UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
SARAH RAQUEL GOMES DE LIMA-SARAIVA
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE NATIVAS
DA CAATINGA: UM ESTUDO COMPARATIVO
RECIFE
2012
SARAH RAQUEL GOMES DE LIMA-SARAIVA
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE NATIVAS
DA CAATINGA: UM ESTUDO COMPARATIVO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Pernambuco, como parte das
exigências do Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas,
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof.ª Dr.ª Elba Lúcia
Cavalcanti de Amorim
Co-orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto
Guedes da Silva Almeida
RECIFE
2012
Lima-Saraiva
Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: um estudo comparativo / Sarah Raquel Gomes de Lima-Saraiva. – Recife: O Autor, 2012.
210 folhas: il., fig.; tab. Graf.30 cm.
Orientador: Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2012.
Inclui bibliografia, anexo e apêndice.
1. Atividade Antinociceptiva. 2.Bromeliaceae.
3.Toxicidade Aguda. 4. Toxicologia. I. Amorim, Elba Lúcia
Cavalcanti de. II. Título.
UFPE
615.4 CDD (20.ed.) CCS2012-036
SARAH RAQUEL GOMES DE LIMA-SARAIVA
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE NATIVAS
DA CAATINGA: UM ESTUDO COMPARATIVO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Pernambuco, como parte das
exigências do Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas,
para obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
APROVADA: 24 de fevereiro de 2011.
_________________________________________________
Prof.: Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida
(Co-orientador)
(UNIVASF)
_________________________________________________
Prof.: Dra. Jane Sheila Higino
(1° Examinador)
(UFPE)
_________________________________________________
Prof.: Dra. Terezinha Gonçalves da Silva
(2° Examinador)
(UFPE)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Vice-Reitor
Prof. Dr. Sílvio Romero de Barros Marques
Pró-Reitor para assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
Diretor do Centro de Ciências da Saúde- CCS
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde- CCS
Profa. Dra. Vânia Pinheiro Ramos
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Dalci José Brondani
Vice- Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Profª. Drª. Ana Cristina Lima Leite
Dedico este trabalho aos meus familiares, e em
especial, aos meus pais Antônio Francisco e
Maria da Conceição e ao meu esposo
Henrique Saraiva que me apoiaram em todos
os momentos, sempre com muito amor e carinho.
AGRADECIMENTOS
Grande é a minha lista de agradecimentos, e por isso me considero uma
pessoa de sorte. Primeiramente, agradeço a Deus, o meu supremo guia e
protetor, que está sempre presente em minha vida.
À minha orientadora, a professora Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de
Amorim por ter me aceito como aluna. Sem ela não teria concretizado este
trabalho.
Ao Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, o meu co-
orientador, agradeço não só pela oportunidade e atenção, mas também pela
valiosa orientação. Sua competência e dedicação servirão sempre de exemplo
para mim. A ti, o meu profundo respeito e admiração!
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, e a
todos os professores que de alguma forma contribuíram para minha formação.
A Antônio Francisco de Lima e Maria da Conceição Gomes de Lima,
meus pais, que são os pilares da minha vida, sempre me proporcionaram
educação, mesmo com dificuldades. E se cheguei até aqui, foi fruto de
sacrifício e renúncia deles. Eles são para mim exemplo de perseverança. Só
tenho a agradecer por isso.
Ao meu companheiro de todas as horas, meu esposo Henrique César
Costa Saraiva, obrigada por todo o carinho, amor, paciência, compreensão,
pelo incentivo diário, pelas noites e fins de semana perdidos comigo no
laboratório e principalmente pela mão amiga que esteve presente nos
momentos de angústia sempre me confortando e me fazendo acreditar que eu
sou capaz. Eu só tenho a agradecer por você existir em minha vida. Amo-te,
muito!
A todos da minha linda Família, Tias, Tios, Primos e em especial aos
meus irmãos, Lívia, Guilherme e Pedro Henrique.
À UNIVASF e ao Magnífico Reitor o Dr. Julianeli Tolentino de Lima,
gostaria de agradecer de maneira especial pelo acolhimento e apoio
concedido.
A todos do Colegiado de Ciências Farmacêuticas (UNIVASF), e aos
professores, principalmente ao Professor Dr. Luciano Ribeiro.
Ao Professor MSc. Fabrício Souza Silva, pela ajuda na realização do
estudo da toxicidade aguda.
À professora Dra Maria Helena Tavares de Matos, e as alunas Vanessa
Raquel Pinto de Barros e Vanúsia Gonçalves Menezes, pela confecção e
coloração das lâminas.
Aos professores, Dr. Carlos Eduardo de Queiroz Lima, Dr. Diógenes
Luiz da Mota e Dr. Ricardo Santana de Lima, pela análise histopatológica.
Ao CRAD/UNIVASF na pessoa do Professor Dr. José Alves de
Siqueira Filho, pela sugestão das espécies para estudo.
Ao Prof. Alexsandro Branco, da Universidade Estadual de Feira de
Santana (UEFS), pela obtenção dos cromatogramas.
Ao Botânico André Paviotti Fontana, pela identificação do material
botânico.
Aos Técnicos: Silvio Alan, Anne, Leonardo e Fernando pela ajuda e
amizade, e principalmente a Roniere A. Oliveira pela contribuição nas análises
hematológicas e bioquímicas do sangue dos animais.
Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda e Elenildo, quanta gratidão.
À Francisca e Sr. Cícero sempre me proporcionando alegria até na
hora de ir buscar as chaves do laboratório.
A todos do Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT),
principalmente a Dani Cabral, Valéria, Valerium, Tadeu e Tiago.
A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisa de Plantas Medicinais,
(NEPLAME) e aos meus colegas de laboratório, Camila Araújo, Clara
Rafaela, Grasielly Rocha, Raimundo Júnior, Pedro Guilherme e Tâmara
Diniz, e principalmente às técnicas Amanda e Ana Paula.
À Alessandra Gomes Marques Pacheco, pela enorme ajuda e
amizade.
Aos colegas de Turma, Rayana Muniz, Larissa Rolim, Magna
Vanessa, Pablo, Januária, Otávio, Danilo, Bruno, Iggor, Luise Lopes,
Hugo, Rafinha e Vitória.
Ao amigo Wagner Reis (padre), pelas orações e apoio físico e espiritual
concedido.
Por último, mas não em último, agradeço imensamente a minha amiga
Juliane Cabral Silva, a minha companheira de laboratório, e sem a qual não
teria terminado os experimentos. Eu gosto de você de graça, te levarei comigo
para sempre. Simplesmente obrigada!
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico e Tecnológico
(CNPq), pela bolsa de mestrado e pelo auxílio financeiro (Processo 476770/
2010-6).
À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE) pelo auxílio financeiro (Processo APQ-0542-4.03/10).
Agradeço a todos que contribuíram de forma direta ou indiretamente
com mais essa conquista.
Muito obrigada!
“No meu mundo não há fadas,
mas a mão de Deus me alcança.”
(Pe Fábio de Melo)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: x um estudo comparativo.
RESUMO
Bromeliaceae é uma família de monocotiledôneas de grande importância pela sua
diversidade ecológica. Possui 57 gêneros e cerca de 3.000 espécies, das quais 40%
podem ser encontradas no Brasil. A família apresenta uma longa história de uso
etnobotânico, como fonte de fibras, alimentos e medicamentos. Foram selecionadas
para o estudo três espécies de Bromeliaceae, Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH),
Encholirium spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), todas com domínio
fitogeográfico na caatinga. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo
do extrato etanólico bruto dessas espécies em camundongos, utilizando estímulos
químicos (teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e teste da
formalina) e térmico (teste da placa quente), bem como realizar o estudo de
toxicidade aguda, a fim de assegurar a utilização dos extratos e servir de parâmetros
para o desenvolvimento de futuros medicamentos. Quanto à atividade
antinociceptiva, os extratos demonstraram efeito em todos os ensaios experimentais.
Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente o comportamento
nociceptivo dos animais no teste das contorções abdominais. Este extrato também
reduziu o tempo em que os animais lamberam a pata na 1ª e 2ª fase do teste da
formalina, além de aumentar o tempo de permanência dos animais na placa quente,
efeito este que foi revertido pela naloxona, sugerindo a participação dos receptores
opióides no mecanismo de ação do extrato. Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg, i.p.)
reduziu significativamente as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. O
extrato também mostrou efeito significativo em reduzir o tempo de lambida em
ambas as fases do teste da formalina. Já no teste da placa quente, a administração
de Es-EtOH não alterou o tempo de permanência dos animais sobre a placa quente,
sugerindo para o extrato um possível mecanismo de ação periférico. Bl-EtOH (100,
200 e 400 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente o número de contorções no teste
das contorções abdominais. Este extrato também reduziu o tempo em que o animal
lambeu a pata na 1ª e 2ª fase do teste da formalina. Quando foi utilizado o teste
da placa quente, de uma maneira geral, a administração do extrato não induziu
alterações no tempo de latência, porém na dose de 100 mg/kg, no tempo de 60
minutos, o extrato apresentou aumento no tempo de latência. Esse efeito não foi
revertido pela naloxona. Este estudo mostrou que os extratos possuem atividade
antinociceptiva em diversos modelos experimentais. Porém, o mecanismo exato pelo
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xi um estudo comparativo.
qual exercem esse efeito ainda está sendo elucidado. Dessa forma, novos estudos
são necessários para se chegar ao mecanismo de ação exato, bem como quais
constituintes químicos são responsáveis pelo efeito antinociceptivo dos extratos. Na
avaliação da toxidade aguda, a administração dos extratos nas doses de 2 e 5 g/kg
pelas vias oral e intraperitoneal, respectivamente, não provocou morte nem
alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e hematológicos do sangue,
assim, podemos considerar os extratos, de baixa toxicidade. Porém, de acordo com
a análise histopatológica dos órgãos dos animais tratados com os extratos, a
avaliação mostrou que houve algumas lesões, sobretudo no fígado e nos rins.
Assim, faz-se necessário a realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e
crônica a fim de determinar o perfil de segurança dos extratos.
Palavras-chave: Atividade antinociceptiva, Bromelia laciniosa, Bromeliaceae,
Encholirium spectabile, Neoglaziovia variegata, Toxicidade aguda.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xii um estudo comparativo.
ABSTRACT
Bromeliaceae is a family of monocotyledons of great importance for its ecological
diversity. It has 57 genera and about 3.000 species, of which 40% can be found in
Brazil. The family has a long history of ethnobotanical use as a source of fiber, food
and drugs. Were selected for study three species of Bromeliaceae, Neoglaziovia
variegata (Nv-EtOH), Encholirium spectabile (Es-EtOH) and Bromelia laciniosa (Bl-
EtOH), all with phytogeographic area in the caatinga. The aim of this study was to
evaluate the antinociceptive effect of crude ethanolic extract of these species in mice
using chemical stimuli (test of abdominal contortions induced by acetic acid and
formalin test) and thermal (hot plate test) and perform the acute toxicity study in order
to ensure the use of extracts and serve as guidelines for the development of future
medicines. As for antinociceptive activity, the extracts showed effects in all
experimental trials. Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.) significantly reduced
the nociceptive behavior of animals in the abdominal writhing test. This extract also
reduced the time the animals licked their paws in the 1st and 2nd phase of the
formalin test, in addition to increasing the length of stay of animals in the hot plate, an
effect that was reversed by naloxone, suggesting the involvement of opioid receptors
in the mechanism of action of the extract. Es-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.)
significantly reduced the action of acetic acid, used to induce abdominal contortions.
The extract also showed significant effect in reducing the duration of licking in both
phases of the formalin test. In the hot plate test, the administration of Es-EtOH did
not alter the length of stay of the animals on the hot plate, suggesting to extract a
possible peripheral mechanism of action. Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg / kg, i.p.)
significantly reduced the number of contortions in the abdominal writhing test. This
extract also reduced the time the animal licked his paw in the 1st and 2nd phase of
the formalin test. When we used the hot plate test, in general, the administration of
the extract did not induce changes in the latency time, but at a dose of 100 mg / kg in
60 minutes, the extract showed an increase in latency time. This effect was reversed
by naloxone, suggesting the involvement of opioid receptors in the effect of the
extract. This study showed that the extracts have antinociceptive activity in several
experimental models. The exact mechanism by which exert this effect is still being
elucidated. Further studies are needed to reach the exact mechanism of action as
well as chemical constituents which are responsible for the antinociceptive effect of
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xiii um estudo comparativo.
the extracts. In the evaluation of acute toxicity, the administration of the extracts at
doses of 2 and 5 g / kg by oral and intraperitoneal routes, respectively, did not cause
death or significant changes in biochemical and hematological parameters of the
blood, so we can consider the extracts, low toxicity. However, according to the
histopathological analysis of organs from animals treated with the extracts, the
evaluation showed that there are some lesions, especially in the liver and kidneys.
Thus, it is necessary to further testing of sub-chronic and chronic toxicity to determine
the safety profile of the extracts.
Keywords: Acute toxicity, Antinociceptive activity, Bromelia laciniosa, Bromeliaceae,
Encholirium spectabile, Neoglaziovia variegata.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xiv um estudo comparativo.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 - Desenho esquemático do nociceptor 34
Figura 02 - Terminações nervosas livres, Fibras Aδ e C 35
Figura 03 - Via nociceptiva de transmissão da dor 36
Figura 04 - Representação esquemática da percepção da dor 38
Figura 05 - Processo de dor inflamatória resultante de lesão tecidual 39
Figura 06 - Representação esquemática do processo fisiopatológico
da reação inflamatória 39
Figura 07 - Distribuição fitogeográfica de Neoglaziovia variegata 44
Figura 08 - Foto de Neoglaziovia variegata 45
Figura 09 - Distribuição fitogeográfica de Encholirium spectabile 46
Figura 10 - Foto de Encholirium spectabile 46
Figura 11 - Distribuição fitogeográfica de Bromelia laciniosa 47
Figura 12 - Foto de Bromelia laciniosa 48
Figura 13 - Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata obtido
por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo
de diodo (CLAE-DAD) em 322 nm 61
Figura 14 - Cromatograma do extrato etanólico de Encholirium spectabile obtido
por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo
de diodo (CLAE-DAD) em 322 nm 62
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xv um estudo comparativo.
Figura 15 - Cromatograma do extrato etanólico de Bromelia laciniosa obtido
por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo
de diodo (CLAE-DAD) em 322 nm 63
Figura 16 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata no modelo de
contorções abdominais induzidas por ácido acético. 64
Figura 17 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata na primeira e
segunda fase do teste da formalina. 65
Figura 18 - Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata no teste da
placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 66
Figura 19 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Nv-EtOH
durante 14 dias 68
Figura 20 - Consumo de líquido pelos animais tratados com Nv-EtOH
durante 14 dias 68
Figura 21 - Ganho de peso dos animais tratados com Nv-EtOH durante 14
dias 69
Figura 22 - Fotomicrografias do histopatológico de rim de animais
representativos do extrato da N.variegata 72
Figura 23 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado de animais
representativos do extrato de N.variegata 72
Figura 24 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile no
modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético 73
Figura 25 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile na primeira
e segunda fase do teste da formalina 75
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xvi um estudo comparativo.
Figura 26 - Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile no teste da
placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 76
Figura 27 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Es-EtOH
durante 14 dias 77
Figura 28 - Consumo de líquido pelos animais tratados com Es-EtOH
durante 14 dias 78
Figura 29 - Ganho de peso dos animais tratados com Es-EtOH durante 14
dias 79
Figura 30 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado do animal
tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.) 80
Figura 31 - Fotomicrografias do histopatológico de rim do animal
tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.) 80
Figura 32 - Fotomicrografias do histopatológico de pulmão do animal
tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.) 81
Figura 33 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa no modelo de
contorções abdominais induzidas por ácido acético 82
Figura 34 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa na primeira e
segunda fase do teste da formalina 83
Figura 35 - Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa no teste da placa
quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração 84
Figura 36 - Consumo de alimentos pelos animais tratados com Bl-EtOH
durante 14 dias 86
Figura 37 - Consumo de líquidos pelos animais tratados com Bl-EtOH
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xvii um estudo comparativo.
durante 14 dias 87
Figura 38 - Ganho de peso dos animais tratados com Bl-EtOH durante 14
dias 88
Figura 39 - Fotomicrografias do histopatológico de fígado do animal
tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.) 90
Figura 40 - Fotomicrografias do histopatológico de rim do animal
tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.) 91
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xviii um estudo comparativo.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários dos extratos das três espécies
de Bromeliaceae por cromatografia em camada delgada 52
Tabela 2 - Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das três
espécies da família Bromeliaceae 60
Tabela 3 - Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados
com o extrato etanólico bruto de Neoglaziovia variegata
(toxicidade aguda) 70
Tabela 4 - Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos
tratados com o extrato etanólico bruto de Neoglaziovia
variegata (toxicidade aguda) 71
Tabela 5 - Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados
com extrato etanólico bruto de Bromelia laciniosa
(toxicidade aguda) 89
Tabela 6 - Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos
tratados com o extrato etanólico bruto de Bromelia
laciniosa (toxicidade aguda) 90
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xix um estudo comparativo.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aα Fibras do tipo A alfa
Aβ Fibras do tipo A beta
Aδ Fibras do tipo A delta
AAS Ácido acetilsalicílico
AINES Anti-inflamatório não esteroidais
ALT Alanina aminotrasnferase
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA Análise de variância
AST Aspartato aminotransferase
Bl-EtOH Extrato etanólico de Bromelia laciniosa
CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
COX Enzima cicloxigenase
CRAD Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
DAD Detector de arranjo de diodo
Es-EtOH Extrato etanólico de Encholirium spectabile
HCM Hemoglobina corpuscular média
HVASF Herbário do Vale do São Francisco
IASP “ International Association for the Study of Pain “
i.pl. Intraplantar
LOX Enzima lipoxigenase
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xx um estudo comparativo.
Morf. Morfina
NLX Naloxona
NMDA N-metil-D-aspartato
Nv-EtOH Extrato etanólico de Neoglaziovia variegata
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
TGO Transaminase glutâmico oxalacética
TGP Transaminase glutâmico pirúvica
TNF Fator de necrose tumoral
VCM Volume corpuscular médio
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxi um estudo comparativo.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ………….…………..........…………….…………………….….......... 27
2 OBJETIVOS .…….………………………..........……………………………….…....... 30
2.1 Objetivo geral ..……………….………….……........……………………….…....... 31
2.2 Objetivos específicos .…………………...........……………………..…….…....... 31
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .…………………..........………………………....... 32
3.1 Considerações sobre a dor .……………….….………..........………………....... 33
3.1.1 Dor e nocicepção ................……………….….……………….........………........ 33
3.1.2 Nociceptores .......................……………….….……………………..........…....... 33
3.1.3 Fibras e vias nociceptivas ...……………….….………………………................. 34
3.1.4 Mecanismo da dor central .....………….........……………………………..….......36
3.1.5 Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória ................................................ 37
3.2 Considerações sobre analgesia ……………………….........…….…….….........40
3.2.1 Analgesia e vias da analgesia ………………………..........................................40
3.2.2 Drogas analgésicas ………………………........................................................41
3.3 Considerações sobre a família e sobre as espécies selecionadas para o
estudo........................................................................................................................42
3.3.1 Considerações sobre a família Bromeliaceae ……………………..…................42
3.3.2 Considerações sobre a espécie Neoglaziovia variegata .............…………..….44
3.3.3 Considerações sobre a espécie Encholirium spectabile …………............…….45
3.3.4 Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa ……………...……….........47
4 PARTE EXPERIMENTAL ……………………………………………….......…...........49
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxii um estudo comparativo.
4.1 Material vegetal…………………………….........…………………………...………50
4.1.1 Neoglaziovia variegata…………………………..........…………………………….50
4.1.2 Encholirium spectabile…………………………………..........…………………….50
4.1.3 Bromelia laciniosa………………………………………………..........……….……50
4.2 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das folhas das espécies
selecionadas………………………………………………………….........…….......51
4.3 Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos….….…..........51
4.4 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)………...............53
4.5 Animais…………………………………………………………………….….............54
4.6 Testes de atividade antinociceptiva………………….....……………..…...........54
4.6.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético …...….............54
4.6.2 Teste da formalina……………………………………………………….............….54
4.6.3 Teste da placa quente…………………………………………………...…............55
4.7 Toxicidade aguda …………………….…………………………………...…...........55
4.7.1 Triagem comportamental………………………………………………...…...........56
4.7.2 Análises dos parâmetros hematológicos e bioquímicos………….................….56
4.7.3 Análise histopatológica dos órgãos………………………………...……..............56
4.8 Análise estatística…………………………………..........……………………..…...57
5 RESULTADOS........................................................................................................58
5.1 Triagem fitoquímica. ……………………….........................................................59
5.2 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)..........................60
5.2.1 Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata...................60
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxiii um estudo comparativo.
5.2.2 Análise em CLAE do extrato etanólico de Encholirium spectabile....................61
5.2.3 Análise em CLAE do extrato etanólico de Bromelia laciniosa...........................62
5.3 Resultados de Neoglaziovia variegata ….....................………….…………........63
5.3.1 Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata. …..........…………….......63
5.3.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ……..........………....…63
5.3.1.2 Teste da formalina.... ………….…………….......…………….......................…64
5.3.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” ……….………………................................66
5.3.2 Toxicidade aguda de Neoglaziovia variegata …..........……………………........67
5.3.2.1 Avaliação comportamental ………………………............................................67
5.3.2.2 Consumo de alimento e água ….……………………......................................67
5.3.2.3 Variação do peso corporal. ………………………...........................................68
5.3.2.4 Parâmetros hematológicos. ………………………..........................................69
5.3.2.5 Parâmetros bioquímicos. ………………………..............................................70
5.3.2.6 Avaliação histopatológica ………….…………….............................................71
5.4 Resultados de Encholirium spectabile …….............…………………..................73
5.4.1 Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile …………………...............73
5.4.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ……………..................73
5.4.1.2 Teste da formalina ………………………........................................................74
5.4.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” ……………………….................................76
5.4.2 Toxicidade aguda de Encholirium spectabile ……….………………..................76
5.4.2.1 Avaliação comportamental dos camundongos ……………………….............77
5.4.2.2 Consumo de alimento e água ….……………………......................................77
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxiv um estudo comparativo.
5.4.2.3 Variação do peso corporal ………………………............................................78
5.4.2.4 Avaliação histopatológica. ………….……………............................................79
5.5 Resultados de Bromelia laciniosa ............……………………….........................81
5.5.1 Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa ………………………..............81
5.5.1.1 Contorções abdominais induzidas por ácido acético ….………………..........81
5.5.1.2 Teste da formalina ………………………........................................................82
5.5.1.3 Teste da placa quente “Hot plate” .....……………………...............................84
5.5.2 Toxicidade aguda de Bromelia laciniosa ………………………..........................85
5.5.2.1 Avaliação comportamental dos camundongos ……………………….............85
5.5.2.2 Consumo de alimento e água ……………………….......................................85
5.5.2.3 Variação do peso corporal. ………………………...........................................87
5.5.2.4 Parâmetros hematológicos. ………………………..........................................87
5.5.2.5 Parâmetros bioquímicos ………………………...............................................88
5.5.2.6 Avaliação histopatológica ………………………..............................................89
6 DISCUSSÕES.........................................................................................................92
6.1 Triagem fitoquímica e análise dos extratos por CLAE ........................................93
6.2 Efeito antinociceptivo ...........................................................................................93
6.3 Toxicidade aguda ................................................................................................97
7 CONCLUSÃO.......................................................................................................102
8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................104
APÊNDICES ............................................................................................................111
APÊNDICE A – Artigo I ..........................................................................................112
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: xxv um estudo comparativo.
APÊNDICE B – Artigo II .........................................................................................133
APÊNDICE C – Artigo III ........................................................................................159
APÊNDICE D – Artigo IV ........................................................................................169
ANEXOS..................................................................................................................203
ANEXO A – Carta de submissão dos artigos .........................................................204
ANEXO B – Tabela de triagem comportamental ....................................................208
ANEXO C – Certificado de aprovação do comitê de ética......................................209
ANEXO D – Certificado ..........................................................................................210
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1. INTRODUÇÃ O
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 28 um estudo comparativo.
1. INTRODUÇÃO
Ao longo da história, o homem tem sido atormentado pela dor, e as causas e
os tratamentos para os estados dolorosos foram buscados desde as mais primitivas
civilizações (CARVALHO, 1999). Dessa forma, o alívio da dor tem sido uma
preocupação constante, e em relação aos processos dolorosos, as plantas
medicinais têm sido, com frequência, a melhor das opções de tratamento para a
população de baixa renda.
Ademais, é inegável que os mais potentes e eficazes medicamentos
analgésicos são derivados de plantas, a exemplo da salicinina, por um lado, que por
algum tempo foi usada para combater a dor e mais tarde serviu como base para a
síntese do ácido acetilsalicílico, em 1899, como também, por outro lado, o ópio, que
é originário da Papaver somniferum, uma planta popularmente conhecida como
“papoula” e de onde foi obtida a morfina, substância com potente atividade
analgésica (VOHORA; DANDIYA, 1992).
Entretanto, muitos tipos de dores, especialmente dores crônicas, apresentam
terapêutica de difícil utilização devido aos efeitos colaterais oriundos do tratamento.
Desta forma, a pesquisa de princípios ativos isolados de plantas medicinais com
propriedades analgésicas continua sendo uma constante (CALIXTO et al., 2000;
CARLINI, 2003).
O Brasil destaca-se no ranking mundial de países “megadiversos” e é
considerado o país de maior diversidade biológica (PEIXOTO; MORIM, 2003). Abriga
cerca de 14% da diversidade de plantas do mundo, e estima-se em 49 mil o número
de espécies de plantas descritas (SHEPHERD, 2002; LEWINSOHN; PRADO, 2002).
Dentre os biomas brasileiros, a Caatinga, embora seja a área menos estudada
dentre as regiões naturais brasileiras, merece destaque, pois é a única grande
região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao território
nacional, além de possuir uma proporção expressiva de plantas endêmicas, sendo,
diversas destas, comumente utilizadas pela população por suas propriedades
terapêuticas e representando, assim, uma importante fonte de recursos naturais.
Contrastando com a sua relevância biológica, o bioma da Caatinga pode ser
considerado um dos ambientes naturais mais ameaçados do Brasil (LEAL et al.,
2005).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 29 um estudo comparativo.
As três espécies selecionadas para este estudo (Neoglaziovia variegata,
Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa) pertencem à família Bromeliaceae, e
todas possuem o seu domínio fitogeográfico na caatinga. Estas plantas foram
incluídas, juntamente a outras plantas, no “Centro de Recuperação da Flora nas
Áreas Prioritárias da Bacia do Rio São Francisco – O Bioma Caatinga”, programa de
referência em conservação vegetal, e pouco se conhece acerca da etnofarmacologia
dessas espécies (CARVALHO et al., 2010).
A família Bromeliaceae fascina pela exuberância, diversidade e beleza das
suas espécies (ROCHA, 2010) e, apesar de possuir várias aplicabilidades e possuir
um inegável potencial econômico, poucas espécies desta família foram estudadas,
química e farmacologicamente até o momento.
Nesse contexto, o estudo farmacológico da atividade antinociceptiva de
plantas da família Bromeliaceae é de grande importância, bem como o estudo de
sua toxicidade, a fim de assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o
desenvolvimento de futuros medicamentos. Assim, haverá uma maior estruturação
no conhecimento a respeito destes vegetais, espécies tão próximas dos nordestinos
sertanejos da caatinga e indispensáveis para sua sobrevivência.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 30 um estudo comparativo.
2. OBJETIVOS
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 31 um estudo comparativo.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Contribuir para o estudo farmacológico de espécies de plantas da família
Bromeliaceae do semiárido (bioma caatinga): Neoglaziovia variegata, Encholirium
spectabile e Bromelia laciniosa.
