UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
VIDYLEISON NEVES CAMARGOS
Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN
(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no
processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e
macrófagos
DIVINÓPOLIS-MG MAIO-2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
VIDYLEISON NEVES CAMARGOS
Expressão heteróloga de uma isoforma solúvel do DC-SIGN
(sDC-SIGN1A tipo III) em Escherichia coli e sua função no
processo de infecção do Dengue virus 2 em monócitos e
macrófagos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
Orientadora: Drª Jaqueline Maria Siqueira Ferreira
Co-orientadora: Drª Luciana Lara dos Santos
DIVINÓPOLIS-MG MAIO-2016
iv
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos...
À grande amiga e orientadora Jaqueline, pelo apoio, ensinamentos, paciência e
magnífica orientação desde o primeiro ano da graduação. Deixo aqui o meu mais
sincero muito obrigado!
À Luciana pela oportunidade de desenvolver esse trabalho e também pela excelente
orientação, paciência e conhecimentos compartilhados durante essa jornada.
Ao Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho por fornecer a linhagem celular usada na
etapa final deste trabalho e, sobretudo, juntamente com o Prof. Dr. Rafael Gonçalves
Teixeira Neto, pelas ótimas contribuições no trabalho e também compreensão e
disponibilidade em aceitarem o convite de fazer parte da banca mesmo com o prazo
apertado.
À Profa. Dra. Débora de Oliveira Lopes pela orientação nos experimentos de
expressão e contribuições essenciais neste projeto. Á todos que também
contribuíram com o trabalho, Prof. Dr. Alexandro Sobreira Galdino, Prof. Dr. Leandro
Augusto de Oliveira Barbosa, Dr. Carlos Eduardo Calzavara e Dra. Andréa Teixeira.
Aos órgãos de fomento CNPq, CAPES, FAPEMIG e, principalmente, a UFSJ por
proporcionar a realização deste trabalho. Aos professores do Programa de Pós
Graduação em Ciências da Saúde pelo ensino e reflexões em suas disciplinas.
Aos amigos Cássio, Rodrigo, Diego, Lailah, Bruno, Bárbara, Rafael e todos os outros
membros do laboratório de Biologia Molecular, pelo auxílio nos experimentos desde
o primeiro dia no laboratório, pelas discussões e amizade dentro e fora do
laboratório.
Aos amigos do laboratório de Microbiologia. Álan, Camyla e Michelli não só pela
grande amizade e companheirismo, mas também pelo auxílio na cultura de células.
Karina, por ser tão prestativa e calma para auxiliar a todos no laboratório. E todos os
outros companheiros que de alguma forma me ajudaram nessa jornada.
Aos pesquisadores, funcionários e colegas que contribuíram direta e indiretamente
para a realização desse trabalho.
À minha família, em especial à Maria José, minha queria mãe, e meu irmão Verlison
pela compreensão, incentivo e apoio constante durante todos esses anos.
Igualmente, à todos meus amigos de longa data, Leonardo, Dênis, Adilson, Paulo e
Vinícius.
A todos, muito obrigado!
v
“Don’t let your dreams be dreams”
(Jack Johnson)
vi
RESUMO
A dengue é um grave problema de saúde pública mundial, que é causada pela
infecção pelo Dengue virus (DENV). O DENV se adere às células hospedeiras por
meio da interação da glicoproteína E viral com o receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-
Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) da célula hospedeira, através do seu
Domínio de Reconhecimento de Carboidratos. Este receptor é codificado pelo gene
CD209, que sofre splicing alternativo gerando diversas isoformas solúveis ou de
membrana. Embora estudos envolvendo o DC-SIGN na infecção do DENV já terem
sido descritos, o papel das isoformas solúveis neste processo ainda não é bem
conhecido. Então, a fim de contribuir para maiores esclarecimentos sobre as funções
do DC-SIGN e do mecanismo de infecção do DENV, o objetivo deste trabalho é
avaliar o papel de uma isoforma solúvel deste receptor no processo de infecção do
DENV. A sequência de cDNA da isoforma sDC-SIGN1A tipo III foi sintetizada e
clonada no vetor de expressão pJ414 pela empresa DNA 2.0 (EUA). A expressão
heteróloga foi realizada a 18 ºC, por 18h após a indução por 0,5 mM de IPTG,
utilizando a linhagem Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta, sendo analisada por SDS-
PAGE e Western Blot. A proteína foi purificada por cromatografia de afinidade em
coluna de cobalto e analisada novamente por SDS-PAGE e Western Blot. A
isoforma foi produzida com sucesso, obtendo 1,09 mg da proteína recombinante.
DENV-2 foi mutiplicado na linhagem celular C6/36 de Aedes albopictus e
quantificado pelo ensaio de TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) em células
BHK-21, obtendo um título viral de 1,6 x 106 TCID50/mL. Ensaios funcionais in vitro
com a proteína recombinante foram realizados para verificar a sua capacidade de
alteração da infecção do DENV em monócitos da linhagem THP-1 e macrófagos,
obtidos através da estimulação das células THP-1 com acetato miristato de forbol. A
diferenciação foi analisada pelas alterações na aderência e morfologia celular. A
quantificação viral dos ensaios funcionais foi realizada pela titulação por TCID50.
Devido à baixa expressão de DC-SIGN, as células utilizadas nos ensaios funcionais
não são altamente permissíveis ao vírus, por isso a carga viral não foi detectada
pela técnica de TCID50. Portanto, testes com outras linhagens celulares, serão
necessários para melhor avaliação do efeito da isoforma sDC-SIGN1A tipo III no
processo de infecção do DENV.
Palavras chave: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, expressão heteróloga, infecção
do DENV.
vii
ABSTRACT
Dengue is a major global public health problem, which is caused by infection with
Dengue virus (DENV). The virus adheres to host cells through interaction of viral
glycoprotein E with DC-SIGN receptor (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-
integrin), by its Carbohydrates Recognition Domain. This receptor is encoded by the
CD209 gene which undergoes alternative splicing generating several different
membrane and soluble protein isoforms. Although studies involving DC-SIGN in
DENV infection have been described, the role of soluble isoforms in this process is
not well known. Thus, in order to contribute to further clarification on DC-SIGN
functions and DENV infection mechanism, the aim of this study is to evaluate the role
of a soluble isoform of this receptor in DENV infection process. The cDNA sequence
of sDC-SIGN1A type III isoform was synthesized and cloned into expression vector
pJ414 by DNA 2.0 company (USA). The heterologous expression was carried out at
18 °C for 18 hours after induction with 0,5 mM IPTG, using Escherichia coli BL21
DE3 Rosetta strain, and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The protein was
purified by affinity chromatography in cobalt column and analyzed again by SDS-
PAGE and Western blot. The protein isoform was successfully produced, yielding
1.09 mg of the recombinant protein. DENV-2 was multiplied in Aedes albopictus
C6/36 cell line and quantified by the TCID50 assay (50% Tissue Culture Infective
Dose) in BHK-21 cells, obtaining a viral titer of 1.6 x 106 TCID50/mL. In vitro functional
assays with the recombinant protein were performed to evaluate its capacity of
changing DENV infection in monocytes of THP-1 cell line and macrophages,
obtained by stimulation of THP-1 cells with phorbol myristate acetate. Differentiation
was assessed by changes in cell adhesion and morphology. The viral quantitation in
functional assays was performed by TCID50 titration. Due to the low DC-SIGN
expression, the cells used in functional assays are not highly permissive to the virus,
hence, the viral load was not detected by the TCID50 technique. Therefore, new tests,
including other cell lines, will be needed to further evaluate any effect of sDC-
SIGN1A type III on DENV infection process.
Keywords: DC-SIGN, CD209, Dengue virus, heterologous expression, DENV
infection
viii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................xii
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1
1.1) Aspectos gerais da Dengue ...................................................................1
1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN ........................4
1.3) O gene CD209 .......................................................................................12
1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos ......................................15
1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune ...............................................17
1.6) Produção de proteínas recombinantes ..................................................18
1.7) Justificativa ............................................................................................20
2. OBJETIVOS ........................................................................................................24
2.1) Objetivo geral ........................................................................................24
2.2) Objetivos específicos .............................................................................24
3. METODOLOGIA .................................................................................................25
3.1) Análises in silico ....................................................................................25
3.2) Síntese do gene e vetor de expressão ..................................................26
3.3) Ensaios de Biologia Molecular ...............................................................27
3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes ...............................28
3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes ......................29
3.3.3) Extração plasmidial ..................................................................30
3.3.4) Confirmação da clonagem .......................................................30
3.3.5) Expressão da proteína recombinante em pequena escala ......31
ix
3.3.6) Expressão da proteína recombinante em larga escala ............32
3.3.7) Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE ...................33
3.3.8) Western blot .............................................................................34
3.3.9) Purificação da proteína recombinante ......................................35
3.3.10) Dosagem de proteínas ...........................................................35
3.4) Cultura de células ..................................................................................36
3.4.1) Células e vírus .........................................................................36
3.4.2) Produção e purificação parcial de DENV-2 ..............................37
3.4.3) Titulação de DENV-2 ...............................................................37
3.4.4) Diferenciação da linhagem THP-1 em macrófagos ..................38
3.4.5) Ensaios funcionais ...................................................................38
3.4.6) Quantificação de RNA viral ......................................................39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................42
4.1) Caracterização da sDC-SIGN1A tipo III através de análise in silico ......42
4.2) Expressão e purificação da sDC-SIGN1A tipo III ..................................45
4.3) Multiplicação e quantificação de DENV-2 ..............................................55
4.4) Ensaios funcionais .................................................................................59
5. CONCLUSÕES ...................................................................................................66
6. PERSPECTIVAS .................................................................................................66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................67
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue ................................................1
Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização
Mundial da Saúde ...................................................................................................3
Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus .......................................................5
Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus ....................................................8
Figura 5: Representação esquemática do gene CD209 ..........................................13
Figura 6: Estrutura do DC-SIGN ..............................................................................14
Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o
Dengue virus ...........................................................................................................16
Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414 .......................................................................27
Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE .....................................................................28
Figura 10: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1A tipo III ..............42
Figura 11: Predições de glicosilações e peptídeo sinal ...........................................44
Figura 12: Alinhamento da sequência proveniente do sequenciamento do produto de
miniprep ..................................................................................................................46
Figura 13: Análise da expressão da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ................48
Figura 14: Análise da solubilidade da proteína recombinante expressa a 18 ºC por
18 h .........................................................................................................................51
Figura 15: Expressão em larga escala da sDC-SIGN1A tipo III recombinante ........52
Figura 16: Purificação da proteína sDC-SIGN1A tipo III recombinante ...................54
Figura 17: Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 de Aedes albopictus ..........55
Figura 18: Titulação de DENV-2 por TCID50 em células BHK-21 ............................56
Figura 19: Análise de produtos de PCR por PAGE .................................................57
xi
Figura 20: Análise de qPCR para quantificação de RNA viral .................................58
Figura 21: Diferenciação de macrófagos a partir da linhagem monocítica THP-1 ...60
Figura 22: Avaliação da carga viral pelo ensaio de TCID50 .....................................62
xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ADE: aumento da infecção dependente de anticorpos
Ala: aminoácido alanina
AgNO3: nitrato de prata
Asn: aminoácido asparagina
Asp: aminoácido ácido aspártico
BHK-21: fibroblastos de Rim de Hamster Bebê
BOD: estufa de Demanda Bioquímica de Oxigênio
B(OH)3: ácido bórico
BSA: albumina bovina sérica
C: proteína do capsídeo do Dengue virus
CD: cluster de diferenciação
CD209: gene que codifica o receptor DC-SIGN
cDNA: DNA complementar
CHO: Células de Ovário de Hamster Chinês
CMV: citomegalovírus
CO2: dióxido de carbono
CO(NH2)2: amônia
Cq: cicle quantification
Cys: aminoácido císteína
DCs: células dendríticas
DC-SIGN: Receptor Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
Grabbing Non-integrin
DENV: Dengue virus
DF: febre do dengue
DHF: febre hemorrágica do dengue
DMEM: meio mínimo essencial de Eagle modificado por Dulbecco
DRC: domínio de reconhecimento de carboidratos
DSS: síndrome do choque do dengue
DTT: (2S,3S)-1,4-Bis-sulfanilbutano-2,3-diol
E: glicoproteína do envelope do Dengue virus
ECP: efeito citopático
EDTA: ácido etilenodiamina tetracético
xiii
Fc: fragmento cristalizável
FcRII: receptor de IgE de baixa afinidade
FcR: receptores Fc gama
gp120: glicoproteína gp120 do HIV
Glu: aminoácido ácido glutâmico
GRAVY: grande média de hidropaticidade
HCl: ácido clorídrico
HEPES: [N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-ácido etanosulfônico]
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana
ICAM-3: Moléculas de Adesão Intercelular-3
iDCs: células dendríticas imaturas
IFN-: interferon beta
IL: interleucina
IMAC: cromatografia de afinidade por íons metálicos
IPTG: isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
KH2PO4: fosfato monopotássico
KCl: cloreto de potássio
L-15: meio Leibovitz L-15
mDC: células dendríticas maduras
M (proteína): proteína de membrana do Dengue virus
M (unidade): molar
mDC-SIGN: isoforma de membrana do DC-SIGN
MgCl2: cloreto de magnésio
MOI: multiplicidade de infecção
NaCl: cloreto de sódio
Na2HPO4: fosfato dissódico
NaH2PO4: fosfato monossódico
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NF-B: fator nuclear de transcrição kappa B
(NH4)SO4: sulfato de amônio
NS: proteína não estrutural do Dengue virus
OD: densidade óptica
PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida
xiv
PAMPs: Padrões Moleculares Associados a Patógenos
PBMC: células mononucleares de sangue periférico
PBS: tampão fosfato-salino
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
PMA: acetato miristato de forbol
prM: proteína precursora de membrana do Dengue virus
PRR: Receptores de Reconhecimento de Padrões
qPCR: Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
RPMI: Meio Roswell Park Memorial Institute 1640
RT-PCR: Transcrição Reversa por Reação em Cadeia da Polimerase
sDC-SIGN: isoforma solúvel do DC-SIGN
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
SFB: soro fetal bovino
TCID50: 50% Tissue Culture Infective Dose
TLR: receptores do tipo Toll
THP-1: linhagem monocítica humana THP-1
TNF-: fator de necrose tumoral alfa
Tris: 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
1
1. INTRODUÇÃO
1.1) Aspectos gerais da Dengue
A dengue é a mais importante arbovirose que afeta o homem atualmente,
causada pela infecção por um dos quatro tipos do Dengue virus (DENV 1-4) que são
transmitidos por vetores artrópodes do gênero Aedes. A doença é considerada um 5
grave problema de saúde pública mundial, gerando um grande impacto econômico
para os países localizados em regiões endêmicas (GUZMAN e HARRIS, 2015).
Cerca de 390 milhões de infecções pelo DENV ocorrem todos os anos, sendo
aproximadamente 96 milhões de casos com sintomas aparentes da doença (BHATT
et al., 2013). Aproximadamente 3,97 bilhões de pessoas vivem atualmente em áreas 10
de risco de transmissão do vírus, compreendidas em 128 países (Figura 1; BRADY
et al., 2012). Desta forma, há um alto custo relacionado à dengue no mundo,
estimado em cerca de US$2,1 bilhões anuais nas Américas e quase US$1 bilhão na
Ásia, desconsiderando, ainda, os gastos com o controle do vetor, o que subestima o
custo total associado à doença (SHEPARD et al., 2011; SHEPARD et al., 2013). 15
Figura 1: Mapa mundial de distribuição de Dengue. Regiões em vermelho apresentam maior prevalência de dengue. A presença da doença é menor nas regiões com tons mais fracos de vermelho. Fonte: Guzman e Harris (2015). 20
Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde, até a semana
epidemiológica 52 de 2015, foram registrados 2.326.829 casos suspeitos de dengue
nas Américas no ano, ocorrendo 1.181 mortes. Os quatro tipos do vírus foram
2
encontrados em diversos países do continente (PAHO, 2016). No Brasil, foram
registrados 1.649.008 casos suspeitos de dengue em 2015, dos quais foram
confirmados 1.569 casos de dengue grave e 20.329 casos de dengue com sinais de
alarme, além de 863 fatalidades. Houve um grande aumento destes números
quando comparados com o mesmo período de 2014, quando foram notificados 5
589.107 casos de dengue, sendo confirmados 764 casos de dengue grave, 8.436
casos de dengue com sinais de alarme e 473 óbitos. Os quatro tipos do vírus
circulam no país, sendo os tipos 1 e 4 mais prevalentes, com 93,8% e 5,1%,
respectivamente. Além disso, de todos os casos registrados, 62,2% destes foram
somente na região Sudeste do país. Em Minas Gerais, 189.378 casos foram 10
notificados, o segundo maior número entre todos os estados brasileiros (SAÚDE,
2015). Em Divinópolis, município localizado no centro-oeste de Minas Gerais, foram
notificados 4.686 casos de dengue em 2014, sendo 4.143 casos confirmados e 6
óbitos. Em 2015 houve uma redução no número de casos no município, uma vez
que foram notificados 2.270 casos, com 1.774 casos confirmados e um caso fatal. 15
Porém, o número de casos aumentou em 2016. Até o início de maio, 3.732 casos
foram notificados, dos quais 1.226 foram confirmados, e ocorreram três mortes
(SEMUSA, 2016).
