p<0.01), em relação aos demais grupos.
Na figura A pata de animal do grupo controle.
A phago
B
B
43
Figura 19 - Imuno-histoquímica para CD45RA (linfócitos B) (A), contagem de linfócitos
B positivos por campo (B), na pata de camundongos após 60 dias de inoculação com
Leishmania (L.) amazonensis. Objetiva 10X (*** p<0.01, em relação aos demais grupos).
Em A pata de animal do grupo tratado com Timulina 5 cH.
A phago
B
B
44
Quadro 3 - Fotomicrografias evidenciando macrófagos com citoplasma vacuolizado
marcados com anti-CD11b. Notar o grande número dessas células na derme e junção
derme-epiderme na pata, após 60 dias de inoculação de Leishmania (L.) amazonensis.
Objetiva 10X.
Grupo descrição fotomicrografia
Controle Macrófagos apresentando
vacúolos citoplasmáticos.
Note o grande número dessas
células na derme e junção
derme-epiderme
Timulina 5 cH Macrófagos apresentando
vacúolos citoplasmáticos.
Note o grande número dessas
células na derme e junção
derme-epiderme
Antimonium
crudum 30 cH
Processo inflamatório com
poucas células positivas para
CD11b quando comparado
aos demais grupos.
Foram ainda marcados baço e linfonodo para CD3, CD45RA e CD11b por meio de
escores predeterminados, com valores de 0-3. Não houve diferença estatística entre os grupos
para todos os marcadores, de acordo com a mediana. Duas pessoas observaram a positividade
celular independentemente (Tabela 2).
musculatura
45
Tabela 2 - Valores referentes à média e desvio padrão (SD) de células positivas por
campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=10 por grupo). C=Controle, T=Timulina 5
cH e A=Antimonium crudum 30 cH, VR= valores de referência de total de células
positivas por campo (pata) e escore (linfonodo e baço) (n=3 por grupo) de camundongos
não tratados (controle negativo +PBS). Os traçados indicam que a análise
correspondente não foi possível. * ANOVA em CD3, (** p<0.01), em CD45R (***p<0.01)
indicam diminuição celular de ambos em pata. Em relação à coloração Giemsa no
linfonodo (**p<0.01 diminuição de amastigotas comparando o controle com o
Antimonium crudum 30 cH), (***p<0.001 diminuição de amastigotas entre Timulina 5
cH e Antimonium crudum 30 cH), e na pata (*p=0.05 diminuição de amastigotas no
grupo tratado com Timulina 5 cH relacionado aos demais grupos).
Me= Mediana, M=Média e SD=desvio padrão.
Baço
Linf Pata
Células C T A VR C T A VR C T A VR
CD3+ Me 1000
2000
2000
2000
1000
1000
1000
1000
M
SD
7,41
3,82
7,37
4,03
5,55*
3,31
3,28
2,08
CD45RA Me 1000
2000
2000
3000
1000
1000
1000
2000
M
SD
8,16
5,79
9,74
7,92
3,45*
2,35
5,15
3,49
CD11B Me 2000
1000
2000
3000
1000
1000
1000
2000 M
SD
____
____
______
______
_____
_____
_____
_____
Área
folículo/
órgão
M
SD
0,32
0,18
0,24
0,05
0,35
0,12
0,30
0,07
0,15
0,05
0,20
0,12
0,17
0,05
0,45
0,16
M
SD
____
____
______
_____
_____
_____
__________
GIEMSA M
SD
________
________
__________
________
48,46
25,89
44,48
19,02
61,35*
30,13
________
M
SD 74,7
65,51
51,55*
44,77
63,69
66,67
__________
46
2.4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
De acordo com a teoria de Khuda-Bukhsh (2009), foi proposto que os medicamentos
homeopáticos carregam sinais específicos que agiriam como gatilho para “ligar” ou “desligar”
alguns genes relevantes, iniciando uma cascata de ação gênica para alterar, balancear ou
corrigir a expressão de genes, que estaria alterada em certas condições patológicas. Assim, a
administração de medicamentos homeopáticos poderia modular o sinal das proteínas,
aumentando ou diminuindo a regulação de tais sinais no âmbito das funções celulares (DE
OLIVEIRA et al., 2008).