2.2. Objetivos específicos
- Realizar triagem fitoquímica para a identificação das principais classes de
constituintes químicos;
- Avaliar o potencial antinociceptivo das espécies Neoglaziovia variegata,
Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa da família Bromeliaceae;
- Avaliar o perfil de segurança, através do estudo de toxicidade aguda do extrato
etanólico bruto das espécies;
- Realizar um estudo comparativo com os resultados das plantas avaliadas;
- Contribuir para a farmacologia da família Bromeliaceae, fornecendo subsídios para
estudos posteriores, visando ao isolamento dos constituintes químicos bioativos.
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3. FUNDÃMENTÃÇÃ O
TEO RICÃ
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3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Considerações sobre a dor
3.1.1. Dor e Nocicepção
A dor é um sintoma muito importante para a sobrevivência do homem, é
necessária e tão imprescindível que a “American Pain Society” insere a dor como
sendo o quinto sinal vital, tão indispensável quanto os outros: temperatura, pulso,
respiração e pressão arterial. Esses quatro sinais são facilmente mensuráveis e
desde muito tempo fazem parte de uma conduta já automatizada e universal. Mas a
dor não pode ser objetivamente determinada, pois, é considerada como uma
experiência subjetiva e pessoal (SOUZA, 2002).
O significado da palavra “dor” denota sofrimento, que vem do latim dolore. Na
literatura a dor é definida de várias formas, e habitualmente é descrita pela
Associação Internacional para Estudos da Dor (IASP) como uma “experiência
sensorial e emocional desagradável associada à lesão tecidual real ou potencial, e
descrita em função de tal” (WIESENFELD-HALLIN, 2005; COSTA et al., 2007; PRO;
GARZA, 2010).
Os fisiologistas distinguem os termos dor e nocicepção, onde a dor é uma
experiência emocional desagradável, enquanto a nocicepção se caracteriza como
sendo um mecanismo pelo qual os estímulos nocivos chegam ao sistema nervoso
central. Assim, quando se trata de animais, o termo correto a ser utilizado é
nocicepção, já que há dificuldade de se avaliar o caráter subjetivo da dor nestes
sujeitos.
3.1.2. Nociceptores
Os nociceptores (Figura 1), de acordo com Fein (2011) são neurônios, cuja
função básica é de transmitir informações sobre a lesão tecidual ocasionada por
estímulos nocivos, térmicos, mecânicos ou químicos. Várias possibilidades podem
explicar como estes diferentes estímulos resultariam na sensação de dor. A primeira
possibilidade é que os nociceptores individuais são sensíveis a todos esses
estímulos diferentes. A outra é que existem vários tipos de nociceptores, e cada um
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 34 um estudo comparativo.
é sensível a um estímulo específico, atualmente, contudo, se evidenciam ambas as
possibilidades.
Os chamados nociceptores foram descritos em quatro classes: os mecânicos,
térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos respondem a
pressão intensa; os nociceptores térmicos respondem a temperaturas extremas,
quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C); já os nociceptores polimodais respondem aos
estímulos nocivos mecânicos, térmicos ou químicos. Os nociceptores silenciosos
são ativados por estímulos químicos, mediadores inflamatórios, e respondem a
estímulos mecânicos e térmicos somente depois de serem ativados (FEIN, 2011).
Figura 1. Desenho esquemático do nociceptor (FEIN, 2011; Disponível em:
http://www.dol.inf.br/nociceptores).
3.1.3. Fibras e vias nociceptivas
As fibras nociceptoras são terminações nervosas livres predominantemente
mielinizadas (Aδ, Aα, Aβ), e podem ser não-mielinizados (fibras C) (Figura 2)
(RUSSO; BROSE, 1998; MILLAN, 1997). Na maioria dos livros atuais se considera
que apenas as fibras nervosas de diâmetros menores e mais lentas são sentidas
como dor, as fibras C e Aδ e que transportam os sinais aferentes dos nociceptores.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 35 um estudo comparativo.
Figura 2. Terminações nervosas livres, Fibras Aδ e C (Disponível em
www.xlsistemas.com - Miniatlas de Dor).
Os sinais dolorosos, por sua vez, são enviados para o cérebro por meio de
duas vias diferentes: o feixe neoespinotalâmico e o feixe paleoespinotalâmico. A
maior parte das fibras do feixe neoespinotalâmico se encaminha diretamente para o
tálamo, terminando no complexo ventrobasal. A partir dessas áreas, os sinais são
transmitidos para outras áreas basais do cérebro e para o córtex sensorial somático
(Figura 3). A via paleoespinotalâmica, por outro lado, é um sistema muito mais antigo
e transmite os sinais dolorosos conduzidos, principalmente, pelas fibras periféricas
de dor lenta do tipo C, cujo neurotransmissor liberado é a substância P (GUYTON;
HALL, 2011). Nas pontas dorsais da medula, onde as fibras nervosas periféricas
dessa via terminam, a maior parte dos sinais passa através de um ou mais
neurônios internunciais de fibras curtas. Os neurônios aí localizados originam
axônios longos que se juntam às fibras da via de dor rápida, passando para o lado
oposto da medula pela comissura anterior e se dirigindo para o cérebro pela mesma
via anterolateral.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 36 um estudo comparativo.
Figura 3. Via nociceptiva de transmissão da dor (Disponível em www.xlsistemas.com
- Miniatlas de Dor).
3.1.4. Mecanismo da Dor Central
A lesão tecidual provoca a liberação de algumas substâncias, tais como:
glutamato, aspartato, substância P, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina,
somatostatina, neurocinina-A. Esses neurotransmissores se ligam a receptores
específicos e se relacionam com a ativação de potenciais pós-sinápticos excitatórios
(ROCHA, 2007). Esses receptores se localizam nas células posteriores da medula
espinhal e sua ativação se relaciona com a transmissão das fibras aferentes
nociceptivas, possivelmente as fibras Aδ e C (NEIRA; ORTEGA, 2004).
Após a liberação de aminoácidos excitatórios, peptídeos e neurotrofinas e sua
interação com receptores específicos, há a ativação de enzimas e segundos
mensageiros, como por exemplo, AMPc, PKA, PKC, fosfotidilinositol, fosfolipase C e
fosfolipase A2. Isto promove a abertura de canais para cálcio, e, conseqüentemente,
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 37 um estudo comparativo.
a produção de prostaglandinas e óxido nítrico. Isto estimula a liberação de
neurotransmissores excitatórios, glutamato e aspartato, no corno dorsal da medula
espinhal e produz a despolarização, ocorrendo, dessa forma, aumento da
condutividade ao cálcio e a resposta à dor.
3.1.5. Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória
A dor pode estar associada a diversos processos que geram danos, lesões,
respostas teciduais ou reações inflamatórias, levando às desordens do sistema
nervoso condutor, associados a estímulos sensoriais envolvidos na transdução dos
sinais dolorosos, que atuam nos nociceptores e permite a condução e a percepção
da dor. Neste contexto, há estímulos sensoriais próprios, tais como deformação
mecânica do tecido, e aumento ou diminuição da temperatura no tecido; existem
alterações locais no meio extracelular devido à liberação de substâncias do tecido
ferido, onde elas normalmente se encontram no meio intracelular; e há substâncias
liberadas como parte de uma resposta inflamatória no local da lesão(ROCHA, 2007).
As citocinas são peptídeos liberados no local da lesão por células do sistema
imunológico, atuando através de sinalização parácrina ou autócrina. Tais substâncias
influem sobre as células do sistema imunológico e controlam a produção e a
atividade de outras citocinas, maximizando ou minimizando a resposta inflamatória
(KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).
Para que a dor seja percebida e interpretada pelo córtex cerebral, no sistema
nervoso central, ela, a dor, e transdutores de seu estímulo percorrem um longo
caminho até que finalmente seja compreendida. Dessa forma, tal estímulo percorre
uma trajetória que atravessa a medula e toda a extensão dos nervos periféricos,
interconectando os sistemas nervosos centrais e periféricos (FEIN, 2011). A origem
se dá nas extremidades das fibras nervosas periféricas, onde se localizam os
nociceptores, aonde agem os estímulos dolorosos térmicos, químicos e mecânicos
que, ao fim de todo processo, converge para a geração de um potencial de ação
nestas fibras, e a condução desse estímulo elétrico transduzido (Figura 4).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 38 um estudo comparativo.
Figura 4. Representação esquemática do mecanismo de percepção da dor.
Assim, através desse processo, a dor de origem inflamatória atua por meio de
substâncias químicas (denominadas algiogênicas), como a acetilcolina, bradicinina,
histamina, serotonina, leucotrienos, substância P, fator de ativação plaquetário,
radicais, ácidos, íons potássio, prostaglandinas, tromboxanos, interleucinas, fator de
necrose tumoral (TNFα), fator de crescimento nervoso e monofosfato cíclico de
adenosina (AMPc); sensibilizando os nociceptores (ROCHA, 2007). O processo
inflamatório é necessário para se iniciar a reparação dos tecidos lesados, e é graças
a esse tecido que a inflamação ocorre, bem como a dor decorrente dela (Figura 5).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 39 um estudo comparativo.
Figura 5. Processo de dor inflamatória resultante de lesão tecidual (Disponível em
www.xlsistemas.com - Miniatlas de Dor).
As células lesadas liberam enzimas intracelulares capazes de oxidar ácidos
graxos de cadeias longas no meio extracelular, originando como produtos as cininas,
As cininas compõem outras enzimas plasmáticas, ativadas pela inflamação e capaz
de originar a bradicinina - um importante componente da propagação inflamatória e
potente vasodilatador arteriolar, que aumenta a permeabilidade capilar (Figura 6).
Figura 6. Representação esquemática do processo fisiopatológico da reação
inflamatória.
A B
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 40 um estudo comparativo.
A fosfolipase A2, por sua vez, é uma enzima intramembranar cuja função e atuação
enzimática gera como produto, o ácido araquidônico intracelular. A partir daí, o ácido
poderá servir como substrato metabólico para três vias principais: a primeira é ser
metabolizado pela enzima cicloxigenase em três produtos, (prostanglandinas,
prostaciclinas e tromboxanos); a segunda é ser metabolizado pela enzima
lipoxigenase em leucotrienos e lipoxinas; e, por fim, pelo citocromo P450,
denominada via da epoxigenase (ROCHA, 2007). Esses compostos resultantes
diminuem o limiar de excitabilidade dos nociceptores, tornando-os mais sensíveis a
captação e a propagação dos estímulos dolorosos.
Em suma, ocorre um acúmulo de metabólitos do ácido araquidônico, em
especial as prostaglandinas e os leucotrienos, resultantes de uma agressão tecidual
inicial, e são responsáveis pela degranulação de mastócitos e ativação de fibras
nervosas, macrófagos e linfócitos, ocorrendo alterações na permeabilidade vascular,
fluxo sanguíneo e produzindo os cinco sinais flogísticos clássicos da inflamação: dor,
calor, rubor, edema e perda de função.
3.2. Considerações sobre analgesia
3.2.1. Analgesia e vias da analgesia
É muito variável o grau com que cada pessoa reage à dor. Isso resulta, em
parte, da capacidade que possui o próprio cérebro de controlar o grau de entrada
dos sinais dolorosos no sistema nervoso, pela ativação do sistema de controle da
dor, chamado sistema da analgesia (GUYTON; HALL, 2011).
O sistema da analgesia consiste em três componentes principais: a área
periaquedutal cinzenta que circunda o aqueduto de Sylvius. Os neurônios dessa
área enviam seus sinais até o núcleo magno da rafe, localizado na parte inferior da
ponte e na parte superior do bulbo, que recebe sinais provenientes dos neurônios
localizados na área cinzenta periaquedutal. Desse núcleo, os sinais são transmitidos
em direção à medula, pelas colunas dorsolaterais, para o complexo para a inibição
da dor localizado nas pontas dorsais da medula espinhal. Nesse ponto os sinais de
analgesia são capazes de bloquear os sinais dolorosos antes que eles cheguem ao
encéfalo.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 41 um estudo comparativo.
Várias substâncias transmissoras estão envolvidas no sistema da analgesia,
especialmente a encefalina e a serotonina. Grande parte das fibras nervosas
provenientes, tanto dos núcleos periventriculares como da área cinzenta
periaquedutal, secretam encefalina por seus terminais. Dessa maneira, a maior parte
das terminações das fibras no núcleo magno da rafe libera encefalina. (GUYTON;
HALL, 2011). As fibras que se originam nesses núcleos e terminam nas pontas
dorsais da medula espinhal secretam serotonina por suas terminações. A serotonina
liberada atua, por sua vez, sobre grupos de interneurônios localizados na medula,
que, ao que parece, liberam encefalina. A encefalina parece causar inibição pré-
sináptica nas junções medulares das fibras de dor tipo C e Aδ. O mecanismo dessa
ação está provavelmente ligado ao bloqueio dos canais de cálcio nas membranas
das terminações nervosas. O bloqueio desses canais provoca diminuição na entrada
de íons cálcio nos terminais, com a conseqüente diminuição da quantidade de
transmissor liberado na sinapse. Portanto, o sistema da analgesia é capaz de
bloquear os sinais dolorosos em seus pontos de entrada na medula espinhal.
3.2.2. Drogas analgésicas
O analgésico tem a finalidade de aliviar a dor, podendo agir perifericamente
no local da dor, ou no sistema nervoso central, modificando o processamento dos
sinais que o cérebro recebe através dos nervos. O conceito de dor, que é o alvo de
atuação dos analgésicos é muito amplo, sendo difícil de ser definido (RANG et al.,
2007).
Os analgésicos já foram denominados narcóticos, hipnoanalgésicos,
narcoanalgésicos, termos que, atualmente, são considerados impróprios (GOZZANI,
1994 apud DUARTE, 2005), haja vista que o alívio ou o cessar da dor deverá ocorrer
sem perda da consciência. Atualmente existem diversas classes de fármacos
analgésicos disponíveis no mercado, que podem ser divididos em: analgésicos
periféricos, ou seja, os fármacos antiinflamatórios não esteroidais (AINES), como o
ácido acetilsalicílico (AAS) e a dipirona, inibidores da síntese das prostaglandinas,
que atuam diminuindo a sensibilidade das fibras aferentes primárias (RANG et al.,
2007). Há também analgésicos de ação central, também chamados opióides, a
exemplo da morfina, que tem como característica aumentar o limiar neuronal ao
estímulo nocivo ou até mesmo erradicar a sensação dolorosa (ALMEIDA, 2006).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 42 um estudo comparativo.
Há casos especiais em que os analgésicos tradicionais não têm boa
atividade, como no caso de dor de origem neuropática (RANG et al., 2007),
necessitando, assim, de uma maior variedade de classes de analgésicos. Dessa
forma, a pesquisa por novos analgésicos tem sido prioridade para farmacologistas e
indústria farmacêutica, na tentativa de obter medicamentos mais eficazes e reduzir
os efeitos colaterais (ALMEIDA, 2006).
3.3. Considerações sobre a família Bromeliaceae e as espécies selecionadas
para estudo
3.3.1. Considerações sobre a família Bromeliaceae
A descrição desta família é atribuída ao padre francês Charles Plumier que,
no final do século XVII, se deparou com um conjunto de plantas diferentes e
resolveu batizá-las de bromélias, em homenagem ao botânico sueco Olaf Bromel.
Em 1789, foi estabelecida formalmente a reunião destas plantas, que se designou
por Bromelie (BENZING, 1980; MANETTI et al., 2009). Bromeliaceae é uma família
de monocotiledôneas de grande importância para a flora ecológica, e se destaca
pela grande diversidade genérica e específica, com 57 gêneros, 80% ocorrem no
território brasileiro, com 3.086 espécies (LUTHER, 2006). Estima-se que do total de
espécies, cerca de 40% podem ser encontradas no Brasil, colocando o país entre os
mais importantes em termos de diversidade na família (LEME, 1997). A família é
tradicionalmente dividida em três subfamílias: Pitcairnioideae, Tillandsioideae e
Bromelioideae (SMITH; DOWNS, 1974; BENZING, 2000).
A família Bromeliaceae apresenta uma longa história de uso etnobotânico,
associada aos povos americanos nativos, como fonte de fibras, alimentos, forragens
e medicamentos, além de uso ornamental e místico (BENNETT, 2000). Estas
categorias refletem, principalmente, antigas aplicações e percepções indígenas e
nem sempre coincidem com seu uso moderno (BENZING, 2000).
Muitas bromeliáceas ganharam popularidade entre paisagistas e jardineiros
justamente devido à beleza de suas formas e cores, durabilidade das
inflorescências, baixa demanda de cuidados e fácil adaptação a pequenos jardins
(BENZING, 2000).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 43 um estudo comparativo.
Apesar do nome desta família estar intimamente associado às bromélias, o
abacaxi (Ananas comosus) é a espécie de Bromeliaceae mais conhecida, pelo seu
sabor e aromas marcantes, sendo o único desta família utilizado como fonte de
alimento. Seus frutos contêm a bromelina, uma enzima que os protege da
depredação por larvas de insetos, a qual apresenta grande valor comercial devido a
sua aplicabilidade na indústria farmacêutica (atividade anti-helmíntica,
antiinflamatória e anticancerígena) (MAURER, 1999) e na indústria alimentícia
(amaciante de carnes vermelhas, hidrolizante de complexos proteína-taninos, na
produção de cerveja, pães, leite de soja e ovos desidratados) (FREIMAN, 1999).
Além da bromelina, muitas outras enzimas já foram isoladas e identificadas de
diferentes bromeliáceas, as quais também apresentam grande potencialidade de ser
empregada nestes ou em outros segmentos industriais (VALLÉS et al., 2007).
Considerando o grande número de espécies da família Bromeliaceae, poucas
delas foram estudadas quimicamente até o momento. Apesar disto, há uma
quantidade considerável de compostos identificados, os quais pertencem
principalmente às classes dos triterpenóides e flavonóides. Outras classes de
compostos como esteróis, diterpenos, ácidos cinâmicos, gliceróis substituídos,
lignanas, compostos nitrogenados, entre outros, também foram identificados nesta
família, embora em número bastante reduzido (MANETTI et al., 2009). Do ponto de
vista farmacológico, também há poucos trabalhos descritos na literatura (MANETTI
et al., 2009). Dessa forma, estudos mostraram que o extrato de Nidularium procerum
apresentou propriedades anti-alérgicas (VIEIRA-DE-ABREU et al., 2005), bem como
propriedades analgésicas e anti-inflamatória (AMENDOEIRA et al., 2005), como
também foi demonstrada atividade antiulcerogênica em outros extratos de plantas da
família (CARVALHO et al., 2010).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 44 um estudo comparativo.
3.3.2. Considerações sobre a espécie Neoglaziovia variegata
A espécie Neoglaziovia variegata Mez. é uma Bromeliaceae endêmica do
Brasil, conhecida popularmente como “caroá”, amplamente distribuída na região da
caatinga por todo o Semiárido do Nordeste brasileiro (RIBEIRO, 2007), e parte da
região Sudeste (Minas Gerais) (Figura 7) (FORZZA et al., 2011). Pode ser
encontrada no interior de matas mais fechadas até as áreas mais abertas, em solos
compactos e pouco profundos. Esta planta possui folhas longas que medem de 100
a 200 cm, com espinhos nos bordos curvados para o ápice da folha, nervuras
paralelinérveas, face adaxial esparsamente pruinosa-lepidota, face abaxial glabra,
verde com manchas irregulares cinza; inflorescência de 18 a 30 cm, racemosa,
ereta, multiflora e flores pedicelada 1 cm, com pétalas avermelhadas e anteras
amarelas.
Figura 7. Distribuição fitogeográfica de Neoglaziovia variegata (Disponível em
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2011).
O caroá apresenta potencialidades econômicas centradas nas folhas, as
quais se constituem de fibras de alta resistência e na década de 40, o extrativismo
do caroá alcançou níveis mais significativos (PEREIRA; QUIRINO, 2008). Nessa
época a espécie foi bastante importante para a economia nordestina, porém, sua
exploração foi abandonada com o surgimento das fibras sintéticas (RIBEIRO, 2007).
Atualmente, as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego
e renda para diversas famílias nordestinas, com a fabricação artesanal de chapéus,
bolsas, entre outros produtos.
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Figura 8. Foto de Neoglaziovia variegata (ARAÚJO; CARVALHO-SOBRINHO, 2009)
Disponível em: http://www.univasf.edu.br/~hvasf
3.3.3. Considerações sobre a espécie Encholirium spectabile
O gênero Encholirium é exclusivamente brasileiro, possui diversas espécies, e
a Encholirium spectabile Mart. é a mais conhecida do gênero, devido à freqüência
com que é encontrada nos afloramentos rochosos ao longo de toda a caatinga
brasileira, com a mais ampla distribuição geográfica dentro do gênero, ocorrendo por
quase toda a Região Nordeste do Brasil e tem como limite sul a região de Milagres,
na Bahia, e ao norte o município de Buriti dos Lopes, no Piauí (FORZZA, 2005).
Esta planta possui vários domínios fitogeográficos, e pode ser localizada na
transição da Caatinga-Cerrado e Caatinga-Mata Atlântica (Figura 9) (FORZZA et al.,
2010).
A espécie Encholirium spectabile Mart. é uma Bromeliaceae endêmica do
Brasil conhecida popularmente como “Macambira de flecha” (SIQUEIRA-FILHO;
LEME, 2006).
A planta possui de 1,2 a 2,5 m de altura, formando grande touceira, o rizoma
apresenta ramificações laterais com roseta de 0,5 a 1,1 m de diâmetro. Esta espécie
ainda se caracteriza por possuir folhas ereto-patentes com bainha foliar de 25 a 84
cm de comprimento e 2,2 a 4,7 cm de largura cuja face abaxial e adaxial cinéreas de
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 46 um estudo comparativo.
coloração muito variada, são carnosas, densamente espinhosas, com acúleos de 0,6
a 1,2 cm de comprimento. (FORZZA, 2005).
Figura 9. Distribuição fitogeográfica de Encholirium spectabile (Disponível em
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2011).
A planta também possui uma haste floral fibrosa, dura, cilíndrica, e sua
inflorescência pode atingir até 1,8 m de comprimento, cujas flores possuem um
cálice verde, corola amarelada e estames amarelos. Esta planta é comumente
utilizada como planta ornamental, e como forrageira. Na literatura há relato sobre a
atividade farmacológica da espécie, pois o extrato de Encholirium spectabile
apresentou uma excelente atividade antiulcerogênica (CARVALHO, 2010).
Figura 10. Foto de Encholirium spectabile (SIQUEIRA-FILHO, 2009) Disponível em:
http://www.univasf.edu.br/~hvasf
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 47 um estudo comparativo.
3.3.4. Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa
Bromelia laciniosa Mart. ex Shult. é uma planta da família das Bromeliaceae
conhecida popularmente como “macambira”, “macambira de porco” e “macambira de
cachorro”, está presente nas áreas secas do Nordeste, desde a Bahia até o Piauí, e
é utilizada na alimentação nos longos períodos de seca, na região do semiárido
nordestino (Figura 11) (FORZZA et al., 2010).
Figura 11. Distribuição fitogeográfica de Bromelia laciniosa (Disponível em
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2011).
As espécies do gênero Bromelia podem ser reconhecidas por possuírem
folhas com acúleos curvos, bainha foliar coberta por tricomas muitas vezes lineares,
pétalas carnosas e unidas ao tubo estaminal, apêndices petalíneos ausentes e
sementes nuas (SMITH; DOWNS, 1979 apud MONTEIRO, 2009). Possuem raízes
finas, caule de forma cilíndrica e folhas com presença de espinhos, dispostas em
roseta em torno do caule (constituídas de duas partes distintas: base dilatada e
limbo), acumula água, possui raiz tipo fasciculada e, por conta dessa característica,
pode ser utilizada no combate à erosão (ANGELIM, 2007).
O tamanho da planta é variado, e o seu fruto é uma baga de três a cinco
centímetros de comprimento e diâmetro, variando de 10 a 20 milímetros. Quando
maduras, as bagas são amarelas, lembrando um cacho de pequenas bananas. A
macambira cresce debaixo de outras árvores ou nas clareiras.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 48 um estudo comparativo.
Figura 12. Foto de Bromelia laciniosa (SOBRINHO, 2009; FONTANA, 2010)
Disponível em: http://www.univasf.edu.br/~hvasf
É aproveitada na alimentação dos animais (ou até mesmo do homem) durante
os longos períodos de seca. Da base das folhas é extraída uma massa, da qual se
fabrica um tipo de pão.
A B. laciniosa é uma espécie que pouco se tem referências, apesar de ser
vista como uma das alternativas oferecidas pela Caatinga, para pequenos criadores
do Nordeste como complementação alimentar de suas criações (caprinos, ovinos e
suínos) e, assim, durante o período de estiagem, reduzir seus custos através de um
manejo adequado e sustentável. Ela possui na sua parte aérea, 4,9% de proteína
bruta, 2,8% de amido e 1,1% de cálcio (MANERA, 2001; ANGELIM, 2007).
Tendo em vista a ampla distribuição dessas espécies no bioma
caatinga e a ausência de estudos químicos e farmacológicos, esse trabalho
apresenta pela primeira vez, os resultados da avaliação da atividade antinociceptiva
de Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa. Assim,
pretendemos fornecer informações a respeito das propriedades farmacológicas
dessas espécies, visando à realização de novos estudos nas áreas de química e
farmacologia, bem como contribuir para a conservação e manejo sustentável das
mesmas na região do semiárido, bioma Caatinga.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 49 um estudo comparativo.
4. PÃRTE EXPERIMENTÃL
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 50 um estudo comparativo.
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. Material vegetal
4.1.1. Neoglaziovia variegata
As folhas de Neoglaziovia variegata foram coletadas no município de
Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. O material botânico foi
identificado pelo biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para
Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta
está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade
Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código 6441.
4.1.2. Encholirium spectabile
As folhas de Encholirium spectabile foram coletadas no município de
Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. O material botânico foi
identificado pelo biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para
Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta
está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da UNIVASF sob o
código 6443.
4.1.3. Bromelia laciniosa
As folhas de Bromelia laciniosa foram coletadas no município de Petrolina,
Estado de Pernambuco em Janeiro de 2010. O material botânico foi identificado pelo
biólogo André Paviotti Fontana do Centro de Referência para Recuperação de Áreas
Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da planta está depositada no
Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da UNIVASF sob o código 6442.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 51 um estudo comparativo.
4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das folhas das espécies
selecionadas
O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração fracionada
com etanol 95%. Foram realizadas 4 extrações com intervalos de 72 horas entre
cada extração. A solução foi filtrada e concentrada em evaporador rotatório. Após
evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico bruto das
plantas estudadas. A partir de:
- 1.174 g do pó seco de Neoglaziovia variegata foi obtido 45 g do extrato
etanólico bruto (3,83% de rendimento em relação ao peso seco da planta).
- 1.196 g do pó seco de Encholirium spectabile foi obtido 64 g do extrato
etanólico bruto (5,35% de rendimento em relação ao peso seco da planta).
- 874 g do pó seco de Bromelia laciniosa foi obtido 39 g do extrato etanólico
bruto (4,39% de rendimento em relação ao peso seco da planta).
4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos
Os extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com
suporte de alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de
solventes, conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar
os principais grupos do metabolismo secundário (Tabela 1).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 52 um estudo comparativo.
Tabela 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os
principais metabólitos secundários dos extratos das três espécies de Bromeliaceae
por cromatografia em camada delgada (Wagner; Bladt, 1996).