A infecção pelo DENV causa quadros clínicos que variam desde formas
assintomáticas até formas graves. Durante muitos anos, a doença foi categorizada de 20
acordo com as manifestações clínicas em: febre indiferenciada, febre do dengue (DF)
e febre hemorrágica do dengue (DHF). DHF ainda era classificada em 4 graus de
gravidade, sendo os dois últimos definidos como síndrome do choque do dengue
(DSS). No entanto, a dificuldade de classificação de alguns casos na prática clínica
levou a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2009, a propor uma nova 25
classificação. Atualmente, baseada em parâmetros clínicos e laboratoriais, a doença
é classificada em três grupos mais bem definidos: dengue sem sinais de alarme,
dengue com sinais de alarme e dengue grave. Os critérios adotados para o
diagnóstico da dengue de acordo com essa classificação estão resumidos na Figura
2. 30
3
Figura 2: Nova classificação clínica da dengue de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Manifestações clínicas de pacientes com dengue (com ou sem sinais de alarme) e dengue grave. Pacientes de ambos os subgrupos de dengue podem desenvolver dengue grave. Fonte: adaptado de WHO (2009). 5
Indivíduos que viajaram ou vivem em áreas endêmicas de dengue que
apresentam dois ou mais sinais ou sintomas da doença, incluindo sinais de alarme,
são considerados casos suspeitos de dengue. Ambos os pacientes, com e sem sinais
de alarme, podem evoluir para dengue grave (WHO, 2009). 10
De acordo com Simmons e colaboradores (2012), os sintomas da dengue
aparecem abruptamente após o período de incubação e seguem três fases: febre
inicial, fase crítica e fase de recuperação. Na primeira fase, são observados os sinais
e sintomas clássicos da doença, como febre alta, comumente acima de 38,5 ºC,
cefaleia, mialgia, dor nas articulações, manifestações hemorrágicas brandas, entre 15
outros. Esta fase perdura por aproximadamente 2 a 7 dias. A fase crítica se inicia
entre os dias 3 e 7 da doença, quando ocorre o aumento da permeabilidade vascular.
Manifestações hemorrágicas são mais comuns nessa fase. Uma pequena proporção
dos pacientes ainda pode desenvolver uma síndrome de liberação plasmática
sistêmica, evidenciada pelo aumento da hemoconcentração, hipoproteinemia, 20
derrame pleural e ascite. Por último, pode ocorrer a reversão do quadro de alteração
da permeabilidade vascular do paciente em torno de 48 a 72 horas, com a melhora
4
dos sintomas rapidamente, apesar de que adultos podem ter fadiga excessiva por
várias semanas após a recuperação.
Epidemias de dengue já foram registradas desde o século XVIII, apesar de a
doença não ser considerada um problema de saúde pública, exceto quando
ocorriam epidemias esporádicas, pois naquela época circulavam apenas um ou dois 5
tipos virais na maioria das regiões tropicais. Após a Segunda Guerra Mundial,
especialmente nas últimas décadas, a dengue vem acometendo populações em
várias regiões do mundo. Com a expansão geográfica dos vírus e mosquitos
vetores, a frequência e magnitude das epidemias de dengue também aumentaram.
Isso pode ser devido a vários fatores, como decadência da infraestrutura de saúde 10
pública, mudanças no estilo de vida, alterações evolutivas dos vírus, entre outros.
Entretanto, três fatores são considerados principais: ineficácia do controle vetorial,
urbanização não planejada e a globalização. Desta forma, o DENV encontrou um
ambiente propício para a sua sobrevivência. Grandes centros urbanos que não
apresentam controle vetorial eficiente e com aeroportos modernos, que transportam 15
milhões de pessoas, muitas delas infectadas, transportam também o vírus, para
diversas regiões do mundo (GUBLER, 2011).
Assim, o controle da dengue requer uma série de medidas que precisam ser
adotadas ou reforçadas, como a vigilância epidemiológica e controle vetorial, nas
quais necessitam de um esforço político para serem efetivadas, além de 20
contribuições no âmbito científico (GUBLER, 2011). No entanto, ainda é necessário
aperfeiçoar o conhecimento relacionado às interações vírus-hospedeiro e vírus-
vetor, a fim de contribuir com o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico,
abordagens terapêuticas, marcadores de prognóstico, novos inseticidas e vacinas.
Nesse contexto, também é necessário compreender os mecanismos de patogênese 25
da doença, que ainda não são completamente elucidados. Por exemplo, alguns
pacientes se curam da infecção rapidamente e sem complicações, enquanto outros
desenvolvem quadros hemorrágicos graves e potencialmente fatais (ST. JOHN et
al., 2013).
30
1.2) O processo de infecção do Dengue virus e o DC-SIGN
O DENV é membro da família Flaviviridae, na qual estão inseridos vários
outros vírus de relevância médica humana, como o Zika virus, vírus da Febre
5
Amarela, vírus do Oeste do Nilo, vírus da Encefalite Japonesa e vírus da Encefalite
Transmitida por Carrapatos, entre outros (ST. JOHN et al., 2013). O DENV é
constituído de RNA fita simples e polaridade positiva, com um genoma de 10,7 kb
contendo regiões 3’ e 5’ não traduzidas que flanqueiam a sequência de uma única
poliproteína, que, após o processamento por proteases virais e do hospedeiro, gera 5
3 proteínas estruturais [capsídeo (C), precursora de membrana (prM)/membrana (M)
e envelope (E)] e 7 não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5;
Figura 3; GUZMAN et al., 2010). A partícula viral madura é esférica, com diâmetro
aproximado de 50 nm, contendo múltiplas cópias das proteínas E, C e M, gerada
após processamento da prM (WHO, 2009). Já as proteínas NS são expressas na 10
célula hospedeira infectada e estão envolvidas, principalmente, na replicação do
genoma viral, processo que ocorre intimamente às membranas celulares (WELSCH
et al., 2009).
Figura 3: Estrutura genômica do Dengue virus. O genoma é constituído de RNA 15 de polaridade positiva e possui uma única janela aberta de leitura, flanqueada por regiões 3’ e 5’ não traduzidas, que codifica uma poliproteína, na qual gera 3 proteínas estruturais (C, prM/M e E) e 7 proteínas não-estruturais após o seu processamento por proteases celulares e virais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Fonte: Guzman et al. (2010). 20
Na fase inicial da dengue, fêmeas do vetor infectadas liberam as partículas
virais durante o repasto sanguíneo, que infectam inicialmente células dendríticas
(DCs) e macrófagos presentes na pele, além de monócitos recém-recrutados para a
derme (SCHMID e HARRIS, 2014). 25
Monócitos, macrófagos e DCs são células que compõem o sistema
mononuclear fagocitário. Estas desempenham um papel importante na manutenção
da integridade dos tecidos, seja no seu desenvolvimento ou na recuperação após
uma lesão, e também nas respostas imune inata e adaptativa (YONA et al., 2013).
Monócitos são células originadas da medula óssea que circulam na corrente 30
sanguínea e podem migrar para tecidos periféricos durante a homeostase e
6
inflamação. Após o seu recrutamento, os monócitos podem se diferenciar em
macrófagos ou DCs (SHI e PAMER, 2011). Os monócitos são o alvo primário de
infecção e replicação ativa do DENV in vivo entre células mononucleares de sangue
periférico (PBMC), tanto em infecções primárias, como secundárias (DURBIN et al.,
2008; KOU et al., 2008). 5
Os macrófagos são células fagocitárias residentes em tecidos linfoides e não
linfoides envolvidas na homeostase desses tecidos, realizando a remoção de células
apoptóticas e produzindo fatores de crescimento (GEISSMANN et al., 2010). Os
macrófagos também possuem um papel importante no processo de infecção da
dengue, uma vez que são alvos do DENV e também são a principal fonte de 10
produção de citocinas inflamatórias (WU et al., 2013). Estudos indicaram a infecção
pelo DENV em macrófagos do baço e linfonodos, humanos e murinos, entre outras
células de diferentes órgãos e tecidos humanos (BLACKLEY et al., 2007; KYLE et
al., 2007; BALSITIS et al., 2009).
As DCs fazem parte do sistema imune inato e estão presentes em sítios de 15
invasão de patógenos, como pele e mucosas. Quando não ativadas, elas
apresentam alta atividade fagocítica, englobam antígenos e reconhecem patógenos
através de Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRR – pattern-recognition
receptors). Uma vez ativadas após o reconhecimento de patógenos, as DCs
produzem citocinas, migram para os linfonodos e apresentam os antígenos para as 20
células T (SCHMID et al., 2014; MERAD et al., 2013). Entre as DCs presentes na
pele, as células de Langerhans são um tipo de células dendríticas imaturas (iDCs)
consideradas o alvo inicial do DENV (WU et al., 2000). Essas células possuem
grande capacidade de infecção pelo vírus, devido à sua alta expressão do receptor
DC-SIGN (Dendritic Cell-specific ICAM-3 Grabbing Non integrin), o que sugere que 25
esse receptor seja um fator crítico no início da infecção do DENV (NAVARRO-
SANCHEZ et al., 2003; TASSANEETRITHEP et al., 2003).
A interação do vírus com a célula hospedeira ocorre, principalmente, por meio
da ligação da glicoproteína E do vírus ao DC-SIGN (NAVARRO-SANCHEZ et al.,
2003). Outro receptor envolvido na infecção do DENV é o Receptor de Manose 30
(MR), que, assim como o DC-SIGN, se liga à glicoproteína E viral (MILLER et al.,
2008). A importância desses receptores foi demonstrada por Alen e colaboradores
(2011), onde o bloqueio do DC-SIGN por anticorpos monoclonais em iDCs
7
promoveu a inibição da infecção do DENV em 80%, enquanto o bloqueio de ambos
os receptores, DC-SIGN e MR, reduziu a infecção em mais de 90%. Isso também
sugere a existência de outros receptores envolvidos. Segundo Hidari e Suzuki
(2011), diversos receptores presentes em células de mamíferos já foram propostos,
como GRP78 (78 kDa glucose-regulated protein), HSP70/HSP90 (heat shock 5
protein), proteínas associadas a CD14, entre outros.
Após essa interação inicial, o vírus move na superfície celular até entrar na
célula hospedeira por endocitose clatrina-dependente, mediada por receptor (VAN
DER SCHAAR et al., 2008 – Figura 4). Apesar do DC-SIGN ser responsável pela
ligação do vírus à superfície celular, a endocitose da partícula viral não é 10
essencialmente dependente desse receptor (LOZACH et al., 2005). Após a
endocitose, ocorre a acidificação do endossomo, que induz uma alteração
conformacional drástica na glicoproteína E, que promove a fusão entre as
membranas viral e endossomal, liberando o nucleocapsídeo do vírus no citoplasma
celular (MODIS et al., 2004). No citoplasma, ocorre a tradução de proteínas virais e 15
replicação do genoma viral em estruturas vesiculares associadas ao retículo
endoplasmático (WELSCH et al., 2009). Por fim, ocorre a associação do RNA viral
às proteínas do capsídeo e o brotamento para dentro do retículo endoplasmático.
Neste processo, o nucleocapsídeo adquire a membrana lipídica com as proteínas
prM/M e E e as partículas virais passam pelo processo de maturação para serem 20
liberados da célula por via secretória do hospedeiro (GUZMAN e HARRIS, 2015).
8
Figura 4: Ciclo de multiplicação do Dengue virus. Esquema demostrando as principais etapas do ciclo de multiplicação do DENV: uma partícula viral (passo 1) é adsorvida à superfície da célula hospedeira por meio de um receptor celular (passo 2) e o vírus penetra na célula por endocitose mediada por receptor (passo 3). 5 Posteriormente, após a acidificação do endossomo, ocorre a liberação do RNA viral no citoplasma celular (passo 4). O RNA viral é traduzido, produzindo uma única poliproteína (passo 5), que após o processamento por proteases celulares e virais, forma o complexo de replicação (passo 6). Com a replicação e tradução do RNA viral, novas partículas virais (passos 7 e 8) são formadas, que após maturação no 10 complexo de Golgi (passo 9), são liberadas no meio extracelular por exocitose. Adaptado de Screaton et al. (2015).
As partículas virais produzidas durante a infecção de uma célula hospedeira
podem conter níveis variados da proteína prM, a qual é normalmente convertida na 15
proteína M durante a maturação dos vírions. Esse processo é muito importante para
o vírus, uma vez que partículas completamente imaturas são consideradas não-
infecciosas, possivelmente devido à interação vírus-receptor e o evento de fusão de
membranas serem afetados (ZYBERT et al., 2008; RICHTER et al., 2014). Apesar
disso, a presença de anticorpos contra a proteína prM, durante uma infecção 20
secundária, por exemplo, pode facilitar a ligação e penetração de partículas virais
9
imaturas em células expressando Receptores Fc (FcR), restaurando a capacidade
infecciosa desses vírus (RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). A expressão de DC-
SIGN também pode contribuir para a infecção de partículas virais imaturas. Richter e
colaboradores (2014) mostraram que partículas do DENV imaturas foram capazes
de infectar iDC e células Raji, uma linhagem de células B, transfectadas 5
eficientemente com DC-SIGN, enquanto não foi possível em iDC com DC-SIGN
bloqueado por anticorpos, nem em células Raji não-transfectadas com DC-SIGN.
Existem diversos fatores que podem estar relacionados à fisiopatologia da
dengue, como a infecção e ativação de células da resposta imune inata, ativação do
sistema do complemento, células T e B, produção de anticorpos autoimunes e 10
presença de anticorpos não neutralizantes derivados de uma infecção primária
(GUZMAN e HARRIS, 2015). Este último fator é considerado um dos principais
responsáveis pela maior gravidade da doença, embora não seja unanimidade na
literatura (LIBRATY et al., 2009).
Após a infecção primária por um sorotipo do DENV, o indivíduo desenvolve 15
imunidade protetora permanente contra o sorotipo infectante e proteção cruzada
temporária contra sorotipos heterólogos (GUZMAN e HARRIS, 2015). Em
concentrações subneutralizantes, os anticorpos heterólogos podem desempenhar o
papel inverso, contribuindo para o aumento da infecção, um efeito denominado
“aumento da infecção dependente de anticorpos” (ADE, antibody-dependent 20
enhancement). Neste caso, esses anticorpos, adquiridos ativamente (por infecção
primária) ou passivamente (crianças nascidas de mães imunes à dengue), podem
formar complexos com o vírus, facilitando a infecção de células expressando FcR,
via interação com a porção Fc dos anticorpos. Com esta interação, há um aumento
nas células infectadas que leva a uma carga viral maior do que ocorre em indivíduos 25
infectados na ausência de tais anticorpos (GUZMAN et al., 2013). Desta forma, a
expressão de FcR modula a infecção nas células durante ADE, ocorrendo maior
infecção nessas células na presença de anticorpos não neutralizantes do que na
ausência destes, como, por exemplo, acontece em células dendríticas maduras
(mDC), macrófagos e monócitos (SCHMID et al., 2014). 30
Além disso, durante a infecção com ADE, o DENV é capaz de alterar diversos
componentes do sistema imune, inibindo vias de sinalização, como de receptores do
tipo Toll (TLR – Toll-like receptors) e fator nuclear de transcrição kappa B (NF-B –
10
Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), suprimindo a
resposta antiviral mediada por interferon. O vírus também pode estimular a
expressão de citocinas imunossupressoras, como interleucina (IL) -10, que leva à
redução da produção de IFN e óxido nítrico (MODHIRAM et al., 2010, UBOL et al.,
2010). De uma forma geral, vários componentes do sistema imune são alterados, a 5
fim de facilitar a multiplicação do vírus, gerando uma alta carga viral no hospedeiro.
Boonnak e colaboradores (2008) detectaram uma alta produção das citocinas
pró-inflamatórias IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-) em mDC cultivadas
com uma concentração ótima de soro que causa ADE nessas células. Inclusive, a
produção elevada destas citocinas não foi detectada quando o receptor FcRIIa foi 10
bloqueado por anticorpos, nem quando a mesma linhagem celular foi cultivada na
ausência do soro, mesmo quando uma alta carga viral (e. g.: multiplicidade de
infecção [MOI] de 1 versus 5) foi utilizada para infectá-las. De fato, não apenas a alta
carga viral está associada com dengue grave, mas também uma alta produção de
citocinas pelo sistema imune do paciente, como TNF- (GAGNON et al., 2002). Uma 15
vez que as características hemorrágicas graves da dengue iniciam coincidentemente
com a diminuição da carga viral, juntamente com o aumento da produção de
citocinas, majoritariamente derivadas de células T, é possível que a dengue grave
seja uma síndrome mediada pelo sistema imune do paciente (MATHEW e
ROTHMAN, 2008; DUANGCHINDAA et al., 2010). 20
Apesar do fenômeno de ADE possibilitar que várias células diferentes sejam
infectadas pelo DENV, nem todas as células normalmente permissíveis ao vírus
possuem essa capacidade de aumento da infecção. Ao contrário das mDC, as iDC
não possuem capacidade de ADE, apesar de sua expressão de FcRs. Isso
provavelmente é devido ao nível de expressão do DC-SIGN. Apesar de ambas as 25
células expressarem níveis similares de FcRIIa, o nível de expressão de DC-SIGN
é menor nas mDC. Inclusive, é considerado que o ADE seja correlacionado
inversamente com a expressão de DC-SIGN (KOU et al., 2008; BOONNAK et al.,
2008).