No presente trabalho correlacionou-se o uso de medicamentos homeopáticos frente à
infecção por Leishmania (L.) amazonensis, procurando entender a cinética celular que
envolve a relação hospedeiro/parasita, com ou sem a intervenção de tais medicamentos.
De acordo com o princípio de similitude proposto por Hahnemann em 1796, ao
administrar aos indivíduos enfermos substâncias que causaram sintomas semelhantes em
indivíduos sadios, estimula-se reação homeostática curativa contra a enfermidade, induzindo
o organismo a reagir contra os próprios sintomas (TEIXEIRA, 2006). Baseado nessa teoria e
referindo à matéria médica homeopática, utilizou-se o Antimonium crudum 30 cH. Por outro
lado, sabe-se que moléculas endógenas que exercem efeitos na regulação do sistema imune
são, do mesmo modo, biologicamente ativas em preparações homeopáticas (DOUCET-
JABOEUF et al., 1985; DAURAT et al., 1986; BASTIDE et al., 1987; BASTIDE et al.,
1995). Entre estes imunomoduladores está a Timulina (SATO et al., 2012; BONAMIN et al.,
2013).
A Timulina é hormônio tímico de ação anti-inflamatória (LUNIN et al., 2010; LUNIN
et al., 2011), dentre outras. Em infecções parasitárias, os níveis de Timulina séricos podem
diminuir, conforme demonstrado em infecção por Trypanosoma cruzi em camundongos
(SAVINO et al., 1989). Em outro relato, demonstrou-se que o tratamento diário com
Timulina modularia a hiperalgesia induzida pela leishmaniose cutânea em camundongos
Balb/c, infectados com Leishmania major. Nesses casos, baixos níveis de IL-1β e NGF (fator
de crescimento neuronal) séricos foram observados (KANAAN et al., 2002, DARDENNE et
al., 2006).
47
Experimentos que demonstram a ação de medicamentos homeopáticos em doenças
parasitárias são descritos na literatura (PEREIRA et al., 2005; SMIT et al., 2009; FERRAZ et
al., 2011). O medicamento Canova® (que compreende os medicamentos Aconitum napellus
11 dH, Arsenicum album 19 dH, Bryonia alba 18 dH, Lachesis muta 18 dH e Thuya
occidentalis 19 dH) tem efeito anti-inflamatório conhecido em animais infectados com
Leishmania (L.) amazonensis. Há ainda diminuição da carga parasitária em linfonodo poplíteo
e baço de animais tratados. Além disso, resultado in vitro demonstrou aumento nos níveis de
óxido nítrico (NO) na cultura de macrófagos (PEREIRA et al., 2005).
Em relação aos subtipos de células B, em nosso experimento avaliamos B-1 e B-2. As
células B-1 provenientes de camundongo Balb/c apresentam características morfológicas
distintas de células B-2, como demonstrado por Abrahão e colaboradores (2003), como o
grande número de mitocôndrias, sugerindo um intenso metabolismo celular. As células B-1
são subdivididas em B-1a e B-1b, sendo as células B-1a (CD5+) derivadas de progenitores do
omento e fígado fetal, e as células B-1b (CD5-), além de progenitores fetais, derivam-se da
medula óssea em adultos (HAYAKAWA et al., 1985; KANTOR et al., 1993; HAYAKAWA
et al., 2000). Essas células se localizam no peritônio e mucosa, secretam espontaneamente
IgM, que reagem com polissacarídios e lipídios microbianos (HAYAKAWA et al., 2000;
ABBAS, 2011).
Com relação à dinâmica das células do sistema imune em infecção experimental, o
aumento de linfócitos B em lesões primárias e linfonodos em linhagens de camundongo
suscetível C57BL/10 e parcialmente resistente CBA, mostrou a relação desse aumento celular
com a piora no prognóstico para leishmaniose, principalmente 90 e 120 dias após a infecção,
indicando que o desvio de resposta Th1 para Th2 impactaria o curso da infecção (CARDOSO
et al., 2010).
No presente trabalho, a progressão foi similar, com aumento de linfócitos B quando
comparado aos linfócitos T no baço, após 60 dias de infecção; porém, esses efeitos foram
potencializados nos animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium crudum 30 cH, com a
ressalva de que o predomínio foi de células B-1, as quais podem diferenciar-se em fagócitos.
