UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLOGICAS
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE 4-((1-
FENIL-1H-PIRAZOL-4-IL) METIL) PIPERAZINA-1-CARBOXILATO: UM
NOVO DERIVADO PIPERAZÍNICO
DAIANY PRISCILLA BUENO DA SILVA
GOIÂNIA-GO
2015
I
DAIANY PRISCILLA BUENO DA SILVA
ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE 4-((1-
FENIL-1H-PIRAZOL-4-IL) METIL) PIPERAZINA-1-CARBOXILATO: UM
NOVO DERIVADO PIPERAZÍNICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Biológicas do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás, como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas.
Área de Concentração: Farmacologia e Fisiologia
Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa
GOIÂNIA-GO
2015
II
Dedicatória
Aos meus pais, Lianeide dos Santos Bueno e Paulo Sérgio da Silva, pelo amor incondicional, confiança e incentivo.
Aos meus avós, Nelita Francisca Bueno e João
Barbosa da Silva, por todo amor, carinho e
cuidado.
III
Agradecimentos
A Deus pelas inúmeras bênçãos concedidas a mim e por estar sempre ao meu lado,
guiando meus passos.
Ao professor Xico por ter aceitado me orientar, pela confiança em mim depositada,
pelos valiosos ensinamentos, pela paciência e, acima de tudo, pelo carinho e
amizade.
Ao professor Ricardo Menegatti por sintetizar e fornecer o composto LQFM-008,
pela constante disposição em ajudar e por todo conhecimento oferecido para o
desenvolvimento desta pesquisa.
As doutorandas Iziara Ferreira Florentino e Pablinny Moreira Galdino pela amizade,
conselhos, incentivo e pela boa vontade em transmitir seus conhecimentos a mim,
os quais foram extremamente importantes para a minha formação científica e para o
desenvolvimento deste estudo.
A mestre Lanussy Porfiro de Oliveira pela amizade, conselhos, conhecimentos
compartilhados e pela contribuição na execução dos experimentos.
Aos demais amigos do Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais (LFPN)
Danillo Oliveira, Dayane Moreira, James O. Fajemiroye, José Luís Rodrigues
Martins, Oscar Romero, Patrícia Vasconcelos, Roberta Campos pelos bons
momentos vividos em equipe, pelos conhecimentos compartilhados, pela paciência,
alegrias e conquistas.
A todos os professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas que contribuíram para minha formação científica.
Aos meus pais, Lianeide dos Santos Bueno e Paulo Sérgio da Silva, pelo amor
incondicional, conselhos, sacrifícios e por sempre me incentivarem a correr atrás dos
meus objetivos. Amo muito vocês.
IV
Aos meus avós Nelita Francisca Bueno e João Barbosa da Silva pelo amor, carinho,
cuidados e por sempre estarem dispostos a me ajudar no que for preciso.
Aos meus irmãos Sérgio Augusto Bueno da Silva, Kamila Bueno Silva e Paula
Fernandes da Silva pelo amor, carinho e paciência.
A toda minha família linda pelo amor, incentivo e boas vibrações a cada conquista
alcançada.
As minhas queridas amigas Allana Souza, Amanda Menezes, Ariane Borges, Juliana
Alves Lillia Rose e Nathanne Ciriaco, pelos conselhos, carinho e por estarem
sempre ao me lado me incentivando e me ensinando a ser uma pessoa melhor.
A Dra. Ekaterina A. F. B. Rivera e Lucas B. Nascimento pela assistência ética e
técnica.
Aos animais do laboratório, pois sem eles não seria possível desenvolver esta
pesquisa.
V
“Cada sonho que você deixa pra trás é um pedaço do seu futuro que deixa de existir”.