Em uma infecção secundária, outra teoria complementar à ADE que pode 30
contribuir com maior gravidade da dengue é o “pecado do antígeno original” (original
antigenic sin). Neste fenômeno, células T e B de memória geradas após uma
11
infecção primária (“antígeno original”) são estimuladas pelo sorotipo viral heterólogo,
expandindo e produzindo uma resposta mais rápida que as novas células
específicas contra este vírus (ROTHMAN, 2011; SCREATON et al., 2015). Uma vez
que essas células apresentam baixa avidez contra o novo sorotipo infectante, é
gerada uma resposta imune celular e humoral inadequada, ocorrendo um aumento 5
na produção de citocinas inflamatórias e também atraso na resolução da infecção
viral (ROTHMAN, 2011; GUZMAN e HARRIS, 2015).
Durante o processo de ativação de células T, as moléculas de adesão
intercelular-3 (ICAM-3) desempenham um papel importante na adesão entre estas
células e DC. Geijtenbeek e colaboradores (2000b) estudaram receptores de adesão 10
celular envolvidos neste processo de ativação de células T e identificaram o DC-
SIGN. Esse receptor mediava à adesão entre DC e ICAM-3 expressas por células T
em repouso através de um mecanismo integrina-independente que requer cálcio
(Ca2+), no qual é característico de lectinas do tipo C. Os autores estenderam seus
achados, mostrando que o DC-SIGN se ligava com a glicoproteína gp120 do 15
envelope do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Apesar do receptor não
promover a penetração do vírus em DC, ele promovia infecção in trans de células
que expressavam CD4 e receptores de quimiocinas. Desta forma, o vírus poderia se
ligar às DC nas mucosas através do DC-SIGN, ser transportado para órgãos
linfoides secundários e, então, infectar células T CD4+ por um mecanismo in trans 20
(GEIJTENBEEK et al., 2000a).
Posteriormente às publicações de Geijtenbeek e colaboradores, Mummidi e
colaboradores (2001) descreveram um extenso repertório de transcritos do gene que
codifica para a proteína DC-SIGN (CD209). Além disso, eles também identificaram
outro gene com grande homologia com o DC-SIGN, designado como DC-SIGN2 25
(CD209L), que também foi descrito por Soilleaux e colaboradores (2000),
coincidentemente no mesmo ano e nomeado como DC-SIGNR (DC-SIGN related
gene). Esse alto número de transcritos eram gerados pelo splicing alternativo do pré-
mRNAdo gene CD209.
O splicing alternativo é um mecanismo de controle da expressão gênica, que 30
desempenha um papel fundamental de regulação entre os processos de transcrição
e tradução (KORNBLIHTT, 2013). Neste processo, enquanto o pré-RNA é
sintetizado no núcleo, os íntrons (sequências não codificantes) são reconhecidos e
12
removidos da molécula de RNA de formas alternativas, possibilitando que alguns
éxons também sejam retirados, ou que sejam realizados cortes em sítios de splicing
5’ ou 3’ alternativos. Desta forma, após conectados e transportados para o citosol,
os transcritos alternativos podem gerar uma gama de proteínas DC-SIGN diferentes
(KELEMEN et al., 2013). 5
Considerando que cerca de 95% dos genes humanos multiéxons sofrem
splicing alternativo e que ocorrem, em média, sete eventos de splicing alternativo por
gene humano multiéxon, é de se esperar que haja uma ampla gama de proteínas
que podem ser expressas pelas diferentes células em um organismo humano (PAN
et al., 2008). Deste modo, aumentando a diversidade de mRNA expresso pelas 10
células, isoformas diferentes de uma determinada proteína podem ser geradas. Essa
nova proteína pode não ter uma função específica, ou a evolução pode selecioná-la
para desempenhar uma função bem definida ou até mesmo apresentar alguma
funcionalidade somente quando ela for expressa juntamente com outra isoforma em
um evento de splicing coordenado (KELEMEN et al., 2013). 15
1.3) O gene CD209
O gene CD209 (Figura 5) está localizado no braço curto do cromossomo 19,
região 1, banda 3, sub-banda 3 (19p13.3), próximo aos genes CD209L e CD23
(receptor de IgE de baixa afinidade - FcRII) e todos estão sujeitos a eventos de 20
splicing alternativo. O gene CD209 possui seis éxons (I-VI) e cinco íntrons, sendo
que os eventos de splicing alternativo podem gerar, pelo menos, 14 transcritos
diferentes, codificando proteínas associadas à membrana ou solúveis (MUMMIDI et
al., 2001). Apesar de Geijtenbeek e colaboradores (2000b) terem detectado a
expressão de DC-SIGN somente em DC, segundo Mummidi e colaboradores (2001), 25
a sua expressão é mais ampla, incluindo placenta, PBMCs e monócitos da linhagem
THP-1.
13
Figura 5: Representação esquemática do gene CD209. O gene CD209 apresenta seis éxons (algarismos romanos na porção inferior) e cinco íntrons (algarismos romanos na porção superior). Os números relacionados ao éxon III mostram o número de repetições em sequência deste éxon. +1 e +101 indicam os potenciais 5 sítios de início da tradução. Asterisco (*) no éxon VI indica o códon de término da tradução dos transcritos DC-SIGN1A, m- e sDC-SIGN1B. Asterisco no éxon Ib indica o códon de término da tradução dos transcritos tDC-SIGN1B. Adaptado de Mummidi et al. (2001).
10
Considerando que (i) o gene CD209 apresenta dois sítios de início da
tradução, localizados nas porções “a” e “b” do éxon I, (ii) que a porção “b” do éxon
pode ser removida durante o splicing alternativo e (iii) que o éxon II codifica o
domínio transmembrana do DC-SIGN e também pode ser eliminado durante o
splicing alternativo, gerando uma isoforma solúvel, Mummidi e colaboradores (2000) 15
classificou as isoformas do DC-SIGN em 5 grupos distintos: mDC-SIGN1A, sDC-
SIGN1A, mDC-SIGN1B, sDC-SIGN1B e tDC-SIGN1B. Os transcritos que mantinham
tanto o códon de iniciação da tradução do éxon Ia, como o éxon II, foram
classificados como mDC-SIGN1A, enquanto aqueles que iniciavam a tradução no
éxon Ia, mas perdiam o éxon II, como sDC-SIGN1A. Já aqueles que mantinham a 20
porção “b” do éxon I e também o éxon II foram agrupados como mDC-SIGN1B,
enquanto os que continham o éxon Ib, porém perdiam o éxon II, foram classificados
como sDC-SIGN1B. Finalmente, o uso do sítio de início da tradução localizado no
éxon Ia pelos transcritos DC-SIGN1B geram uma isoforma truncada de 41
aminoácidos, classificada como tDC-SIGN1B. Logo, as isoformas dos grupos m- e 25
sDC-SIGN1B iniciam a tradução no sítio localizado no éxon Ib. De forma geral, os
transcritos foram agrupados observando se mantinham o éxon II (mDC-SIGN) ou
não (sDC-SIGN) e também se continham o éxon Ib (DC-SIGN1B) ou não (DC-
SIGN1A).
O DC-SIGN apresenta basicamente quatro componentes: domínio 30
citoplasmático na região N-terminal, domínio transmembrana, região de pescoço e
Domínio de Reconhecimento de Carboidratos (DRC) na região C-terminal (Figura 6).
Cada um destes componentes é codificado por um éxon diferente, exceto o DRC,
14
que é codificado pelos últimos três éxons, IV, V e VI (GEIJTENBEEK, 2000b;
MUMMIDI et al., 2001).
Figura 6: Estrutura do DC-SIGN. O DC-SIGN possui quatro componentes 5 principais: o domínio citoplasmático, codificado pelo éxon I, o domínio transmembrana, codificado pelo éxon II, a região de repetições (ou região de pescoço), codificado pelo éxon III, e o DRC, codificado pelos éxons IV, V e VI. Adaptado de Wu e KewalRamani (2006).
10
O éxon I codifica para a maioria da cauda citoplasmática do DC-SIGN. Como
mencionado anteriormente, ele apresenta três porções distintas, Ia, Ib e Ic, sendo
que algumas isoformas podem manter ou perder o éxon Ib. Além do códon ATG na
porção exônica Ia (+1), há uma forte sequência de Kozak flanqueando a posição
+101 para o início da tradução na porção Ib (GCCATGG; MUMMIDI et al., 2001). 15
Alguns estudos mostram uma importância do domínio citoplasmático no processo de
internalização de algumas moléculas ou vírus, onde células expressando um DC-
SIGN mutante que não contém o domínio citoplasmático apresentaram uma
internalização significativamente reduzida de partículas semelhantes a vírus ou até
mesmo impediram a internalização de vírions HIV-1 (SMITH et al., 2007; MANZO et 20
al., 2012).
O éxon II do gene CD209 codifica para todo o domínio transmembrana, além
de 5 aminoácidos do domínio citoplasmático, e a sua eliminação do mRNA durante o
splicing alternativo gera isoformas solúveis do DC-SIGN. Uma possibilidade a ser
considerada é de que estas isoformas poderiam ser secretadas no meio extracelular 25
e inibir competitivamente a interação entre o DC-SIGN e seu ligante (como ICAM-3
15
ou HIV) in vivo ou regulando a expressão das isoformas de membrana do DC-SIGN
(MUMMIDI et al., 2001).
O éxon III codifica para uma região de pescoço extracelular do DC-SIGN,
constituída por 7 repetições e meia em sequência de 23 aminoácidos (MUMMIDI et
al., 2001; POKIDYSHEVA et al., 2006). Na superfície celular, o DC-SIGN apresenta-5
se em um estado oligomérico, formando um tetrâmero, enquanto somente o DRC se
apresenta como um monômero (MITCHELL et al., 2001). Uma vez que a
oligomerização contribui com a afinidade pelo seu ligante, essa região possui grande
importância para a funcionalidade da proteína, uma vez que ela é responsável pela
tetramerização do DC-SIGN (SNYDER et al., 2005; FEINBERG et al., 2005). A partir 10
do uso de técnicas bioquímicas e biofísicas mais avançadas, pesquisadores
puderam explorar ainda mais o nível de organização do DC-SIGN na superfície
celular, que vai além da tetramerização, demonstrando que o DC-SIGN não apenas
formam microdomínios, como também nanodomínios na superfície celular. A
formação e a estabilidade destes domínios são dependentes da região de pescoço e 15
do DRC, sendo que essa clusterização contribui para maior interação com o ligante
do DC-SIGN, provavelmente permitindo a ligação de patógenos de diferentes
tamanhos (LIU et al., 2012; MANZO et al., 2012).
Por fim, o DRC, que forma o ectodomínio do DC-SIGN juntamente com a
região de pescoço, é codificado pelos éxons IV, V e VI. Esta é a porção mais externa 20
da molécula, sendo responsável, de fato, pela interação com o seu ligante
(MUMMIDI et al., 2001). Desta forma, o DC-SIGN se liga a diversos patógenos,
como bactérias, fungos, helmintos e vírus, por meio de estruturas contendo manose
ou fucose na presença de Ca2+ (GEIJTENBEEK et al., 2009).
25
1.4) Domínio de Reconhecimento de Carboidratos
Análises cristalográficas do DC-SIGN complexado com ligantes carboidratos
mostram que o DRC apresenta uma estrutura mista / com duas folhas
antiparalelas principais, sendo que, afastado das terminações amino e carboxila,
vários loops se agrupam para formar o sítio de ligação do DRC (Figura 7A; 30
POKIDYSHEVA et al., 2006). O DRC está compreendido no domínio extracelular
entre os resíduos Cys253 e Ala404, e apresenta três sítios de ligação a íons Ca2+,
16
sendo que a interação com o ligante é dependente de pelo menos dois íons Ca2+, o
qual não pode ser substituído por outro cátion bivalente (GEIJTENBEEK et al.,
2000b).
Entre os três sítios de ligação ao Ca2+ (sítios 1-3), o sítio 2 é considerado o
sítio primário, onde quatro resíduos de aminoácidos, Glu347, Asn349, Glu354 e Asn465, 5
se interagem com o íon bivalente através de seus grupos carbonila. O resíduo
Asp366 coordena a ligação ao Ca2+, mas não contribui para a interação com o ligante,
apesar de ser essencial para a ligação, uma vez que a substituição de Asp para um
resíduo de Ala resulta na perda total da interação com o ligante (GEIJTENBEEK et
al., 2002a). 10
Com relação ao DENV, o DRC se liga ao vírion através dos resíduos
glicosilados Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes (Figura 7B). Uma unidade
icosaédrica do DENV, constituída por três monômeros de glicoproteína E, possui
seis sítios de glicosilação, três Asn67 e três Asn153, mas o DRC se liga apenas a dois
Asn67 próximos, pois os outros sítios são distantes entre eles, impossibilitando a sua 15
ligação (POKIDYSHEVA et al., 2006).
Figura 7: Domínio de Reconhecimento de Carboidratos e sua interação com o Dengue virus. A) Estrutura cristalográfica do monômero do DRC, mostrada em 20 vermelho e verde, ligado a um oligossacarídeo, representado em amarelo. Íons Ca2+ ligados estão representados em azul. B) Esquema demonstrando as interações do DRC com o DENV, representadas pelos círculos em azul, que ocorrem por meio da sua ligação aos resíduos Asn67 de duas glicoproteínas E adjacentes. Adaptado de Pokidysheva et al. (2006). 25
17
1.5) Funções do DC-SIGN no sistema imune
O DC-SIGN possui uma ampla capacidade de reconhecimento de patógenos,
desde vírus a parasitos. Além disso, este receptor também funciona como um PRR,
reconhecendo Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) e induzindo
ou modulando a expressão gênica em resposta aos patógenos reconhecidos. A 5
resposta imune modulada pelo DC-SIGN é dependente do patógeno que está
envolvido (GEIJTENBEEK et al., 2009).
Em DC, DC-SIGN pode capturar e internalizar Mycobacterium bovis através
de um componente da parece celular de micobactérias chamado
lipoarabinomanana. Além disso, a ligação desse componente ao DC-SIGN previne a 10
maturação de DC por meio da alteração da sinalização de TLR, causando
imunossupressão do paciente (GEIJTENBEEK et al., 2002b). Essa modificação na
sinalização por TLR também pode ocorrer em diferentes patógenos, mas a
sinalização celular produzida antes e após essa alteração pode variar. Patógenos
que expressam glicoproteínas ricas em manose, como Mycobacterium tuberculosis e 15
HIV-1, modulam a sinalização de TLR diferentemente de patógenos que expressam
fucose, como Helicobacter pylori, levando a expressão de diferentes níveis de
citocinas pró- e anti-inflamatórias (GRINGHUIS et al., 2009).
Apesar de diversos estudos terem sidos publicados envolvendo a isoforma
mais comum do DC-SIGN, que é associada à membrana, a função das outras 20
isoformas desse receptor, especialmente as isoformas solúveis, ainda não é bem
conhecida. Existem trabalhos prévios envolvendo estas isoformas, mas os
resultados ainda não foram esclarecedores. Por exemplo, alguns estudos mostraram
que a incubação de sDC-SIGN com células expressando DC-SIGN inibiram a
infecção ou a ligação do HIV a estas células (KWON et al. 2002; BIGGINS et al., 25
2007). Em contraste, Hijazi e colaboradores (2011) demonstraram que o sDC-SIGN
inibia a infecção de HIV em células PM1 (linhagem contínua de células T CD4+) em
concentrações nanomolares, porém aumentou a infecção viral em concentrações
sub-nanomolares. As hipóteses sugeridas pelos autores foram que em altas
concentrações, o excesso de DC-SIGN ligado à gp120 do HIV bloquearia o sítio de 30
ligação ao CD4, um receptor essencial para a infecção do vírus. Em baixas
concentrações ocorreria a potencialização da infecção devido ao aumento da
afinidade do complexo gp120-DC-SIGN pelo CD4. No entanto, mais estudos são
18
necessários para confirmar estas hipóteses. Outros trabalhos demonstraram que a
incubação de iDC com o DRC do DC-SIGN inibiu mais de 90% da infecção do
DENV, entretanto Plazolles e colaboradores (2011) evidenciaram que a isoforma
sDC-SIGN1A tipo I promoveu um aumento da infecção de Citomegalovírus (CMV)
humano nestas mesmas células (NAVARRO-SANCHEZ et al., 2003; PLAZOLLES et 5
al., 2011). Diante disso, ainda são necessários mais estudos para validar a
verdadeira função dessas isoformas.
1.6) Produção de proteínas recombinantes
No desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, a indústria 10
microbiológica tradicional se fundiu com a biologia molecular, dando origem a
processos recombinantes otimizados para a produção de variados produtos
celulares, especialmente enzimas e proteínas de interesse farmacológico. Para isto,
microrganismos são modificados geneticamente para a fabricação destes produtos
e, dentre os processos de recombinação nestes organismos, destaca-se a 15
transformação, na qual envolve a captação e expressão de um DNA por células
competentes. Essa competência pode ser induzida em laboratórios, alterando-se o
ambiente físico-químico onde as células se encontram, por exemplo, pelo tratamento
com cloreto de cálcio gelado, choque térmico, eletroporação, entre outros (ADRIO e
DEMAIN, 2010; TU et al., 2016). 20
Entre os vetores utilizados na transformação, destacam-se os plasmídeos.