Classe
química
Sistema eluente Padrão Revelador
Alcalóides
gerais
Tolueno:acetato de
etila:dietilamina
(70:20:10)
Yoimbina
Quinina Dragendorff
Antocininas
Acetato de etila:ácido
fórmico:ácido acético
glacial:água
(100:11:11:26)
Azul de
metileno Anisaldeído sulfúrico
Antraquinonas
agliconas
Éter de Petróleo:acetato de
etila:ácido fórmico
(75:25:1)
Antraquinona
Ácido fosfomolíbdico/
H2SO4 etanólico 10%
Flavonóides
Acetato de etila:ácido
fórmico:ácido acético
glacial:água
(100:11:11:26)
Rutina
Quercetina NEU
Cumarinas
Tolueno:éter etílico
(1:1 saturado com ácido
acético 10%)
Escopoletina KOH etanólico 10%
Derivados
antracênicos
Acetato de
etila:metanol:água
(100:13,5:10)
Aloína KOH etanólico 10%
Lignanas Clorofórmio:metanol:água
(70:30:4)
Estrato de
linhaça Vanilina fosfórica
Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico
(99:1)
Biflorina
Lapachol
KOH etanólico 10%
Continua
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 53 um estudo comparativo.
Tabela 1 (Continuação)
Saponinas
Clorofórmio:ácido
acético:metanol:água
(64:32:12:8)
Saponina Anisaldeído sulfúrico
Taninos
condensados
Acetato de etila:ácido
acético glacial:ácido
fórmico:água
(100:11:11:26)
Catequina
Epicatequina Vanilina clorídrica
Taninos
hidrolisáveis
n-Butanol:acetona:tampão
fosfato
(40:50:10)
Ácido gálico
Ácido tânico
Sulfato de ferro
amoniacal( 1%)
Triterpenos e
esteróides
Tolueno:clorofórmio:etanol
(40:40:10)
Lupeol
Sitosterol Lieberman-Burchard
Xantinas
Acetato de
etila:Metanol:água
(100: 13,5: 10)
Cafeína Iodo- KI-HCl
4.4. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a
detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)
A análise do perfil de compostos fenólicos foi realizada em CLAE, modelo
Lachrom Elite, coluna de fase reversa LiCospher RP18 (5 mm) com dimensões (150
mm x 04 mm) Merck equipado com detector de arranjo de diodo (DAD). A fase
móvel utilizada foi uma solução de H2O/H3PO4 0,1 % (A) e MeOH (B),
inicialmente 75% de A e 25% de B, por 25 minutos. A temperatura da coluna foi
mantida constante em 30 °C com um fluxo de 1,0 mL/min. Para o extrato foi utilizado
um volume de injeção de 20 μl. Os dados espectrais foram registrados em 320-
322 nm durante a corrida inteira. A análise em CLAE-DAD foi realizada no
Laboratório de Fitoquímica da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS),
Bahia.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 54 um estudo comparativo.
4.5. Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os
sexos, pesando entre 25-35 g, todos procedentes do Biotério Setorial da UNIVASF,
Campus Petrolina. Antes dos experimentos, todos os animais foram mantidos em
gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura (22 ± 2 °C) controladas e
constantes e ciclo claro-escuro de 12 horas, com a fase de luz iniciando às 6:00 e
terminando às 18:00 horas, sob rigoroso controle alimentar com uma dieta
balanceada a base de ração tipo “pellets” (Labina®) com livre acesso à água
(disponível em frascos de plástico com bicos apropriados) até 60 minutos antes dos
experimentos. Todos os experimentos foram realizados no período de 07:00 às
14:00 horas. Os procedimentos obedeceram às normas do Colégio Brasileiro De
Experimentação Animal (COBEA), e os protocolos experimentais foram aprovados
pelo comitê de ética em pesquisa da UNIVASF sob o número 21051023.
4.6. Testes de atividade antinociceptiva
4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Koster,
Anderson e Beer (1959). Grupos de 6 animais receberam veículo (salina), morfina
(10 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e os extratos de Neoglaziovia
variegata (Nv-EtOH), Encholirium spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-
EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg em relação ao peso do corpo dos
animais. Os extratos foram administrados por via intraperitoneal (i.p.) 30 minutos
antes da administração de uma solução de ácido acético (0,9% v/v). O número de
contorções abdominais produzidas em cada grupo foi registrado durante 10 minutos,
iniciando-se 5 minutos após a administração do ácido acético.
4.6.2. Teste da formalina
O método utilizado foi semelhante ao descrito por Vianna et al. (1998). Os
animais foram tratados com veículo (salina), morfina (10 mg/kg), ácido acetilsalicílico
(AAS 200 mg/kg) e os extratos de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), Encholirium
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 55 um estudo comparativo.
spectabile (Es-EtOH) e Bromelia laciniosa (Bl-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400
mg/kg em relação ao peso do corpo dos animais. Os extratos foram administrados
por via intraperitoneal (i.p.) 1 hora antes da administração subplantar de 20 µL de
formalina 2,5% (em salina). Para avaliar a participação de receptores opióides no
efeito do extrato, foi administrado naloxona (1,5 mg/kg), um antagonista desses
receptores. Foi considerado como indicativo de dor, lambidas realizadas pelo animal
na pata que sofreu a injeção. Registrou-se o tempo de lambidas no intervalo de 0 a 5
minutos (fase 1 – dor neurogênica) e no intervalo de 15 a 30 minutos (fase 2 – dor
inflamatória). Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho
montado em três lados para permitir a visão das patas.
4.6.3. Teste da placa quente
Nesse teste, foi considerado como latência de resposta, o tempo que os
animais permaneciam sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até
reagirem ao estímulo térmico, caracterizado pelo comportamento de levantar ou
lamber as patas (TITA et al., 2001). As aferições foram realizadas em 30, 60, 90 e
120 minutos após a administração de salina (grupo controle), Nv-EtOH, Es-EtOH e
Bl-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) e morfina (10 mg/kg). Naloxona também foi
administrada para avaliação da participação de receptores opióides.
4.7. Toxicidade Aguda e determinação da DL50
Na investigação da toxicidade aguda, os camundongos foram divididos em
grupos de 5 machos e 5 fêmeas (n = 10). O grupo controle recebeu veículo (salina).
Os demais receberam pré-tratamento com uma dose única do extrato etanólico bruto
das plantas, na dose de 2000 mg/kg e 5000 mg/kg por via intraperitoneal e via oral,
respectivamente. Posteriormente, os animais foram observados durante 14 dias para
avaliar a presença de mortes e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como:
variação de peso corporal, consumo de alimento e água foram avaliados
diariamente, durante todo o estudo.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 56 um estudo comparativo.
4.7.1. Triagem comportamental
A triagem comportamental dos camundongos foi realizada seguindo os
parâmetros descritos por Almeida et al. (1999). Os animais foram observados em
0,5, 1, 2, 3 e 4 h após a administração do extrato etanólico bruto das espécies
estudadas. Comportamentos específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções
abdominais, convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras,
sedação, ambulação aumentada, a resposta ao toque diminuída, movimentação
intensa das vibrissas, agressividade, estereotipia, analgesia e defecação) foram
observados e classificados.
4.7.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos
Ao final dos 14 dias do experimento, os animais foram anestesiados
(cetamina 90 mg/kg e xilasina 5 mg/kg), e o sangue foi retirado para análise. Para a
avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi utilizada a
metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008) com
modificações. O sangue foi retirado puncionando-se o plexo braquial (0,9 mL de
sangue), para análise laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de
eritrócitos (106/mm3), hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular
médio (MCV, μ3), hemoglobina corpuscular média (MCH, g), concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%),
monócitos (%) e plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em
amostras de soro foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL),
AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Para a
determinação dos parâmetros hematológicos foi utilizado analisador de hematologia
Sysmex XT-2000, já para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador
semi-automático Wiener BT 3000 Plus.
4.7.3. Análise histopatológica dos órgãos
Após a coleta do sangue, os animais ainda sob anestesia profunda, foram
removidos fragmentos (medindo aproximadamente:1,0cm X 1,0cm) dos seguintes
órgãos: rins, fígado, coração, pulmão, pâncreas e estômago, lavados imediatamente
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 57 um estudo comparativo.
em solução salina (soro fisiológico) e a seguir para se proceder à Fixação os
mesmos foram imersos em solução de formol a 10%, tamponado (tampão fosfato
0,1 M pH 7,2) por 18 h. Decorrido este tempo, os fragmentos foram lavados em água
corrente e em seguida imersos em álcool a 70% e transportados ao Laboratório de
Biologia Celular, Histologia e Citologia, no Campus de Ciências Agrárias da
UNIVASF. Para desidratação destes utilizou-se etanol em série crescente (80, 95 e
100%), sendo posteriormente clarificados em xilol, impregnados com parafina
histológica em estufa à 58ºC e finalmente incluídos em parafina histológica,
obtendo-se desta forma os blocos. Cada bloco de parafina foi submetido à
microtomia e as seções de 7 µm de espessura obtidas foram estiradas em banho
histológico e em seguida montadas em lâminas de vidro. Para análise histológica as
preparações foram coradas com hematoxilina e eosina (H.E.) e examinadas em
microscópio de luz 400 x. (Microscópio Binocular Zeiss Axiolab - Laboratório de
Citologia e Histologia Quantitativa do Dep.Ciências Farmacêuticas,CCS-UFPE).
4.8. Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism, versão
4.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos foram calculadas pela aplicação de
uma análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Dunnett, ou pelo teste t de
Student, conforme exigido pelo protocolo experimental. Foram considerados
significativos os valores de p < 0,05, quando comparados com o controle negativo.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 58 um estudo comparativo.
5. RESULTÃDOS
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 59 um estudo comparativo.
5. RESULTADOS
5.1. Triagem fitoquímica
As análises fitoquímicas dos extratos etanólicos brutos de N. variegata, E.
spectabile e B. laciniosa revelaram que, entre todos os constituintes avaliados, os
flavonóides mostraram-se mais fortemente presentes em todas as amostras (Tabela
2).
Outras substâncias foram detectadas como as antocianinas, terpenóides,
embora, a presença tenha sido igualmente moderada, enquanto a de saponinas foi
fraca para os três extratos. Não foram detectados em nenhum dos extratos
analisados os seguintes constituintes: alcalóides, taninos condensados, cumarinas,
lignanas, naftoquinonas, triterpenos, esteróides e xantinas. O extrato de N. variegata
mostrou fortemente a presença de antraquinonas, perfil diferente do encontrado para
a E. spectabile, cuja presença foi moderada, e para a B. laciniosa, que se mostrou
ausente. Foram encontrados traços moderados de taninos hidrolisáveis no extrato
de N. variegata, e traço fraco na E. spectabile. Já em relação aos derivados
antracênicos, a concentração maior foi encontrada no Es-EtOH, embora tenha sido
moderada, ao mesmo tempo em que no Nv-EtOH e em Bl-EtOH foram encontrados
traços fracos.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 60 um estudo comparativo.
Tabela 2. Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das três espécies da
família Bromeliaceae.
Grupo metabólico Nv-EtOH Es-EtOH Bl-EtOH
Alcalóides gerais - - -
Antocianinas ++ ++ ++
Antraquinonas agliconas +++ ++ -
Taninos condensados - - -
Taninos hidrolisáveis ++ + -
Flavonóides +++ +++ +++
Cumarinas - - -
Derivados antracênicos + ++ +
Lignanas - - -
Naftoquinonas - - -
Saponinas + + +
Triterpenos e esteróides - - -
Xantinas - - -
Resultados: Ausente (-); Baixo (+); Moderado (++); Forte (+++)
5.2. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a
detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)
5.2.1. Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata
Os perfis fenólicos avaliados em 322 nm para o Nv-EtOH são apresentados
na Figura 13. O cromatograma mostra a presença de oito picos com tempos de
retenção diferentes: 9,60 (1), 10,89 (2), 11,80 (3), 14,44 (4), 15,16 (5), 15,58 (6),
16,69 (7) e 17,62 (8). Com base nos dados espectrais de UV-Vis e nos tempos de
retenção, os compostos têm características da banda de UV para derivados do ácido
cinâmico, cumarinas ou flavonóides. Estes compostos estão sob investigação.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 61 um estudo comparativo.
Figura 13: Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata obtido por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE-
DAD) em 322 nm.
5.2.2. Análise em CLAE do extrato etanólico de Encholirium spectabile
Os perfis fenólicos em 320 nm para o Es-EtOH avaliados são apresentados
na Figura 14. O cromatograma mostra a presença de dez picos com tempos de
retenção diferentes: 10,89 (1), 11,12 (2), 11,78 (3), 12,86 (4), 13,37 (5), 14,44 (6),
15,16 (7) 15,58 (8), 16,68 (9) e 17,63 (10). Com base nos dados espectrais de UV-
Vis e nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV
para derivados do ácido cinâmico, cumarinas ou flavonóides. Estes compostos estão
sob investigação.
1
3
5
7
82
4
6
1
3
5
7
82
4
6
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 62 um estudo comparativo.
Figura 14: Cromatograma do extrato etanólico de Encholirium spectabile obtido por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE-
DAD) em 320 nm.
5.2.3. Análise em CLAE do extrato etanólico de Bromelia laciniosa
Os perfis fenólicos a 320 nm para o Bl-EtOH avaliados são apresentados na
Figura 15. O cromatograma mostra a presença de nove picos com tempos de
retenção diferentes: 11,79 (1), 11,44 (2), 15,14 (3), 15,57 (4), 16,67 (5), 17,62 (6),
18,09 (7) 19,01 (8) e 19,89 (9). Com base em seus dados espectrais de UV-Vis e
seus tempos de retenção, os compostos têm características da banda UV para
derivados do ácido cinâmico, cumarinas e flavonóides. Estes compostos estão sob
investigação.
1 3 5
78
9
2
4
6
101 3 5
78
9
2
4
6
10
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 63 um estudo comparativo.
Figura 15: Cromatograma do extrato etanólico de Bromelia laciniosa obtido por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE-
DAD) em 320 nm.
5.3. Resultados de Neoglaziovia variegata
5.3.1. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata
5.3.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
Através do teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético foi
possível comprovar que Nv-EtOH possui atividade antinociceptiva. O efeito foi
evidenciado pela redução significativa no número de contorções (p < 0,01) em todas
as doses do extrato (100, 200 e 400 mg/kg), apresentando percentuais de inibição
de 89,50, 71,34 e 87,42 %, respectivamente, quando comparado ao grupo controle
(Figura 16). O grupo tratado com morfina na dose de 10 mg/kg obteve um percentual
de inibição de 100%, enquanto o grupo tratado com ácido acetilsalicílico na dose de
200 mg/kg obteve 99,28% de inibição, quando comparado ao grupo controle.
1
2 3 4
5
6 7
8
9
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 64 um estudo comparativo.
Figura 16. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo
de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos como
média ± erro padrão da média, n = 6. **p < 0,01 significativamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
5.3.1.2. Teste da formalina
No teste da formalina, o extrato etanólico da espécie analisada (Nv-EtOH)
apresentou atividade antinociceptiva em ambas as fases do teste. Na primeira fase,
o Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) inibiu 46,67, 44,23 e 41,81 % , respectivamente
(Figura 17). Porém, na segunda fase do teste, a inibição no tempo de lambida foi
mais pronunciada, apresentando percentuais de inibição todos superiores a 69%,
quando comparados ao grupo controle: 70,14, 69,43 e 90,28 %, respectivamente. O
melhor resultado do efeito de Neoglaziovia variegata no método de dor induzida por
formalina, foi observado na concentração de 400 mg/kg, chegando ao percentual de
inibição de 90,28 %, em relação ao grupo controle. O grupo tratado com morfina, na
dose de 10 mg/kg obteve percentual de inibição no tempo de lambida da pata na
primeira fase do teste de 60%, e na segunda fase 82,68%. Já no grupo que foi
administrado ácido acetilsalicílico na dose de 200 mg/kg, o percentual de inibição no
tempo de lambida da pata foi de 52,72% e 89,75% na primeira e segunda fase,
respectivamente.
0
10
20
30
**
**
**
** **
Controle
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
Nú
mero
de c
on
torç
ões
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 65 um estudo comparativo.
Figura 17. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Nv-EtOH
(400 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5
mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos
como média ± erro padrão da média, n = 6. **p < 0,01 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
O percentual de inibição no tempo de lambida da pata, após o pré-tratamento
com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 29,81% e 10%, na primeira e segunda fase,
respectivamente, para o grupo de animais que utilizou a morfina (10 mg/kg). Já para
o grupo experimental de Nv-EtOH ( 400 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,
não provocou nenhum percentual de inibição na primeira fase, ou seja, o efeito foi
completamente revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do teste da
Primeira fase
0
10
20
30
40
50
60
70
****
***
Controle
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + NLX
Nv-EtOH + NLX
*
Tem
po
de l
am
bid
a d
a p
ata
(s)
Segunda fase
0
50
100
150
**
** **
Controle
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + NLX
Nv-EtOH + NLX**
****
Tem
po
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am
bid
a d
a p
ata
(s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 66 um estudo comparativo.
formalina o grupo dos animais que receberam Nv-EtOH ( 400 mg/kg) com pré-
tratamento da naloxona, apresentou um percentual de inibição significativo (p <0,01)
de 72,32% no tempo de lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.
5.3.1.3. Teste da placa quente (hot plate)
No teste da placa quente, Nv-EtOH foi capaz de aumentar o tempo de latência
quando comparado com o grupo controle, fazendo com que os animais
permanecessem por mais tempo sobre a placa aquecida (Figura 18). O efeito foi
mais pronunciado nos tempos de 60, 90 e 120 minutos após a administração do
extrato, principalmente no tempo de 120 minutos nas doses de 200 e 400 mg/kg,
cujo tempo de latência foi elevado a valores muitos próximos aos apresentados pela
morfina. O pré-tratamento dos animais com a naloxona reverteu o efeito
antinociceptivo provocado pelo Nv-EtOH.
Figura 18. Atividade antinociceptiva de Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Nv-EtOH
(400 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5
mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua
administração. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p <
0,05; **p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo
teste de Dunnett).
30 60 90 1200
5
10
15
20Controle
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morfina + NLX
Nv-EtOH + NLX
***
* *
****
**
**
*
Tempo (min)
Tem
po d
e latê
ncia
(s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 67 um estudo comparativo.
5.3.2. Toxicidade aguda de Neoglaziovia variegata
Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Neoglaziovia
variegata, não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a
morte dos animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via
oral, respectivamente, indicando baixa toxicidade do extrato. Neste experimento foi
observado que Nv-EtOH tem DL50 > 2,0 g/kg quando administrado pela via
intraperitoneal e > 5,0 g/kg quando administrado pela via oral.
5.3.2.1. Avaliação comportamental dos camundongos
A triagem comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após
a administração de Nv-EtOH nas doses de 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via
intraperitoneal e por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram
mudanças significativas no comportamento. Os animais não mostraram qualquer
sinal de toxicidade, ou alteração comportamental ou de outras atividades
fisiológicas.
5.3.2.2. Consumo de alimento e água
O consumo de alimentos e água pelos camundongos tratados com Nv-EtOH
mostrou alterações significativas, principalmente naqueles em que foi administrada a
dose de 5 g/kg via oral. A quantidade de alimentos consumidos no final do
experimento foi de 53,69 ± 1,64 g para o grupo controle, enquanto o grupo tratado
com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 29,62 ± 0,86 g (p < 0,001) (Figura 19).
A quantidade de água consumida no final do experimento foi de 94,38 ± 3,15
ml para o grupo controle, enquanto o grupo tratado com a dose de 5 g/kg v.o. foi de
65,77 ± 3,41 mL (p < 0,001) (Figura 20).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 68 um estudo comparativo.
Figura 19. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Nv-EtOH durante 14
dias (n =10).
Figura 20. Consumo de líquido pelos animais tratados com Nv-EtOH durante 14
dias (n = 10).
5.3.2.3. Variação do peso corporal
Houve mudanças significativas (p < 0,001) no peso corporal dos camundongos
do 1 ao dia 14 no grupo tratado com o extrato na dose de 5 g/kg v.o. No final do
experimento, a média do grupo controle foi de 40,44 ± 0,27 g, enquanto a do grupo
tratado com a dose de 5 g/kg foi de 34,59 ± 0,22 g. A variação de peso ao longo do
experimento pode ser vista na Figura 21.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1520
30
40
50
60
70Controle
Nv-EtOH 2 g/kg i.p.
Nv-EtOH 5 g/kg v.o.
Dias
Co
nsu
mo
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ação
(g
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525
50
75
100
125Controle
Nv-EtOH 2 g/kg i.p.
Nv-EtOH 5 g/kg v.o.
Dias
Co
nsu
mo
de l
íqu
ido
(m
l)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 69 um estudo comparativo.
Figura 21. Ganho de peso dos animais tratados com Nv-EtOH durante 14 dias (n =
10).
5.3.2.4. Parâmetros hematológicos
Analisando os resultados para os parâmetros hematológicos (Tabela 3), é
possível observar que, após a administração de doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg
v.o., não houve variação significativa nos parâmetros hematológicos (glóbulos
vermelhos, hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, leucócitos e plaquetas).
Apenas algumas alterações estatisticamente significativas (p < 0,05) foram
encontradas nos parâmetros hematológicos, tais como o aumento do percentual de
hematócrito, linfócitos e monócitos. No entanto, o significado clínico deste aumento
está sendo investigado.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530
35
40
45Controle
Nv-EtOH 2 g/kg i.p.
Nv-EtOH 5 g/kg v.o.
Dias
Peso
co
rpo
ral
(g)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 70 um estudo comparativo.
Tabela 3. Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados com 2,0
g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato etanólico
bruto de Neoglaziovia variegata após 14 dias (toxicidade aguda).
Parâmetros Grupos
Controle Após 2 g/kg i.p. Após 5 g/kg v.o.
Eritrócitos (106/mm3) 8,47 ± 0,10 8,50 ± 0,08 8,62 ± 0,15
Hemoglobina (g/dL) 12,90 ± 0,20 13,03 ± 0,23 13,13 ± 0,12
Hematócrito (%) 34,40 ± 0,66 35,05 ± 0,32 34,70 ± 0,18*
VCM (μ3) 41,20 ± 0,48 42,35 ± 0,46 40,40 ± 0,84
HCM (μg) 15,77 ± 0,21 15,70 ± 0,19 15,25 ± 0,16
CHCM (%) 37,40 ± 0,33 37,37 ± 0,61 37,93 ± 0,47
Leucócitos (103/mm3) 2,98 ± 0,16 2,98 ± 0,21 3,11 ± 0,15
Linfócitos (%) 63,23 ± 2,00 69,73 ± 0,58* 62,01 ± 2,62
Monócitos (%) 1,45 ± 0,41 1,57 ± 0,26 2,25 ± 0,25*
Plaquetas (103/mm3) 471,50 ± 48,66 447,00 ± 65,91 341,50 ± 59,31
Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student
p < 0,05.
5.3.2.5. Parâmetros Bioquímicos
Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostram que a glicose,
colesterol, triglicérides, aspartato amino transferase (AST/TGO), creatinina e uréia
não têm significância estatística em comparação ao grupo controle (Tabela 5). Os
níveis de alanina amino-transferase (ALT/TGP) após a dose de 2,0 g/kg i.p. foram
significativamente menores que o grupo controle (p < 0,05). Os animais tratados com
uma dose de 5 g/kg v.o. mostraram aumento dos níveis de AST e creatinina, embora
este não foi estatisticamente significativo.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 71 um estudo comparativo.
Tabela 4. Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos tratados
com 2,0 g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato
etanólico bruto de Neoglaziovia variegata após 14 dias (toxicidade aguda).
Parâmetros Grupos
Controle Após 2 g/kg i.p. Após 5 g/kg v.o.
Glicose (mg/dL) 131,00 ± 10,08 132,00 ± 8,94 141,00 ± 16,67
Colesterol (mg/dL) 118,20 ± 8,20 107,70 ± 6,32 121,80 ± 5,74
Triglicérides (mg/dL) 142,80 ± 23,64 135,70 ± 19,08 148,80 ± 8,98
AST/TGO (U/L) 170,00 ± 11,07 197,30 ± 18,25 236,70 ± 28,26
ALT/TGP (U/L) 84,93 ± 5,82 65,72 ± 5,22* 86,40 ± 12,00
Uréia (mg/dL) 73,50 ± 6,81 63,83 ± 3,16 69,75 ± 7,47
Creatinina (mg/dL) 0,73 ± 0,09 0,62 ± 0,05 0,85 ± 0,02
Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n= 8. Teste t de Student –
p < 0,05.
5.3.2.6. Análise Macroscópica e Histológica
Os órgãos dos animais tratados com extrato etanólico bruto de Neoglaziovia
variegata, não exibiram macroscopicamente alterações na forma, coloração e
dimensões quando comparados aos órgãos do grupo controle. A análise histológica
dos rins mostrou infiltrado inflamatório perivascular e no interstício de intensidade
variável (Figura 22).
Na figura 22 (A), observam-se glomerúlos e túbulos com estrutura histológica
preservada, enquanto na figura 22 (B) nota-se um infiltrado de células inflamatórias
(seta). Na figura 22 (C) a seta aponta pra um pequeno acúmulo de célula
inflamatótias entre os túbulos coletores.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 72 um estudo comparativo.
Figura 22. Fotomicrografias dos rins de animais representativos dos três grupos
estudados: (A) controle, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) e (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.).
(coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x ).
No fígado eram evidentes os infiltrados de células inflamatórias , localizados
em torno do vasos sanguíneos (perivasculares), assim como focos isolado no
parênquima hepático e algumas vezes no septos interlobulares (Figura 23).
Estas alterações microscópicas estavam presentes em ambos os grupos
tratados com doses de 2 g/kg i.p. e 5 g/kg v.o. Os dados obtidos mostraram que
as doses empregadas não provocaram a morte de animais, mas apresentaram
alterações no fígado e nos rins, sem alterar, contudo, os demais órgãos analisados.
Figura 23. Fotomicrografias de cortes histológicos do fígado de animais
representativos dos três grupos estudados. (A) grupo controle, (B) Nv-EtOH (2
g/kg i.p.) e (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400
x ).
A B C
A B C
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 73 um estudo comparativo.
5.4. Resultados de Encholirium spectabile
5.4.1. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile
5.4.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
A administração intraperitoneal de Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) diminuiu
significativamente (p<0,01) a ação do ácido acético utilizado para induzir as
contorções abdominais em camundongos. Os percentuais de inibição provocados a
partir da administração de Es-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) foram de 68,59, 79,33 e
65,28%, respectivamente, quando comparado ao grupo controle. O ácido
acetilsalicílico (200 mg/kg) também inibiu significativamente (p<0,01) as contorções,
com percentual de inibição de 99,33%, enquanto a morfina aboliu completamente os
números de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, com percentual de
inibição de 100%, quando comparado ao grupo controle. Os resultados podem ser
vistos na Figura 24.
Figura 24. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile (Es-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo
de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média , n= 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
5.4.1.2. Teste da formalina
0
10
20
30
**
**
**
** **
Controle
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Nú
mero
de c
on
torç
ões
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 74 um estudo comparativo.
O extrato da planta (Es-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg injetado 60
min antes da formalina, mostrou um efeito significativo em reduzir o tempo de
lambida da pata em ambas as fases deste teste. Na primeira fase (dor neurogênica)
os efeitos foram dose-dependentes, com porcentagens de inibição de 34,14, 52,61 e
60,97%, respectivamente. O efeito foi mais significativo na segunda fase (dor
inflamatória), cujos percentuais de inibição foram de 89,56, 79,90 e 96,71%,
respectivamente. Da mesma forma, a morfina (10 mg/kg) causou inibição
significativa, cujo percentual de inibição foi de 61,67 % na primeira fase e de 81,06%
na segunda fase. O AAS (200 mg/kg) causou inibição de 54,70% e 88,79% na
primeira e segunda fase deste teste, respectivamente. Os resultados do teste da
formalina são mostrados na Figura 25.
O percentual de inibição no tempo de lambida da pata, após o pré-tratamento
com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 32,75% e 4,00%, na primeira e segunda fase,
respectivamente, para o grupo de animais que utilizou a morfina (10 mg/kg). Já para
o grupo experimental de Es-EtOH (400 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,
provocou um percentual de inibição na primeira fase de 33,44% ou seja, o efeito foi
revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do teste da formalina o
grupo dos animais que receberam Es-EtOH com pré-tratamento da naloxona,
apresentou um percentual de inibição significativo (p <0,01) de 95,97 % no tempo de
lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 75 um estudo comparativo.