Este parece ser o ponto mais crítico da modulação da infecção e da relação entre o parasita e o
hospedeiro, pois a Leishmania (L) amazonensis é parasita intracelular obrigatório de
macrófagos. No caso do tratamento com Timulina 5 cH, esse aumento de células B-1 no baço
foi predominante no gate de linfócitos ativados, onde havia ainda aumento de fagócitos,
48
provavelmente derivados das próprias células B-1. Talvez a modulação de tal direcionamento
das células B-1 para fagócitos no baço tenha a participação concomitante de linfócitos T, pois
houve aumento de células CD8+ nos animais tratados com Timulina 5 cH. O aumento na
proporção de linfócitos T em relação aos linfócitos B no peritônio dos animais desse grupo
reforça a hipótese.
Nas infecções por Leishmania major, há aumento de células B-1a (CD5+) no peritônio
e produção de altos níveis de anticorpos naturais (BABAI et al., 1999). Dados similares foram
relatados por Buza e colaboradores (1997), em que houve maior produção de IgM nas
populações de células B-1a (CD5+) provenientes de baço de bovinos infectados com
Trypanosoma congolense.
Os resultados relatados neste trabalho demonstraram aumento de proporção de células
B-1 de peritônio em relação a B-2, nos animais tratados com Timulina 5 cH e Antimonium
crudum 30 cH, em comparação ao grupo controle. Dessa população celular, houve aumento
mais expressivo de células B1-a (CD5+), sendo resultado condizente com a literatura. O papel
que as células dispensam no processo ainda poderá ser objeto de estudos futuros.
Foi investigada a interação de células B-1 na infecção por Leishmania major em
Balb/c, constatando-se que após a irradiação letal, havendo depleção de células B-1
peritoneais, os animais apresentaram piora, quando comparados ao controle. Porém, a
expansão de células B-1 foi secundária para a progressão da doença e o desenvolvimento de
uma resposta Th2 (BABAI et al., 1999).
Dados similares foram obtidos em experimento anterior, demonstrando que
camundongos Balb/c infectados por Leishmania major foram caracterizados por resposta Th2;
porém esse perfil de resposta é alterado para Th1 em camundongo Balb/c Xid deficiente em
célula B-1 (HOERAUF et al., 1994). Em outro experimento, realizado pelo mesmo por
Hoerauf e coautores (1995) verificou que camundongos Balb/Xid infectados com Leishmania
major apresentaram piora da infecção em relação a outras linhagens B-1+.
Considerando que esse perfil de resposta Th2 está associado à produção de citocinas
como IL- 4 e IL-10, as células B e B-1 são as principais fontes de IL-10 (O’ GARRA et al.,
1992). Em estudo em infecção por Leishmania major em camundongo Balb/c houve aumento
de células B-1 esplênicas, mas não houve esse aumento em camundongo Balb/c Xid.
Adicionalmente, esse subtipo de célula B aumentou os níveis de IL-10 in vitro em resposta à
49
estimulação com extrato solúvel de leishmania (PALANIVEL et al., 1996). Sugere-se que as
diferentes linhagens de camundongos interferem na resposta de células B-1, mas a função das
células na patogênese na infecção por Leishmania sp. ainda permanece controversa.
Em outro experimento, camundongos infectados com protozoários Trypanosoma cruzi
apresentaram mudança na cinética de células B-1 e B-2. Em análise quantitativa, as células B-
1 diminuíram significantemente a partir do 15º dia, permanecendo em níveis baixos até 65
dias após a infecção. As células B-2 diminuíram após o 4° dia, mas aumentaram a partir do
23º dia, voltando a valores normais em 65 dias (MERINO et al., 2010). A comparação dos
diferentes relatos descritos na literatura para diferentes parasitas e a importância das células
B-1 nessas infecções revelam que a interação das células com hospedeiro/parasita.
Com relação à dinâmica e função efetora de como essas células influenciariam a
infecção causada por Leishmania (L.) amazonensis, seria oportuno considerar que as células
B-1 migrariam da cavidade peritoneal e pleural para o foco inflamatório, diferenciando-se em
fagócitos ativos. Em trabalho relatado por Moon e colaboradores (2011), houve a migração de
células B-1 para fora da cavidade peritoneal, sobre a estimulação por LPS, acompanhada de
aumento de CXCR4 e CXCL12. Esta hipótese, no caso do presente estudo, também serve de
estímulo para estudos futuros centrados na atividade dos fagócitos presentes na lesão.