Algumas características de um plasmídeo de expressão podem influenciar a taxa de
expressão do gene clonado neste vetor, sendo as principais: o seu promotor, o sítio
de ligação ao ribossomo, um gene que confere resistência a um antibiótico e o
número de cópias do plasmídeo, determinado pela origem de replicação. Desta 25
forma, a configuração do vetor de expressão deve ser analisada cuidadosamente a
fim de se obter um nível adequado de síntese proteica (MAKRIDES, 1996; ROSANO
e CECCARELLI, 2014).
A maioria dos biofármacos produzidos atualmente é de origem recombinante,
sendo que o sistema de expressão escolhido para a produção de determinada 30
proteína recombinante dependerá da sua qualidade, funcionalidade, rendimento e
velocidade de produção. Entre os sistemas biológicos mais utilizados para fins
19
biotecnológicos, destacam-se as células de mamíferos e insetos, leveduras e
bactérias (ADRIO e DEMAIN, 2010, SANCHEZ-GARCIA et al., 2016). Dentre estes,
Escherichia coli é um organismo já bem estabelecido para a expressão de proteínas
recombinantes, além de ser a primeira escolha de organismos para essa finalidade,
uma vez que apresenta fácil manuseio e um longo histórico de uso na biotecnologia 5
(TEGEL et al., 2010, CHEN 2012). Entre os sistemas utilizados na produção de
proteínas recombinantes nos mercados dos Estados Unidos e Europa, cerca de 40%
são bactérias, sendo a grande maioria delas alguma linhagem de E. coli (RADER,
2008).
Mesmo que existam diversos sistemas de expressão disponíveis, muitos 10
ainda estão em desenvolvimento, tanto microrganismos convencionais, como E. coli
e Saccharomyces cerevisae, como também plataformas mais recentes, como
Pseudoalteromonas haloplanktis, Trichoderma reesei, Chlamydomonas reinhardtii,
Leishmania tarentolae, entre outros (CORCHERO et al, 2013; SANCHEZ-GARCIA et
al., 2016). Assim, há um grande número de opções disponíveis para a produção de 15
proteínas e dificilmente é possível alcançar uma combinação ideal, pelo menos
inicialmente. Condições para a produção de determinado produto gênico podem não
funcionar para outro produto gênico, nem modelos confiáveis de predição de
expressão proteica estão disponíveis, então o processo de produção de proteínas
continua empírico. Por isso, múltiplas condições são testadas para otimizar esse 20
processo e obter a proteína desejada (TEGEL et al., 2010; ROSANO E
CECCARELLI, 2014).
A expressão heteróloga em E. coli pode ser afetada por diversos fatores,
como características estruturais da sequência gênica, a estabilidade e eficiência da
tradução do mRNA, a capacidade de enovelamento proteico, a degradação da 25
proteína por proteases celulares, a diferença do uso de códons entre organismos, a
possível toxicidade da proteína produzida ao hospedeiro, entre outros (MAKRIDES,
1996, ROSANO E CECCARELLI, 2014). Diversas linhagens de E. coli já foram
modificadas, dando origem a novas cepas capazes de diminuir ou evitar as suas
desvantagens na produção de proteínas recombinantes. Linhagens deficientes em 30
proteases, o que confere maior estabilidade de proteínas heterólogas, como as
BL21(DE3) e outras derivadas são bastante utilizadas. Estirpes que melhoram a
formação de pontes dissulfeto também já foram desenvolvidas, bem como cepas
20
capazes de realizar glicosilação (CHEN, 2012; ROSANO e CECCARELLI, 2014). A
variação nos códons utilizados por eucariotos e procariotos no processo de tradução
também pode influenciar a produção de proteínas eucarióticas em E. coli. Esse viés
pode ser atenuado pela alteração dos códons raros no gene a ser expresso por
códons mais utilizados em E. coli ou pela utilização de linhagens capazes de realizar 5
a expressão de tRNAs raros (KOPANIC et al., 2013).
Apesar de otimizações serem realizadas para atingir uma alta expressão da
proteína de interesse, muitas vezes essa produção excessiva em E. coli pode
resultar na formação de agregados proteicos no citoplasma da célula bacteriana,
denominados corpos de inclusão, onde é necessário a sua solubilização, 10
renovelamento e purificação a fim de se obter a proteína funcionalmente ativa.
Porém, ainda que a formação de corpos de inclusão seja muitas vezes indesejada,
ela pode ser explorada como uma vantagem, uma vez que ocorrerá uma alta
expressão da proteína de interesse nesses agregados, nos quais, além de
prevenirem a degradação proteica por proteases celulares, podem ser facilmente 15
isolados e purificados em um número de etapas reduzido (SINGH e PANDA, 2005;
ROSANO E CECCARELLI, 2014).
A produção de proteínas recombinantes é uma área da ciência extensa, onde
um grande progresso nesse campo foi alcançado nas últimas décadas e ainda está
em constante desenvolvimento (CHEN, 2012). Vários sistemas de expressão estão 20
disponíveis e cada um deles, seja procarioto ou eucarioto, possui suas vantagens e
desvantagens. Então a escolha entre eles precisa ser analisada previamente de
acordo com a proteína de interesse. Nesse contexto, a utilização de E. coli é bem
estabelecida e se tornou o sistema de expressão mais popular atualmente
(ROSANO e CECCARELLI, 2014). Desta forma, com o constante acúmulo de 25
conhecimento e o desenvolvimento de novas estratégias biotecnológicas, espera-se
que a produção de proteínas biologicamente ativas seja cada vez mais exequível.
1.7) Justificativa
A dengue é considerada a arbovirose mais importante que afeta o homem 30
atualmente e que, mesmo sendo uma doença presente em quase todo mundo, ainda
continua em expansão. Desta forma, é esperado um aumento na frequência,
21
proporção e gravidade das epidemias nas regiões afetadas (GUBLER, 2011). O
desenvolvimento de vacinas ou fármacos contra o vírus seriam importantes
ferramentas no combate a doença, no entanto, para que isso seja possível, é
necessário elucidar os mecanismos de patogênese da dengue, que ainda não são
completamente conhecidos. 5
Durante a fase inicial da dengue, as partículas virais introduzidas na pele pelo
mosquito vetor infectam, principalmente, macrófagos e DCs presentes na pele
(SCHMID e HARRIS, 2014). Em seguida, o DENVse dirige aos linfonodos e corrente
sanguínea, infectando DCs, macrófagos e monócitos. Uma vez na corrente
sanguínea, o vírus pode se dispersar e infectar células em diversos órgãos, como 10
fígado, baço, cérebro, coração, entre outros (PRESTWOOD et al., 2012; SCHMID e
HARRIS, 2014). A alta susceptibilidade das iDCs ao vírus, em comparação aos
macrófagos e monócitos, se deve provavelmente ao seu alto nível de expressão do
receptor DC-SIGN (SCHMID e HARRIS, 2014). Este receptor atua reconhecendo,
ligando e/ou internalizando diferentes classes de patógenos, gerando diferentes 15
respostas nas células envolvidas nesse reconhecimento ou até mesmo no
organismo como um todo (GRINGHUIS et al., 2009).
Devido ao processo de splicing alternativo, o gene CD209 que codifica para
este receptor tem a capacidade de gerar diversas isoformas da proteína, tanto de
membrana quanto solúveis. Dentre os poucos estudos envolvendo as isoformas 20
solúveis, os resultados obtidos não elucidaram completamente a função dessas
proteínas. Alguns autores observaram que elas poderiam contribuir com o aumento
da infecção, enquanto outros encontraram o inverso, a inibição da infecção viral
(KWON et al., 2002; BIGGINS et al., 2007; HIJAZI et al., 2011; PLAZOLLES et al.,
2011). Consequentemente, ainda é necessário o desenvolvimento de novos 25
trabalhos para avaliar qual é, de fato, a função dessas isoformas do DC-SIGN,
especialmente com relação à infecção pelo DENV, uma vez que os estudos
realizados previamente são relacionados ao vírus HIV e citomegalovírus.
Além disso, estudos já revelaram que um mesmo indivíduo pode apresentar
diferentes níveis de expressão de mRNA das isoformas do DC-SIGN o que poderia 30
contribuir para a variabilidade fenotípica associada à infecção por dengue.
(MUMMIDI et al., 2001; PLAZOLLES et al., 2011). A expressão dessas isoformas
também pode variar em diferentes condições fisiológicas, como a maior expressão
22
de sDC-SIGN em amostras de tecidos sob inflamação versus não inflamados.
(PLAZOLLES et al., 2011; JIANG et al., 2014). Todos estes estudos sugerem um
grande nível de complexidade relacionado à expressão das isoformas do DC-SIGN
no organismo humano. Complexidade a qual ainda precisa ser melhor
compreendida, avaliando o papel das variantes do DC-SIGN em determinadas 5
condições fisiológicas, como no caso de infecções virais.
Estudos anteriores do grupo de pesquisa da Profa. Dra. Luciana Lara dos
Santos (CCO/UFSJ) avaliaram a expressão gênica do DC-SIGN em indivíduos
saudáveis e detectaram a expressão de cinco isoformas do DC-SIGN. A modelagem
comparativa de quatro delas mostrou que duas perdiam os três sítios de Ca2+ do 10
DRC, o que levou a sugerir a perda da interação destas proteínas ao ligante, no
caso o DENV. Várias isoformas estão sendo avaliadas in vitro por este grupo de
pesquisa, tanto as que possivelmente perdem a interação ao ligante quanto à
isoforma deste estudo, que não possui alteração no DRC, mas que ainda não tem
papel definido no processo de infeção viral. 15
O DENV é capaz de infectar células de variadas linhagens, especialmente
monócitos, macrófagos e DCs, sendo que o nível de infecção varia de acordo com a
subpopulação dessas linhagens e também com a condição fisiopatológica do
indivíduo, como durante uma infecção primária ou secundária (SCHMID et al., 2014).
Esta variação pode ser relacionada ao DC-SIGN, pois o DENV infecta 20
preferencialmente uma célula alvo através do DC-SIGN quando níveis suficientes
deste receptor estão presentes, não ocorrendo a entrada do vírus via FcR nessa
condição (BOONNAK et al., 2008).
Além disso, devido ao papel ambíguo de inibição e aumento da infecção viral
promovido pelo sDC-SIGN, Plazolles e colaboradores (2011) propuseram um 25
modelo hipotético onde (i) em altas concentrações da proteína, os vírions são
rapidamente complexados, impedindo a sua ligação e internalização pela célula
hospedeira, mas (ii) em concentrações menores, em uma estequiometria “ótima”, o
sDC-SIGN atua como uma opsonina, levando a internalização do maior número de
vírions ligados ao sDC-SIGN; já (iii) em concentrações muito baixas, a maioria dos 30
vírions estão livres e o nível de infecção é semelhante àquele na ausência de sDC-
SIGN.
23
Desta forma, considerando a grande variação do nível de expressão do DC-
SIGN nas diversas células alvo do vírus, além de que o sDC-SIGN pode ser
secretado durante uma infecção viral, é difícil prever o que pode ocorrer no
microambiente fisiológico de um paciente durante a infecção pelo DENV
(PLAZOLLES et al., 2011; SHMID et al., 2014). Assim, estudos por meio da 5
expressão proteica das variantes do DC-SIGN e sua incubação junto ao DENV em
diferentes células alvo poderiam trazer um melhor entendimento acerca da função
das isoformas solúveis na interação com o DENV.
Portanto, frente ao desafio que a dengue representa à saúde pública, faz-se
necessário compreender melhor sua etiopatogênese. Estudos avaliando a 10
participação do DC-SIGN e suas variantes neste processo são importantes para
maiores esclarecimentos sobre o mecanismo da doença e, consequentemente, para
a avaliação da possibilidade de bloqueio da multiplicação viral no hospedeiro.
24
2. OBJETIVOS
2.1) Objetivo geral:
Avaliar o papel da sDC-SIGN1A tipo III na capacidade de infecção do Dengue
virus em monócitos e macrófagos.
5
2.2) Objetivos específicos:
Caracterizar a isoforma sDC-SIGN1A tipo III através de análises in silico;
Produzir e purificar a sDC-SIGN1A tipo III por expressão heteróloga;
Verificar se existe alteração na capacidade de infecção celular do Dengue
virus na presença ou ausência da proteína recombinante sintetizada em 10
monócitos e macrófagos.
25
3. METODOLOGIA
3.1) Análises in silico
A sequência de nucleotídeos que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo
III, assim como a sequência de aminoácidos da proteína, foram obtidas através do
GenBank, sob código de acesso AY042227.1e AAK91852.1, respectivamente. 5
Análises in silico foram realizadas utilizando softwares de bioinformática, a fim
de se determinar algumas características estruturais e físico-químicas da proteína.
Todas as ferramentas utilizadas nas análises estão disponíveis na Plataforma
ExPASy (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://www.expasy.org/tools/).
Um dos softwares utilizados foi o ProtParam (SIB Swiss Institute of 10
Bioinformatics, Suiça – http://web.expasy.org/protparam/), uma ferramenta de
proteômica capaz de calcular parâmetros físico-químicos de uma proteína, como a
massa molecular, ponto isoelétrico teórico, hidropaticidade (índice GRAVY),
composição de aminoácidos e de átomos, entre outros (GASTEIGER, 2003).
A localização celular da proteína foi estimada pelo PSORT (Human Genome 15
Center, Japão – http://www.psort.org/). Este software requer uma sequência
completa de aminoácidos de origem bacteriana, leveduriforme, vegetal ou animal.
De acordo com a origem assinalada, o programa atribui possíveis sítios de
localização da sequência de aminoácidos inserida. Então, ele calcula o valor de
variáveis referentes a características da sequência, interpreta estes valores e estima 20
a possibilidade de localização em cada um dos sítios atribuídos inicialmente,
mostrando o(s) mais provável(eis) entre eles (NAKAI e HORTON, 1999).
A busca por domínios proteicos funcionais foi realizada pelo ScanProsite (SIB
Swiss Institute of Bioinformatics, Suiça – http://prosite.expasy.org/scanprosite/). Este
software faz a identificação de combinações proteicas contra assinaturas do 25
PROSITE database, que é uma base de dados constituída por uma grande coleção
de assinaturas com relevância biológica que são descritas como padrões ou perfis,
usados para a detecção de motivos curtos ou perfis generalizados para detecção
sensível de maiores domínios (CASTRO et al., 2006).
A presença de modificações pós-traducionais foi analisada por dois softwares 30
diferentes, YinOYang e NetNGlyc (Center for Biological Sequence Analysis,
Dinamarca). Em sequências proteicas eucarióticas, essas ferramentas produzem
26
previsões de redes neurais para determinar sítios de ligação de O--GlcNAc
(YinOYang – http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/) e N-glicosilação no contexto
de sequons Asn-Xaa-Ser/Thr (NetNGlyc – http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc),
respectivamente.
Por fim, a presença do peptídeo sinal, que é uma sequência sinalizadora para 5
que a proteína recém-sintetizada seja secretada pela célula, foi analisada pelo
software SignalP (Center for Biological Sequence Analysis, Dinamarca –
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Pela combinação de várias redes neurais,
essa ferramenta é capaz de distinguir peptídeos sinais e não-sinais, além de
reconhecer seus sítios de clivagem, predizendo, assim, a presença e localização do 10
peptídeo sinal em sequências de aminoácidos de diferentes organismos procariotos
e eucariotos (NIELSEN et al., 1997).
3.2) Síntese do gene e vetor de expressão
A síntese da sequência de nucleotídeos do gene que codifica para a isoforma 15
sDC-SIGN1A tipo III foi realizada pela empresa DNA 2.0 (EUA), sendo incluída uma
cauda de histidina na porção C-terminal, para auxiliar na posterior identificação e
purificação da proteína . A sequência foi fornecida pela empresa já modificada com
os códons preferenciais para expressão em E. coli, para otimização da expressão, e
ligada ao vetor de expressão pJ414 (série pJexpress 411-416), que contém o 20
promotor T7 e gene de resistência à ampicilina (Figura 8).
27
Figura 8: Mapa do plasmídeo pJ414. A) Mapa simplificado do vetor pJ414 da série pJexpress. B) Mapa completo do plasmídeo pJ414, que contém o gene de resistência à ampicilina (Ampicillin-r_*), origem de replicação (Ori_pUC) e o promotor T7 (P_T7). 5
28
3.3) Ensaios de Biologia Molecular
3.3.1) Obtenção de bactérias eletrocompetentes
A linhagem utilizada neste trabalho foi E. coli BL21 DE3 Rosetta [F- ompT
hsdSB(rB- mB
-) gal dcm (DE3) pRARE (CamR)]. Esta cepa é transformada com o
plasmídeo pRARE, no qual codifica genes de tRNAs de códons raros para E. coli, 5
permitindo, assim, uma maior expressão de proteínas de outros organismos (Figura
9). Como parte da classe BL21, ela possui os genes das proteases lon e ompT
deletados, o que garante maior estabilidade de proteínas recombinantes utilizando
essa estirpe bacteriana. Além disso, assim como outras linhagens DE3, ela
apresenta a sequência do fago λDE3, levando, assim, uma cópia cromossomal do 10
gene da T7 RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5, o que a torna
adequada para a expressão de genes clonados em vetores sob o controle do
promotor T7, através da indução por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG –
NOVY et al., 2001; GOPAL e KUMAR, 2013).