Figura 25. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile (Es-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Es-EtOH
(400 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5
mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média, n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
Primeira fase
0
10
20
30
40
50
60
70
**
**
*
Controle
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg** **
Morf + NLX
Es-EtOH + NLX
(a)T
em
po
de l
am
bid
a (
s)
Segunda fase
0
25
50
75
100
125
**
****
Controle
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
****
Morf + NLX
Es-EtOH + NLX**
(b)
Tem
po
de l
am
bid
a (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 76 um estudo comparativo.
5.4.1.3. Teste da placa quente (hot plate)
Utilizando o teste da placa quente, de uma maneira geral, a administração
do extrato não induziu alterações no tempo de latência, quando comparado ao grupo
controle. O extrato inibiu a nocicepção neste método somente no tempo de 60 min,
na dose de 100 mg/kg. Os resultados são mostrados na Figura 26.
Figura 26. Atividade antinociceptiva de Encholirium spectabile (Es-EtOH 100, 200 e
400 mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Es-EtOH
(400 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5
mg/kg) no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua
administração. Valores são expressos como média ± erro padrão da média, n = 6. *p
< 0,05; **p < 0,01 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido
pelo teste de Dunnett).
5.4.2 Toxicidade aguda de Encholirium spectabile
Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Encholirium
spectabile não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a
morte dos animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via
oral, respectivamente, indicando, portanto, baixa toxicidade do extrato.
5.4.2.1. Avaliação comportamental dos camundongos
30 60 90 1200
5
10
15
20Controle
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morf + NLX
Es-EtOH + NLX
***
** ****
Tempo (min)
Tem
po
de l
atê
ncia
(s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 77 um estudo comparativo.
A triagem comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após
a administração de Es-EtOH 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via intraperitoneal e
por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram mudanças significativas
no comportamento. Os animais não mostraram qualquer sinal de toxicidade, ou
alteração comportamental ou de outras atividades fisiológicas.
5.4.2.2. Consumo de alimento e água
O consumo de alimentos pelos camundongos durante os 14 dias de
experimento mostrou alterações significativas (p < 0,01) entre o grupo tratado por via
oral, e o grupo controle. A média no consumo de ração para o grupo controle foi de
57,92 ± 1,81 g, enquanto que para o grupo tratado com Es-EtOH na dose de 2 g/kg
i.p. foi de 46,92 ± 3,73 g, já para o grupo tratado com Es-EtOH (5g/kg, v.o) a média
do consumo de ração foi de 32,23 ± 2,46 g. O gráfico da variação do consumo de
ração pode se mostrado abaixo (Figura 27).
Figura 27. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Es-EtOH durante 14
dias (n = 10).
Em relação ao consumo de água durante os 14 dias de experimentos, a
ingestão de água foi semelhante entre o grupo controle e o grupo tratado com Es-
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 78 um estudo comparativo.
EtOH (2g/kg, i.p.), ou seja, não houve significância estatística entre os perfis de
consumo entre esses grupos. Já para o Es-EtOH (5 g/kg, v.o), houve diferença
estatística (p < 0,0001) no consumo de líquido dos animais tratados por via oral em
relação ao grupo controle. O grupo controle consumiu uma média de 88,54 ± 3,40
mL, enquanto que o grupo tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p) consumiu em média um
volume de 84,15 ± 4,10 ml, e o grupo tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.) foi de 66,77
± 4,20ml (Figura 28).
Figura 28. Consumo de líquido pelos animais tratados com Es-EtOH durante 14
dias (n = 10).
5.4.2.3. Variação do peso corporal
Houve mudanças significativas (p <0,001) no peso corporal dos camundongos
a partir do dia 1 ao dia 14 nos dois grupos de camundongos tratados com os
extratos de E. spectabile, quando comparados ao grupo controle, principalmente na
dose de 5 g/kg v.o. Em ambas as doses de Es-EtOH, houve diminuição
estatisticamente significativa no peso corporal dos camundongos, de modo que, a
média de peso corporal do grupo controle permaneceu acima de 40 g, enquanto a
dos grupos tratados com extrato não passaram de 35 g. Ao final do experimento, a
média do grupo controle foi de 39,87 ± 0,26 g, enquanto a do grupo tratado com a
dose de 2 g/kg i.p. foi de 33,91 ± 0,30 g, e com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 31,80 ±
0,34 g. A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista na Figura 29.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 79 um estudo comparativo.
Figura 29. Ganho de peso dos animais tratados com Es-EtOH durante 14 dias (n
= 10).
5.4.2.4. Análise Macroscópica e Histológica
A análise das lâminas do fígado dos animais tratados com o extrato etanólico
bruto de Encholirium spectabile revelou a presença de poucos focos inflamatórios no
parênquima hepático, isolados em torno do ducto hepático, na região periductal e no
espaço porta (Figura 30). A estrutura dos lóbulos hepáticos apresentou-se
preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos em arranjo radial
típico dentro da normalidade. O estroma do órgão, também mostrou-se preservado.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 80 um estudo comparativo.
Figura 30. Fotomicrografia do fígado de animal tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.).
Observam-se numerosas células inflamatórias (seta) aglomeradas na margem de
um vaso hepático. (Coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x )
As preparações examinadas dos rins dos animais tratados com o extrato
etanólico de Encholirium spectabile apresentam infiltrados inflamatórios no interstício
e no parênquima renal. Além disso, observaram-se a presença de células
inflamatórias também no glomérulo e diminuição do espaço subcapsular (Figura 31).
A estrutura histológica dos túbulos renais mostrou-se preservada.
Figura 31. Fotomicrografia do rim de animal tratado com Es-EtOH (2 g/kg, i.p.).
Notam-se glomérulos renais de aspecto condensado devido ao grande número de
células mesangiais. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400x)
Os cortes examinados do pâncreas exibiram estrutura glandular preservada,
tanto a porção endócrina quanto a exócrina, o mesmo observando-se em relação ao
estroma do órgão (ácinos e ilhotas pancreáticas), no qual não houve alterações.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 81 um estudo comparativo.
Nos cortes examinados do pulmão, percebeu-se a presença de células
inflamatórias no parênquima e na parede dos bronquíolos. Dentre a maioria dos
animais analisados, as estruturas do pulmão encontravam-se preservadas, contudo,
observou-se, em um único animal, a presença de grandes áreas inflamatórias
(nódulos) distribuídos por todo o parênquima pulmonar.
Figura 32: Fotomicrografia do pulmão de animal tratado com Es-EtOH (5 g/kg, v.o.).
A seta assinala um pequeno nódulo na parede bronquiolar (coloração: hematoxilina-
eosina; aumento: 400x).
Nenhuma alteração pode ser vista no miocárdio, e as demais estruturas do
coração encontraram-se dentro dos parâmetros da normalidade. No estômago, foi
observada a presença de focos de células inflamatórias na mucosa e na submucosa
do órgão, mas essas alterações não foram consideradas significativas.
5.5. Resultados de Bromelia laciniosa
5.5.1. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa
5.5.1.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético
A administração intraperitoneal de Bl-EtOH diminuiu significativamente (p <
0,01) a ação do ácido acético, utilizado para induzir as contorções abdominais em
camundongos, quando comparado ao grupo controle. Os percentuais de inibição
provocados pela administração de Bl-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) foram de 91,80,
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 82 um estudo comparativo.
93,44 e 78,68%, respectivamente. O ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) também inibiu
significativamente (p < 0,01) o número das contorções abdominais, com percentual
de inibição de 95,08%, enquanto que a morfina (10 mg/kg) aboliu completamente o
número de contorções induzida pelo ácido acético. Os resultados podem ser vistos
na Figura 33.
Figura 33. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 e 400
mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no modelo de
contorções abdominais induzidas por ácido acético. Valores são expressos em
média ± erro padrão da média , n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do
grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
5.5.1.2. Teste da formalina
O extrato da planta (Bl-EtOH) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg injetado 60
min antes da formalina mostrou um efeito significativo (p < 0,01) em reduzir o tempo
de lambida da pata em ambas as fases deste teste. Na primeira fase (dor
neurogênica), os percentuais de inibição no tempo de lambida da pata foram de
60,86, 62,84 e 66,79%, respectivamente, em relação ao grupo controle. O efeito foi
mais significativo na segunda fase (dor inflamatória), cujos percentuais de inibição
foram 91,93, 82,18 e 88,73%, respectivamente. Da mesma forma, a morfina (10
mg/kg) causou inibição significativa, cujo percentual de inibição foi de 60,47% na
primeira fase e de 86,21% na segunda fase. O AAS (200 mg/kg) causou um
percentual de inibição na primeira fase de 28,45% (p < 0.05), e de 92,77% (p < 0,01)
0
10
20
30
** **
**
****
Controle
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Nú
mero
de c
on
torç
ões
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 83 um estudo comparativo.
na segunda fase deste teste. Os resultados do teste da formalina são mostrados na
Figura 34.
Figura 34. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 e 400
mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Bl-EtOH (100
mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na
primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em média ±
erro padrão da média, n = 6. ** p < 0,01 significativamente diferente do grupo
controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).
O percentual de inibição no tempo de lambida da pata, após o pré-tratamento
com naloxona (1,5 mg/kg) foi de 23,71% e 17,14%, na primeira e segunda fase,
respectivamente, para o grupo de animais que utilizou a morfina (10 mg/kg). Já para
Primeira fase
0
10
20
30
40
50
60
** **
Controle
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg** **
* *
Morf + NLX
Bl-EtOH + NLX
(a)
Tem
po
de l
am
bid
a (
s)
Segunda fase
0
50
100
150
**** **
Controle
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
AAS 200 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
****
** Morf + NLX
Bl-EtOH + NLX
(b)
Tem
po
de l
am
bid
a (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 84 um estudo comparativo.
o grupo experimental de Bl-EtOH (100 mg/kg), o pré-tratamento com a naloxona,
provocou um percentual de inibição na primeira fase de 27,66% (p < 0,05) ou seja, o
efeito foi parcialmente revertido pelo uso da naloxona. Porém, na segunda fase do
teste da formalina o grupo dos animais que receberam Bl-EtOH com pré-tratamento
da naloxona, apresentou um percentual de inibição significativo (p < 0,01) de 77,47
% no tempo de lambida da pata, quando comparado ao grupo controle.
5.5.1.3. Teste da placa quente (hot plate)
Utilizando o teste da placa quente, a administração do extrato (Bl-EtOH) não
alterou o tempo de permanência dos animais tratados na placa quente, quando
comparado ao grupo controle, principalmente nos primeiros 30 minutos. Contudo, na
dose de 100 mg/kg, no tempo de 60 minutos, o extrato etanólico da planta
apresentou elevação no tempo de latência dos animais no teste da placa quente. O
efeito antinociceptivo não foi revertido quando, o grupo tratado com Bl-EtOH (100
mg/kg), recebeu pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg). Os resultados são
mostrados na Figura 35.
Figura 35. Atividade antinociceptiva de Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 e 400
mg/kg), ácido acetilsalicílico (AAS 200 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Bl-EtOH (100
mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no
teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores
são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05; **p < 0,01
30 60 90 1200
5
10
15
20Controle
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
Morfina 10 mg/kg
Morf + NLX
Bl-EtOH + NLX
**
***
**
**
**
Tempo (min)
Tem
po
de l
atê
ncia
(s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 85 um estudo comparativo.
significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett).
5.5.2. Toxicidade aguda de Bromelia laciniosa
Na avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico de Bromelia laciniosa
não foram observadas alterações comportamentais e fisiológicas, nem a morte dos
animais nas doses de 2,0 g/kg por via intraperitoneal, e de 5 g/kg por via oral,
respectivamente, indicando baixa toxicidade do extrato.
5.5.2.1. Avaliação comportamental dos camundongos
A triagem farmacológica comportamental dos animais foi realizada em 0,5, 1,
2, 3 e 4 h após a administração de Bl-EtOH 2,0 e 5,0 g/kg (peso corporal) por via
intraperitoneal e por via oral, respectivamente. Os animais não apresentaram
mudanças significativas no comportamento. Os animais não mostraram qualquer
sinal de toxicidade, ou alteração comportamental ou de outras atividades
fisiológicas.
5.5.2.2. Consumo de alimento e água
O consumo de alimentos pelos camundongos durante os 14 dias de
experimento mostrou alterações significativas (p < 0,01) entre o grupo tratado por via
oral, e o grupo controle. A média no consumo de ração para o grupo controle foi de
42,46 ± 1,18 g, enquanto que para o grupo tratado com a dose de 2 g/kg i.p. foi de
44,00 ± 2,13 g, já para o grupo tratado com Bl-EtOH (5g/kg, v.o) a média do
consumo de ração foi de 49,46 ± 1,47 g. O gráfico da variação do consumo de ração
pode se observado abaixo (Figura 36).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 86 um estudo comparativo.
Figura 36. Consumo de alimentos pelos animais tratados com Bl-EtOH durante 14
dias (n = 10).
Em relação ao consumo de água durante os 14 dias de experimentos, a
ingestão de água foi semelhante entre o grupo controle e o grupo tratado com Bl-
EtOH (5 g/kg, v.o), ou seja, não houve significância estatística entre os perfis de
consumo entre esses grupos. Já para o Bl-EtOH (2 g/kg, i.p), houve diferença
estatística (p < 0,01) no consumo de líquido dos animais tratados por via i.p. em
relação ao grupo controle. O grupo controle consumiu uma média de 71,85 ± 2,09
mL, enquanto que o grupo tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p) consumiu em média um
volume de 62,77 ± 2,40 Ml, e o grupo tratado com Bl-EtOH (5 g/kg, v.o.) foi de 71,62
± 3,02 mL (Figura 37).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 87 um estudo comparativo.
Figura 37. Consumo de líquido pelos animais tratados com Bl-EtOH durante 14
dias (n = 10).
5.5.2.3. Variação do peso corporal
Houve mudança significativa no peso corporal dos camundongos tratados
com o extrato por via oral, em relação ao controle. Em ambas as doses de Bl-EtOH,
houve uma elevação no peso corporal dos camundongos, de modo que, a média de
peso corporal dos três grupos não ultrapassou os 37,5 g. Ao final do experimento, a
média do grupo controle foi de 40,44 ± 0,27 g, enquanto a do grupo tratado com a
dose de 2 g/kg i.p. foi de 39,26 ± 0,22 g, e com a dose de 5 g/kg v.o. foi de 34,59 ±
0,21 g. A variação de peso ao longo do experimento pode ser vista na Figura 38.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 88 um estudo comparativo.
Figura 38. Ganho de peso dos animais tratados com Bl-EtOH durante 14 dias (n =
10).
5.5.2.4. Parâmetros Hematológicos
Analisando os resultados para os parâmetros hematológicos (Tabela 5), é
possível observar que, após a administração de doses de 2,0 g/kg i.p. e 5,0 g/kg
v.o., não houve nenhuma variação significativa nos parâmetros hematológicos
(eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, VCM, HCM, CHCM, leucócitos, linfócitos e
plaquetas).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 89 um estudo comparativo.
Tabela 5. Parâmetros hematológicos de sangue de camundongos tratados com 2,0
g / kg por via intraperitoneal e 5,0 g / kg por via oral do extrato bruto etanólico de
Bromelia laciniosa após 14 dias (toxicidade aguda).
Parâmetros Grupos
Controle Após 2 g/kg i.p. Após 5 g/kg v.o.
Eritrócitos (106/mm3) 8,05 ± 0,49 8,43 ± 0,15 8,09 ± 0,09
Hemoglobina (g/dL) 13,40 ± 0,91 12,88 ± 0,68 13,06 ± 0,27
Hematócrito (%) 42,41 ± 2,48 43,33 ± 1,25 42,84 ± 0,40
VCM (μ3) 52,60 ± 1,36 51,88 ± 0,45 52,86 ± 0,46
HCM (μg) 16,60 ± 0,22 16,43 ± 0,18 16,78 ± 0,15
CHCM (%) 31,69 ± 0,83 31,88 ± 0,34 32,06 ± 0,40
Leucócitos (103/mm3) 6,25 ± 0,57 5,88 ± 0,41 6,97 ± 0,59
Linfócitos (%) 88,93 ± 5,36 88,53 ± 1,08 88,55 ± 1,35
Plaquetas (103/mm3) 883,70 ± 108,30 856,90 ± 71,14 911,30 ± 73,18
Valores são expressos em médias ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student
p < 0,05.
5.5.2.5. Parâmetros Bioquímicos
Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados mostram que os níveis
séricos de triglicérides, aspartato aminotransferase (AST/TGO), alanina amino-
transferase (ALT/TGP) e uréia todos se apresentam dentro do perfil de normalidade,
incluindo os níveis séricos da creatinina, embora tenha apresentado diferença
estatística no grupo tratado com Bl-EtOH (5 g/kg, v.o.), essa alteração não
apresenta significância clínica.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 90 um estudo comparativo.
Tabela 6. Parâmetros bioquímicos obtidos a partir do soro de camundongos tratados
com 2,0 g/kg por via intraperitoneal (i.p.) e 5,0 g/kg por via oral (v.o.) do extrato
etanólico bruto de Bromelia laciniosa após 14 dias (toxicidade aguda).
Parâmetros Grupos
Controle Após 2 g/kg i.p. Após 5 g/kg v.o.
Triglicérides (mg/dL) 133,30 ± 5,57 111,17 ± 15,21 141,80 ± 14,14
AST/TGO (U/L) 123,10 ± 11,23 111,70 ± 25,05 116,70 ± 12,61
ALT/TGP (U/L) 75,29 ± 8,58 60,23 ± 8,08 66,30 ± 7,22
Uréia (mg/dL) 66,44 ± 4,40 65,89 ± 6,16 67,56 ± 4,84
Creatinina (mg/dL) 0,36 ± 0,01 0,42 ± 0,11 0,26 ± 0,02**
Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 8. Teste t de Student
**p < 0.01.
5.5.2.6. Análise Macroscópica e Histológica
As preparações examinadas revelaram que no fígado dos animais do grupo
tratado com o extrato da B. laciniosa, a estrutura dos lóbulos hepáticos apresentou-
se preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos no arranjo
dentro da normalidade. Áreas de infiltração de células inflamatórias foram vistas no
espaço porta, assim como entre os hepatócitos (Figura 39) e principalmente em
torno dos vasos sanguíneos e ductos biliares (inflamação periductal).
Figura 39. Fotomicrografia do fígado de animal tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.). A
seta assinala um foco inflamatório. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400x).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 91 um estudo comparativo.
Quanto à estrutura histológica dos rins foram observadas áreas de inflamação
no interstício renal, bem como hipercelularidade nos glomérulos devido a presença
de um maior número de células mesangiais (Figura 40). A estrutura histológica dos
túbulos renais mostrou-se preservada.
Figura 40. Fotomicrografia do rim de animal tratado com Bl-EtOH (2 g/kg, i.p.).
Notam-se glomérulos renais de aspecto condensado com núcleos de células
mesangiais em destaque. (coloração: hematoxilina-eosina; aumento: 400 x ).
Na análise histológica do pâncreas, os cortes exibiram estruturas dentro dos
parâmetros da normalidade, tanto no estroma quanto nas estruturas glandulares,
endócrina e exócrina.
Nos cortes examinados do pulmão, dentre a maioria dos animais analisados,
as estruturas do órgão encontravam-se preservadas. Em alguns animais foram
encontrados áreas de infiltrados inflamatórios entre os alvéolos, bem como na
parede dos bronquíolos.
Nos cortes examinados do coração, nenhuma alteração foi vista no miocárdio,
e as demais estruturas se encontravam dentro dos parâmetros da normalidade.
No estômago glândular, de maneira geral, apresentou áreas com infiltrados de
células inflamatórias tanto na mucosa, como na submucosa.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 92 um estudo comparativo.
6. DISCUSSO ES
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 93 um estudo comparativo.
6. DISCUSSÕES
6.1. Triagem fitoquímica e análise dos extratos por CLAE
A partir dos dados obtidos na triagem fitoquímica, foi possível identificar
que, entre os constituintes químicos que estavam presentes, os compostos fenólicos
estavam em maior quantidade. Este dado foi corroborado a partir dos resultados
obtidos através da análise por CLAE, pois os dados espectrais de UV-Vis e os
respectivos tempos de retenção dos picos, caracterizam os compostos como sendo
derivados do ácido cinâmico, derivados cumarínicos ou derivados de flavonóides.
Estes compostos estão sob investigação. Serão utilizados padrões para se chegar à
determinação dos mesmos através de cromatografia líquida de alta eficiência. Vale
destacar principalmente a presença de flavonóides em todos os extratos das plantas
analisadas, após a triagem fitoquímica. Os flavonóides compõem uma classe de
substâncias de origem natural com extensa diversidade estrutural, e, atualmente, já
foram identificadas mais de 9 mil substâncias pertencentes a este grupo (MARTENS;
MITHOFER, 2005). A fitoquímica da família também apresenta flavonóides como
constituintes químicos de diversas espécies de Bromeliaceae (MANETTI et al.,
2009). Além disso, diversos ensaios vêm comprovando variadas atividades
biológicas dos flavonóides, e de acordo com Simões et al. (2004), esses compostos
podem apresentar atividades antioxidantes, antiinflamatória, cicatrizante, analgésica,
antialérgica, anti-tumoral, protetor cardíaco e anti-diabético.
A similaridade entre os perfis cromatográficos obtidos para os diferentes
extratos das espécies analisadas foi avaliada através da comparação dos tempos de
retenção dos sinais cromatográficos observados. A identificação das substâncias
flavonoídicas e derivados de ácidos fenólicos foi realizada por comparação com
banco de dados de padrões, contendo tempo de retenção e espectro no UV obtidos
nas mesmas condições dos nossos experimentos.
6.2. Efeito antinociceptivo
O presente estudo mostrou o efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto
das espécies Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia laciniosa em
diferentes métodos nociceptivos, utilizando estímulos químicos e térmicos. Três
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 94 um estudo comparativo.
modelos animais diferentes foram utilizados neste estudo. Tais métodos foram
selecionados com base em sua capacidade de investigar a resposta analgésica
tanto em nível central, como em nível periférico.
Inicialmente, foi utilizado o modelo das contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético, que é considerado um modelo de nocicepção simples e pouco
específico, e que permite avaliar a atividade antinociceptiva de várias substâncias
que atuam em nível central e periférico (PERAZA et al., 2007). Tal método
experimental caracteriza-se por induzir as contrações e rotação do abdômen dos
camundongos, seguida pela extensão de uma ou ambas as patas traseiras. Esta
resposta decorre da aplicação intraperitoneal do ácido acético na concentração de
0,9%, que age como um estímulo álgico. Os resultados obtidos através desse
modelo experimental servem apenas como uma triagem inicial, e não é possível
avaliar com maior precisão os mecanismos de ação envolvidos. O estímulo químico
do ácido acético provoca nos camundongos uma sensibilização dos nociceptores
(ROCHA et al., 2007), e desencadeia um potencial de ação que culmina na liberação
de substâncias, como: acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrienos,
prostaglandinas, tromboxanos, interleucinas, fator de necrose tumoral (TNFα), entre
outros. Os nociceptores são sensíveis à ação de drogas antiinflamatórias não
esteroidais, como o ácido acetilsalicílico, e a analgésicos opióides, como a morfina,
daí ser considerado como um método inespecífico de nocicepção.
Após a verificação inicial de que os extratos possuíam ou não atividade
antinociceptiva, foi realizado o teste da formalina a fim de distinguir entre a ação
antinociceptiva central ou periférica. Desta forma, se seguiu com o teste da
formalina, que é um modelo experimental confiável e sensível para várias classes de
drogas analgésicas. Este método foi inicialmente descrito por Dubuison e Dennis
(1997) e consiste na aplicação por via intraplantar de uma substância irritante
(formalina) em uma das patas traseiras do camundongo, determinando o surgimento
de alterações comportamentais, traduzidas por respostas motoras que permitem
avaliar a intensidade da resposta nociceptiva ao estímulo químico. A resposta
nociceptiva é medida pela observação do tempo que o animal permanece lambendo
a pata na qual o estímulo foi aplicado. Com o modelo experimental, são
evidenciadas duas fases de sensibilidade dolorosa distintas. A primeira fase ou
aguda (0-5 min), quando a dor neurogênica é causada pela ativação direta das fibras
aferentes nociceptivas do tipo C, liberando neuropeptídeos como a substância P,
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 95 um estudo comparativo.
entre outros. A segunda fase ou tônica (15-30 min) é caracterizada como dor
inflamatória, relacionada à liberação de mediadores químicos como a histamina,
serotonina, bradicinina, prostaglandinas e aminoácidos excitatórios, que pode ser
inibida por medicamentos analgésicos e antiinflamatórios (TJOLSEN et al., 1992;
PEREIRA et al., 2010)
Para análise mais criteriosa do mecanismo de ação dos extratos estudados,
foi realizado, posteriormente, o teste da placa quente “hot plate”. Este modelo
experimental foi descrito inicialmente por Woolfe; Macdolnad (1944) como modelo
específico para a detecção de sustâncias analgésicas de efeito central. Ou seja, a
resposta no teste da placa quente fornece uma confirmação para o efeito central das
drogas estudadas pelo método. Embora o uso do analgésico central e periférico
responda pela inibição do número de contrações provocadas por estímulos de dor
química, apenas os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da
placa quente (GARCIA et al., 2004). Este modelo utiliza a temperatura como
estímulo nociceptivo. Então, os nociceptores (fibras C e Aδ) são estimulados após a
ativação dos receptores vanilóides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que
possuem limiar de ativação em 43 ºC e os receptores do tipo VRL-1, que possuem
limiar de ativação em 52 ºC. Estes últimos são mais importantes na medição da
resposta a estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta ao
aumento da temperatura (JULIUS; BASBAUM, 2001; apud BENEDITO, 2009).
A administração intraperitoneal do extrato etanólico de N. variegata nas doses
de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01) o número das contorções
induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição de 89,50, 71,34 e 87,42 %,
respectivamente. O resultado revela que o Nv-EtOH apresenta uma potente
atividade antinociceptiva. O teste de contorções induzidas pelo ácido acético é
amplamente utilizado como teste de triagem de drogas analgésicas, e somente com
este método não é possível se identificar a ação exata do extrato, pois é um método
inespecífico. Para distinguir entre a ação antinociceptiva central ou periférica, o teste
da formalina foi utilizado. Os resultados desse método para o Nv-EtOH mostraram
que o extrato apresentou efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400
mg/kg) nas duas fases do teste, sendo mais significativo na segunda fase, quando
comparado ao grupo controle. O efeito do extrato na primeira e segunda fase do
teste da formalina sugere que a atividade pode ser resultado de sua ação central,
pois, geralmente, drogas que possuem mecanismo de ação central, como a morfina,
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 96 um estudo comparativo.
apresentam efeitos em ambas as fases do teste da formalina. O pré-tratamento com
a naloxona reverteu a atividade antinociceptiva de Nv-EtOH na primeira fase do
teste. O resultado sugere a possibilidade do envolvimento dos receptores opióides
no efeito do extrato. O teste da placa quente, com o uso prévio da naloxona, foi
realizado com o intuito de averiguar o possível mecanismo de ação do extrato, pois
o teste da placa quente é seletivo somente para drogas que possuem efeito
analgésico central. Os resultados de Nv-EtOH no referido teste mostraram que o
extrato foi capaz de aumentar o tempo de latência dos animais sobre a placa,
quando comparados ao grupo controle, fazendo com que permanecessem por mais
tempo sobre a placa quente. Este efeito foi mais pronunciado na dose de 400 mg/kg
no tempo de 120 minutos. Além disso, o efeito antinociceptivo foi revertido pelo uso
da naloxona, o que sugere o efeito central, bem como a participação dos receptores
opióides no mecanismo de ação do extrato. Porém, não podemos descartar a
hipótese da droga possuir ação periférica, pois o extrato possuiu um efeito
significativo na segunda fase do teste da formalina.