Além da migração de célula B-1, relata-se a diferenciação desse tipo celular em
células fenotipicamente similares a fagócito mononuclear in vitro e in vivo (ALMEIDA et
al.,2001; POPI et al., 2008; POPI et al., 2012). Recentes estudos indicam a capacidade
microbicida e fagocítica de fagócitos derivados de células B-1, como por exemplo, em
experimento observou-se a capacidade microbicida dessas células em modelo de infecção por
Coxiella burnetii in vitro (POPI et al., 2008), e estudo realizado por MUSSALEM e
colaboradores (2012) relataram um aumento da atividade fagocítica dos fagócitos derivados
de B-1 após estimulação com Propionibacterium acnes.
Outra hipótese que se levanta, portanto, é a possível atuação das células B-1 como
apresentadoras de antígenos (APC), conforme demonstrado em (MOHAN et al., 2006). Nesse
caso, há aumento de coexpressão de proteínas B7-1 e B7-2 (moléculas coestimuladoras) em
células B-1a de camundongos NZM 2410, suscetíveis ao lúpus. Outros experimentos que
demonstram a propriedade de células B-1 como APC envolvendo infecção por
50
Paracoccidioides brasiliensis in vitro são descritos em (VIGNA et al., 2002; LOPES et al.,
2009).
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, houve diminuição da carga
parasitária nos fagócitos alojados na pata infectada com concomitante aumento de fagócitos
provenientes do gate de células B-1 no baço e peritônio de animais tratados com Timulina 5
cH, conforme avaliado por meio de citometria de fluxo. Em face dos dados, sugerimos que
essas células estejam migrando e se diferenciando em fagócitos, contribuindo de alguma
maneira para o controle do parasita. Curiosamente, além da redução da carga parasitária local,
observou-se maior organização do exsudato celular no coxim inoculado, em animais tratados
com Timulina 5 cH. Esse achado, embora descritivo, tem respaldo em estudos recentes
desenvolvidos pelo nosso grupo, que mostram o papel da Timulina 5 cH na atividade de
lesões granulomatosas (SATO et al., 2011; BONAMIN et al., 2013). Já foi relatada por Vigna
e colaboradores (2006) a evidência de que as células B-1 participam da formação de
granuloma in vitro em fagócitos parasitados por Paracoccidioides brasiliensis. A organização
do tecido inflamatório no sítio da infecção é relevante no caso da Leishmania (L)
amazonensis, pois alterações de matriz extracelular, com áreas extensas de necrose e redução
de fibras de colágeno, são descritas em pata de camundongo Balb/c, 60 dias após a infecção
com esse parasita (SILVA-ALMEIDA et al., 2012).
Ao contrário, no linfonodo poplíteo houve contagem superior de formas amastigotas
do grupo tratado com Antimonium crudum 30 cH quando comparado aos demais grupos.
Contudo, a maior concentração de parasita foi vista no tecido adiposo da adventícia desse
órgão, sugerindo disseminação da infecção para além do coxim no qual os parasitas foram
inoculados. A redução da celularidade na lesão inflamatória associada à redução de fagócitos
com aumento de células B em relação às células T no peritônio nesse grupo reforça tal
hipótese, considerando-se os dados indicados na literatura (CARDOSO et al, 2010).
Tradicionalmente, tais efeitos são relatados na literatura homeopática como “supressão
homeopática”.
Conclui-se, portanto, que os medicamentos homeopáticos Timulina 5 cH e
Antimonium crudum 30 cH alteram o perfil de células inflamatórias envolvidas na resposta
cutânea à Leishmania sp., interferindo na relação hospedeiro/parasita por mecanismos
distintos, ora aumentando a resposta imune contra o parasita, ora reduzindo a inflamação local
e os sintomas da doença.
51
2.5. REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular. 7 ed.
Rio de Janeiro: Revinter, 2011.
ABRAHÃO, T. B.; FREYMULLER, E.; MORTARA, R. A.; LOPES, J. D.; MARIANO, M.
Morphological characterization of mouse B-1 cells. Immunobiology, v. 208, p. 401-411,
2003.
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58
3. ANEXO
59
3. ANEXO
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