15
Figura 9: Mapa do plasmídeo pRARE. Mapa do plasmídeo pRARE utilizado na transformação de linhagens E. coli para a criação de hospedeiros da série Rosetta™ para a maior expressão de genes contendo códons raros de E. coli. Adaptado de Novy et al. (2001). 20
O meio de cultura utilizado para o cultivo microbiano foi 2xYT [0,5% (p/v)
NaCl, 1% (p/v) extrato de levedura e 1,6% (p/v) peptona de carne], cujo pH foi
ajustado para 7,2. No caso de meio sólido para utilização em placas de Petri, foi
adicionado 1,5% (p/v) de ágar bacteriológico ao meio 2xYT. 25
29
Para obtenção de bactérias eletrocompetentes, primeiramente, foi realizado
um pré-inóculo de bactérias E. coli BL21 DE3 Rosetta em 10 mL de meio 2xYT
líquido e incubado em shaker orbital (Solab, Brasil) a 37 ºC a 180 rpm por 18 h. Após
este período, uma alíquota de 5 mL desta cultura foi transferida para 500 mL de
meio 2xYT e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a densidade ótica de 600 nm 5
(OD600) entre 0,20 e 0,25. Posteriormente, as células foram sedimentadas por
centrifugação a 1250 g, 4 ºC por 20 min. Então, foram realizadas sucessivas
lavagens do pellet: O meio de cultura foi descartado, o pellet ressuspendido em 80
mL de glicerol 10% gelado e nova centrifugação foi feita a 1250 g, 4 ºC por 20 min.
Esse processo de lavagem foi repetido com volumes decrescentes de glicerol 10%: 10
80 mL, 40 mL, 20 mL, 10 mL e 1 mL. Por fim, 25 L dessa suspensão celular foram
transferidos para 10 mL de glicerol 10% e a sua OD600 foi verificada, com valor
esperado de 0,15. Então, a suspensão celular de 1 mL foi aliquotada em microtubos
e armazenadas a -80 ºC.
15
3.3.2) Transformação de bactérias eletrocompetentes
As células eletrocompetentes de E. coli BL21 DE3 Rosetta foram
transformadas através de eletroporação. Em banho de gelo, 1 a 10 ng de DNA (vetor
com o gene de interesse) foram adicionados a 30 L das bactérias
eletrocompetentes. Após homogeneização, a mistura foi transferida para uma cubeta 20
de eletroporação de 0,2 cm (BioRad, EUA) e submetidas a um pulso elétrico de 250
V utilizando o programa Ec2 do eletroporador MicroPulser (BioRad, EUA). Em
seguida, as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio 2xYT, transferidas para
um microtubo de 1,5 mL e incubadas por 45 min, a 37 ºC, sob agitação constante de
180 rpm. Posteriormente, 75 L da cultura foram semeados em ágar 2xYT 25
suplementado com ampicilina (100 g/mL) e as placas foram incubadas em estufa a
37 ºC por 18 h.
Além da eletroporação com o plasmídeo recombinante, o mesmo
procedimento foi realizado utilizando o plasmídeo pUC18 sem inserto, a fim de
comprovar a eficiência das células (controle positivo), bem como também sem 30
adicionar qualquer amostra de DNA, permitindo detectar contaminações que possam
ocorrer no procedimento (controle negativo).
30
3.3.3) Extração plasmidial
Após o cultivo dos microrganismos submetidos à eletroporação, as colônias
que se cresceram no meio provavelmente haviam sido transformadas com o
plasmídeo recombinante. A partir destas colônias, um novo cultivo desses
microrganismos foi realizado para a sua purificação plasmidial em pequena escala 5
(miniprep).
Uma colônia isolada foi transferida para um tubo cônico de 15 mL estéril
contendo 10 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100 g/mL) e
incubado a 37ºC, por 18h a 180 rpm. Como controle negativo, para se detectar
contaminações, um tubo cônico contendo apenas meio de cultura suplementado 10
com ampicilina foi incubado nas mesmas condições anteriores. Após este período,
as células foram sedimentadas através de centrifugação a 18.000g por 10 min e o
DNA plasmidial foi extraído usando o kit comercial PureLink Quick Plasmid Miniprep
Kit (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo fornecido pela fabricante.
O produto da extração foi quantificado por espectrofotometria utilizando o 15
NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, EUA). O comprimento de onda para
dosagem de DNA foi de 260 nm. Além disso, foram utilizadas as razões 260/280 e
260/230 para a avaliação de contaminação do DNA com proteínas e contaminantes
orgânicos, respectivamente.
20
3.3.4) Confirmação da clonagem
Para a confirmação da presença do plasmídeo contendo a sequência da
isoforma sDC-SIGN1A tipo III nos microrganismos transformados, o DNA plasmidial
obtido no procedimento anterior (item 3.3.3) foi sequenciado pelo método de Sanger.
O sequenciamento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular (CCO/UFSJ). 25
A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit BigDye® Terminator
v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, EUA), seguindo as instruções
do fabricante. A reação foi preparada em um volume total de 10 L, contendo 100 ng
de DNA plasmidial e 1 mM do iniciador do promotor T7(5’-
TAATACGACTCACTATAGGG-3’). O programa usado no termociclador continha os 30
seguintes passos: desnaturação a 96 ºC por 1 min, 35 ciclos de desnaturação a 96
31
ºC por 15 s, anelamento a 50 ºC por 15 s e extensão a 60 ºC por 3 min. Por fim, o
produto foi mantido a 4 ºC por 4 min.
Após a retirada das amostras do termociclador, estas foram purificadas pelo
método de etanol/EDTA e ressuspendidas em 10 L de formamida HiDi® (Thermo
Fisher Scientific, EUA). Em seguida, foram levadas ao termociclador, permanecendo 5
a 95 ºC por 5 min e, posteriormente, resfriadas. Por fim, as amostras foram
analisadas por eletroforese capilar utilizando o sequenciador automático Genetic
Analyser 3500xL (Thermo Fisher Scientific, EUA). A sequência obtida foi analisada
no software Sequence Scanner Software 2.0 e MultAlin
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/), para confirmar a qualidade do 10
sequenciamento e a similaridade entre a sequência obtida e aquela fornecida pelo
fabricante do vetor de expressão.
3.3.5) Expressão da proteína recombinante em pequena escala
Inicialmente, uma expressão em pequena escala em diferentes temperaturas 15
foi realizada para otimizar as condições experimentais da produção da proteína
recombinante, para que, posteriormente, fosse feita uma expressão em larga escala
para a sua purificação e utilização nos testes in vitro.
Uma colônia isolada após transformação com o vetor de expressão foi
inoculada em 10 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100 g/mL) e 20
incubada a 37 ºC, por 18 h a 180 rpm. Em seguida, uma alíquota de 200 L desta
cultura foi transferida para 20 mL de meio 2xYT suplementado com ampicilina (100
g/mL) e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a fase exponencial de crescimento,
com OD600 entre 0,6 e 0,8, cerca de 5 h. Ao atingir a OD desejada, 2 mL de cada
cultura foram retirados e armazenados a 4 ºC para utilização como controle (não-25
induzido; T0). A expressão foi induzida através da adição de 0,5 mM de IPTG à
cultura remanescente, seguida de incubação à 18 ºC por 18 h sob agitação
constante de 180 rpm. Novas alíquotas de 2 mL foram retiradas após 4 (T4) e 18 h
de indução (tempo final; T18), sendo armazenadas a 4 ºC. Com o objetivo de
padronizar a temperatura de expressão, todo o procedimento descrito acima foi 30
repetido, porém a incubação após a indução com IPTG foi realizada a 37 ºC por 4 h,
sendo as alíquotas retiradas após 2 (T2) e 4 h de indução (tempo final; T4).
32
Para a confirmação da expressão, as amostras foram centrifugadas a 18.000
g por 10 min, o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido em 40 L de água
Milli-Q e 40 L de tampão de amostra DTT 2X (100 mM Tris-HCl pH 6,8; 200 mM
DTT; 4% dodecil sulfato de sódio [SDS]; 0,2% azul de bromofenol; 20% glicerol).
Posteriormente, as amostras foram fervidas a 100 ºC por 5 min para lise das células, 5
centrifugadas a 18.000 g por 3 min e analisadas através de eletroforese em gel de
poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) e Western blot (procedimentos descritos
abaixo, nos itens 3.3.7 e 3.3.8).
Para verificar a necessidade de purificação em condições desnaturantes,
posteriormente, uma nova expressão foi realizada a 18 ºC por 18 h e a cultura ao 10
final da expressão foi submetida a outro tratamento. Após uma centrifugação inicial a
1250 g por 20 min a 4ºC, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em
2 mL de tampão de ligação da coluna (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; pH 7,4). Em
seguida, essa amostra foi submetida a 5 ciclos de congelamento e
descongelamento, a -20 e 37 ºC, para lise inicial das células. A seguir, as células 15
foram sonicadas com 5 pulsos de 30 s, na potência de 45 do Desruptor de Célula
Ultrassônico (UNIQUE, Brasil) para a liberação das proteínas de corpos de inclusão.
Posteriormente, a amostra foi centrifugada novamente a 1250 g por 20 min a 4ºC,
sendo o sobrenadante coletado, no qual foi adicionado tampão de amostra DTT 2X
(relação 1:1 amostra/tampão). O pellet foi ressuspendido em 40 L de água Milli-Q e 20
40 L de tampão de amostra DTT 2X. Por fim, as amostras foram fervidas a 100 ºC
por 5 min, centrifugadas a 18.000 g por 3 min e analisadas por SDS-PAGE e
Western blot.
3.3.6) Expressão da proteína recombinante em larga escala 25
A expressão em larga escala foi realizada para produção da proteína
recombinante em quantidade suficiente para a sua purificação. Uma colônia isolada
após transformação com o vetor de expressão foi inoculada em 10 mL de meio 2xYT
suplementado com ampicilina e incubada a 37 ºC, por 18 h a 180 rpm. Em seguida,
uma alíquota de 5 mL desta cultura foi transferida para 500 mL de meio 2xYT 30
suplementado com ampicilina e incubada a 37 ºC a 180 rpm até atingir a fase
exponencial de crescimento, com OD600 entre 0,6 e 0,8, cerca de 5 h. Então, a
33
expressão foi induzida através da adição de 0,5 mM de IPTG à cultura
remanescente, seguida de incubação a 18 ºC por 18 h sob agitação constante de
180 rpm. Alíquotas de 2 mL foram retiradas antes (T0) e após 18 h de indução
(tempo final; T18), sendo armazenadas a 4 ºC.
Decorrido o tempo necessário para a expressão da proteína recombinante, a 5
cultura restante foi centrifugada a 1250 g por 20 min a 4ºC, o sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspendido em 100 mL de tampão de ligação da coluna
acrescido de 5 M de ureia. Para facilitar o manejo nos procedimentos seguintes, a
amostra foi dividida em 4 tubos cônicos com volumes iguais. Em seguida, as
amostras foram submetidas a 5 ciclos de congelamento e descongelamento, a -20 e 10
37 ºC, e sonicadas com 5 pulsos de 30 s, na potência de 45 do desruptor de células
para a liberação das proteínas de corpos de inclusão. Após isso, as amostras foram
centrifugadas novamente a 1250 g por 20 min a 4 ºC e os sobrenadantes
transferidos para novos tubos falcon. A expressão foi confirmada através da análise
por SDS-PAGE e Western blot antes de iniciar a purificação. 15
3.3.7) Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
Para avaliar a expressão da proteína recombinante, uma das técnicas
empregadas neste trabalho foi a SDS-PAGE, que permite avaliar a possível
produção da proteína de interesse através da comparação com um padrão de peso 20
molecular.
As amostras foram submetidas à SDS-PAGE constituída de um gel de
empacotamento (5%) e um gel de separação (15%), sendo aplicadas 10 L de cada
amostra, exceto as alíquotas antes da indução, que foram 20 L para manter uma
proporção aproximada de células por amostra, e 7 L do padrão de peso molecular 25
BenchMark 10-220 kDa (Thermo Fisher Scientific, EUA). A corrida foi efetuada a 80
V em tampão tris-glicina (25 mM Tris base; pH 8,3; 250 mM glicina; 0,1% SDS) até
as amostras passarem o gel de empacotamento (cerca de 45 min), e então, a tensão
elétrica foi alterada para 100 V e mantida até as amostras chegarem ao final do gel
(aproximadamente 3 h). Por fim, o gel foi corado com uma solução de Azul de 30
Coomassie (0,25% Azul de Coomassie R250; 50% metanol; 10% ácido acético) por
34
cerca de 4 h e lavado várias vezes com solução descorante (50% metanol; 10%
ácido acético) até que fosse possível visualizar as bandas nitidamente.
3.3.8) Western blot
A confirmação da expressão da proteína de interesse foi realizada através da 5
imunodetecção por Western blot, que permite a sua identificação através da ligação
de um anticorpo (conjugado à fosfatase alcalina) à cauda de histidina, a qual está
presente principalmente nas proteínas recombinantes, revelando-as na membrana
somente quando estão presentes na amostra, ou seja, quando forem expressas.
Inicialmente, as amostras foram separadas por SDS-PAGE conforme descrito 10
anteriormente (item 3.3.7) e transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose
com poro de 0,45 m de diâmetro (Thermo Fisher Scientific, EUA) em um tampão de
transferência tris-glicina (20% metanol; 25% tampão 4X –0,025 M Tris base, 0,192 M
glicina, pH 8,3) por 3 h, com corrente elétrica fixada em 300 mA.
A transferência foi confirmada através da coloração da membrana com 15
solução de Ponceau (1,6x10-4 M ponceau xilidina; 5% ácido acético glacial). Após a
confirmação, a membrana foi lavada com água destilada e incubada por 18 h em
solução de bloqueio (10% leite desnatado em pó; 0,05% de Tween 20; PBS 1X – 5,8
M NaCl, 7,4 M KCl, 14,2 M Na2HPO4, 13,6 M KH2PO4) sob agitação constante.
Posteriormente, a membrana foi lavada 3X por 10 min com solução de 20
lavagem (PBS 1X; 0,05% Tween 20; pH 8) e incubada com anticorpo monoclonal
anti-histidina conjugado à fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich, EUA) em solução de
lavagem na proporção 1:2000 por 2 h sob agitação constante. Após este período, a
membrana foi novamente lavada 3X por 10 min com solução de lavagem e incubada
com a solução substrato NBT/BCIP (0,02% Nitro Blue Tetrazolium; 0,016% 5-bromo-25
4-cloro-3-indolil-fosfato; tampão fosfatase alcalina – 100 mM tris-HCl pH 9,5, 100 mM
NaCl, 5 mM MgCl2) (Thermo Fisher Scientific, EUA) até o aparecimento das bandas
na membrana. Por fim, a mesma foi lavada com água deionizada e mantida em
temperatura ambiente até que secasse completamente, antes de ser fotografada.
30
35
3.3.9) Purificação da proteína recombinante
A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade
utilizando a coluna HiTrap TALON® crude (GE Healthcare, EUA), de acordo com o
protocolo fornecido pela fabricante. Esta coluna é constituída de uma resina de
agarose e íons cobalto imobilizados, a qual permite a sua ligação às proteínas 5
contendo uma cauda de histidina, com capacidade de ligação de até 20 mg de
proteínas. A coluna foi acoplada a uma bomba peristáltica, cujo fluxo foi ajustado
para 1 mL/min. Primeiramente, a coluna foi equilibrada com 10 mL do tampão de
ligação contendo ureia 5 M (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; 5 M CO(NH2)2; pH 7,4).
Posteriormente, 50 mL do lisado celular foram aplicados, com fluxo de 0,4mL/min. 10
Em seguida, foram feitas sucessivas lavagens para remoção de proteínas com
interações inespecíficas com o íon cobalto, ao mesmo tempo em que era promovido
o reenovelamento da proteína recombinante, uma vez que o tampão de ligação
continha ureia como agente desnaturante (SINGH e PANDA, 2005). Para isto, foram
aplicados, consecutivamente, 30 mL de cinco soluções contendo concentrações 15
decrescentes de ureia: 4, 3, 2, 1 e 0 M. Por fim, a proteína foi eluída da coluna com
10 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl; 500 mM imidazol; pH
7,4) e armazenadas a -20 ºC. As alíquotas foram dosadas pelo método de Bradford
e analisadas por SDS-PAGE e Western blot para verificação da sua pureza.
20
3.3.10) Dosagem de proteínas
Inicialmente, uma curva padrão de concentração de proteínas utilizando
albumina bovina sérica (BSA) foi preparada em uma placa de 96 poços. As
concentrações de BSA variaram de 0 a 100 g/mL, no volume de 20 L. Com
relação às amostras, foram adicionados 5 L de cada alíquota e 15 L de água Milli-25
Q. Também foram utilizados 20 L de água Milli-Q como branco das reações. Em
seguida, foram adicionados 180 L de reagente de Bradford em todos os poços. As
reações foram realizadas em duplicata. Por fim, a absorbância foi mensurada em
comprimento de onda de 595 nm utilizando o leitor de microplacas PowerWave XS2
(Biotek, EUA) e a concentração proteica determinada com base na curva padrão de 30
BSA.