Para o extrato etanólico bruto de Encholirium spectabile, a administração
intraperitoneal nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01)
o número das contorções induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição
de 68,59, 79,33 e 65,28 %, respectivamente. O resultado revela que o Es-EtOH
apresenta atividade antinociceptiva. No teste da formalina, o extrato apresentou
efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400 mg/kg) nas duas fases do
teste, diminuindo significativamente (p < 0,01) o tempo de lambida da pata, quando
comparado ao grupo controle. O pré-tratamento com a naloxona reverteu a atividade
antinociceptiva de Es-EtOH na primeira fase do teste. O resultado sugere a
possibilidade do envolvimento de receptores opióides no efeito do extrato.
Entretanto, no teste da placa quente, o extrato de Encholirium spectabile, não
provocou alterações significativas (p<0,01) no tempo de latência dos animais sobre a
placa. Tampouco, provocou reversão do efeito antinociceptivo após o uso da
naloxona. Os resultados obtidos no teste da placa quente descartam a hipótese
inicial de que o Es-EtOH possuía mecanismo de ação central e, dessa forma, o
resultado indica que o efeito antinociceptivo do extrato é realmente por mecanismos
periféricos.
Para o extrato etanólico bruto de Bromelia laciniosa, a administração
intraperitoneal nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg inibiu significativamente (p< 0,01)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 97 um estudo comparativo.
o número das contorções induzidas pelo ácido acético com percentuais de inibição
de 91,80, 93,44 e 78,68 %, respectivamente. O resultado revela que o Bl-EtOH
apresenta atividade antinociceptiva. No teste da formalina, o extrato apresentou
efeito em todas as doses administradas (100, 200 e 400 mg/kg) nas duas fases do
teste, diminuindo significativamente (p < 0,01) o tempo de lambida da pata, quando
comparados ao grupo controle. O pré-tratamento com a naloxona reverteu a
atividade antinociceptiva de Bl-EtOH na primeira fase do teste. O resultado sugere a
possibilidade do envolvimento de receptores opióides no efeito do extrato. O teste da
placa quente, com o uso prévio da naloxona, mostrou que o extrato etanólico bruto
de Bromelia laciniosa de maneira geral, não alterou o tempo de permanência na
placa quente quando comparado ao grupo controle, contudo, na dose de 100 mg/kg
no tempo de 60 min, o Bl-EtOH apresentou uma elevação no tempo de latência no
teste da placa quente. Esse efeito não foi revertido pelo uso da naloxona, dessa
forma, pode-se sugerir que o mecanismo de ação antinociceptiva do extrato é
central. Porém, não podemos descartar a hipótese da droga possuir ação periférica,
pois o extrato apresentou um efeito significativo na segunda fase do teste da
formalina.
Ao fazer uma análise comparativa, percebeu-se que todos os extratos
possuíram atividade antinociceptiva, porém, os mecanismos pelo qual exercem os
seus efeitos são diferentes, pois Encholirium spectabile possui um mecanismo de
ação periférico, enquanto que Neoglaziovia variegata e Bromelia laciniosa, possuem
mecanismo de ação central. Porém, para o Nv-EtOH e Bl-EtOH, não se pode
descartar, também, a hipótese de ação periférica destes extratos. A justificativa para
a participação dos extratos em dois mecanismos de ações distintos se explica
porque não se trabalhou com substâncias isoladas, uma vez que a amostra
experimental é um extrato bruto, possuindo diferentes constituintes químicos. Dessa
forma, se faz necessário o aprimoramento dos estudos, utilizando as frações
isoladas dos extratos, a fim de determinar os mecanismos de ação moleculares
exatos dos extratos. O estudo biomonitorado pode levar ao isolamento dos
constituintes químicos responsáveis pela atividade antinociceptiva dos extratos.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 98 um estudo comparativo.
6.3. Toxicidade Aguda
A toxicidade aguda pode ser definida como efeito adverso produzido em um
curto período de tempo após administração de uma dose única de uma substância.
Neste experimento foi observado que o extrato etanólico de N. variegata, bem como
o de E. spectabile e B. laciniosa apresentam a DL50> 5000 mg/kg, quando
administrado por via oral, e DL50> 2000 mg/kg, quando administrado por via
intraperitoneal. Assim, podem ser considerados praticamente não-tóxicos, ou de
baixa toxicidade. A tendência atual, segundo Barros; Davino (1996) é substituir a
determinação da DL50 pelo teste de dose fixa, onde a substância a ser testada é
administrada em uma dose específica (ALMEIDA, 2006). Os órgãos governamentais
de diversos países empregam testes toxicológicos no controle biológico de diversas
substâncias para a averiguação de efeitos colaterais e tóxicos. Geralmente, entre
todos os possíveis sinais de toxicidade, os que são habitualmente observados são o
número de mortes, além dos efeitos sobre o comportamento, tais como:
agressividade, ambulação aumentada, contorções abdominais, convulsões,
estereotipia, movimentação intensa das vibrissas, piloereção, defecação, paralisia
das patas dianteiras, analgesia, tremores, catatonia, ptose palpebral, resposta ao
toque diminuída e sedação (ALMEIDA, 2006).
Os animais dos grupos tratados com os extratos de N. variegata, E. spectabile
e B. laciniosa não mostraram sinais significativos de toxicidade, alterações
comportamentais ou outras atividades fisiológicas. Também foram avaliados os
parâmetros de mudança do peso corporal e a ingesta de alimentos e água, a fim de
monitorar diariamente os sinais de toxicidade.
Com relação a mudanças no peso corporal dos animais nos quais se
administrou o extrato etanólico de N. variegata, houve uma diminuição bastante
significativa na ingesta de alimento, de tal forma que foi evidenciada uma diminuição
significativa no peso dos animais, principalmente no grupo tratado com a dose de
5g/kg. O consumo de água também mostrou uma diminuição significativa. Da
mesma forma ocorreu com o Es-EtOH, onde houve uma diminuição significativa para
os dois grupos de animais tratados com o extrato, na ingesta de alimentos e água,
além de diminuição do peso corporal, principalmente no grupo tratado com a dose
de 5g/kg. Contudo, para o grupo de animais tratados com o Bl-EtOH, não houve
uma variação significativa em tais parâmetros.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 99 um estudo comparativo.
Geralmente, as alterações no peso corporal de camundongos tratados com
substâncias refletem seus efeitos tóxicos, e têm sido utilizadas como indicadores de
efeitos adversos de medicamentos e produtos químicos, especialmente se tal perda
for maior do que 10% do peso inicial (SUBRAMANION, 2011). A análise da ingestão
de alimentos e água em uma experimentação animal é importante para investigar a
segurança das substâncias estudadas com intuito terapêutico (MUKINDA; EAGLES,
2010).
Com relação às análises dos parâmetros hematológicos, não houve
alterações significativas de uma forma geral, apenas alterações estatisticamente
pouco significativas foram encontradas. A análise do sistema hematopoiético é muito
importante, pois é altamente sensível a substâncias tóxicas no sangue, servindo
assim como um importante parâmetro para analisar o estado fisiológico e patológico
em animais (ADENEYE, 2006).
Em relação aos paramentos bioquímicos, os níveis de ALT/TGP após a dose
de 2g/kg foram menores, em comparação ao grupo controle, mas de pouca
significância estatística e clínica. Já na dose de 5g/kg por via oral houve aumento
nos níveis de AST/TGO e creatinina, embora estatisticamente insignificante. AST e
creatinina são bons indicadores de funções hepáticas e renais, respectivamente.
Alterações em seus níveis sugerem modificações nestes órgãos. Transaminases
(TGO e TGP) são enzimas hepáticas localizadas dentro dos hepatócitos e são
usadas como marcadores bioquímicos de substâncias potencialmente tóxicas, já
que seus valores bioquímicos são elevados quando ocorre uma lesão no
parênquima hepático (RAHMAN, 2001).
Em relação ao estudo histopatológico, o exame macroscópico inicial dos
órgãos dos animais tratados com os extratos não mostrou alterações na cor em
relação ao controle. Na histopatologia do tecido renal, contudo, se observou a
presença do maior número de alterações para os animais tratados com o extrato de
N. variegata, no qual se observou lesões restritas e discretas, mas multifocais em
áreas grandes e extensas, com presença de edema, áreas de necrose e
aparecimento de uma massa de crescimento celular desorganizado e intensa, além
de infiltrado perivascular. Para os animais tratados com o Es-EtOH, a histopatologia
demonstrou infiltrados inflamatórios no interstício e no parênquima renal, assim
como no extrato Bl-EtOH, no qual também se percebeu infiltrados no parênquima da
região entre os túbulos e glomérulos renais. Glomérulos estes, nos quais houve a
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 100 um estudo comparativo.
presença de células inflamatórias para o extrato de E. spectabile. Para os dois
extratos a estrutura histológica dos túbulos renais se mostrou preservada.
Na histopatologia do fígado, se observou a presença de infiltrados celulares
com lesões leves, com a característica diferencial de ser perivascular e mais extensa
no parênquima do fígado dos animais tratados com o extrato da N. variegata, em
ambos os grupos de concentrações de dose, e isolados em torno do ducto hepático,
na região periductal e no espaço porta (inflamação periductal) no parênquima
hepático dos animais tratados com os extratos da E. spectabile e B. laciniosa. De um
modo geral, o Nv-EtOH gerou alterações apresentadas no fígado dos animais com ele
tratados, enquanto para os outros dois extratos a estrutura dos lóbulos hepáticos se
apresentou preservada, com os hepatócitos e sinusóides hepáticos dispostos no
arranjo dentro da normalidade, e com o estroma do órgão preservado.
Na histopatologia do pâncreas, para os três extratos das plantas analisadas, se
percebeu estrutura glandular preservada, tanto a porção endócrina quanto a exócrina,
o mesmo se observando em relação ao estroma do órgão (ácinos e ilhotas
pancreáticas), no qual não houve alterações.
Na histopatologia do pulmão, para os animais tratados com os extratos de
E.spectabile e B. laciniosa, se percebeu a presença de células inflamatórias no
parênquima e parede dos bronquíolos, embora dentre a maioria dos animais
analisados, as estruturas do órgão encontraram-se preservadas. Para o Es-EtOH
foram encontrados a presença de grandes áreas inflamatórias (nódulos) distribuídos
por todo o parênquima pulmonar, enquanto para o Bl-EtOH, em um caso particular,
em um dos animais do grupo no qual se administrou 5 g/kg do extrato, foram
encontradas grandes áreas compactas devido a presença de nódulos volumosos em
várias áreas do parênquima. Nos animais tratados com o Nv-EtOH não se evidenciou
nenhuma alteração no pulmão.
Nenhuma alteração pode ser vista no miocárdio, e as demais estruturas do
coração encontraram-se dentro dos parâmetros da normalidade para os animais
tratados com os três extratos. Na histopatologia do estômago foram observadas a
presença de focos de células inflamatórias na mucosa e na submucosa do órgão dos
animais tratados com E. spectabile e B. laciniosa, com a particularidade deste último
ter sido restrito a porção glandular, enquanto com a N. variegata não se observaram
alterações.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 101 um estudo comparativo.
De um modo geral, o teste de toxicidade aguda é empregado para o
delineamento de doses a serem utilizadas nos estudos de toxicidade sub-crônica e
crônica. Além disso, fornece informações preliminares sobre o modo de ação tóxica e
possíveis órgãos alvo da substância.
Tomados juntos, os resultados do presente estudo mostraram que o extrato
etanólico das espécies Neoglaziovia variegata, Encholirium spectabile e Bromelia
laciniosa apresentam efeito antinociceptivo, e podem ser considerados de baixa
toxicidade. Das três espécies estudadas, apenas B. laciniosa tem uso na medicina
popular, e as informações aqui apresentadas servirão de base para estudos
farmacológicos posteriores.
Nossos resultados comprovam o potencial farmacológico de espécies de
Bromeliaceae nativas da caatinga, o que poderá contribuir para as políticas de
conservação e manejo adequado dessas espécies, visto que, além do potencial
econômico, elas podem vir a ser exploradas como fontes de novas substâncias
biologicamente ativas.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 102 um estudo comparativo.
7. CONCLUSO ES
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 103 um estudo comparativo.
7. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que os
extratos brutos das espécies de Bromeliaceae, nas doses e concentrações utilizadas
apresentam excelente atividade antinociceptiva. Os extratos de Neoglaziovia
variegata e Bromelia laciniosa, além de possuírem atividade analgésica periférica,
possuem também atividade central, e o mecanismo pelo qual os extratos exercem os
seus efeitos envolvem possivelmente o sistema opióide. Por outro lado, para o extrato
etanólico de Encholirium spectabile, sua atividade analgésica é possivelmente
mediada por mecanismos de ação periféricos. No entanto, mais estudos são
necessários para a melhor elucidação do mecanismo de ação dos extratos.
Com relação ao perfil de segurança dos extratos, no teste de toxicidade aguda,
os extratos foram considerados de baixa toxicidade, pois todos apresentaram DL50
maior que 2 e 5 g/kg por via i.p. e v.o, respectivamente. As análises dos parâmetros
hematológicos e bioquímicos também revelaram certo perfil de segurança para os
extratos, mas o mesmo não ocorreu com as análises histopatológicas, pois apontam
uma possível sobrecarga renal e hepática. Dessa forma, faz-se necessário a
realização de outros ensaios de toxicidade sub-crônica e crônica a fim de realmente
determinar o perfil de segurança dos extratos e, assim, para que futuramente tais
extratos possam se tornar agentes seguros para uso terapêutico.
Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para as
espécies em estudo, dessa forma, demos uma importante contribuição para a
farmacologia de plantas do bioma caatinga, em especial às espécies da família
Bromeliaceae.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 104 um estudo comparativo.
8. REFERE NCIÃS
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 105 um estudo comparativo.
8. RERERÊNCIAS ADENEYE, A. A.; AJAGBONNA, O. P.; ADELEKE, T. I.; BELLO, S. O. Preliminary toxicity and phytochemical studies of the stem bark aqueous extract of Musanga cecropioides in rats. J. Ethnopharmacology, v. 105, p. 374–379, 2006. ALMEIDA, R. N.; FALCÃO, A. C. G. M.; DINIZ, R. S. T.; QUINTANS-JÚNIOR, L. J.; POLARI, R. N.; BARBOSA-FILHO, J. M.; AGRA, M. F.; DUARTE, J. C.; FERREIRA, C. D.; ANTONIOLLI, A. R.; ARAÚJO, C. C. Metodologia para avaliação de plantas com atividade no Sistema Nervoso Central e alguns dados experimentais. Rev Bras Farm, v. 80, p. 72-76, 1999. ALMEIDA, R. N. Psicofarmologia – fundamentos práticos. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. AMENDOEIRA, F. C.; FRUTUOSO, V. S.; CHEDIER, L. M.; PEARMAN, A. T.; FIGUEIREDO, M. R.; KAPLAN, M. A. C.; PRESCOTT, S. M.; BOZZA, P. T.; CASTRO-FARIA-NETO, H. C. Antinociceptive effect of Nidularium procerum: a Bromeliaceae from the Brazilian coastal rain Forest. Phytomedicine, v. 12, p. 78-87, 2005. ANGELIM, A. E; MORAES, J. P. S; SILVA, J. A. B; GONÇALVES-GERVÁSIO, R. C. R. Germinação e aspectos morfológicos de plantas de macambira (Bromelia laciniosa) encontradas na Região do Rio São Francisco. Revista Brasileira de Biociência, v. 5, supl. 2. P. 1065-1067, 2007. ARAÚJO, A. A. S.; BONJARDIM, L. R.; MOTA, E. M.; ALBUQUERQUE-JÚNIOR, R. L. C.; ESTEVAM, C. S.; CORDEIRO, L.; SEIXAS, S. R. S.; BATISTA, J. S.; QUINTANS-JÚNIOR, L. J. Antinociceptive activity and toxicological study of aqueous extract of Egletes viscosa Less (Asteraceae). Braz. J. Pharm. Sci, v. 44, n. 4, p. 707-715, out./dez. 2008. BARROS, S. B. M.; DAVINO, S. C. Avaliação da toxicidade. In: OGA, S. Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Atheneu, 1996. p. 60-70. BARROS, G. A. M. D.; GARCIA, J. B. D. S.; SAKATA, R. K. Dor: Aspectos Atuais da Sensibilização Periférica e Central. Rev Bras Anestesiol, v. 57, p. 94-105, 2007. BENEDITO, R. B. Efeito antinociceptivo do monoterpeno (S)-(-)-Alcool perílico em camundongos. 2009. Dissertação (Mestrado em produtos naturais e sintéticos bioativos) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, 2009. BENNETT, B. C. Ethnobotany of Bromeliaceae. In: BENZING, D. H. Bromeliaceae: profile of an adaptative radiation. 1nd ed. London: Cambridge University Press, 2000. cap. 14, p. 587- 608. BENZING, D. H. Bromeliaceae: Profile of an adaptive radiation. 1nd ed. London: Cambridge University Press, 2000. BENZING, D. H. The Biology of Bromeliads. California: Mad River Press, 1980.
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ÃPE NDICES
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APENDICE A – Artigo I
Artigo I:
ANTINOCICEPTIVE EFFECT OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF
Neoglaziovia variegata (BROMELIACEAE) IN MICE
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ARTIGO I
Artigo submetido à:
Revista: Journal of Pharmacy and Pharmacology
Título: Antinociceptive effect of the ethanolic extract of Neoglaziovia variegata
(Bromeliaceae) In Mice
Autores: Sarah R.G. de Lima-Saraiva, Henrique C.C. Saraiva, Juliane C. Silva, Julianeli T. de
Lima, José A. de Siqueira-Filho, Patrícia K.F. Damasceno, Carla R.C. Branco, Alexsandro
Branco, Elba L.C. Amorim, Jackson R.G.S. Almeida
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 114 um estudo comparativo.
Antinociceptive effect of the ethanolic extract of Neoglaziovia
variegata (Bromeliaceae) in mice
Sarah R.G. de Lima-Saraivaa, Henrique C.C. Saraiva
b, Juliane C. Silva
b, Julianeli T. de Lima
b,
José A. de Siqueira-Filhob, Patrícia K.F. Damasceno
c, Carla R.C. Branco
c, Alexsandro Branco
c;
Elba L.C. Amorima, Jackson R.G.S. Almeida
b,*
aFederal University of Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazil;
bFederal University of São
Francisco Valley, Petrolina, Pernambuco, Brazil; cState University of Feira de Santana, Feira
de Santana, Bahia, Brazil
*Correspondence
Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida
Universidade Federal do Vale do São Francisco
Postal code: 56.304-205
Petrolina, PE, Brazil
Tel/Fax + 55-87-21016862
E-mail: [email protected]
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 115 um estudo comparativo.
Abstract
Objectives This study was carried out to evaluate the antinociceptive effects of ethanolic
extract from Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH) in mice using models of nociception.
Methods The evaluation of antinociceptive activity was carried out by the acetic acid-induced
writhing, formalin and hot plate tests. HPLC was used to determine the fingerprint
chromatogram of the Nv-EtOH.
Key findings In the acetic acid-induced writhing test, the Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg,
i.p.) reduced the number of writhing by 89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. Additionally,
the extract decreased by 46.67, 44.23 and 41.81%, respectively, the paw licking time in the first
phase of the formalin test, as well as 70.14, 69.43 and 90.28%, respectively, in the second
phase of this test. The effect of Nv-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its
central effect. The effects of Nv-EtOH and morphine in the formalin and hot plate tests were
inhibited by naloxone. The presence of phenolic compounds in the extract was confirmed using
HPLC.
Conclusions Results based from formalin and hot plate tests indicated that the extract has
compounds that interact with the opioid system. Pharmacological and chemical studies are
continuing in order to characterize the mechanism responsible for this effect.
Keywords: antinociceptive activity; Neoglaziovia variegata; Bromeliaceae
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 116 um estudo comparativo.
Introduction
Sensory systems have the role of informing the brain about the state of the external
environment and the internal milieu of the organism. Pain is a perception, and as such, it is one
of the outputs of a system in more highly evolved animals – the nociceptive system – which
itself is a component of the overall set of controls responsible for homeostasis.[1]
Pain is a
sensorial modality which in many cases represents the only symptom for the diagnosis of
several diseases. It often has a protective function. Throughout history man has used many
different forms of therapy for the relief of pain, among them, medicinal herbs are highlighted
due to their wide popular use.[2]
The effective treatment of the pain continues to be one of the major challenges in healthcare.
While analgesics that target the central opioid system are highly effective, these drugs are
associated to respiratory-depressant effects as well as the development of tolerance to
prolonged applications.[3]
Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), steroidal drugs and
immuno-supressant drugs, which have been used usually in the relief of pain and inflammatory
diseases by the people of the world for a long time. However, these drugs were often associated
with severe adverse side effects, such as gastrointestinal bleeding and peptic ulcers.[4]
Recently,
many natural medicines derived from plants, marine organisms, etc, were considered as the
effective and safer for the treatment of various diseases including inflammation and pain.[5]
Medicinal plants are alternative options to conventional therapies to many diseases, and Brazil
with its enormous biodiversity can contribute to the search of new natural products and
bioactive molecules.[6]
The Brazilian flora remains poorly studied with regard to its chemical
and pharmacological potential. Thus, the purpose of this study was to evaluate the
pharmacological potential of Neoglaziovia variegata, a species belonging to the family
Bromeliaceae.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 117 um estudo comparativo.
The Bromeliaceae, one of the largest botanical families of the New World, is distributed
extensively in tropical America.[7]
This family comprises 58 genera and 3172 speies.[8]
Considering the large number of species of the Bromeliaceae family few have been studied
chemically so far. Despite this, there is a considerable amount of identified compounds, which
mostly belong to the class of triterpenoid and flavonoids. Other classes of compounds such as
sterols, diterpenes, cinnamic acids, glycerol replaced, lignans, nitrogen compounds, among
others, were also identified in this family, although greatly reduced in number. From the
pharmacological standpoint, there are also few studies in the literature.[9]
Extracts of
Nidularium procerum showed anti-allergic properties[6]
as well as analgesic and anti-
inflammatory properties.[10]
Antiulcer activity of ethanolic extract of Encholirium spectabile
was also demonstrated.[11]
The family Bromeliaceae fascinates by the exuberance, diversity and beauty of its species.[12]
Neoglaziovia variegata is a species native to the lower stratum of the Brazilian Caatinga. It has
striped leaves, flowers protected by bracts with bright coloration and fruits as juicy berries.
This species is known in the Northeast Region of Brazil as “caroá” and constitutes one of the
most used raw material for use in craftsmanship in the region, generating jobs and income for
many families. Its leaves are used in fiber extraction which is used for manufacturing string,
hats, purses, rugs, hammocks, fishing nets and fabrics. The caroá plant, however, has been
collected directly in the Caatinga in a extrativism manner, without any systematization of
cultivation, having practically disappeared in some regions.[13]
There is no previous report on the analysis of the antinociceptive activity of Neoglaziovia
variegata. In our continuing search of the medicinal plants from Brazilian Caatinga for
combine biodiversity conservation with drug discovery, the aim of this study was to evaluate
the antinociceptive activity of ethanolic extract of N. variegata in experimental models.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 118 um estudo comparativo.
Materials and Methods
Plant material
The leaves of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez were collected in the city of Petrolina,
State of Pernambuco, Brazil, in January of 2011. The samples were identified by André
Paviotti Fontana, a botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
(CRAD). A voucher specimen (6441) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco
(HVASF) of the Federal University of São Francisco Valley.
Extraction
The leaves dried and pulverized (1.174 g) were macerated with ethanol 95% at room
temperature for 72 h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a
rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 45 g of crude ethanol extract (Nv-EtOH).
Analysis of Nv-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)
The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi
model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04
mm) Merck equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a
solution of H2O/H3PO4 0.1% (A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for
25 minutes. The column temperature was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For
the extract was used an injection volume of 20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm
during the whole run.
Animals
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 119 um estudo comparativo.
Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g), were used throughout this study. The
animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/ dark cycle
(lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals were
deprived of food 12 h prior to the experiments. They were used in groups of five or six animals
each. All nociception tests were carried out by the same visual observer. Experimental
protocols and procedures were approved by the Federal University of São Francisco Valley
Animal Care and Use Committee by number 21051023.
Acute toxicity
In the inquiry of the acute toxicity, groups of five male and five female Swiss mice (n=10) were
administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0 g/kg orally of the crude ethanol extract of N.
variegata (Nv-EtOH). Control group received vehicle. Mortality in each group within 72 h was
recorded and the animals were observed during a period of 14 days for the presence of toxicity
signals.
Acetic acid-induced writhing in mice
This test was performed as described by Koster et al.[14]
with modifications. Mice (n=6) were
intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10
ml/kg). Vehicle (saline), Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid
(ASA, 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection.
Following the injection of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by
counting the total number of writhes (a response consisting of contraction of the abdominal
wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after
stimulus injection.[15]
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 120 um estudo comparativo.
Formalin test
The method used was similar to that described previously.[16,17,18]
Twenty microlitres of 2.5%
formalin was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds)
spent in licking and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain
response. Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic
phase) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Nv-EtOH
(100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered
intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control animals received the same volume
of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow
view of the paws.
Hot plate test
Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the
parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or
jumping) greater than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline,
0.1 ml/10 g), morphine (10 mg/kg) and Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency
time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the maximum period of
20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the extract.[19]
Statistical analysis
The data obtained from animal experiments were analyzed using the GraphPad Prism program
version 4.0 and expressed as mean ± S.E.M. Statistically significant differences between groups
were calculated by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s
test. Values were considered significantly different at p < 0.05.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 121 um estudo comparativo.
Results
Analysis of Nv-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)
Phenolic profiles at 322 nm for the Nv-EtOH evaluated are presented in Figure 1. The
chromatogram shows the presence of eight peaks with different retention times: 9.60 (1), 10.89
(2), 11.80 (3), 14.44 (4), 15.16 (5), 15.58 (6), 16.69 (7) and 17.62 (8). Based on their UV-Vis
spectral data and their retention time, the compounds have UV band characteristic for cinnamic
acid, coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are under investigation.
INSERT FIGURE 1
Acute toxicity
In the acute toxicity evaluation of Nv-EtOH, behavioral and physiological alterations were not
observed neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,
respectively, indicating low toxicity of the extract. Further studies will be carried out to confirm
the absence of acute and chronic toxicity through histopatological analysis and determination of
hematological and biochemical parameters of blood.
Acetic acid-induced writhing in mice
Figure 2 shows that the i.p. administration of Nv-EtOH (100, 200 e 400 mg/kg) decreased
significantly (p < 0.01) the number of writhing movements induced by the i.p. administration of
the acetic acid compared with the control group. The inhibitions of writhes in percentage were
89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. Acetylsalicylic acid (200 mg/kg) and morphine (10
mg/kg), which are non-steroidal anti-inflammatory and opioid drugs, respectively, and which
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were used as positive controls, also produced significant inhibition of the response to acetic
acid-induced writhing. Morphine abolished the nociceptive response.
INSERT FIGURE 2
Formalin test
The formalin test revealed an antinociceptive effect of the extract (Figure 3a and 3b). Nv-EtOH
caused a significant inhibition of both neurogenic and inflammatory phases in the licking
induced by formalin. The result was most significative in the inflammatory phase. Nv-EtOH
(100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 46.67, 44.23 and 41.81%, respectively, the paw
licking time in the first phase, as well as 70.14, 69.43 and 90.28%, respectively, in the second
phase of the formalin test. The treatment with acetylsalicylic acid and morphine was also able
to inhibit the first and second phases. The pretreatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed
the antinociceptive activity of the extract at dose of 400 mg/kg in the first phase of this test.
The effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone. The results suggest a
possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.