Steve Jobs
VI
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Siglas...................................................................... IX
Lista de Figuras.............................................................................................. XIV
Lista de Tabelas............................................................................................. XVI
Resumo........................................................................................................... XVII
Abstract........................................................................................................... XVIII
1. Introdução................................................................................................... 1
1.1 Inflamação.................................................................................................. 2
1.1. Dor............................................................................................................ 9
2. Justificativa................................................................................................ 20
3. Objetivos..................................................................................................... 23
3.1. Objetivo geral................................................................................................ 24
3.2. Objetivos específicos.................................................................................... 24
4. Materiais e Métodos....................................................................................... 25
4.1. Síntese do LQFM-008............................................................................... 26
4.2. Animais..................................................................................................... 26
4.3. Fármacos e Reagentes................................................................................ 26
4.4. Métodos farmacológicos usados para avaliar o composto LQFM-008..... 27
4.4.1. Avaliação da atividade antinociceptiva.................................................. 27
4.4.1.1. Teste da dor Induzida pela Formalina................................................. 27
4.4.2. Avaliação da atividade anti-inflamatória 27
VII
4.4.2.1. Edema de pata induzido por carragenina 27
4.4.2.2. Pleurisia induzida por carragenina...................................................... 28
4.4.3. Testes para avaliar o efeito antinociceptivo central ............................. 28
4.4.3.1. Teste da Flexão de cauda................................................................... 28
4.4.3.2. Teste da Placa Quente........................................................................ 29
4.4.4. Testes para avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na
atividade antinociceptiva de LQFM-008........................................................... 29
4.4.4.1. Avaliação do envolvimento dos receptores opióides no efeito de
LQFM-008........................................................................................................ 29
4.4.4.2. Avaliação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no
efeito do LQFM-008......................................................................................... 30
4.4.4.3. Avaliação do envolvimento da serotonina endógena no efeito do
LQFM-008........................................................................................................ 31
4.5. Análise estatística..................................................................................... 31
5. Resultados.................................................................................................. 32
5.1. Atividade antinoceptiva do LQFM-008...................................................... 33
5.1.1. Efeito do LQFM-008 no teste da dor Induzida pela Formalina.............. 33
5.2. Atividade anti-inflamatória do LQFM-008..................................................... 34
5.2.1. Efeito de LQFM-008 no teste do edema de pata induzido por
carragenina.......................................................................................................... 34
5.2.2. Efeito de LQFM-008 nos teste da pleurisia induzida por carragenina... 35
VIII
5.3. Efeito de LQFM-008 nos testes para avaliação da atividade
antinociceptiva central.......................................................................................... 36
5.3.1. Efeito de LQFM008 no teste da flexão de cauda....................................... 36
5.3.2. Efeito de LQFM008 no teste da placa quente........................................ 37
5.4. Mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva de LQFM-
008....................................................................................................................... 38
5.4.1. Envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-008................. 38
5.4.2. Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito de LQFM-
008....................................................................................................................... 40
5.4.3. Envolvimento da serotonina endógena no efeito de LQFM-008................ 41
6. Discussão................................................................................................... 42
7. Conclusão e Perspectivas......................................................................... 50
Referências Bibliográficas................................................................................ 53
IX
Lista de abreviaturas e sigla
5-HPETE 5-Hidroperoxieicosatetraenóico
12-HETE 12-hidroxieicosatetraenóico
5-HT 5-hidroxitriptamina (Serotonina)