36
3.4) Cultura de células
3.4.1) Células e vírus
Células de linhagem contínua de larvas de mosquito Aedes albopictus C6/36
as quais foram obtidas originalmente da American Type Culture Collection (ATCC;
EUA) foram utilizadas para a multiplicação de DENV-2. As células foram cultivadas 5
em frascos de 25 cm² utilizando meio Leibovitz L-15 (Cultilab, Brasil) contendo 10%
de Soro Fetal Bovino (SFB; Sigma-Aldrich, EUA), 0,3% de solução penicilina-
estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2 mg/mL; Sigma-Aldrich,
EUA). A cultura foi incubada em estufa de Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD)
a 28 ºC. 10
Para a realização da titulação do DENV-2, células Baby Hamster Kidney
fibroblasts (fibroblastos de Rim de Hamster Bebê – BHK-21; ATCC, EUA) foram
cultivadas em frascos de 25 cm², usando meio Mínimo Essencial de Eagle
Modificado por Dulbecco (DMEM; Cultilab, Brasil) contendo 5% SFB, 0,3% de
solução penicilina-estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2 15
mg/mL; Sigma-Aldrich, EUA). As culturas foram incubadas em estufa de atmosfera
umidificada, de 5% de CO2, a 37 ºC.
As linhagens celulares foram repicadas a cada 2-3 dias. A monocamada
celular foi previamente lavada com tampão salina fosfato (PBS; 4 mM Na2HPO4, 2
mM KH2PO4, 150mM NaCl, pH 7,2), desprendida do frasco enzimaticamente com 20
tripsina/EDTA 0,05% (Thermo Fisher Scientific, EUA) e homogeneizada. Quando
necessário, a contagem do número de células foi realizada utilizando câmara de
Neubauer. Posteriormente, a suspensão celular foi transferida para outro frasco
estéril e adicionado o meio de cultura adequado.
A linhagem monocítica THP-1 foi utilizada para a realização dos ensaios 25
funcionais da sDC-SIGN1A tipo III produzida neste trabalho. As células foram
cultivadas em Meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI; Cultilab, Brasil),
suplementado com 10% SFB, 0,01 M de HEPES (Sigma-Aldrich, EUA), 0,3% de
solução penicilina-estreptomicina-anfotericina B (10.000 U/mL + 10 mg/mL + 2
mg/mL; Sigma-Aldrich, EUA), na concentração de 1 x 105 células/mL. 30
Posteriormente, as células foram transferidas para frascos de 25 cm² e incubadas
em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC. As células foram
37
cultivadas trocando metade do volume de cultura pelo volume equivalente de meio
de cultura suplementado a cada 2 dias.
3.4.2) Produção e purificação parcial de DENV-2
A produção de estoque viral utilizado nos ensaios de infecção foi realizada de 5
acordo com Souza e colaboradores (2009). Células C6/36 foram cultivadas em
frascos de 25 cm² até apresentar 80-90% de confluência, lavadas com PBS e
infectadas com DENV-2, com uma multiplicidade de infecção de 0,01, em 2 mL de
meio L-15 sem SFB. As células foram incubadas em estuda BOD a 28 ºC por 1 h
para adsorção do vírus, sendo agitadas a cada 10 min. Após esse período, 3 mL de 10
meio L-15 com 2% SFB foram adicionados e incubadas novamente em estufa BOD
a 28 ºC por 4-7 dias. Como cultura controle, o mesmo procedimento descrito acima
foi realizado em outro frasco de 25 cm², porém sem a adição do DENV-2.
As células foram monitoradas diariamente ao microscópio óptico invertido,
observando a apresentação de efeito citopático (ECP), que são a formação de 15
sincícios e vacuolizações, indicando a ocorrência de multiplicação viral nessas
células. Após apresentar ECP acima de 70% em relação à cultura controle (não
infectada), as células foram submetidas a ciclos de congelamento/descongelamento
(-20 ºC/28 ºC), o sobrenadante foi coletado e clarificado. Nesta etapa, os restos
celulares (pellet) foram separados da suspensão viral (sobrenadante) por 20
centrifugação a 1600 g a 4 ºC, por 30 min. O sobrenadante foi coletado e
armazenado a -80 ºC até o momento do uso.
3.4.3) Titulação de DENV-2
O título de DENV-2 foi estimado pelo método de TCID50 (50% Tissue Culture 25
Infective Dose) adaptado de Li e colaboradores (2011). Para isto, células BHK-21
foram semeadas em placas de 96 poços, em concentração final de 1 x 104
células/poço em meio DMEM com 5% SFB e incubadas em estufa de atmosfera
umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC, por 24 h. Posteriormente, o meio foi retirado e
100 L de cada uma das diluições seriadas (100 a 10-6) das amostras virais foram 30
adicionados em 4 replicatas. A placa foi incubada em estufa de atmosfera
umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 1 h, agitando-a a cada 10 min, para
38
permitir a adsorção do vírus. Em seguida, o sobrenadante foi descartado para
remover o excesso de vírus não adsorvido e a monocamada foi coberta com 200 L
de meio DMEM contendo 2% SFB. A placa foi novamente incubada em estufa de
atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 5 a 7 dias, observando-se o
desenvolvimento de ECP diariamente através de microscópio óptico invertido. O 5
título viral, expresso em TCID50/mL, foi calculado através do método de Spearman e
Kärber, descrito por Hierholzer e Killington (1996).
3.4.4) Diferenciação da linhagem THP-1 em macrófagos
Para a realização dos ensaios funcionais utilizando sDC-SIGN1A tipo III, 10
células THP-1 foram diferenciadas em macrófagos, de acordo com Chanput e
colaboradores (2013), com modificações.
As células THP-1 foram estimuladas por 48 h com acetato miristato de forbol
(PMA – phorbol 12-myristate 13-acetate), seguido por uma fase de repouso na
ausência de PMA por 24 h, antes da realização dos ensaios funcionais. Para isto, as 15
células THP-1 foram coletadas por centrifugação a 350 g, por 10 min, e
ressuspendidas em meio RPMI com 10% SFB na concentração de 1 x 105
células/mL. Posteriormente, 1 mL/poço da suspensão celular foram colocados em
placas de 24 poços e 100 ng/poço de PMA foram adicionados. Em seguida, as
células foram incubadas por 48 h em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de 20
CO2, a 37 ºC. Após este período, o sobrenadante foi removido e 1 mL de meio RPMI
com 10% SFB foi adicionado e as células foram novamente incubadas por 24 h em
estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC.
As células foram observadas diariamente em microscópio óptico invertido
para visualização da alteração da morfologia celular. Além disso, dois poços foram 25
utilizados como controle da diferenciação, sendo coletados os sobrenadantes após a
estimulação com PMA e a contagem foi feita na câmara de Neubauer para
determinar a aderência das células.
3.4.5) Ensaios funcionais 30
Os ensaios funcionais foram realizados utilizando monócitos e macrófagos, a
fim de avaliar uma possível alteração da isoforma sDC-SIGN1A tipo III sobre a
39
infecção do DENV-2. Estes ensaios foram baseados em testes realizados por
Diamond e colaboradores (2000) e Plazolles e colaboradores (2011).
Para os ensaios utilizando macrófagos, após a diferenciação das células
THP-1 descrita no item 3.4.4, o sobrenadante foi removido e as células aderentes
foram incubadas com DENV-2 (MOI de 1) na presença da proteína recombinante 5
(1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 ng/mL), volume total de 200 L em meio
RPMI sem SFB, em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 ºC por 2
h, agitando-se a placa cada 15 min, para permitir a adsorção do vírus.
Posteriormente, o volume foi completado para 1 mL com meio RPMI 2% SFB e as
células foram novamente incubadas em estufa de atmosfera umidificada, com 5% de 10
CO2, a 37 ºC por 72 h.
Para os testes com monócitos, as células THP-1 foram coletadas por
centrifugação a 350 g, por 10 min, ressuspendidas em meio RPMI 1640 e semeadas
em placa de 24 poços na concentração de 1 x 105 células/poço. Em seguida, as
células foram incubadas com DENV-2 e a proteína recombinante nas mesmas 15
condições do ensaio com macrófagos, descritas no parágrafo anterior.
Como controles, as células também foram incubadas com DENV-2 na
ausência da proteína recombinante (controle de infecção) ou adicionando-se o
volume equivalente de tampão da proteína recombinante (controle negativo – 50 mM
NaH2PO4; 300 mM NaCl; pH 7,4). Os ensaios foram realizados em duplicatas. Em 20
todos os testes, após a incubação final, o sobrenadante foi coletado e centrifugado a
350 g, por 10 min, previamente à quantificação da carga viral pelo ensaio de TCID50
(item 3.4.3) e Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR – item
3.4.6).
25
3.4.6) Quantificação de RNA viral
Para a quantificação da carga viral nos ensaios funcionais, a construção de
uma curva padrão foi necessária para a quantificação relativa do RNA viral das
amostras. Para isto, o RNA de uma amostra de DENV-2 com título viral conhecido,
determinado por TCID50, foi extraído utilizando o kit RTP® DNA/RNA Virus Mini Kit 30
(STRATEC Molecular, Alemanha), segundo as instruções da fabricante. O produto
obtido foi quantificado por espectrofotometria usando NanoDrop 2000c (Thermo
40
Fisher Scientific, EUA), aliquotado em volumes de 10 μL e armazenados a -80°C até
a realização da Transcrição Reversa por Reação em Cadeia da Polimerase (RT-
PCR) em termociclador Veriti™ Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os
iniciadores utilizados neste trabalho foram descritos por Yong e colaboradores
(2007). 5
Na síntese de cDNA por RT-PCR, inicialmente foi realizada uma etapa de
linearização incubando 1 g da amostra de RNA e 30 pmoles de iniciador reverse
(5’-AAG ACA TTG ATG GCT TTT GA-3’), por 10 min a 70 ºC. Em seguida, 0,4 mM
de dNTP’s, o tampão de reação (50 mM Tris-HCl, 75 mM de KCl, 3 mM MgCl2 e 10
mM de DTT pH 8,3 a 25 °C) e 200 U de Moloney Murine Leukemia Virus Reverse 10
Transcriptase (MMLV-RT – New England BioLabs, EUA) foram adicionados ao RNA
linearizado e a reação foi incubada a 50 ºC por 50 min. O volume total de reação foi
25 L.
O cDNA foi amplificado através de PCR convencional para verificar o
resultado a RT-PCR. Para padronização da concentração de cDNA para 15
amplificação, o cDNA foi previamente diluído nas razões 1:10, 1:50 e 1:100, sendo
adicionados ao tubo de reação: 2 L de cDNA, 0,2 mM de dNTP’s, tampão da DNA
polimerase 10x (10mM Tris-HCl, 200mM de KCl, 50 mM (NH4)SO4, pH 8,3 a 25°C), 2
mM MgCl2, 10 pmoles de cada iniciador (forward: 5’-AGT TGT TAG TCT ACG TGG
ACC GAC A-3’; reverse: 5’-AAG ACA TTG ATG GCT TTT GA-3’) e 1 U de Taq DNA 20
Polimerase (Ludwig Biotecnologia, Brasil). O volume total de reação foi 25 L e as
condições de amplificação foram: uma etapa a 94 ºC por 1 min; 30 ciclos de
desnaturação a 94 ºC por 30 s, anelamento a 57 ºC por 30 s e extensão a 72 ºC por
30 s; etapa final a 72 ºC por 10 min.
Para visualização dos produtos da PCR, foi realizada a eletroforese em gel de 25
poliacrilamida 8%, sendo aplicados 8 L de cada amostra junto a 3 L de tampão de
amostra 6X (New England BioLabs, EUA), além de 5 L de padrão de massa
molecular de 100 pb (LowRanger 100 bp DNA Ladder – Norgen Biotek, Canadá) e 7
L de padrão de massa molecular de 50 pb (Ludwig Biotecnologia, Brasil) . A corrida
foi efetuada a 100 V em tampão tris-borato-EDTA (TBE – 89 mM Tris base; 89 mM 30
B(OH)3; 2 mM EDTA; pH 8,3), com duração de cerca de 3 h. Por fim, o gel foi
revelado por coloração com nitrato de prata, sendo ele imerso em 20 min em
41
solução fixadora (60% etanol e 0,3% ácido acético), 20 min em solução corante
(0,1% AgNO3) e, após lavagem com água destilada, mergulhado em solução
reveladora (3% NaOH e 0,1% formaldeído) até que fosse possível visualizar as
bandas.
Para quantificação do RNA viral, o cDNA foi diluído em série (10-1 a 10-5) e 5
amplificado por qPCR, cuja reação de volume final de 10 L continha: 2 L de cDNA,
10 pmoles de cada iniciador e 5 L de PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix
(Thermo Fisher Scientific, EUA). As condições da reação foram: 50 ºC por 2 min; 95
ºC por 2 min; 40 ciclos a 95 ºC por 30 s e 57 ºC por 30 s. Ao final da reação, as
amostras foram aquecidas gradualmente, de 57 ºC a 93 ºC, para a construção das 10
curvas melting. Os gráficos, curvas melting e valores de cycle quantification (Cq)
foram gerados automaticamente pelo equipamento Eco™ Real-Time PCR System
(Illumina, EUA).
42
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1) Caracterização da sDC-SIGN1A tipo III através de análises in silico
A sequência de nucleotídeos que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo
III e sua sequência de aminoácidos foram obtidas pelo GenBank e estão
apresentadas abaixo (Figura 10). 5
Figura 10: Sequência gênica e proteica da isoforma sDC-SIGN1A tipo III. A) Sequência do cDNA do sDC-SIGN1A tipo III gerado a partir do splicing alternativo do gene CD209. B) Sequência de aminoácidos da isoforma sDC-SIGN1A tipo III
10
Uma análise de bioinformática foi realizada utilizando os softwares
ProtParam, PSORT, ScanProsite, YinOYang, NetNGlyc e SignalP, o que possibilitou
determinar algumas características da proteína que seriam relevantes para os
experimentos in vitro realizados posteriormente.
Através da análise do programa ProtParam, foi verificado que a sDC-SIGN1A 15
tipo III é composta por 268 resíduos de aminoácidos, com massa molecular de 30,4
kDa e ponto isoelétrico (pI) teórico de 5,13. O grau de hidropaticidade calculado foi
de -0,693, indicando que a sequência possui um caráter hidrofílico, que seria de uma
proteína solúvel. Além disso, conforme análise pelo software PSORT, a localização
mais provável da proteína seria no citoplasma. Uma vez que a isoforma do DC-SIGN 20
em estudo é considerada solúvel por não possuir o domínio transmembrana, cujo
43
éxon codificante é eliminado no processo de splicing alternativo do seu pré-RNAm, o
resultado da análise pelo PSORT era esperado (MUMMIDI et al., 2001).
Com relação à estrutura da proteína em estudo, o ScanProsite indicou que
esta possui um domínio de lectina do tipo C entre os resíduos 127 e 242. Este
resultado era esperado, uma vez que o DC-SIGN é considerado um receptor de 5
lectina do tipo C (GEIJTENBEEK et al., 2000b). Além disso, foram indicadas duas
possíveis pontes dissulfeto envolvendo os resíduos 148-241 e 220-233. Essas
pontes provavelmente fazem parte do domínio de lectina do tipo C, uma vez que
esses resíduos estão compreendidos dentro da sequência deste domínio e também
porque quatro cisteínas são consideradas os resíduos mais conservados em 10
domínios proteicos desse tipo, formando dois loops em sua estrutura secundária, os
quais estão presentes na região envolvida com a ligação a carboidratos Ca2+-
dependente (ZELENSKY E GREADY, 2005).
Os programas YinOYang e NetNGlyc indicaram possíveis sítios de
glicosilação na sequência de aminoácidos da isoforma sDC-SIGN1A tipo III. 15
Especificamente, 6 possíveis sítios de O-glicosilação foram detectados pelo
YinOYang, sendo três deles com score de menor força (+) e um de maior força
(+++), conforme indicado na Figura 11A, onde os possíveis sítios possuem valores
de potencial (picos em verde) acima do limiar (linha em azul). Também foi detectado
um provável sítio de N-glicosilação pelo NetNGlyc (score de força +++; Figura 11B). 20
No entanto, essa modificação pós-traducional provavelmente não ocorreria in vivo,
uma vez que é improvável que a proteína seja exposta à maquinaria de N-
glicosilação da célula eucariótica devido à ausência do peptídeo sinal, resultado
indicado pelo software SignalP (Figura 11C). Na ausência do peptídeo sinal, a
proteína, que é sintetizada pelos ribossomos no citoplasma, não é reconhecida por 25
uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP –signal recognition particle), etapa
inicial do endereçamento de proteínas SRP-dependente para o retículo
endoplasmático, e, consequentemente, não é transportada para este compartimento
celular, local onde ocorre o processo de N-glicosilação (KEENAN et al., 2001).