INSERT FIGURE 3
Hot plate test
In the hot plate test (Figure 4), the animals treated with Nv-EtOH at dose of 200 mg/kg showed
an increase in latency time at 60 and 120 min. This effect was most significant at a dose of 400
mg/kg, which showed a marked increase latency time in 60, 90 and 120 minutes. Trying to
elucidate the mechanism by which Nv-EtOH induces antinociception, animals were pre-treated
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 123 um estudo comparativo.
with naloxone. The effects of Nv-EtOH and morphine were inhibited by naloxone, which
completely reversed the antinociceptive effect in the hot plate model.
INSERT FIGURE 4
Discussion
The present study showed the antinociceptive effect of the Neoglaziovia variegata extract in
different nociceptive responses generated by a chemical or thermal noxious stimulus. Three
different animal models were used in this study to investigate the potential antinociceptive of
the ethanolic extract. The methods for investigating antinociception were selected based on
their capacity to investigate both centrally and peripherally mediated effects. The abdominal
constriction induced by acetic acid and the hot plate methods investigate peripheral and central
activity, respectively, while the formalin test investigates both.[15]
The extract intraperitoneally administered significantly inhibited (p < 0.01) the acetic
acid-induced writhings in mice. Intraperitoneal injection of acetic acid produced 23.83 ± 2.60
writhes in the control group for 10 min after injection. The groups previously treated with 100,
200 and 400 mg/kg of Nv-EtOH exhibited a significant reduction in the number of writhings of
89.50, 71.34 and 87.42%, respectively. The results revealed that Nv-EtOH has a potent
antinociceptive activity in this method. The acetic acid-induced writhing test was commonly
considered as classical peripheral analgesic animal model and widely used for screening
analgesic drugs.[20]
Although this test is a nonspecific model of nociception, it is widely used
for analgesic screening and involves local peritoneal receptors, which are thought to be
partially responsible for abdominal constriction response. Some researchers have associated
this method with prostanoids in general, i.e., increased levels of PGE2 and PGF2α, as well as
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 124 um estudo comparativo.
lypoxigenase products in peritoneal fluids.[21]
However, it is important to note that other type of
analgesics, such as the opioids, are also effective in this test without inhibiting COX or LOX.
In order to distinguish between the central and peripheral antinociceptive action, the
formalin test was performed. The formalin test is a valid and reliable model of nociception and
is sensitive for various classes of analgesic drugs. Formalin test produced a distinct biphasic
response and different analgesics may act differently in the early and late phases of this test.
Intraplantar injection of formalin makes two phases of painful sensitivity evident. The first or
acute phase (0 – 5 min) when the neurogenic pain is caused by direct activation of type C
nociceptive afferent fibers, releasing neuropeptides such as substance P, among others. The
second or tonic phase (15 – 30 min) is characterized as inflammatory pain, related to release of
chemical mediators such as histamine, serotonin, bradykinin, prostaglandins and excitatory
aminoacids, which can be inhibited by painkillers and anti-inflammatory drugs.[22, 23]
This test
is a very useful method for not only assessing the antinociceptive drugs but also helping in the
elucidation of the action mechanism.[16]
Centrally acting drugs such as narcotics inhibit both
phases. Peripheral acting drugs such as NSAIDs and corticoids inhibit mainly the second phase.
The extract was able to block both phases of the formalin response although the effect was
more pronounced in the second phase. The effect of extract on the first and second phases of
formalin test suggests that its activity may be resulted from its central action when compared
with morphine activity in this respect. The pretreatment with naloxone reversed the
antinociceptive activity of the extract in the first phase of this test. The results suggest a
possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.
The effect of Nv-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its central effect. In
addition, the antinociceptive effect could be blocked by naloxone, indicating an interaction with
brain opioid mechanisms. The hot plate test is a central model that has selectivity for opioid-
derived analgesics, such as morphine. Although the central and peripheral analgesics respond
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 125 um estudo comparativo.
by inhibiting the number of contractions provoked by chemical pain stimuli, only the central
analgesics increase the time of response in the hot plate test.[24]
These results induce to think
that the antinociceptive action of the extract, probably is more related to a central mechanism
than with a peripheral mechanism.
Conclusions
Taken together, the results of our work suggest that the ethanolic extract from the leaves of
Neoglaziovia variegata possess an antinociceptive effect, which probably is related with a
central mechanism. The exact mechanism and the bioactive principles responsible for this
effect remain to be explained. Pharmacological and chemical studies are continuing in order to
characterize the mechanism responsible for this effect.
Declarations
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest to disclose.
Funding
This work was supported by grants from CNPq and FACEPE.
Acknowledgments
The authors wish to express their thanks to Centro de Referência para Recuperação de Áreas
Degradadas (CRAD/UNIVASF) for collection and botanical identification of the plant
material.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 126 um estudo comparativo.
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LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 129 um estudo comparativo.
Figure 1 High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD)
profiles of Neoglaziovia variegata ethanolic extract recorded at 322 nm.
1
3
5
7
82
4
6
1
3
5
7
82
4
6
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 130 um estudo comparativo.
Figure 2 Effect of ethanolic extract of the Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), acetylsalicylic
acid (ASA) and morphine on acetic acid induced writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p <
0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
0
10
20
30
**
**
**
** **
Control
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Nu
mb
er
of
wri
thin
gs
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 131 um estudo comparativo.
Figure 3 Effect of ethanolic extract of Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), acetylsalicylic acid
(ASA), morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Nv-EtOH +
NLX (400 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01,
significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
First phase
0
10
20
30
40
50
60
70
****
***
Control
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Nv-EtOH + NLX
*
(a)
Lic
kin
g t
ime (
s)
Second phase
0
50
100
150
**
** **
Control
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Nv-EtOH + NLX**
****
(b)
Lic
kin
g t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 132 um estudo comparativo.
Figure 4 Effect of ethanolic extract of Neoglaziovia variegata (Nv-EtOH), morphine,
morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Nv-EtOH + NLX (400 mg + 1.5
mg/kg) on hot plate test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly
different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
30 60 90 1200
5
10
15
20Control
Nv-EtOH 100 mg/kg
Nv-EtOH 200 mg/kg
Nv-EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Nv-EtOH + NLX
***
* *
****
**
**
*
Time (min)
Late
ncy t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 133 um estudo comparativo.
APENDICE B – Artigo II
Artigo II:
ANTIOXIDANT ACTIVITY AND ACUTE TOXICITY OF Neoglaziovia
variegata (BROMELIACEAE)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 134 um estudo comparativo.
ARTIGO II
Artigo submetido à:
Revista: Latin American Journal of Pharmacy
Título: Antioxidant activity and acute toxicity of Neoglaziovia variegata
(Bromeliaceae)
Autores: Sarah Raquel G. de Lima-Saraiva, Amanda L. Guimarães, Ana P. de Oliveira,
Henrique C. C. Saraiva, Raimundo G. de Oliveira-Júnior, Vanessa R. P. de Barros, Roniere A.
de Oliveira, Fabrício S. Silva, Ricardo S. Lima, Maria H. T. de Matos, Elba L. C. Amorim,
Jackson R.G. da S. Almeida
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 135 um estudo comparativo.
Antioxidant Activity and Acute Toxicity of Neoglaziovia variegata
(Bromeliaceae)
Sarah R.G. de LIMA-SARAIVA1, Amanda L. GUIMARÃES
2, Ana P. de OLIVEIRA
2,
Henrique C. C. SARAIVA2, Raimundo G. de OLIVEIRA-JÚNIOR
2, Vanessa R. P. de
BARROS2, Roniere A. de OLIVEIRA
2, Fabrício S. SILVA
2, Ricardo S. LIMA
2, Maria H. T.
de MATOS2, Elba L. C. AMORIM
1, Jackson R.G. da S. ALMEIDA
2,1
1Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil
2Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife,
Pernambuco, Brazil
SUMMARY. Antioxidant activities of N. variegata were evaluated by using DPPH radical
scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching and compared with ascorbic acid, BHA
and BHT. The total phenolics content of the extracts was determined by the Folin-
Ciocalteu method. Total flavonoid was also determined. The most significant total
phenolic content was of 543.50 ± 9.38 mg of gallic acid equivalent/g for AcOEt extract,
which presented the best antioxidant activity (IC50 5.08 ± 0.20 µg/ml) for DPPH
scavenging. The acute toxicity of Nv-EtOH was performed 2.0 g/kg intraperitoneally and
5.0 g/kg orally in mice. No mortality and no toxicity signs were observed, indicating low
toxicity of the extract. Blood was removed after 14 days for laboratory analysis of
hematological and biochemical parameters. Alterations of AST and creatinine were
observed. The data obtained showed that the doses induced microscopic alterations in the
liver and kidney. In conclusion, the Nv-EtOH can be considered of low toxicity.
1 Corresponding author: Tel/fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 136 um estudo comparativo.
Keywords: Antioxidant activity, acute toxicity, Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae
INTRODUCTION
Neoglaziovia variegata belongs to the family Bromeliaceae, subfamily Bromelioideae, and is
known popularly as “caroá”. This species can be commonly found in the Brazilian Caatinga.
Presents economic potential centered on the leaves, which are constituted by high resistance
fibers. The extraction of caroá reached significant levels in the 40's, before the advent of
synthetic fibers, caused by the expansion of sisal plantations1. This species, which, although
endemic of Caatinga and of proven economic importance, has not been studied as to their
chemical and pharmacological properties.
Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological
properties such as antioedematogenic and free radical scavenging2, antinociceptive and anti-
inflammatory3, anti-allergic
4, antiulcer
5 and cytotoxic activity
6.
Despite of the large number of species of this family, few have been studied chemically so far.
However, there is a considerable amount of identified compounds, which belong mainly to the
classes of flavonoids. These compounds polyphenolic are antioxidants7 and help to prevent
diseases associated with oxidative stress8,9
.
Oxidative stress, caused by an imbalance between reactive oxygen species (ROS) and the anti-
oxidative defense systems is considered to be a major etiological or pathogenic agent of
cardiovascular and neurodegenerative diseases, cancers, Alzheimer’s, diabetes and aging.
Because they inhibit or delay the oxidative process by blocking both the initiation and
propagation of oxidizing chain reactions, antioxidants for the treatment of cellular
degenerations are beginning to be considered10
.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 137 um estudo comparativo.
Antioxidants stabilize or deactivate free radicals, often before they attack targets in biological
cells. Although almost all organisms possess antioxidant defense and repair systems to protect
against oxidative damage, they cannot prevent the damage entirely.
Nowadays, the interest in naturally occurring antioxidants has considerably increased for use in
food, cosmetic and pharmaceutical products, replacing synthetic antioxidants which are often
restricted due to carcinogenic effects11
.
On the other hand, it is necessary to carry out toxicological studies to evaluate safety
parameters which are not observed by the popular use of the plants. Toxicological studies help
to decide whether a new drug should be adopted for clinical use or not. The toxicological
analysis of plant extracts is of fundamental importance, since it characterizes the deleterious
effects of toxic compounds produced from its administration.
There is no previous report on the analysis of the antioxidant activity and acute toxicity of
Neoglaziovia variegata. In our continuing search of the medicinal plants from Brazilian
Caatinga for combine biodiversity conservation with drug discovery, the aim of this study was
to evaluate the antioxidant activity and possible toxic effects of ethanolic extract of N.
variegata in mice.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
The leaves of Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez were collected in the city of Petrolina,
State of Pernambuco, Brazil, in January of 2011. The samples were identified by André
Paviotti Fontana, a botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
(CRAD). A voucher specimen was deposited at the Herbarium of São Francisco Valley, of the
Federal University of São Francisco Valley, with the code (6441).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 138 um estudo comparativo.
Preparation of extracts
The leaves of Neoglaziovia variegata dried and pulverized (1.174 g), were subjected to
maceration with 95% EtOH for 72 hours. The solution was filtered and concentrated in a
rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 45 g of crude ethanol extract (Nv-EtOH). For the
evaluation of antioxidant activity, the ethanolic extract was suspended in MeOH:H2O (3:7) and
partitioned with hexane, chloroform (CHCl3) and ethyl acetate (AcOEt) in crescent order of
polarity to obtain the respective extracts.
Total phenolic content
Total phenolic contents were assayed using the Folin-Ciocalteu reagent, it is based on the
method reported by Slinkard and Singleton12
, only the volumes have been adjusted13
. An
aliquot (40 μl) of a suitable diluted extracts was added to 3.16 ml of distilled water and 200 μl
of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. The mixture was shaken and allowed to stand for
6 min, before adding 600 μl of sodium carbonate solution, and shake to mix. The solutions
were left at 20 °C for 2 hours and the absorbance of each solution was determined at 765 nm
against the blank and plot absorbance vs. concentration. Total phenolic contents of the extracts
(three replicates per treatment) were expressed as mg gallic acid equivalents per gram (mg
GAE/g) through the calibration curve with gallic acid. The calibration curve range was 50-1000
mg/l (R² = 0.9938). All samples were performed in triplicates.
Total flavonoid content
Total flavonoid content was measured by the aluminum chloride colorimetric assay14
. An
aliquot (300 µl) of Nv-EtOH, ethyl acetate extract or standard of catechin was added to flask
containing 1.5 ml of distilled water. To the flask was added 90 µl NaNO2 (5%). After 6 min,
180 µl AlCl3 (10%) was added. After 5 min, 600 µl 1M NaOH was added and the total volume
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 139 um estudo comparativo.
was made up with 330 µl of distilled water. The solution was mixed well and the absorbance
was measured against prepared reagent blank at 510 nm. Total flavonoid contents were
expressed as mg catechin equivalents per gram (mg CE/g) through the calibration curve with
catechin. The calibration curve range was 50-1000 mg/L (R² = 0.9784). All samples were
performed in triplicates.
Antioxidant activity
DPPH Free Radical Scavenging Assay
The free radical scavenging activity was measured using the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazil
(DPPH) assay15,16
. Sample stock solutions (1.0 mg/ml) of the extracts were diluted to final
concentrations of 243, 81, 27, 9, 3 and 1 µg/ml, in ethanol. One ml of a 50 µg/ml DPPH
ethanol solution was added to 2.5 mL of sample solutions of different concentrations, and
allowed to react at room temperature. After 30 min the absorbance values were measured at
518 nm and converted into the percentage antioxidant activity (AA) using the following
formula: AA% = [(absorbance of the control – absorbance of the sample)/ absorbance of the
control] x 100. Ethanol (1.0 ml) plus plant extracts solutions (2.5 ml) were used as a blank.
DPPH solution (1.0 ml) plus ethanol (2.5 ml) was used as a negative control. The positive
controls (ascorbic acid, BHA and BHT) were those using the standard solutions. Assays were
carried out in triplicate.
β-Carotene Bleaching Test
The β-carotene bleaching method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to
its reaction with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion11
. The rate of β-
carotene bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants. β-carotene (2 mg) was
dissolved in 10 ml chloroform and to 2 ml of this solution, linoleic acid (40 mg) and Tween 40
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 140 um estudo comparativo.
(400 mg) were added. Chloroform was evaporated under vacuum at 40 ºC and 100 ml of
distilled water was added, then the emulsion was vigorously shaken during two minutes.
Reference compounds (ascorbic acid, BHA and BHT) and sample extracts were prepared in
ethanol. The emulsion (3.0 ml) was added to a tube containing 0.12 ml of solutions 1 mg/ml of
reference compounds and sample extracts. The absorbance was immediately measured at 470
nm and the test emulsion was incubated in a water bath at 50 ºC for 120 min, when the
absorbance was measured again. Ascorbic acid, BHA and BHT were used as positive control.
In the negative control, the extracts were substituted with an equal volume of ethanol. The
antioxidant activity (%) was evaluated in terms of the bleaching of the β-carotene using the
following formula: % Antioxidant activity = [1 - (A0 – At) / (A00 – At
0)] x 100; where A0 is the
initial absorbance and At is the final absorbance measured for the test sample, A00
is the initial
absorbance and At0
is the final absorbance measured for the negative control (blank). The
results are expressed as percentage of antioxidant activity (% AA). Tests were carried out in
triplicate.
Animals
Male and female adult albino Swiss mice (30-40 g and aged 8-10 weeks), were used throughout
this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/
dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals
were deprived of food 12 h prior to the experiments. Experimental protocols and procedures
were approved by the Federal University of Vale do São Francisco Animal Care and Use
Committee by number 21051023.
Acute toxicity
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 141 um estudo comparativo.
In the inquiry of the acute toxicity, animals were randomly divided in groups of five male and
five female Swiss mice (n=10). Animals were administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0
g/kg orally of the crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata. Control group received
vehicle. Subsequently, the animals were observed for 14 days to evaluate the presence of signs
of toxicity. Mortality in each group within 72 h was recorded. LD50 was estimated by the
method described by Litchfield & Wilcoxon17
. Were assessed daily throughout the study the
parameters of body weight variation, consumption of food and water.
Behavioural screening
The behavioral screening of the mice was performed following parameters described by
Almeida et al.18
. The animals were observed at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after administration of Nv-
EtOH. Specific behaviors (piloerection, palpebral ptosis, abdominal contortions, locomotion,
hypothermia, muscular tonus, trembling, forepaws paralysis, sedation, ambulation reduction,
response to touch, analgesia and defecation) were observed and graded).
Hematological and biochemical parameters analysis of blood
For the evaluation of hematological and biochemical parameters of blood was utilized the
methodology described by Vasconcelos et al.19
and Araújo et al.20
with modifications. Blood
was removed after 14 days through brachial plexus for laboratory analysis of hematological
parameters: count of erythrocytes (106/mm
3), hemoglobin (g/dL), hematocrit (%), the mean
corpuscular volume (MCV, μ3), the mean corpuscular hemoglobin (MCH, μg), the mean
corpuscular hemoglobin concentration (MCHC, %), leukocytes (103/mm
3), lymphocites (%),
monocytes (%) and platelets (103/mm
3). The biochemical parameters analyzed in serum
samples were glucose (mg/dL), cholesterol (mg/dL), triglycerides (mg/dL), AST/TGO (U/L),
ALT/TGP (U/L), urea (mg/dL) and creatinine (mg/dL). For the determination of hematological
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 142 um estudo comparativo.
parameters was used hematology analyser Sysmex XT-2000, for the biochemical parameters
was used an automatic analyser Wiener BT 3000 Plus.
Histopathological Analysis
Sections of tissues such as kidney and liver were obtained for histopathological studies. The
organs were fixed in 10% buffered formaldehyde for 18 h. After fixation, the organ was
immersed in 70% alcohol and transported to the Laboratory of Cell Biology, Histology and
Cytology, Campus of Agricultural Sciences of UNIVASF. It was then dehydrated in increasing
series of ethanol (80, 95 and 100%) subsequently clarified in xylene, and even embedded in
paraffin histology. From each paraffin block containing the tissue samples, sections of 7 µm
were cut in microtome and mounted on glass slides, which were stained with hematoxylin and
eosin for further evaluation of tissues structure in light microscope (400 x).
Statistical analysis
The data obtained were analyzed using the GraphPad Prism® version 4.0 and expressed as
mean ± S.E.M or mean ± S.D. as appropriate. Statistically significant differences between
groups were calculated by the application of Student’s t-test. Values were considered
significantly different at p < 0.05.
RESULTS AND DISCUSSION
Total phenolic, total flavonoid contents and antioxidant activity
Table 1 summarizes the results from the quantitative determination of phenolic (TP) and
flavonoids (TF) as well as the effect of extracts from Neoglaziovia variegata, ascorbic acid,
BHA and BHT on the DPPH free radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 143 um estudo comparativo.
test. The extracts were evaluated by comparing with ascorbic acid, BHA and BHT, which are
well-known commercial antioxidants.
The total phenolic contents of the extracts were determined by Folin-Ciocalteu method as gallic
acid equivalents in milligrams per gram (mg GAE/g) while total flavonoid contents were
calculated as catechin equivalents in milligrams per gram (mg CE/g). Among the four extracts,
ethyl acetate extract (AcOEt) was containing highest (543.50 ± 9.38) amount of phenolic
compounds followed by CHCl3 extract (203.90 ± 10.23) and crude ethanol extract (65.13 ±
1.25). Numerous publications applied the total phenols assay often found excellent linear
correlations between the total phenolic profiles and the antioxidant activity21
. For the total
flavonoid content, the highest value was observed in AcOEt extract (262.30 ± 1.33) while the
CHCl3 and crude ethanol extract (EtOH) presented 32.52 ± 4.19 and 7.82 ± 10.28 mg CE/g,
respectively.
In the present study, the antioxidant ability of the N. variegata extracts was investigated
through some in vitro models such as radical scavenging activity using, 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl (DPPH) method and β-carotene-linoleate model system. Antioxidant activity on
method of DPPH was expressed as IC50 which is defined as the concentration sufficient to
obtain 50% of a maximum effect estimate in 100%. Lower IC50 value indicated higher
antioxidant activity. In β-carotene-linoleate model system the antioxidant activity was
expressed as percentage of antioxidant activity (%AA).
The DPPH reactivity is one popular method for screening of the free radical-scavenging ability
of compounds that has been extensively used for screening antioxidants from plant extracts.
DPPH is a stable free radical that reacts with compounds that can donate a hydrogen atom. This
method is based on the scavenging of DPPH through the addition of a radical species or an
antioxidant that decolourizes the DPPH solution. The degree of color change is proportional to
the concentration and potency of the antioxidants22
. The data showed that the AcOEt and
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 144 um estudo comparativo.
CHCl3 extracts exhibited excellent free radical scavenging activity. The AcOEt extract showed
better antioxidant activity than BHT using by DPPH method, with a value of IC50 of 5.08 ±
0.20 µg/ml. BHA was the most effective antioxidant, with a value of IC50 of 3.50 ± 3.17 µg/ml.
It appears that N. variegata have compounds with a strong hydrogen-donating capacity and can
efficiently scavenge DPPH radicals.
The antioxidant activity of extracts was also evaluated by the β-carotene/linoleate bleaching
method. This method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to its reaction
with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion. β-carotene in this model system
undergoes rapid discoloration in the absence of an antioxidant. The rate of the β-carotene
bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants23
. This method is one of the
antioxidant assays suitable for plant extracts. All extracts had lower antioxidant activity than
BHT and BHA.
Acute toxicity
Neoglaziovia variegata is a plant that has not broad popular use. However, studies are needed
to prove the safety of its use, as well as the analysis of acute toxicity is fundamentally
important to identify the doses that could be used, and to reveal the possible clinical signs
caused by the extract under investigation.
In the acute toxicity of Nv-EtOH, behavioral and physiological alterations were not observed
neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,
respectively, indicating low toxicity of the extract. In this experiment was observed that the Nv-
EtOH has LD50 > 5000 mg/kg. According to Kennedy et al.24
, substances that present LD50
higher than 5.0 g/kg by oral route can be considered practically non-toxic.
There were significant changes (p < 0.001) in body weight of mice from day 1 to day 14 in
group treated with the extract at dose of 5 g/kg v.o. At the end of the experiment, the average of
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 145 um estudo comparativo.
control group was of 40.44 ± 0.27 g, while the treated group was of 34.59 ± 0.22 g. The
variation of weight along of the experiment could be seen in Figure 1. Generally, alterations in
body weight gain of mice treated with substances reflect toxic effects, and have been used as an
indicator of adverse effects of drugs and chemicals, especially if weight loss is greater than
10% of initial weight in the mices25
. Food and water consumption also showed significant
alterations (Figures 2 and 3). The amount of food consumed at the end of the experiment was of
53.69 ± 1.64 g for the control group, while the treated group was of 29.62 ± 0.86 g (p < 0.001).
The amount of water consumed at the end of the experiment was of 94.38 ± 3.15 ml for the
control group, while the treated group was of 65.77 ± 3.41 ml (p < 0.001). The analysis of food
and water intake in an animal experimentation is important to investigate the safety of
substances studied for therapeutic purposes26
.
Behavioural screening
The behavioural screening of animals was realized at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after
administration of Nv-EtOH 2.0 and 5.0 g/kg (body weight) intraperitoneally and orally,
respectively. The animals did not display significant changes in behavior. The animals did not
show any sign of toxicity or change in behavioral or other physiological activities.
Hematological and biochemical parameters analysis of blood
Analyzing the results to hematological parameters (Table 2), it is possible to observe that, after
administration of doses of 2.0 g/kg i.p. and 5.0 g/kg v.o., there was no significant variation in
hematological parameters (red blood cells, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC, leukocytes and
platelets); only a few changes were found statistically significant (p < 0.05) in hematological
parameters such as increase of percentage of hematocrit, lymphocytes and monocytes.
However, the clinical significance of this increase is being investigated. This analysis is very
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 146 um estudo comparativo.
important because the hematopoietic system is highly sensitive to toxic substances in the blood,
serving thus as an important parameter to analyze the physiological and pathological status in
animals27
.
Regarding the biochemical parameters, the results show that the glucose, cholesterol,
triglycerides, aspartate amino transferase (AST/TGO), creatinine and urea have not statistical
significance compared to the control group (Table 3). The levels of alanine amino transferase
(ALT/TGP) after the dose of 2.0 g/kg i.p. were significantly lower than control group (p <
0.05). The animals treated with a dose of 5 g/kg v.o. showed increased levels of AST and
creatinine, although this was not statistically significant. AST and creatinine are good
indicators of liver and kidney functions, respectively. Alterations in their levels suggest
alterations in these organs. Transaminases (AST and ALT) are liver enzymes located within the
hepatocytes and are used as biochemical markers to potentially toxic substances, since their
biochemical values are high when an injury occurs in the liver parenchymal28
.
Histopathological Analysis
Macroscopic examination of the organs of the animals treated with extract showed no changes
in color compared to control. In the histopathology the kidney tissue showed perivascular
infiltrates and parenchymal cells of varying intensity, with expansive characteristics well
defined, discrete lesions restricted, but multifocal lesions in large and extensive areas, and the
presence of edema, areas of necrosis and the appearance of a mass of disorganized cell growth
and intense (Figure 4). In the liver, it was evident cellular infiltrates, with the same
characteristics, injuries ranging from mild to more extensive perivascular and parenchymal
liver. In some animals the lesions are quite clear and expansive nature (Figure 5). These
microscopic changes were present in both groups treated with doses of 2 g/kg i.p. and 5 g/kg
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 147 um estudo comparativo.
v.o. The data obtained showed that the doses did not induce death of animals, but showed
alterations in the liver and kidney.
Toxic effects of substances can reach all systems and organs, however, the liver and kidneys
are the organs most commonly affected because the kidneys are the organs responsible for
excretion of metabolic wastes and control of homeostasis. The liver is the main organ for drug
metabolism and detoxification.
CONCLUSIONS
The present study was designed to further investigate the antioxidant activity and toxicity of
ethanolic extract of N. variegata by using acute toxicity analysis. To our knowledge, this
species is being investigated for the first time.
N. variegata could be a good source of antioxidant phenolics. It was demonstrated that the
extracts contains high content of phenolic compounds and flavonoids. The antioxidant activity
presented by the extracts is related to the presence of these compounds.
Based on the results presented, we conclude that the Nv-EtOH may be considered of low
toxicity, since the acute administration intraperitoneally and orally produced no deaths or signs
of toxicity in animals. The extract not induced significant alterations in almost all biochemical
and hematological parameters observed. The levels of AST and creatinine were altered,
indicating that there may be potential liver and kidney damage. This hypothesis was confirmed
by histopathological analysis of organs. However, further long-term toxicological studies
(chronic toxicity) are needed in order to establish it as medicine.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by grants from CNPq and FACEPE. The authors wish to
express their thanks to Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho and André Paviotti Fontana of
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 148 um estudo comparativo.
Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) for collection and
botanical identification of the plant material.
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LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 151 um estudo comparativo.