30
44
Figura 11: Predições de glicosilações e peptídeo sinal. A) Seis possíveis sítios de O-glicosilação foram detectados pelo software YinOYang, sendo eles nos resíduos 2 (+), 17 (++), 22 (++), 24 (+), 172 (+) e 262 (+++). A força do score é classificada qualitativamente em +, ++, +++ ou ++++. B) O software NetNGlyc 5 detectou um potencial sítio de N-glicosilação, localizado no resíduo 36 (+++). C) A predição de peptídeo sinal pelo software SignalP não detectou um peptídeo sinal na sequência analisada, conforme indicado pela ausência de valores de score acima do limiar (linha tracejada em roxo). 10
45
4.2) Expressão e purificação da sDC-SIGN1A tipo III
Após a obtenção de bactérias eletrocompetentes e sua transformação com o
vetor de expressão contendo o gene que codifica para a isoforma sDC-SIGN1A tipo
III, o DNA plasmidial foi extraído a fim de amplificar o estoque do vetor de
expressão. A leitura por espectrofotometria do produto de miniprep apresentou 5
valores das razões (260/280 e 260/230) próximos de 2,00, sendo considerada como
uma amostra pura (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Além disso, não foi observada
qualquer alteração na sequência de nucleotídeos, conforme análise do
eletroferograma do sequenciamento e do alinhamento da sequência obtida com a
sequência referência do vetor de expressão (Figura 12). Ademais, anterior ao códon 10
de parada da tradução (TAA, destacado no quadrado em verde na Figura 12),
podem ser observados os nucleotídeos correspondentes à cauda de histidina (CAT
CAC CAC CAC CAT CAT, destacados no quadrado em azul na Figura 12),
constituída de 6 resíduos deste aminoácido, adicionada à sequência como estratégia
para a realização das etapas posteriores de imunodetecção e purificação da 15
proteína recombinante.
46
Figura 12: Alinhamento da sequência proveniente do sequenciamento do produto de miniprep. As sequências do plasmídeo fornecida pela empresa (pJ414), do produto de miniprep (seq_miniprep) e da sDC-SIGN1A tipo III acrescida dos nucleotídeos referentes à cauda de histidina (gene_sDC-SIGN1A_III) foram 5 alinhadas. Nenhuma alteração na sequência foi observada. As sequências da cauda de histidina e do códon de parada da tradução foram destacadas nos quadrados azul e verde, respectivamente. O alinhamento foi realizado pelo software MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/).
10
Uma vez que a sequência estava correta, foi realizada a expressão da
proteína recombinante. Inicialmente, foram realizadas duas expressões “piloto” em
pequena escala, sendo uma a 37 ºC por 4 h e outra a 18 ºC por 18 h, para analisar
qual temperatura seria mais adequada para a produção da proteína. Para confirmar
a expressão, foi feito um gel SDS-PAGE 15% (Figura 13A) e a imunodetecção por 15
Western blot (Figura 13B), onde foram aplicadas as amostras coletadas nos tempos
0 (não-induzido), 2 e 4 h de expressão a 37 ºC e nos tempos 0, 4 e 18 h de
expressão a 18 ºC.
47
Foi possível observar no SDS-PAGE (Figura 13A) o aparecimento de uma
banda de massa molecular compatível com a análise in silico (30,4 kDa) nos tempos
intermediários (2 e 4 h) e finais (4 e 18 h) de expressão. Isso indica que, em ambas
as condições testadas, a proteína estava sendo mais expressa em relação às outras
proteínas constitutivas da célula bacteriana, que mantiveram o mesmo nível de 5
produção nos tempos analisados.
Utilizando a estratégia de fusão da cauda de histidina à proteína
recombinante, foi possível realizar a confirmação da expressão da sDC-SIGN1A tipo
III através da sua imunodetecção utilizando anticorpos anti-histidina. Isso pode ser
visualizado na Figura 13B, onde houve a revelação de uma banda na altura 10
esperada (30,4 kDa) em ambas as condições de expressão avaliadas.
48
Figura 13: Análise da expressão da sDC-SIGN1A tipo III recombinante. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue: 1 – padrão de proteínas; 2 e 5 – lisado celular antes da indução da expressão por IPTG 0,5 mM; 3 e 4 – lisado após 2 e 4 h de expressão a 37 ºC, respectivamente; 6 e 7 – lisado após 4 e 18 h de expressão a 5 18 ºC, respectivamente. B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose: 1 – padrão de proteínas; 2 – controle positivo (proteína Mug, de Corynebacterium pseudotuberculosis, com massa molecular de 25 kDa); 3 e 6 – lisado celular antes da indução da expressão por IPTG; 4 e 5 – lisado após 2 e 4 h de expressão a 37 ºC, respectivamente; 7 e 8 – lisado após 4 e 18 h de expressão a 10 18 ºC, respectivamente. Indicações de massa molecular em kDa.
49
A produção de proteínas pode ser realizada utilizando diversos organismos,
como bactérias, leveduras, fungos filamentosos, células de mamíferos e vegetais,
entre outros (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). Entre estes sistemas, a produção de
uma proteína eucariótica utilizando um organismo procarioto apresenta uma
desvantagem, que é a incapacidade de grande parte das bactérias realizarem 5
glicosilação, uma modificação pós-traducional comum em proteínas eucarióticas,
devido à ausência da maquinaria de pós-tradução necessária para esse processo.
Consequentemente, a produção de proteínas glicosiladas utilizando um organismo
procarioto pode não ser adequada (SAHDEV et al., 2008). Assim, a produção em E.
coli é preferencial quando a proteína de interesse não é glicosilada. Porém, há 10
alguns anos, Wacker e colaboradores (2002) realizaram a descoberta de um sistema
de N-glicosilação em Campylobacter jejuni e a sua transferência com êxito para E.
coli. Ainda que os glicanos sejam diferentes daqueles encontrados em eucariotos,
esse avanço pode representar um importante marco na produção de proteínas
recombinantes. Desta forma, linhagens mutantes E. coli podem vir a ser utilizadas 15
na produção de proteínas glicosiladas para aplicações na pesquisa e indústria
(CHEN, 2012).
Apesar de sistemas eucariotos serem a alternativa mais apropriada para
contornar esse problema, leveduras, fungos filamentosos e células de insetos, por
exemplo, são geneticamente incapazes de realizar glicosilações como as células de 20
mamíferos. Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) são capazes de mimetizar
a glicosilação humana, no entanto, esse processo tem um custo elevado e as
glicoproteínas produzidas não possuem exatamente o mesmo padrão de
glicosilação humana (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). Isso ocorre, por exemplo,
devido às células CHO apresentarem menor taxa de sialilação de proteínas quando 25
comparada com células humanas, a utilização de ácido N-glicosilneuramínico, que é
uma forma de ácido siálico não encontrado em células humanas, entre outras
diferenças (BROOKS, 2006).
A bactéria E. coli é uma importante opção utilizada, geralmente, para a
produção de pequenas proteínas, até 30 kDa, enquanto as maiores são expressas 30
em organismos eucariotos (DEMAIN e VAISHNAV, 2009). O uso desse
microrganismo como maquinaria para a produção de proteínas recombinantes
apresenta diversas vantagens, como rápido crescimento celular a partir de
50
substratos de baixo custo, genoma bem conhecido, alto nível de expressão, entre
outras (SAHDEV et al., 2008; ROSANO e CECCARELLI, 2014). Além disso, outros
estudos envolvendo o DC-SIGN foram desenvolvidos utilizando E. coli como sistema
de expressão heteróloga, obtendo-se proteínas plenamente funcionais (KWON et al.,
2002; HALARY et al., 2002; NAVARRO-SANCHEZ et al., 2003; HIJAZI et al., 2011; 5
PLAZOLLES et al., 2011). Por isso, esse microorganismo foi selecionado para a
produção recombinante neste trabalho.
Em contraste com o alto rendimento de expressão em E. coli, a formação de
corpos de inclusão é um problema que surge frequentemente durante a super
expressão de genes heterólogos utilizando esse organismo, onde as proteínas-alvo 10
formam agregados insolúveis no citoplasma da célula bacteriana (DE GROOT et al.,
2008). Uma vez que a proteína também foi produzida na menor temperatura testada
(18 ºC, por 18 h), as expressões subsequentes foram realizadas nessa condição, a
fim de minimizar a formação de corpos de inclusão (MAKRIDES, 1996). Altas
temperaturas provavelmente favorecem a formação de interações intermoleculares 15
em detrimento das interações intramoleculares, promovendo a formação de
agregados proteicos estáveis (DE GROOT e VENTURA, 2006). Em temperaturas
mais baixas e um maior tempo de expressão, esperava-se que ocorresse a redução
da formação de corpos de inclusão, permitindo a expressão da proteína
recombinante de forma solúvel no citoplasma. Para avaliar essa possibilidade, as 20
células foram lisadas por ciclos de congelamento/descongelamento e sonicação
após a expressão e, em seguida, o debri celular (pellet) foi separado do lisado
(sobrenadante) por centrifugação e ambos analisados por SDS-PAGE (Figura 14A)
e Western blot (Figura 14B).
25
51
Figura 14: Análise da solubilidade da proteína recombinante expressa a 18 ºC por 18 h. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue e B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. Em ambas as Figuras: 1 – extrato celular antes da indução da expressão por IPTG; 2 – extrato celular após 18 h de 5 expressão; 3 – padrão de proteínas; 4 – lisado celular (sobrenadante); 5 – debri celular (pellet). Indicações de peso molecular em kDa.
Foi observado que a maior parte da proteína produzida não se encontrava
solúvel no citoplasma, ou seja, possivelmente estavam em corpos de inclusão. A 10
formação destes corpos pode ocorrer por diversas causas, como o alto nível de
expressão em relação às proteínas nativas, produção de proteínas contendo pontes
dissulfeto ou proteínas altamente hidrofóbicas, entre outras (ROSANO e
CECCARELLI, 2014). Para a recuperação de proteínas funcionais a partir desses
depósitos, é necessário promover a sua solubilização utilizando agentes 15
52
desnaturantes, a remoção deste agente para renovelar as proteínas e, por fim, a
purificação dessas proteínas solubilizadas (SINGH e PANDA, 2005). Por isso, o
extrato celular foi ressuspendido em tampão de ligação da coluna contendo 5M de
ureia, com o objetivo de solubilizar as proteínas presentes nos corpos de inclusão.
Sabendo-se que a proteína recombinante estava sendo produzida sob a 5
forma de corpos de inclusão, foi realizada a expressão utilizando um maior volume
de cultura para obter quantidades suficientes da proteína que permitiria a sua
purificação. Após o período de indução da expressão, as células foram lisadas em
um tampão de ligação da coluna cromatográfica contendo ureia como agente
desnaturante. 10
A presença de ureia no gel de SDS-PAGE ou o excesso de sais na amostra
pode alterar a mobilidade eletroforética das proteínas no gel (FONTES et al., 1984;
PORTER et al., 2015). Como as amostras foram ressuspendidas em um tampão
contendo uma alta concentração de ureia (5 M), a separação das proteínas pelo
SDS-PAGE pode ter sido afetada, não sendo possível realizar uma análise 15
adequada por este método. Assim, a expressão em larga escala foi analisada
somente por Western blot (Figura 15).
Figura 15: Expressão em larga escala da sDC-SIGN1A tipo III recombinante. 20 Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. 1 – padrão de proteínas; 2 – extrato celular após 18 h de expressão; 3 – extrato celular antes da indução da expressão por IPTG; 4 – debri celular (pellet); 5 – lisado celular (sobrenadante) ressuspendido em tampão de ligação contendo 5 M de ureia. Indicações de peso molecular em kDa. 25
53
A expressão da proteína também foi confirmada utilizando um maior volume
de cultura, como pode ser observado pelo aparecimento de uma banda no tamanho
esperado após o período de expressão. Além disso, uma banda forte foi observada
na canaleta da amostra coletada antes da indução por IPTG (Figura 15, canaleta 3).
Isto pode ter ocorrido devido ao maior número de células presentes na cultura nesse 5
momento em relação à expressão em pequena escala, evidenciando mais a
expressão basal das proteínas desse organismo. Ademais, a proteína se encontrava
solúvel no tampão de ligação contendo ureia, conforme demonstrado pelo
aparecimento de uma banda na canaleta correspondente a essa amostra.
A partir da obtenção da proteína solúvel, foi possível realizar a sua 10
purificação. Esta etapa foi feita por cromatografia de afinidade por íons metálicos
(IMAC – Immobilized Metal Affinity Chromatography), onde se utiliza uma coluna
constituída frequentemente por um suporte baseado em uma matriz de gel, como
agarose, celulose ou outros polissacarídeos, e um grupo quelante coordenado com
um íon metálico divalente, como níquel ou cobalto, para purificação de proteínas 15
com cauda de histidina (CHEUNG et al., 2012). O mecanismo de adsorção de
proteínas com cauda de histidina se baseia na interação entre o íon metálico
imobilizado pelo ligante (tri- tetra- ou pentadentado) e os resíduos de histidina, onde
ocorre a coordenação entre o metal e os anéis imidazólicos desses resíduos, que
desempenham o papel de doadores de elétrons para a formação dessa ligação 20
(BLOCK et al., 2009).
Como a proteína foi solubilizada a partir de corpos de inclusão utilizando
ureia, seria necessária a sua remoção para que a proteína atingisse a sua
conformação nativa e funcional. Para isto, durante o processo de purificação, a
proteína foi lavada com tampões com concentrações decrescentes de ureia 25
consecutivamente até que ela fosse totalmente removida. Esse método, também
chamado de protein folding liquid chromatography, permite o enovelamento gradual
da proteína até atingir a sua conformação nativa ainda ligada à coluna (WANG et al.,
2014). Por fim, as eluições foram coletas e analisadas por SDS-PAGE e Western
blot para avaliar o sucesso da purificação e a pureza das amostras obtidas (Figura 30
16).
54
Figura 16: Purificação da proteína sDC-SIGN1A tipo III recombinante. A) Gel SDS-PAGE 15% corado por Coomassie blue e B) Imunodetecção por Western blot em membrana de nitrocelulose. Em ambas as Figuras: 1 – extrato celular após 18 h de expressão; 2 – padrão de proteínas; 3-10 – eluições da proteína purificada. 5 Indicações de peso molecular em kDa.
A presença de bandas na altura esperada de 30,4 kDa foi observada em 7
eluições coletadas (Figura 16, canaletas 4 a 10) tanto na eletroforese como na
imunodetecção, indicando que a proteína foi purificada com êxito. As proteínas 10
foram dosadas pelo método de Bradford e as alíquotas apresentaram um total de
1,09 mg de proteínas em 10 mL de tampão de eluição, quantidade considerada
suficiente para a realização dos testes posteriores. Com isso, ensaios in vitro
poderiam ser realizados para avaliar se esta isoforma solúvel do DC-SIGN exerce
alguma influência sobre a capacidade de infecção do DENV em células humanas. 15
55
4.3) Multiplicação e quantificação de DENV-2
Para a realização de ensaios virais utilizando a sDC-SIGN1A tipo III
recombinante produzida neste trabalho, foi necessária a obtenção de amostras de
DENV-2 titulado para a sua utilização nestes testes. O vírus foi produzido em células
de insetos, cuja infecção pôde ser acompanhada observando-se o ECP que essas 5
células apresentam devido à multiplicação viral.
O ECP pôde ser notado, inicialmente, a partir do 3º dia de infecção, sendo
proeminente no 5º dia, como pode ser observado na Figura 17. Apesar de produzir
partículas virais contendo uma grande quantidade de prM, que pode prejudicar a
taxa de infecção viral, a linhagem C6/36 de A. albopictus é amplamente utilizada 10
para produção de DENV, sendo inclusive utilizada no diagnóstico clínico (JUNJHON
et al., 2008; JARMAN et al., 2011; RICHTER et al., 2014).
Figura 17: Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 de Aedes albopictus. Microscopia óptica de monocamada de células C6/36 controle não infectada (A) e 15 infectada após o 5º dia de infecção com MOI de 0,01 (B). Como indicado pelas setas vermelhas, o ECP, como sincícios e vacuolizações, também pode ser visto em todo o campo de visão das células infectadas. Aumento de 100X.
Após a multiplicação do DENV-2, a titulação viral foi feita pelo ensaio de 20
TCID50. A Figura 18 ilustra a realização deste ensaio, que é baseado na visualização
de ECP em células BHK-21 gerado pela infecção do DENV-2, em sucessivas
diluições seriadas da amostra viral. A partir deste ensaio, as amostras de DENV-2
56
produzidas apresentaram um título de 1,6 x 106 TCID50/mL, em volume suficiente
para a realização dos ensaios funcionais com a proteína recombinante também
produzida nesse trabalho.
5
Figura 18: Titulação de DENV-2 por TCID50 em células BHK-21. Microscopia óptica de monocamada de células BHK-21 controle não infectado (A), controle viral (B) e amostra na diluição 10-2 (C) após o 5º dia de infecção. Setas azus indicam o ECP, como sincícios e vacuolizações causados pela multiplicação do DENV. Aumento de 40X. 10
Diversos ensaios para titulação de DENV já foram desenvolvidos, como os
ensaios de formação de placas e de TCID50, e também testes modernos baseados
em métodos imunoenzimáticos e imunoflurescentes. Embora o ensaio de TCID50
apresente algumas desvantagens, como a ausência de ECP durante a infecção de 15
alguns isolados clínicos de DENV e ser uma técnica trabalhosa e demorada, é um
método confiável e considerado “padrão ouro” para a titulação de DENV (LI et al.,
2011).
Além da titulação pelo ensaio de TCID50, a carga viral também seria
quantificada por qPCR. Esta técnica molecular altamente sensível permite detectar e 20
quantificar o RNA viral de diversas amostras, sendo que já é utilizada atualmente
tanto para objetivos clínicos como na rotina laboratorial (CONCEIÇÃO et al., 2010).
Para a construção da curva padrão e quantificação do RNA viral, inicialmente,
o RNA de uma amostra viral produzida neste trabalho foi extraído, quantificado por
espectrofotometria e o cDNA foi produzido por RT-PCR. Em seguida, o cDNA foi 25
diluído (1:10, 1:50 e 1:100), amplificado por PCR convencional e os produtos foram
visualizados por PAGE (Figura 19).
57
Figura 19: Análise de produtos de PCR por PAGE. Gel de PAGE corado por prata: 1 e 7 – padrões de massa molecular de 50 e 100 pb, respectivamente; 2 a 5 – amplificações de cDNA, sendo (2) amostra não diluída, (3) diluições 1:10, (4) 1:50 e (5) 1:100; 6 – controle negativo (sem adição de cDNA). 5
A partir dos iniciadores utilizados neste trabalho, a produção de um fragmento
de 251 pb era esperada (Yong et al., 2007). No entanto, a análise por PAGE
mostrou que o fragmento esperado possivelmente não foi produzido, uma vez que
duas bandas evidentes de aproximadamente 300 pb foram observadas. Além disso, 10
a amplificação de produtos inespecíficos pela PCR também foi detectada, devido ao
aparecimento de bandas em diferentes alturas no gel.
Mesmo com os resultados inesperados na amplificação por PCR, a qPCR foi
realizada, pois a construção da curva melting poderia contribuir para o
esclarecimento de que o fragmento visualizado por PAGE teria sido gerado por 15
amplificação inespecífica ou apenas por um padrão atípico de migração no gel,
devido à alguma condição inadequada na corrida do mesmo.
Assim, a amostra de cDNA, utilizada anteriormente por PCR, foi novamente
diluída (10-1 a 10-5) e submetida a qPCR, utilizando o fluoróforo SYBR® Green I
(Figura 20). Este marcador fluorescente se liga a moléculas de ácido nucleico, 20
emitindo fluorescência majoritariamente quando ligado a uma molécula de dupla fita
de DNA (ZIPPER et al., 2004). Devido a esta propriedade, o SYBR Green I é
utilizado na análise de curva melting em conjunto com qPCR, uma vez que permite o
58
monitoramento da estabilidade da dupla fita de DNA à medida que a temperatura da
solução é aumentada. Desta forma, diferentes produtos de PCR podem ser
distinguidos pela análise de variações na temperatura de dissociação (melting
temperature) (WITTWER, 2009).
5
Figura 20: Análise de qPCR para quantificação de RNA viral. Curvas de amplificação (A) e melting (B) geradas a partir do resultado da amplificação das amostras de cDNA por qPCR.
Como pode ser observado na Figura 20A, a amplificação de todas as 10
amostras de cDNA testadas (diluições 10-1 a 10-5) foi observada. No entanto, a
análise da curva melting indicou a presença de diversos produtos inespecíficos,
devido à presença de picos de fluorescência em diferentes temperaturas. Inúmeras
variações na RT-PCR, PCR convencional e qPCR foram realizadas, como a
concentração de ácido nucleico, concentração dos reagentes, temperatura e 15
duração dos ciclos de amplificação, entre outras (dados não mostrados). No entanto,
não foi possível obter uma condição ideal para a realização da qPCR e,
consequentemente, da quantificação de RNA viral por esta técnica.
Uma hipótese para o problema encontrado pode ser relacionada aos
iniciadores utilizados neste trabalho. Apesar de que as condições da reação e o 20
preparo do material genético possam influenciar uma PCR, é essencial a utilização
de um par de iniciadores adequados. A sua especificidade é essencial e a
possibilidade de mutações, como polimorfismos de nucleotídeo único na sequência-
alvo deve ser ponderada. Por isso, essas regiões devem ser evitadas, buscando a
amplificação a partir de regiões conservadas no genoma de interesse (YE et al., 25
59
2012). Embora os iniciadores desse trabalho amplifiquem um fragmento do DENV-2
a partir de regiões conservadas em seu genoma, a possibilidade de variação da
região alvo por diferenças genotípicas entre a linhagem amplificada e aquelas
usadas no desenho dos iniciadores não deve ser desconsiderada (YONG et al.,
2007). Assim, a realização de novos testes, como o sequenciamento do cDNA 5
produzido e o alinhamento da sequência obtida com os iniciadores, a obtenção de
outros iniciadores ou ainda novas condições de reação, serão necessários para
avaliar esta hipótese.
4.4) Ensaios funcionais 10
Com o objetivo de avaliar uma possível alteração da isoforma sDC-SIGN1A
tipo III sobre o processo de infecção do DENV, ensaios funcionais foram realizados
para avaliar essa hipótese. Para isto, dois tipos celulares que possuem importância
na patogênese da dengue foram utilizados, os monócitos e macrófagos (DURBIN et
al., 2008; KOU et al., 2008; BLACKLEY et al., 2007; KYLE et al., 2007; BALSITIS et 15
al., 2009). A linhagem monocítica THP-1 foi utilizada, tanto nos ensaios funcionais
em si, como também para a sua diferenciação em macrófagos a partir da sua
estimulação com PMA. Assim, células THP-1 foram cultivadas na presença de PMA
(100 ng/mL) durante 48 h para a diferenciação em macrófagos, seguida de uma fase
repouso na ausência de PMA por 24 h (Figura 21). 20
60
Figura 21: Diferenciação de macrófagos a partir da linhagem monocítica THP-1. Microscopia óptica de células THP-1 (A e B) e macrófagos diferenciados após estimulação com PMA (C e D). Aumento de 40 (A e C) e 200X (B e D).
5
Após a estimulação das células THP-1 com PMA, o sobrenadante de cultura
foi coletado e realizado a contagem de células em câmara de Neubauer. No entanto,
não foi possível realizar a contagem devido à ausência de células na amostra
coletada, nem mesmo quando sobrenadante foi concentrado por centrifugação, tanto
após a estimulação inicial com PMA, como após a fase de repouso (dados não 10
mostrados). Isso indica que, virtualmente, todas as células se tornaram aderentes, o
que era esperado com a diferenciação em macrófagos. As células também foram
analisadas por microscopia e elas apresentaram diferenças morfológicas marcantes,
quando comparadas antes (Figura 21 A e B) e após a sua estimulação com PMA
(Figura 21 C e D). 15
A diferenciação da linhagem monocítica humana THP-1 em macrófagos
através da estimulação por PMA é bem estabelecida e utilizada em diversos estudos
como alternativa ao cultivo primário dessas células (SCHWENDE et al., 1996; PARK
61
et al., 2007). O tratamento de células THP-1 com PMA promove a ativação da
proteína quinase C, induzindo a aderência e a expressão de marcadores de
superfícies relacionados com a diferenciação dessa linhagem em macrófagos
(SCHWENDE et al., 1996). Além disso, algumas características morfológicas são
associadas a essa diferenciação, como a expansão citoplasmática e de organelas, 5
como mitocôndrias e lisossomos. O tratamento da linhagem THP-1 com PMA
seguido de um período de cultivo na ausência desse agente também é importante,
uma vez que direciona as células obtidas para um fenótipo mais próximo ao
observado em macrófagos derivados de monócitos ex vivo (DAIGNEAULT et al.,
2010). Assim, a partir do conjunto de dados obtidos, foi considerado que as células 10
THP-1 se diferenciaram em macrófagos, permitindo a sua utilização nos ensaios
funcionais com sDC-SIGN1A tipo III.
As células THP-1 e macrófagos derivados dessa linhagem foram incubados
com o DENV (MOI = 1) na presença da proteína recombinante em diferentes
concentrações, sendo elas: 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 ng/mL. Após 15
o período de incubação, o sobrenadante foi coletado e a carga viral foi avaliada pelo
ensaio de TCID50. Entretanto, o ECP não foi observado em nenhum dos
sobrenadantes testados, tanto aqueles referentes às amostras (infecção viral na
presença da proteína recombinante) como aos controles de infecção (infecção viral
na ausência da proteína recombinante) dos ensaios funcionais. Como pode ser 20
observada na Figura 22, no 7º dia do ensaio de TCID50, a monocamada de células
BHK-21 ainda era observada, mas predominava-se um grande número de células
mortas, que possuem morfologia esférica, de forma similar na amostra testada e no
controle não infectado. Desta forma, a morte das células no ensaio de TCID50 não foi
atribuída à infecção viral, como pode ser observada na Figura 18, mas sim ao longo 25
período de cultura dessas células neste procedimento.
62
Figura 22: Avaliação da carga viral pelo ensaio de TCID50. Microscopia óptica de monocamada de células BHK-21 controle não infectado (A) e amostra referente ao controle de infecção dos ensaios funcionais (B) no 7º dia de infecção. Aumento de 100X. 5
Uma hipótese que pode explicar a não detecção da carga viral pelo ensaio de
TCID50 é a baixa susceptibilidade de infecção de monócitos e macrófagos. Embora
essas células possuam grande relevância na dengue, devido à produção de
citocinas inflamatórias e a maior capacidade de infecção devido ao ADE, elas 10
apresentam uma infecção baixa na ausência de anticorpos subneutralizantes
(SCHMID et al., 2014). Segundo Kou e colaboradores (2008), a infecção do DENV
em monócitos é ineficiente, sendo detectada a infecção em apenas 3,5% dessas
células, mesmo utilizando uma MOI alta (5) durante um período de cultura de 2 dias.
Outros autores também encontraram resultados semelhantes. Wu e colaboradores 15
(2000) observaram que apenas 1-2% de macrófagos eram infectados após a sua
exposição ao DENV em uma MOI de 0,2, sendo que em uma MOI 10 vezes maior,
apenas 5% dos macrófagos foram infectados. Blackley e colaboradores (2007)
encontraram uma taxa de infecção ainda menor em macrófagos esplênicos, sendo
que apenas cerca de 0,77% das células são infectadas, enquanto na presença de 20
anticorpos neutralizantes este valor foi de 5,41%.
A baixa capacidade de infecção dessas células pode ser devido à ausência
ou baixa expressão de receptores cognatos do DENV, como o DC-SIGN, nessas
células (KOU et al., 2008; DURBIN et al., 2008; SCHMID et al., 2014). Isso foi
evidenciado por Tassaneetrithep e colaboradores (2003), onde observaram que 25
menos de 5% de monócitos da linhagem THP-1 foram infectados pelo DENV após
63
48 h de exposição ao vírus em uma MOI de 1. Porém, utilizando uma linhagem de
THP-1 transfectada para a expressão de DC-SIGN, a infecção foi de
aproximadamente 80% das células no mesmo período e carga viral testada
inicialmente.
Em um dos poucos estudos sobre as isoformas solúveis do DC-SIGN e seu 5
envolvimento em infecções virais, Plazolles e colaboradores (2011) analisaram o
efeito de uma isoforma solúvel do DC-SIGN (sDC-SIGN1A tipo I) na infecção do
CMV em iDC. Foi observado que essa proteína era capaz de promover um aumento
da infecção nessas células em uma concentração ótima de 50 ng/mL.
Concentrações acima de 100 ng/mL e abaixo de 50 ng/mL não alteraram a taxa de 10
infecção de iDC. Isso levou aos autores proporem um modelo hipotético onde altas
concentrações do sDC-SIGN poderia impedir a internalização viral pela célula
hospedeira, enquanto em uma determinada faixa de concentrações mais baixas
(entre 100 e 10 ng/mL), a proteína contribuiria com a internalização do maior número
de vírions. Já em concentrações muito baixas (abaixo de 10 ng/mL), a influência do 15
sDC-SIGN seria quase nula e o nível de infecção seria semelhante àquele na
ausência dessa proteína. No entanto, detalhes sobre essa possível e complexa
função do sDC-SIGN precisam ser melhor investigados.
O modelo proposto por Plazolles e colaboradores (2011) sugere algumas
hipóteses que possam explicar a capacidade de aumento da infecção viral pelo sDC-20
SIGN. Uma delas seria a existência de um ou mais receptores, ainda
desconhecidos, para a internalização das partículas virais associadas ao sDC-SIGN.
Além disso, sabe-se que o domínio de pescoço do DC-SIGN é essencial para a sua
tetramerização, que, por sua vez, é fundamental para a interação plena com o seu
ligante (SNYDER et al., 2005; MENON et al., 2009). Com isso, outra hipótese 25
plausível seria a associação do sDC-SIGN, ou de vírions ligados a essa proteína,
com dímeros ou trímeros de mDC-SIGN pré-existentes na membrana da célula
hospedeira, facilitando a internalização das partículas virais (PLAZOLES et al.,
2011).
É importante ressaltar que no trabalho desenvolvido por Plazolles e 30
colaboradores (2011), embora o aumento na taxa de infecção do CMV em iDC tenha
sido tenha sido significante, a taxa de de células infectadas foi aproximadamente
duas vezes maior que o controle de infecção, 33,1±6% e 14,8±7,2%,
64
respectivamente. Então, considerando que as linhagens celulares utilizadas neste
trabalho apresentam uma baixa taxa de infecção pelo DENV, possivelmente abaixo
de 5%, em uma situação hipotética onde a sDC-SIGN1A tipo III aumentaria a
infecção do DENV nas células testadas em duas vezes, a taxa de infecção ainda
seria baixa. Assim, mesmo com essa elevação da infecção, a carga viral produzida 5
poderia não ser detectada no ensaio de TCID50. Com isso, torna-se necessária a
realização de novos testes utilizando linhagens mais susceptíveis à infecção pelo
DENV, como iDCs e mDCs, e também a padronização da qPCR, pois a associação
desta técnica mais sensível com a titulação por TCID50, proporcionará maior
confiança nos resultados obtidos neste trabalho. 10
Estudos a respeito das isoformas solúveis do DC-SIGN e seu envolvimento
em infecções de outros vírus foram publicados. Enquanto Biggins e colaboradores
(2007) mostraram que o ectodomínio do DC-SIGN era capaz de inibir a ligação de
HIV-1 às células 293T expressando a isoforma completa do DC-SIGN, Hijazi e
colaboradores (2011) demonstraram que em concentrações sub nanomolares este 15
ectodomínio aumentou a infecção do HIV em células PM1. Navarro-Sanchez e
colaboradores (2003) mostraram que o sDC-SIGN possui a capacidade de inibir a
infecção do DENV em iDC. Porém, a proteína que os autores avaliaram era
constituída somente do DRC, ou seja, uma parte do DC-SIGN. Assim, não foi
considerada uma suposta participação do restante da proteína no processo de 20
infecção viral.
Sabe-se que o domínio citoplasmático é importante no processo de
internalização do HIV (KWON et al., 2002; SMITH et al., 2007). Células expressando
uma forma truncada do DC-SIGN que perde sua cauda citoplasmática foram
susceptíveis à infecção pelo DENV, enquanto células expressando o receptor 25
completo produziram uma taxa de infecção muito maior (75%) que a forma truncada
(TASSANEETRITHEP et al., 2003). Então, semelhante ao que ocorre com o HIV,
embora esse domínio não seja completamente essencial para infecção do DENV,
sua presença parece contribuir favoravelmente para este processo.
Contudo, a maioria desses estudos foi realizada considerando a isoforma 30
completa do DC-SIGN e variantes com a presença ou ausência total da região de
pescoço. Uma vez que não foram avaliados os possíveis efeitos de outras isoformas
do sDC-SIGN sobre o processo de infecção do DENV, além de que a sDC-SIGN1A
65
tipo III perde parcialmente a região de pescoço (repetições 3 a 6), almeja-se obter
um melhor entendimento da função do DC-SIGN com este trabalho. Desta forma,
espera-se ampliar o conhecimento do processo de patogênese da dengue, bem
como avaliar uma possível estratégia de combate ao vírus por meio da alteração da
função desta proteína, objetivando a diminuição a multiplicação do vírus no 5
organismo humano.
66
5. CONCLUSÕES
A partir das análises in silico, foi possível analisar algumas características
estruturais e físico-químicas da sDC-SIGN1A tipo III, que foram úteis para a
avaliação da produção desta proteína por expressão heteróloga. Essas
análises indicaram que era uma proteína hidrofílica de peso molecular de 30,4 5
kDa, pI de 5,13, apresentava um domínio lectina do tipo C, sítios de O- e N-
glicosilação e não possuía peptídeo sinal;
A sDC-SIGN1A tipo III recombinante foi purificada com sucesso após sua
recuperação a partir de corpúsculos de inclusão, obtendo-se 1,09 mg da
proteína, quantidade considerada suficiente da proteína recombinante para a 10
realização dos ensaios funcionais;
O DENV-2 foi produzido e quantificado, apresentando título viral de 1x106
TCID50/mL;
A estimulação da linhagem monocítica THP-1 por PMA induziu a sua
diferenciação em macrófagos, evidenciada por alterações na adesão e 15
morfologia celular;
A carga viral nos ensaios funcionais da sDC-SIGN1A tipo III recombinante
não foi detectada por titulação possivelmente devido à baixa taxa de infecção
viral de monócitos e macrófagos.
20
6. PERSPECTIVAS
Padronizar a reação de qPCR para quantificar o DENV-2;
Diferenciar células THP-1 em células dendríticas imaturas (iDCs) e maduras
(mDCs), bem como confirmar o fenótipo destas células por citometria de fluxo
a partir da expressão de marcadores específicos; 25
Avaliar o efeito da sDC-SIGN1A tipo III no processo de infecção do DENV
através de ensaios funcionais em iDCs e mDCs.
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