TP (mg GAE/g) TF (mg CE/g) DPPH (IC50,
µg/ml)
β-carotene
bleaching (% AA)
EtOH 65.13 ± 1.25 7.82 ± 10.28 243.70 ± 69.99 41.87 ± 3.20
Hexane --- --- 517.30 ± 152.30 56.15 ± 2.73
CHCl3 203.90 ± 10.23 32.52 ± 4.19 48.31 ± 1.65 29.84 ± 13.49
AcOEt 543.50 ± 9.38 262.30 ± 1.33 5.08 ± 0.20 40.31 ± 7.61
Ascorbic acid --- --- 4.72 ± 2.67 7.50 ± 2.12
BHA --- --- 3.50 ± 3.17 80.93 ± 3.45
BHT --- --- 17.87 ± 2.98 86.77 ± 1.14
Table 1. Total phenolics (TP), total flavonoids (TF) and antioxidant activity of extracts from
Neoglaziovia variegata. The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression
analysis with 95% of confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain
50% of a maximum effect estimate in 100%. Values are given as mean ± SD (n=3).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 152 um estudo comparativo.
Parameters Groups
Control After 2 g/kg i.p. After 5 g/kg v.o.
Erythrocytes (106/mm
3) 8.47 ± 0.10 8.50 ± 0.08 8.62 ± 0.15
Hemoglobin (g/dL) 12.90 ± 0.20 13.03 ± 0.23 13.13 ± 0.12
Hematocrit (%) 34.40 ± 0.66 35.05 ± 0.32 34.70 ± 0.18*
MCV (μ3) 41.20 ± 0.48 42.35 ± 0.46 40.40 ± 0.84
MCH (μg) 15.77 ± 0.21 15.70 ± 0.19 15.25 ± 0.16
MCHC (%) 37.40 ± 0.33 37.37 ± 0.61 37.93 ± 0.47
Leukocytes (103/mm
3) 2.98 ± 0.16 2.98 ± 0.21 3.11 ± 0.15
Lymphocites (%) 63.23 ± 2.00 69.73 ± 0.58* 62.01 ± 2.62
Monocytes (%) 1.45 ± 0.41 1.57 ± 0.26 2.25 ± 0.25*
Platelets (103/mm
3) 471.50 ± 48.66 447.00 ± 65.91 341.50 ± 59.31
Table 2. Hematological parameters of blood of Swiss mice treated with 2.0 g/kg
intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata after 14
days (acute toxicity). Values are mean ± S.E.M, n = 8. *p < 0.05; Student’s t-test at 5 %
probability.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 153 um estudo comparativo.
Parameters Groups
Control After 2 g/kg i.p. After 5 g/kg v.o.
Glucose (mg/dL) 131.00 ± 10.08 132.00 ± 8.94 141.00 ± 16.67
Cholesterol (mg/dL) 118.20 ± 8.20 107.70 ± 6.32 121.80 ± 5.74
Triglycerides (mg/dL) 142.80 ± 23.64 135.70 ± 19.08 148.80 ± 8.98
AST/GOT (U/L) 170.00 ± 11.07 197.30 ± 18.25 236.70 ± 28.26
ALT/GPT (U/L) 84.93 ± 5.82 65.72 ± 5.22* 86.40 ± 12.00
Urea (mg/dL) 73.50 ± 6.81 63.83 ± 3.16 69.75 ± 7.47
Creatinine (mg/dL) 0.73 ± 0.09 0.62 ± 0.05 0.85 ± 0.02
Table 3. Biochemical parameters obtained from the serum of Swiss mice treated with 2.0 g/kg
intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Neoglaziovia variegata after 14
days (acute toxicity). Values are mean ± S.E.M, n = 8. *p < 0.05; Student’s t-test at 5 %
probability.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 154 um estudo comparativo.
Figure 1. Body weight gain for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1530
35
40
45Control
After 2 g/kg i.p.
After 5 g/kg v.o.
Days
Bo
dy w
eig
ht
gain
(g
)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 155 um estudo comparativo.
Figure 2. Consumption of food for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1520
30
40
50
60
70Control
After 2 g/kg i.p.
After 5 g/kg v.o.
Days
Co
nsu
mp
tio
n o
f fo
od
(g
)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 156 um estudo comparativo.
Figure 3. Consumption of liquid for animals treated with Nv-EtOH during 14 days (n= 10).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1525
50
75
100
125Control
After 2 g/kg i.p.
After 5 g/kg v.o.
Days
Co
nsu
mp
tio
n o
f w
ate
r (m
l)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 157 um estudo comparativo.
Figure 4. Photomicrographs of kidney histopathology from representative animals. (A) Control
group, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) and (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (hematoxylin-eosin stain).
A B C
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 158 um estudo comparativo.
Figure 5. Photomicrographs of liver histopathology from representative animals. (A) Control
group, (B) Nv-EtOH (2 g/kg i.p.) and (C) Nv-EtOH (5 g/kg v.o.) (hematoxylin-eosin stain)
A B C
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 159 um estudo comparativo.
APENDICE C – Artigo III
Artigo III:
ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT OF
Encholirium spectabile (BROMELIACEAE) IN MICE
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 160 um estudo comparativo.
ARTIGO III
Artigo submetido à:
Revista: Records of Natural Products
Título: Antinociceptive Activity of the Ethanolic Extract of Encholirium
spectabile (Bromeliaceae) in Mice
Autores: Sarah R. G. de Lima-Saraiva, Henrique C. C. Saraiva, Juliane C. Silva, José A. de
Siqueira-Filho, Patrícia K. F. Damasceno, Carla R. C. Branco, Alexsandro Branco, Elba Lúcia
C. Amorim and Jackson Roberto G. da S. Almeida
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 161 um estudo comparativo.
Rec. Nat. Prod. x:x (2012) xxx-xxx
Antinociceptive Activity of the Ethanolic Extract of Encholirium
spectabile (Bromeliaceae) in Mice
Sarah R. G. de Lima-Saraiva1, Henrique C. C. Saraiva
2, Juliane C. Silva
2,
José A. de Siqueira-Filho2, Patrícia K. F. Damasceno
3, Carla R. C. Branco
3,
Alexsandro Branco3, Elba Lúcia C. Amorim
1 and Jackson Roberto G. da S.
Almeida2*
1 Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife, Pernambuco,
Brazil.
2 Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
3 Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana,
44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil
(Received January xx, 2012; Revised xxxxx xx, 2012; Accepted xxxxxx xx, 2012)
Abstract: This study was carried out to evaluate the antinociceptive effects of ethanolic extract of the leaves from
E. spectabile (Es-EtOH) in mice using chemical (writhing and formalin) and thermal (hot plate) models of
nociception. HPLC was used to determine the fingerprint chromatogram. The Es-EtOH was examined for its
intraperitoneal (i.p.) antinociceptive activity at the doses of 100, 200 and 400 mg/kg body weight. In the acetic
acid-induced writhing test, the Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhings by 68.59,
79.33 and 65.28%, respectively. Additionally, Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 34.14, 52.61
and 60.97%, respectively, the paw licking time in the first phase, as well as 89.56, 79.90 and 96.71%, respectively,
in the second phase of the formalin test. In a general manner, Es-EtOH did not show effect in the hot plate test, the
extract increase the latency time only at dose of 100 mg/kg after 60 min. The presence of phenolic compounds in
the extract was confirmed using HPLC. These results indicate that Es-EtOH has antinociceptive activity, probably
of peripheral origin. The mechanism involved is not completely understood, at least in part, there is the
participation of opioid receptors.
Keywords: antinociceptive activity; Encholirium spectabile; Bromeliaceae.
1. Introduction
Herbal drugs have been used since ancient times as medicines for the treatment of a range of diseases.
Medicinal plants have played a key role in world health. In spite of the great advances observed in
* Corresponding author: E-Mail: [email protected]; Phone/Fax: +55-87-21016862.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 162 um estudo comparativo.
modern medicine in recent decades, plants still make an important contribution to health care [1].
Natural products of plant origin are still a major part of traditional medicinal systems in developing
countries. There is also a resurgence of interest in herbal medicines in western countries as an
alternative source of drugs often for diseases as inflammation and pain [2]. The need for safer and
effective analgesic drugs justifies the interest in the study of medicinal plants because many species of
plants are used worldwide for the relief of pain.
The Bromeliaceae family is predominantly Neotropical and comprises 58 genera and approximately
3172 species [3]. The phytochemistry of this family is characterized by the presence of flavonoids,
triterpenoids, steroids, diterpenes, cinnamic acid derivatives, lignans, nitrogen compounds among others
[4]. Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological
properties such as antioedematogenic and free radical scavenging [5], antinociceptive and anti-
inflammatory [6], anti-allergic [7] and cytotoxic activity [8].
Encholirium is a Brazilian genus of Bromeliaceae which occurs exclusively in rocky landscapes in areas
of Cerrado, Caatinga and Atlantic Forest and is constituted by 23 species. This genus is exclusively
Brazilian and has restricted distribution of most endemic species [9-10].
Encholirium spectabile is the species best known of the genus because the frequency with which it is
found in outcrops rocky throughout the Brazilian Caatinga [11]. Is popularly known as “macambira-de-
flecha” and “macambira-de-pedra” [12]. It is one of the plants that have been included in a conservation
program of the “Reference Center for Recovery of Flora in Priority Areas of the San Francisco River
Basin – The Caatinga Biome”.
Little is known about the chemistry and pharmacology of Encholirium species. Previous study realized
by our research group demonstrated that the ethanolic extract of Encholirium spectabile has
gastroprotective activity against gastric mucosal damage induced by ethanol, HCl/ethanol, ibuprofen,
ischemia and reperfusion, which suggests that the extract may activate cytoprotective mechanisms that
increase the release of prostaglandins. The presence of phenolic compounds, mainly flavonoids,
contributes to the gastroprotective activity of the extract [13]. Except this study, so far no other
biological studies were carried out on Encholirium spectabile.
One of most important side effects of conventional analgesic and anti-inflammatory drugs (NSAIDs, for
example) is their ulcerogenic activity. Flavonoids are good analgesic and anti-inflammatory compounds
and are also able to protect the gastric mucose against a variety of ulcerogenic agents. Many studies
were performed examining the antiulcerogenic activity of flavonoids using both naturally derived and
synthetic compounds. Flavonoids are reported to act in the gastrointestinal tract as antisecretory and
antiulcer agents [14].
Considering the effect shown by the ethanolic extract of E. spectabile using different standard
experimental models of induced acute gastric ulceration, the objective of this work was to evaluate the
antinociceptive effect of the extract of this plant in mice using experimental models of pain. There is no
previous report on the analysis of the antinociceptive activity of Encholirium spectabile.
2. Materials and Methods
2.1. Plant material The leaves of Encholirium spectabile Mart. ex Schult. f. were collected in the city of Petrolina, State of
Pernambuco, Brazil, in January of 2010. The samples were identified by André Paviotti Fontana, a
botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). A voucher specimen
(6443) was deposited at the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF) of the Federal University of
São Francisco Valley.
2.2. Extraction The leaves dried and pulverized (1196 g) were macerated with ethanol 95% at room temperature for 72
h. The solution was filtered and concentrated under reduced pressure in a rotatory evaporator oven at 50 oC, producing 64 g of crude ethanol extract (Es-EtOH).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 163 um estudo comparativo.
2.3. Analysis of Es-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC) The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi
model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04 mm) Merck
equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a solution of H2O/H3PO4 0.1%
(A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for 25 minutes. The column temperature
was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For the extract was used an injection volume of
20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm during the whole run.
2.4. Animals Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g), were used throughout this study. The animals were
randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/ dark cycle (lights on at 6:00 a.m.)
with free access to food and water. When necessary, animals were deprived of food 12 h prior to the
experiments. They were used in groups of five or six animals each. All nociception tests were carried
out by the same visual observer. Experimental protocols and procedures were approved by the Federal
University of São Francisco Valley Animal Care and Use Committee by number 21051023.
2.5. Acute toxicity In the inquiry of the acute toxicity, groups of five male and five female Swiss mice (n=10) were
administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0 g/kg orally of the crude ethanol extract of E. spectabile
(Es-EtOH). Control group received vehicle. Mortality in each group within 72 h was recorded and the
animals were observed during a period of 14 days for the presence of toxicity signals.
2.6. Acetic acid-induced writhing in mice This test was performed as described by Koster et al. [15] with modifications. Mice (n=6) were
intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10 ml/kg).
Vehicle (saline), Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid (ASA, 200
mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection. Following the injection
of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by counting the total number of
writhes (a response consisting of contraction of the abdominal wall, pelvic rotation followed by hind
limb extension) occurring between 5 and 15 min after stimulus injection [16].
2.7. Formalin test The method used was similar to that described previously [17-19]. Twenty microlitres of 2.5% formalin
was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds) spent in licking and
biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain response. Responses were
measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic phase) and 15-30 min after formalin
injection (second phase, inflammatory phase). Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg)
and morphine (10 mg/kg) were administered intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control
animals received the same volume of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror
mounted on three sides to allow view of the paws.
2.8. Hot plate test Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5
oC. Licks on the rear paws were the parameters of
observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or jumping) greater than
20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline, 0.1 ml/10 g), morphine (10
mg/kg) and Nv-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency time (in seconds) for each mice was
determined on the hot plate during the maximum period of 20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min
after the administration of the extract [20].
2.9. Statistical analysis The data obtained from animal experiments were analyzed using the GraphPad Prism program version
4.0 and expressed as mean ± S.E.M. Statistically significant differences between groups were calculated
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 164 um estudo comparativo.
by the application of analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test. Values were
considered significantly different at p < 0.05.
3. Results and Discussion Phytochemical screening showed that the ethanolic extract of leaves from E. spectabile (Es-EtOH)
contains phenols, flavonoids, steroids and terpenoids. Phenolic profiles at 320 nm for the Es-EtOH
evaluated are presented in Figure 1. The chromatogram shows the presence of ten peaks with different
retention times: 10.89 (1), 11.12 (2), 11.78 (3), 12.86 (4), 13.37 (5), 14.44 (6), 15.16 (7) 15.58 (8), 16.68
(9) and 17.63 (10). Based on their UV-Vis spectral data and their retention time, the compounds have
UV band characteristic for cinnamic acid, coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are
under investigation.
Figure 1. High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) profiles of
Encholirium spectabile ethanolic extract recorded at 320 nm.
Acute toxicity results showed no signs of toxicity and mortality of the animals. Therefore, an
LD50 > 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally may be assumed.
The intraperitoneal administration of Es-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) decreased
significantly the action of acetic acid used to induce writhes in mice, when compared to the control
group. The percentages of inhibition were of 68.59, 79.33 and 65.28%, respectively. ASA (200 mg/kg)
also significant inhibited the writhes, while the morphine abolished the nociception induced by acetic
acid. The results can be seen in Figure 2.
The acetic acid-induced writhing reaction in mice has been largely used as screening tool for
assessment of analgesic or anti-inflammatory properties of new agents as well as a typical model for
visceral inflammatory pain [21-22]. The local irritation provoked by a test agent in the intraperitoneal
cavity triggers a variety of mediators, such as bradykinin, substance P and prostaglandins, especially
PGI2, as well as some cytokines such as IL-1β, TNF-α and IL-8 [23]. Es-EtOH was able to reduce the
writhing in all doses tested, suggesting that its antinociceptive effect could be related to inhibition of
mediators released in response to acetic acid.
1 3 5
78
9
2
4
6
101 3 5
78
9
2
4
6
10
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 165 um estudo comparativo.
Figure 2. Effect of ethanolic extract of the Encholirium spectabile (Es-EtOH), acetylsalicylic acid
(ASA) and morphine on acetic acid induced writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01,
significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
The extract (100, 200 and 400 mg/kg) injected 60 min before formalin showed a significant
effect to reduce the licking time in both phases of this test. In the first phase (neurogenic pain) the
effects were dose-dependent with percentages of inhibition of 34.14, 52.61 and 60.97%, respectively.
The effect was more significant in the second phase (inflammatory pain), 89.56, 79.90 and 96.71%,
respectively. Similarly, morphine (10 mg/kg) caused significant inhibition of 61.67 and 81.06% of
formalin-induced nociceptive behavior in the first and second phases, respectively. ASA (200 mg/kg)
caused inhibition of 88.79% in the second phase of this test. The results of formalin test are showed in
Figure 3.
The formalin test is believed to represent a significant model of clinical pain. This test allows
the evaluation of two distinct phases. It is known that the first phase is result of the direct chemical
activation of myelenated and unmyelenated nociceptive afferent fibers while the second phase response
is considered as a consequence of noxious stimulus-evoked long term changes in the properties of spinal
dorsal horn neurons [24]. The first phase occurs during the first 5 min after the formalin injection and is
characterized by the direct stimulation of nociceptors presents on afferent C and in part by Aδ fibers
(glutamate and substance P release). The second phase occurs between the 15th and 30
th min after
formalin injection and is putatively caused by the release of pro-inflammatory mediators such as
adenosine, bradykinin, histamine, prostaglandins and serotonin. The results presented in this test
(inhibition of both phases, although higher inhibition was seen in the second phase) suggest that the Es-
EtOH might possess anti-inflammatory activity. The extract exerts its antinociceptive effects connected
with peripheral mechanisms. However, the inhibition presented in the first phase suggests a disruption
of either the production or release of some central neurotransmitters [25].
In another set of experiments, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was injected 30 min before the morphine (10
mg/kg) and Es-EtOH (400 mg/kg). The pre-treatment of animals with naloxone had significant effect on
the antinociception of the first phase. The naloxone reverted the effect caused by morphine in both
phases of formalin-induced licking. At least in part, the antinociceptive effect presented by the extract
may involve the participation of opioid receptors.
0
10
20
30
**
**
**
** **
Control
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Nu
mb
er
of
wri
thin
gs
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 166 um estudo comparativo.
Figure 3. Effect of ethanolic extract of Encholirium spectabile (Es-EtOH), acetylsalicylic acid (ASA),
morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Es-EtOH + NLX (400 mg +
1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different
from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
Using the hot plate test, in a general manner, the administration of the extract did not induce
alterations in the latency time when compared to the control. The hot plate is a method used to
investigate central antinociceptive activity. Interestingly, the extract at the doses which inhibited the
nociception caused by acetic acid and formalin, has no effect on the hot plate test. The effect was
observed only at time of 60 min with a dose of 100 mg/kg. The present study lead us to the conclusion
that the opioid system, at least in part, is involved in the antinociceptive effect of the extract. However,
in this method, the pre-treatment with naloxone, a non-selective opioid receptor antagonist, not reversed
significantly the antinociceptive effect presented by the extract. This could indicate that the effect is
really by peripheral mechanisms. The results are shown in Figure 4.
First phase
0
10
20
30
40
50
60
70
**
**
*
Control
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg** **
Morph + NLX
Es-EtOH + NLX
(a)
Lic
kin
g t
ime (
s)
Second phase
0
25
50
75
100
125
**
****
Control
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
****
Morph + NLX
Es-EtOH + NLX**
(b)
Lic
kin
g t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 167 um estudo comparativo.
Figure 4. Effect of ethanolic extract of Encholirium spectabile (Es-EtOH), morphine, morphine +
naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Es-EtOH + NLX (400 mg + 1.5 mg/kg) on hot plate
test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA
followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
In summary, we demonstrated that the ethanolic extract of Encholirium spectabile exhibit antinociception
when assessed in chemical models of nociception in mice. Novel antinociceptive agents could be discovered
from medicinal plants containing a wide variety of phytoconstituents. The presence of phenolic compounds
in the extract was confirmed using HPLC. The results indicate that Es-EtOH has antinociceptive activity,
probably of peripheral origin. The mechanism involved is not completely understood, at least in part, there is
the participation of opioid receptors. Further research would be of interest to explain the exact mechanism of
this antinociceptive effect.
Acknowledgments
This work was supported by grants from Brazilian agencies CNPq (Process 476770/2010-6) and
FACEPE (Process APQ-0542-4.03/10).
Supporting Information
Supporting Information accompanies this paper on http://www.acgpubs.org/RNP
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30 60 90 1200
5
10
15
20Control
Es-EtOH 100 mg/kg
Es-EtOH 200 mg/kg
Es-EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Es-EtOH + NLX
***
** ****
Time (min)
Late
ncy t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 168 um estudo comparativo.
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© 2012 Reproduction is free for scientific studies
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 169 um estudo comparativo.
APENDICE D – Artigo IV
Artigo IV:
PHENOLIC CONTENT, ANTIOXIDANT AND ANTINOCICEPTIVE
PROPERTIES AND ACUTE TOXICITY OF ETHANOLIC EXTRACT OF
Bromelia laciniosa (BROMELIACEAE)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 170 um estudo comparativo.
ARTIGO IV
Artigo submetido à:
Revista: Journal of Medicinal Food
Título: Phenolic Content, Antioxidant and Antinociceptive Properties and Acute
Toxicity of Ethanolic Extract of Bromelia laciniosa (Bromeliaceae)
Autores: Sarah R. G. de Lima-Saraiva, Amanda L. Guimarães, Ana P. de Oliveira, Clara R.R.
Santana, Henrique C. C. Saraiva, Juliane C. Silva, José A. de Siqueira-Filho, Patrícia K. F.
Damasceno, Carla R. C. Branco, Alexsandro Branco, Elba Lúcia C. Amorim e Jackson Roberto
G. da S. Almeida
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 171 um estudo comparativo.
Phenolic Content, Antioxidant and Antinociceptive Properties and
Acute Toxicity of Ethanolic Extract of Bromelia laciniosa
(Bromeliaceae)
Sarah R.G. Lima-Saraiva1, Amanda L. Guimarães
2, Ana P. de Oliveira
2, Clara R.R. Santana
2,
Henrique C.C. Saraiva2, Juliane C. Silva
2, José A. de Siqueira-Filho
2, Patrícia K.F.
Damasceno3, Carla R.C. Branco
3, Alexsandro Branco
3, Elba Lúcia C. Amorim
1, Jackson
Roberto G.S. Almeida2,2
1Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Farmácia, 50.740-521, Recife,
Pernambuco, Brazil.
2Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil.
3Laboratório de Fitoquímica, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de
Santana, 44.036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil.
Running title: Pharmacologic effects of Bromelia laciniosa
2 Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, Universidade Federal do Vale do São Francisco,
Postal code: 56.304-205, Petrolina, PE, Brazil. Tel/Fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 172 um estudo comparativo.
ABSTRACT The phenolic content, antioxidant and antinociceptive activity as well as the
acute toxicity of Bromelia laciniosa were evaluated. An HPLC fingerprint of phenolic
compounds was developed and the total phenolics content of extracts was determined by the
Folin-Ciocalteu method. Total flavonoid content also was measured. Antioxidant activities
were evaluated by using DPPH radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching and
compared with ascorbic acid, BHA and BHT. The antinociceptive effects of ethanolic extract
(Bl-EtOH) in mice were carried out using chemical (writhing and formalin) and thermal (hot
plate) models of nociception. The acute toxicity of Bl-EtOH was performed 2.0 g/kg
intraperitoneally and 5.0 g/kg orally in mice. Blood was removed for laboratory analysis of
hematological and biochemical parameters. The AcOEt extract showed better antioxidant
activity than BHT using by DPPH method (IC50 = 6.51 ± 0.14 µg/ml). Bl-EtOH (100, 200 and
400 mg/kg, i.p.) reduced the number of writhing (91.80, 93.44 and 78.68%, respectively) and
the number of paw licks during the first (60.86, 62.84 and 66.79%) and second phase (91.93,
82.18 and 88.73%) of the formalin test. Naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) antagonized the
antinociceptive action of Bl-EtOH (100 mg/kg), and this finding suggests participation of the
opioid system. The effect of Bl-EtOH on hot plate response provides a confirmation of its
central effect. Peripheral, and at least in part, central mechanisms, may be involved in this
antinociceptive effect. The results of acute toxicity support the concept that the ethanolic
extract from leaves is safe for human use.
KEY WORDS: phenolic content, antioxidant activity, antinociceptive activity, acute toxicity,
Bromelia laciniosa, Bromeliaceae.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 173 um estudo comparativo.
INTRODUCTION
The caatinga biome (semi-arid vegetation) is a highly threatened biome covering a vast area in
Northeastern Brazil, and is the source of many little studied natural resources.1 Many medicinal
plants species from the caatinga are widely known and used in folk medicine and for
commercial manufacturing of phytotherapeutic products. Few ethnobotanical and
pharmacological studies have been undertaken in this region, however, in spite of the great
cultural and biological diversity to be found there.2 In the Brazilian Northeastern, the caatinga
has fundamental importance in the lives of people that inhabit this region because it offers a
wide variety of animals and plants that are used for food, fuel, building materials and medicinal
purposes.3
The Bromeliaceae, one of the largest botanical families of the New World, is distributed
extensively in tropical America.4 This family comprises 58 genera and 3172 species.
5
Considering the large number of species of the Bromeliaceae family few have been studied
chemically so far. Despite this, there is a considerable amount of identified compounds, which
mostly belong to the class of triterpenoid and flavonoids. Other classes of compounds such as
sterols, diterpenes, cinnamic acids, glycerol replaced, lignans, nitrogen compounds, among
others, were also identified in this family, although greatly reduced in number. From the
pharmacological standpoint, there are also few studies in the literature.6
Some studies have demonstrated that species of the Bromeliaceae family have pharmacological
properties such as antioedematogenic and free radical scavenging7, antinociceptive and anti-
inflammatory8, anti-allergic
9, antiulcer
10, cytotoxic
11, antioxidant and antimycobacterial
activities.12
Bromelia is one of the most diverse genera within Bromeliaceae and includes 56
species.5 Some species of this genus are used in traditional medicine as a vermifuge, anti-
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 174 um estudo comparativo.
helmintic, diuretic, in cases of respiratory and kidney problems, intestinal disorders, diabetes,
among others.13
Bromelia antiacantha is one of the most studied species.14
Bromelia laciniosa is a species native to the Brazilian Caatinga. This species is known in the
Northeast Region of Brazil as “macambira” and is used in the alimentation of man and
domestic animals, especially in times of drought.15
From the base of the leaves is extracted a
mass, which is produces a type of bread.16
The main therapeutic indications are for treat child
colic, diarrhea, fever, jaundice, dandruff and hepatitis.2 The decoction of the roots is also
popularly used against hepatitis and intestinal disorders, as a diuretic, while the dried and
powdered leaves are used in cooking as a source of protein.6,13
Considering the popular use and because of the scarcity of chemical and pharmacological
studies about this species, this study evaluated the phenolic content, antioxidant and
antinociceptive activities as well as the acute toxicity of the ethanolic extract from leaves of
Bromelia laciniosa in mice.
MATERIAL AND METHODS
Plant material
The leaves of Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f. were collected in the city of Petrolina,
State of Pernambuco, Brazil, in January of 2011. The samples were identified by André
Paviotti Fontana, a botanist from Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga
(CRAD). A voucher specimen (6442) was deposited at the Herbarium of São Francisco Valley,
of the Federal University of São Francisco Valley.
Preparation of extracts
The leaves of B. laciniosa dried and pulverized (874 g), were subjected to maceration with 95%
EtOH for 72 hours. The solution was filtered and concentrated in a rotatory evaporator oven at
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 175 um estudo comparativo.
50 oC, producing 39 g of crude ethanol extract (Bl-EtOH). For the evaluation of antioxidant
activity, the ethanolic extract was suspended in MeOH:H2O (3:7) and partitioned with hexane,
chloroform (CHCl3) and ethyl acetate (AcOEt) in crescent order of polarity to obtain the
respective extracts.
Chemicals
Folin-Ciocalteu reagent, catechin, β-carotene, butylated hydroxyanisole (BHA) and butylated
hydroxytoluene (BHT) were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) was purchased from Fluka. Ascorbic acid was purchased
from Dinâmica, Brazil. Linoleic acid and gallic acid were obtained from Vetec, Brazil.
Recordings were made in a UV-VIS Spectrometer QUIMIS, Brazil. Acetic acid and
formaldehyde were purchased from Vetec, Brazil. Polyoxyethylenesorbitan monolate (Tween
80) and acetylsalicylic acid were purchased from Sigma. Morphine and naloxone were
purchased from União Química. All reagents and solvents were of analytical grade.
Analysis of Bl-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)
The analysis of phenolic compounds profile were performed in liquid chromatograph Hitachi
model Lachrom Elite, colunm LiCospher 100 RP18 (5 mm) with dimensions (150 mm x 04
mm) Merck equipped with Diode Array Detector (DAD). The mobile phase used was a
solution of H2O/H3PO4 0.1% (A) and MeOH (B) provided initial 75% of A and 25% of B for
25 minutes. The column temperature was kept constant at 30 °C with a flow of 1.0 ml/min. For
the extract was used an injection volume of 20 μl. Spectral data were recorded in 322 nm
during the whole run.
Total phenolic content
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 176 um estudo comparativo.
Total phenolic contents were assayed using the Folin-Ciocalteu reagent, it is based on the
method reported by Slinkard and Singleton17
, only the volumes have been adjusted.18
An
aliquot (40 μl) of a suitable diluted extracts was added to 3.16 ml of distilled water and 200 μl
of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. The mixture was shaken and allowed to stand for
6 min, before adding 600 μl of sodium carbonate solution, and shake to mix. The solutions
were left at 20 °C for 2 hours and the absorbance of each solution was determined at 765 nm
against the blank and plot absorbance vs. concentration. Total phenolic contents of the extracts
(three replicates per treatment) were expressed as mg gallic acid equivalents per gram (mg
GAE/g) through the calibration curve with gallic acid. The calibration curve range was 50-1000
mg/l (R² = 0.9938). All samples were performed in triplicates.
Total flavonoid content
Total flavonoid content was measured by the aluminum chloride colorimetric assay.19
An
aliquot (300 µl) of Bl-EtOH, ethyl acetate extract or standard of catechin was added to flask
containing 1.5 ml of distilled water. To the flask was added 90 µl NaNO2 (5%). After 6 min,
180 µl AlCl3 (10%) was added. After 5 min, 600 µl 1M NaOH was added and the total volume
was made up with 330 µl of distilled water. The solution was mixed well and the absorbance
was measured against prepared reagent blank at 510 nm. Total flavonoid contents were
expressed as mg catechin equivalents per gram (mg CE/g) through the calibration curve with
catechin. The calibration curve range was 50-1000 mg/L (R² = 0.9784). All samples were
performed in triplicates.
DPPH Free Radical Scavenging Assay
The free radical scavenging activity was measured using the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazil
(DPPH) assay.20,21
Sample stock solutions (1.0 mg/ml) of the extracts were diluted to final
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 177 um estudo comparativo.
concentrations of 243, 81, 27, 9, 3 and 1 µg/ml, in ethanol. One ml of a 50 µg/ml DPPH
ethanol solution was added to 2.5 mL of sample solutions of different concentrations, and
allowed to react at room temperature. After 30 min the absorbance values were measured at
518 nm and converted into the percentage antioxidant activity (AA) using the following
formula: AA% = [(absorbance of the control – absorbance of the sample)/ absorbance of the
control] x 100. Ethanol (1.0 ml) plus plant extracts solutions (2.5 ml) were used as a blank.
DPPH solution (1.0 ml) plus ethanol (2.5 ml) was used as a negative control. The positive
controls (ascorbic acid, BHA and BHT) were those using the standard solutions. Assays were
carried out in triplicate.
β-Carotene Bleaching Test
The β-carotene bleaching method is based on the loss of the yellow colour of β-carotene due to
its reaction with radicals formed by linoleic acid oxidation in an emulsion.22
The rate of β-
carotene bleaching can be slowed down in the presence of antioxidants. β-carotene (2 mg) was
dissolved in 10 ml chloroform and to 2 ml of this solution, linoleic acid (40 mg) and Tween 40
(400 mg) were added. Chloroform was evaporated under vacuum at 40 ºC and 100 ml of
distilled water was added, then the emulsion was vigorously shaken during two minutes.
Reference compounds (ascorbic acid, BHA and BHT) and sample extracts were prepared in
ethanol. The emulsion (3.0 ml) was added to a tube containing 0.12 ml of solutions 1 mg/ml of
reference compounds and sample extracts. The absorbance was immediately measured at 470
nm and the test emulsion was incubated in a water bath at 50 ºC for 120 min, when the
absorbance was measured again. Ascorbic acid, BHA and BHT were used as positive control.
In the negative control, the extracts were substituted with an equal volume of ethanol. The
antioxidant activity (%) was evaluated in terms of the bleaching of the β-carotene using the
following formula: % Antioxidant activity = [1 - (A0 – At) / (A00 – At
0)] x 100; where A0 is the
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 178 um estudo comparativo.
initial absorbance and At is the final absorbance measured for the test sample, A00
is the initial
absorbance and At0
is the final absorbance measured for the negative control (blank). The
results are expressed as percentage of antioxidant activity (% AA). Tests were carried out in
triplicate.
Animals
Male and female adult albino Swiss mice (25-35 g and aged 8-10 weeks), were used throughout
this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/
dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with free access to food and water. When necessary, animals
were deprived of food 12 h prior to the experiments. Experimental protocols and procedures
were approved by the Federal University of Vale do São Francisco Animal Care and Use
Committee by number 21051023.
Acetic acid-induced writhing in mice
This test was performed as described by Koster et al.23
with modifications. Mice (n=6) were
intraperitoneally pre-treated 30 min before the nociceptive agent, acetic acid 0.9% (v/v, 10
ml/kg). Vehicle (saline), Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg, body weight), acetylsalicylic acid
(ASA, 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered before acetic acid injection.
Following the injection of acetic acid, the intensity of nociceptive behavior was quantified by
counting the total number of writhes (a response consisting of contraction of the abdominal
wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after
stimulus injection.24
Formalin test
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 179 um estudo comparativo.
The method used was similar to that described previously.25
Twenty microlitres of 2.5%
formalin was injected subcutaneously into the right hind paw of mice. The time (in seconds)
spent in licking and biting responses of the injected paw was taken as an indicator of pain
response. Responses were measured for 5 min after formalin injection (first phase, neurogenic
phase) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory phase). Bl-EtOH
(100, 200 and 400 mg/kg), ASA (200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) were administered
intraperitoneally 60 min before formalin injection. Control animals received the same volume
of saline. Mice were observed in the chambers with a mirror mounted on three sides to allow
view of the paws.
Hot plate test
Mice were pre-selected on the hot plate at 55 ± 0.5 oC. Licks on the rear paws were the
parameters of observation. Animals showing a reaction time (latency for licking the hind feet or
jumping) greater than 20 s were discarded. The animals were then treated with vehicle (saline,
0.1 ml/10 g), morphine (10 mg/kg) and Bl-EtOH (100, 200 and 400 mg/kg) via i.p. Latency
time (in seconds) for each mice was determined on the hot plate during the maximum period of
20 s, at intervals of 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the extract.26
Acute toxicity
In the inquiry of the acute toxicity, animals were randomly divided in groups of five male and
five female Swiss mice (n=10). Animals were administered intraperitoneally 2.0 g/kg and 5.0
g/kg orally of the crude ethanol extract of Bromelia laciniosa. Control group received vehicle.
Subsequently, the animals were observed for 14 days to evaluate the presence of signs of
toxicity. Mortality in each group within 72 h was recorded. LD50 was estimated by the method
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 180 um estudo comparativo.
described by Litchfield & Wilcoxon.27
Were assessed daily throughout the study the parameters
of body weight variation, consumption of food and water.
Behavioral screening
The behavioral screening of the mice was performed following parameters described by
Almeida et al.28
The animals were observed at 0.5, 1, 2, 3 and 4 h after administration of Bl-
EtOH. Specific behaviors (piloerection, palpebral ptosis, abdominal contortions, locomotion,
hypothermia, muscular tonus, trembling, forepaws paralysis, sedation, ambulation reduction,
response to touch, analgesia and defecation) were observed and graded).
Hematological and biochemical parameters analysis of blood
For the evaluation of hematological and biochemical parameters of blood was utilized the
methodology described by Vasconcelos et al.29
and Araújo et al.30
with modifications. Blood
was removed after 14 days through brachial plexus for laboratory analysis of hematological
parameters: count of erythrocytes (106/mm
3), hemoglobin (g/dL), hematocrit (%), the mean
corpuscular volume (MCV, μ3), the mean corpuscular hemoglobin (MCH, μg), the mean
corpuscular hemoglobin concentration (MCHC, %), leukocytes (103/mm
3), lymphocites (%)
and platelets (103/mm
3). The biochemical parameters analyzed in serum samples were
triglycerides (mg/dL), AST/TGO (U/L), ALT/TGP (U/L), urea (mg/dL) and creatinine
(mg/dL). For the determination of hematological parameters was used hematology analyser
Sysmex XT-2000, for the biochemical parameters was used an automatic analyser Wiener BT
3000 Plus.
Statistical analysis
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 181 um estudo comparativo.
The data obtained were analyzed using the GraphPad Prism® version 4.0 and expressed as
mean ± S.E.M or mean ± S.D. as appropriate. Statistically significant differences between
groups were calculated by the application of Student’s t-test. For animal experiments,
significant differences between groups were calculated by the application of analysis of
variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test. Values were considered significantly different
at p < 0.05.
RESULTS
Analysis of Bl-EtOH by high performance liquid chromatography (HPLC)
Phenolic profiles at 320 nm for the Bl-EtOH evaluated are presented in Figure 1. The
chromatogram shows the presence of nine peaks with different retention times: 11.79 (1), 14.44
(2), 15.44 (3), 15.57 (4), 16.67 (5), 17.62 (6), 18.09 (7), 19.01 (8) and 19.89 (9). Based on their
UV-Vis spectral data and their retention time, the compounds have UV band characteristic for
coumarin and flavonoid derivatives. These compounds are under investigation.
INSERT FIGURE 1
Total phenolic, total flavonoid contents and antioxidant activity
Table 1 summarizes the results from the quantitative determination of phenolic (TP) and
flavonoids (TF) as well as the effect of extracts from Bromelia laciniosa, ascorbic acid, BHA
and BHT on the DPPH free radical scavenging and β-carotene-linoleic acid bleaching test. The
extracts were evaluated by comparing with ascorbic acid, BHA and BHT, which are well-
known commercial antioxidants.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 182 um estudo comparativo.
INSERT TABLE 1
The total phenolic contents of the extracts were determined by Folin-Ciocalteu method as gallic
acid equivalents in milligrams per gram (mg GAE/g) while total flavonoid contents were
calculated as catechin equivalents in milligrams per gram (mg CE/g). Among the four extracts,
ethyl acetate extract (AcOEt) was containing highest (234.00 ± 67.15) amount of phenolic
compounds followed by CHCl3 extract (181.40 ± 12.78) and crude ethanol extract (50.26 ±
1.28). For the total flavonoid content, the highest value was observed in AcOEt extract (101.70
± 4.89) while the crude ethanol extract (EtOH) presented 10.07 ± 6.23 mg CE/g.
In the present study, the antioxidant ability of the B. laciniosa extracts was investigated through
some in vitro models such as radical scavenging activity using, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH) method and β-carotene-linoleate model system. Antioxidant activity on method of
DPPH was expressed as IC50 which is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a
maximum effect estimate in 100%. Lower IC50 value indicated higher antioxidant activity. In β-
carotene-linoleate model system the antioxidant activity was expressed as percentage of
antioxidant activity (%AA).
The data showed that the AcOEt and CHCl3 extracts exhibited excellent free radical scavenging
activity. The AcOEt extract showed better antioxidant activity than BHT using by DPPH
method, with a value of IC50 of 6.51 ± 0.14 µg/ml. BHA was the most effective antioxidant,
with a value of IC50 of 2.11 ± 0.13 µg/ml. It appears that B. laciniosa have compounds with a
strong hydrogen-donating capacity and can efficiently scavenge DPPH radicals.
The antioxidant activity of extracts was also evaluated by the β-carotene/linoleate bleaching
method. This method is one of the antioxidant assays suitable for plant extracts. All extracts
had lower antioxidant activity than BHT and BHA.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 183 um estudo comparativo.
Acetic acid-induced writhing in mice
Bl-EtOH significantly reduced writhing and stretching induced by 0.9% acetic acid. The
significant protective effects were observed as 91.80, 93.44 and 78.68% (p < 0.01) at 100, 200
and 400 mg/kg of the extract, respectively, while ASA (200 mg/kg) had 95.08%. Morphine (10
mg/kg) abolished the nociceptive response (Fig. 2).
INSERT FIGURE 2
Formalin test
Bl-EtOH had analgesic effects on both the first (0-5) and second phase (15-30) of
formalin-induced pain. These phases corresponded to neurogenic and inflammatory pains,
respectively. The result was most significative in the inflammatory phase. Bl-EtOH (100, 200
and 400 mg/kg, i.p.) decreased by 60.86, 62.84 and 66.79%, respectively, the paw licking time
in the first phase, as well as 91.93, 82.18 and 88.73%, respectively, in the second phase of the
formalin test (Fig. 3). The treatment with acetylsalicylic acid and morphine was also able to
inhibit the first and second phases. The pretreatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed
the antinociceptive activity of the extract at dose of 100 mg/kg in the first phase of this test.
The effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone. The results suggest a
possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.
INSERT FIGURE 3
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 184 um estudo comparativo.
Hot plate test
Figure 4 shows the results of the hot plate test. The reaction time parameter was only
significantly increased at a dose of 100 mg/kg in 60 min. The effect of morphine was reverted
by naloxone.
INSERT FIGURE 4
Acute toxicity
In the acute toxicity of Bl-EtOH, behavioral and physiological alterations were not observed
neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally,
respectively, indicating low toxicity of the extract. The administration of the extract did not
cause any appreciable alterations in water and food intake in any of the groups. Moreover, body
weight gain during the observation period among the treated animals with 5 g/kg v.o. was
statistically different when comparable to control group (Fig. 5).
INSERT FIGURE 5
Behavioral screening
The animals did not display significant changes in behavior. The animals did not show any sign
of toxicity or change in behavioral or other physiological activities.
Hematological and biochemical parameters analysis of blood
The administration of intraperitoneal and oral doses of Bl-EtOH did not cause
erythrocyte, hemoglobin, hematocrit, MCV, MCH, MCHC, leukocytes, lymphocites and
platelets level to change (Table 2).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 185 um estudo comparativo.
INSERT TABLE 2
Likewise, the values of triglycerides, AST/GOT, ALT/GPT and urea (mg/dL) showed no
significant changes. However, a significant decrease in the creatinine in the group treated with
5 g/kg by oral rout was observed when compared to the control group (Table 3).
INSERT TABLE 3
DISCUSSION
The present study showed that the ethanolic extract of Bromelia laciniosa has phenolic
compounds, which are possibly responsible for their antioxidant and antinociceptive properties.
An HPLC fingerprint of phenolic compounds was developed and total phenolics through Folin-
Ciocalteau method and total flavonoids were evaluated. Numerous publications applied the
total phenols assay often found excellent linear correlations between the total phenolic profiles
and the antioxidant activity.
The antioxidant activity of the extracts of B. laciniosa by assessment of their capacity to
scavenge the DPPH radical was carried out. DPPH radical is a stable chromogen (purple)
radical with maximum absorption ranging from 515 to 517 nm, which can readily undergo
reduction by an antioxidant leading to its discoloration. The degree of color change is
proportional to the concentration and potency of the antioxidants. Because of the ease and
convenience of this reaction it has been used to free radical-scavenging activity assessment of
several kinds of samples.20
The data showed that the AcOEt extract exhibited excellent free radical scavenging activity.
The AcOEt extract showed better antioxidant activity than BHT using by DPPH method, with a
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 186 um estudo comparativo.
value of IC50 of 6.51 ± 0.14 µg/ml. Previous study investigated the antiradical potential of
twenty different extracts from six Brazilian Bromeliaceae species.31
In a general way, the polar
rhizome extracts from Bromeliaceae representatives showed better antioxidant results than the
extracts from leaves and fruits of the same species. B. laciniosa may be considered a good
source of antioxidant compounds.
In the β-carotene bleaching assay, linoleic acid produces hydroperoxides as free radicals during
incubation at 50 °C. The presence of antioxidants in the extracts minimizes the oxidation of β-
carotene by hydroperoxides. The degradation rate of β-carotene-linoleate depends on the
antioxidant activity of the samples being analyzed. There was a correlation between
degradation rate and the bleaching of β-carotene, the extract with the lowest β-carotene
degradation rate exhibited the highest antioxidant activity.32
All extracts showed lower
antioxidant activity than BHT and BHA.
Bromelia laciniosa showed antinociceptive activity in different nociceptive responses
generated by a chemical or thermal noxious stimulus. The first test to evaluate the
antinociceptive activity of Bl-EtOH was the writhing induced by acetic acid. Acetic acid-
induced writhing is a standard, simple, and sensitive test for measuring analgesia induced by
both opioids and peripherally acting analgesics. Additionally, although this test is a nonspecific
model (e.g. anticholinergic and antihistaminic and other agents show activity in this test) it is
widely used for analgesic screening and involves local peritoneal receptors (cholinergic and
histaminic receptor).33
Bl-EtOH significantly reduced the acetic acid-induced writhing in mice.
These results support the hypothesis of Bl-EtOH participation in the inhibition of prostaglandin
synthesis, as the nociceptive mechanism involves the process or release of arachidonic acid
metabolites via cyclooxygenase (COX), prostaglandin biosynthesis or other peripherally
pathway.34
A positive result with this test is indicative of antinociceptive activity in the extract
under investigation, which may be of central or peripheral origin.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 187 um estudo comparativo.
In order to distinguish between the central and peripheral antinociceptive action, the formalin
test was performed. Subcutaneous injection of formalin into the animal hind paw evokes an
array of stereotyped behaviors. The nociceptive response to formalin occurs in a biphasic
pattern; there is an initial acute period (phase 1) and, after a short period of remission, phase 2
begins and consists of a longer period of sustained activity. The phase 1 corresponds to acute
nociceptive neurogenic pain, and is sensitive to analgesic drugs that interact with opioid
system. The phase 2 corresponds to an inflammatory pain, dependent of several inflammatory
mediators release and action, and the expression of nociceptive behavior in this phase is very
sensitive to non-steroid anti-inflammatory drugs as the cyclooxygenase inhibitors. Drugs that
act primarily as central analgesics inhibit both phases while peripherally acting drugs inhibit
only the second phase.35
The extract was able to block both phases of the formalin response
although the effect was more pronounced in the second phase. The effect of extract on the first
and second phases of formalin test suggests that its activity may be resulted from its central
action when compared with morphine activity in this respect. The pre-treatment with naloxone
reversed the antinociceptive activity of the extract in the first phase of this test. The results
suggest a possible involvement of opioid receptors in the antinociceptive effect of the extract.
The evaluation of Bl-EtOH on hot plate response show that, in general, the extract did not
present effect in the hot plate test, the extract increase the latency time only at dose of 100
mg/kg after 60 minutes. As the hot plate test is a specific central antinociceptive test, it is
possible that Bl-EtOH exert their antinociceptive effect at least in part through central
mechanisms, as observed in the formalin test by inhibition of both phases of the test.
The use of medicinal plants has been very significant in several populations, especially in the
Northeast of Brazil. However, the popular or traditional uses are not sufficient to validate the
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 188 um estudo comparativo.
herbal medicines as effective and safety. It is necessary to carry out toxicological studies to
evaluate safety parameters which are not observed by the popular use of these plants.36
The tests for acute toxicity of Bl-EtOH did not demonstrate signs of lethality in mice at doses
tested. A 2.0 and 5.0 g/kg body weight administered by via intraperitoneal and oral,
respectively, dose were considered as the “limit test”, as recommended by acute toxicity testing
procedures.29,30
In the acute toxicity of Bl-EtOH, behavioral and physiological alterations were
not observed neither animal’s death in the doses of 2.0 g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg
orally, respectively, indicating low toxicity of the extract. In this experiment was observed that
the Bl-EtOH has LD50 > 5000 mg/kg. According to Kennedy et al.37
, substances that present
LD50 higher than 5.0 g/kg by oral route can be considered practically non-toxic.
There was no significant variation in hematological parameters in the groups treated with the
extract compared to control. In regard to biochemical parameters a significant decrease in the
creatinine in the group treated with 5 g/kg by oral rout was observed when compared to the
control group. Creatinine is a good indicator of kidney function. Alterations in their levels
suggest alterations in this organ. Histopathological analysis of the kidneys revealed that the
histological structure of renal tubules showed preserved (data not shown).
CONCLUSION
In conclusion, the present work indicates that Bromelia laciniosa is a source of phenolic
compounds and exhibit antioxidant and antinociceptive properties. Peripheral and, at least in
part, central mechanisms may be involved in the antinociceptive effect. Further studies
currently in progress will enable as to understand the mechanisms of action underlying the
effects observed in this investigation. The results obtained so far show that the plant is non-
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 189 um estudo comparativo.
toxic at the doses used because there was no death or alterations of hematological and
biochemical parameters. The results of the present study support the concept that the ethanolic
extract from leaves is safe for human use.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from Brazilian agencies CNPq (Process 476770/2010-6)
and FACEPE (Process APQ-0542-4.03/10). The authors wish to express their thanks to Centro
de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD/UNIVASF) for collection and
botanical identification of the plant material.
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LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 195 um estudo comparativo.
FIG. 1. High performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD)
profiles of Bromelia laciniosa ethanolic extract recorded at 320 nm.
1
2 3 4
5
67
8
9
1
2 3 4
5
67
8
9
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 196 um estudo comparativo.
FIG. 2. Antinociceptive activity of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH 100, 200 and 400 mg/kg),
acetylsalicylic acid (ASA 200 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) on acetic acid induced
writhing test. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01, significantly different from control;
ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 197 um estudo comparativo.
FIG. 3. Effect of ethanolic extract of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), acetylsalicylic acid
(ASA), morphine, morphine + naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Bl-EtOH +
NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01,
significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
First phase
0
10
20
30
40
50
60
** **
Control
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg****
* *
Morph + NLX
Bl-EtOH + NLX
(a)
Lic
kin
g t
ime (
s)
Second phase
0
50
100
150
**** **
Control
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
ASA 200 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
****
** Morph + NLX
Bl-EtOH + NLX
(b)
Lic
kin
g t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 198 um estudo comparativo.
FIG. 4. Effect of ethanolic extract of Bromelia laciniosa (Bl-EtOH), morphine, morphine +
naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Bl-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on
hot plate test. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from
control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).
30 60 90 1200
5
10
15
20Control
Bl-EtOH 100 mg/kg
Bl-EtOH 200 mg/kg
Bl-EtOH 400 mg/kg
Morphine 10 mg/kg
Morph + NLX
Bl-EtOH + NLX
**
***
**
**
**
Time (min)
Late
ncy t
ime (
s)
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 199 um estudo comparativo.
FIG. 5. Body weight gain for animals treated with Bl-EtOH during 14 days (n= 10).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 200 um estudo comparativo.
TABLE 1. Total phenolics (TP), total flavonoids (TF) and antioxidant activity of extracts from
Bromelia laciniosa.
TP (mg GAE/g) TF (mg CE/g) DPPH (IC50,
µg/ml)
β-carotene
bleaching (% AA)
EtOH 50.26 ± 1.28 10.07 ± 6.23 61.04 ± 1.63 46.97± 1.01
Hexane 1.81 ± 0.514 --- > 243 59.53 ± 6.53
CHCl3 181.40 ± 12.78 --- 28.66 ± 0.81 53.14 ± 0.95
AcOEt 234.00 ± 67.15 101.70 ± 4.89 6.51 ± 0.14 46.08 ± 4.89
Ascorbic acid --- --- 2.43 ± 0.27 9.26 ± 1.66
BHA --- --- 2.11 ± 0.13 80.92 ± 3.45
BHT --- --- 7.24 ± 0.49 86.77 ± 1.14
The IC50 values were obtained by interpolation from linear regression analysis with 95% of
confidence level. IC50 is defined as the concentration sufficient to obtain 50% of a maximum
effect estimate in 100%. Values are given as mean ± SD (n=3).
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 201 um estudo comparativo.
TABLE 2. Hematological parameters of blood of Swiss mice treated with 2.0 g/kg
intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Bromelia laciniosa after 14
days (acute toxicity).
Parameters Groups
Control After 2 g/kg i.p. After 5 g/kg v.o.
Erythrocytes (106/mm
3) 8.05 ± 0.49 8.43 ± 0.15 8.09 ± 0.09
Hemoglobin (g/dL) 13.40 ± 0.91 12.88 ± 0.68 13.06 ± 0.27
Hematocrit (%) 42.41 ± 2.48 43.33 ± 1.25 42.84 ± 0.40
MCV (μ3) 52.60 ± 1.36 51.88 ± 0.45 52.86 ± 0.46
MCH (μg) 16.60 ± 0.22 16.43 ± 0.18 16.78 ± 0.15
MCHC (%) 31.69 ± 0.83 31.88 ± 0.34 32.06 ± 0.40
Leukocytes (103/mm
3) 6.25 ± 0.57 5.88 ± 0.41 6.97 ± 0.59
Lymphocites (%) 88.93 ± 5.36 88.53 ± 1.08 88.55 ± 1.35
Platelets (103/mm
3) 883.70 ± 108.30 856.90 ± 71.14 911.30 ± 73.18
Values are mean ± S.E.M, n = 8. Student’s t-test at 5 % probability.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 202 um estudo comparativo.
TABLE 3. Biochemical parameters obtained from the serum of Swiss mice treated with 2.0
g/kg intraperitoneally and 5.0 g/kg orally of crude ethanol extract of Bromelia laciniosa after
14 days (acute toxicity).
Parameters Groups
Control After 2 g/kg i.p. After 5 g/kg v.o.
Triglycerides (mg/dL) 133.30 ± 5.57 111.17 ± 15.21 141.80 ± 14.14
AST/GOT (U/L) 123.10 ± 11.23 111.70 ± 25.05 116.70 ± 12.61
ALT/GPT (U/L) 75.29 ± 8.58 60.23 ± 8.08 66.30 ± 7.22
Urea (mg/dL) 66.44 ± 4.40 65.89 ± 6.16 67.56 ± 4.84
Creatinine (mg/dL) 0.36 ± 0.01 0.42 ± 0.11 0.26 ± 0.02**
Values are mean ± S.E.M, n = 8. **p < 0.01; Student’s t-test at 5 % probability.
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 203 um estudo comparativo.
ÃNEXOS
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 204 um estudo comparativo.
ANEXO A – Carta de submissão dos artigos
Carta A
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 205 um estudo comparativo.
Carta B
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 206 um estudo comparativo.
Carta C
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 207 um estudo comparativo.
Carta D
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 208 um estudo comparativo.
ANEXO B – Tabela de triagem comportamental
Triagem Farmacológica (Modelo retirado de Almeida et al., 1999)
PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____
VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________
RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________
ATIVIDADE FARMACOLÓGICA
Quantificação dos efeitos
(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso
até 30` 1h 2h 3h 4h
1 - SNC
a - Estimulante
Hiperatividade
Irritabilidade
Agressividade
Tremores
Convulsões
Piloereção
Movimento intenso das vibrissas
Outras_____________________
b - Depressora
Hipnose
Ptose
Sedação
Anestesia
Ataxia
Reflexo do endireitamento
Catatonia
Analgesia
Resposta ao toque diminuído
Perda do reflexo corneal
Perda do reflexo auricular
c - Outros comportamentos
Ambulação
Bocejo excessivo
Groming
Rearing
Escalar
Vocalizar
Sacudir a cabeça
Contorções abdominais
Abdução das patas do trem posterior
Pedalar
Estereotipia
2 - SN AUTÔNOMO
Diarréia
Constirpação
Defecação aumentada
Respiração forçada
Lacrimejamento
Micção
Salivação
Cianose
Tono muscular
Força para agarrar
3 - MORTE
obs.:_________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 209 um estudo comparativo.
ANEXO C – Certificado de aprovação do comitê de ética
LIMA-SARAIVA, S.R.G. Efeito antinociceptivo de espécies de Bromeliaceae nativas da caatinga: 210 um estudo comparativo.
ANEXO D – Certificados.
Certificado A
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