5-HT1A 5-hidroxitriptamina 1A
5-HT1B 5-hidroxitriptamina 1B
5-HT2C 5-hidroxitriptamina 2C
5-HT3 5-hidroxitriptamina 3
5-LOX 5-lipoxigenase
AA Ácido Araquidônico
AMPA Ácido α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazole-propiônico
(Receptor glutamatérgico)
AMPc 3',5'-adenosina monofosfato cíclico
ATP Adenosine triphosphate / Adenosina trifosfato
B1 Receptor para bradicinina tipo 1
B2 Receptor para bradicinina tipo 2
BAX Bcl-2 associada a proteína X / Regulador da apoptose
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CGRP Calcitonin generelated peptide / Peptídeo relacionado
ao gene da calcitonina
COX Ciclooxigenase
COX-1 Cicloxigenase - 1
X
COX-2 Cicloxigenase - 2
COX-3 Cicloxigenase – 3
cyPGs Cyclopentenone prostaglandins / Prostaglandinas
ciclopentenônicas
DHA Docosahexaenoic Acid / Ácido docosahexaenóico
DRG Ganglio da raiz dorsal
ENK Enkephalin / Encefalinas
EPA Eicosapentaenoic acid / Ácido eicosapentenóico
FLAP Five-lipoxygenase activating protein / Enzima de
ativação 5-LOX
FTCβ Fator transformador de crescimento β
GABA Gamma-AminoButyric Acid / Ácido gama aminobutírico
GMPc Guanosine monophosphate cyclic / Monofosfato cíclico
de guanosina
GRD Gânglio da Raiz Dorsal
H1 Receptor de histamina 1
H2 Receptor de histamina 2
H3 Receptor de histamina 3
H4 Receptor de histamina 4
HETE Ácido hidroxieicosatetraenóico
IASP International Association for the Study of Pain /
Associação Internacional para o Estudo da Dor
IFN Intérferon
IL Interleucina
XI
IL-1 Interleucina 1
IL-1 β Interleucina 1 beta
IL-1ra Antagonista dos receptores de interleucina 1
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-8 KC Interleucin 8 - Key Chemokine / Interleucina 8 –
Quimiocina chave
IL-10 Interleucina 10
IL-13 Interleucina 13
LOX Lipoxigenase
i.p. Intraperitoneal
IP3 Inositol trifosfato
LT Leucotrieno
LTA4 Leucotrieno A4
LTB4 Leucotrieno B4
LTC4 Leucotrieno cisteínico C4
LTD4 Leucotrieno cisteínico D4
LTE4 Leucotrieno cisteínico E4
LXs Lipoxinas
MCP1 Monocyte chemotactic protein 1 / Monócito
quimiotático – Proteína 1
mg Miligrama (s)
NaCl Cloreto de sódio
XII
Nal Naloxona
NAN-190 1- (2-metoxifenil) -4- [4- (2-ftalimido) butil] piperazina
hidrobrometo
NMDA N-metil-D-aspartato / Receptor glutamatérgico
NK Neurokinin / Receptor de neurocininas
ORL-1 Receptor do tipo opioide-1
p53 Proteína plasmática de massa molecular de 53 kDa
PAF Platelet-activating factor / Fator de agregação
plaquetária
PAF (Figura 5 e 6) Fibra aferente primária
PAG Periaqueductal gray / Substância cinzenta
periaquedutal
PCPA p- clorofenilalanina
PGA2 Prostaglandina A2
PGD2 Prostaglandina D2
PGE2 Prostaglandina E2
PGF2 Prostaglandina F2
PGG2 Prostaglandina G2
PGJ2 Prostaglandina J2
PGH2 Prostaglandina H2
PGI2 Prostaciclina
PLA2 Fosfolipase A2
PN Neurônio de projeção
XIII
RvE Resolvinas da série E
RvD Resolvinas da série D
RVs Resolvinas
Sal Salina
s.c. Via subcutânea
SP Substância P
SRS-A Somatostatin receptor scintigraphy / Receptor de
somatostatina substância de reação lenta da anafilaxia
TGF-β1 Transforming growth factor beta 1 / Fator de
transformação do crescimento beta 1
TNF-α Tumor necrosis factor alpha / Fator de necrose tumoral
alfa
TNFR1 Receptor de fator de necrose tumoral 1
TNFR2 Receptor de fator de necrose tumoral 2
TPH1 Triptofano hidroxilase 1
TXA2 Tromboxano A2
v.o. Via oral
v/v Volume/volume
μ, κ, δ Receptores opiódes mu, kappa e delta
XIV
Lista de Figuras
Figura 1. Cascata do ácido araquidônico e formação de mediadores
lipídicos............................................................................................................ 5
Figura 2. Caracterização temporal da resposta inflamatória aguda a partir
da ação dos mediadores associados............................................................... 8
Figura 3. Transmissão de estímulos nociceptivos.......................................... 12
Figura 4. Via descendente inibitória 16
Figura 5. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras serotoninérgicas 17
Figura 6. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras noradrenérgicas 18
Figura 7. Estrutura do composto LQFM-008: etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il)
metil) piperazina-1-carboxilato......................................................................... 26
Figura 8. Efeito do LQFM-008, no teste da dor induzida por formalina,
primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min)........................................ 33
Figura 9. Efeito do LQFM-008 no edema de pata induzida por carragenina. 34
Figura 10. Efeito do LQFM-008 na migração celular...................................... 35
Figura 11. Efeito do LQFM-008 na exsudação de proteínas.......................... 36
Figura 12. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no
teste de flexão de cauda.................................................................................. 37
Figura 13. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste
da placa quente.................................................................................................... 38
Figura 14. Envolvimento dos receptores opióides no efeito do LQFM-008......... 39
XV
Figura 15. Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito do
LQFM-008........................................................................................................... 40
Figura 16. Envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-008.... 41
XVI
Lista de Tabelas
Tabela 1. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do
envolvimento da via opióide............................................................................. 30
Tabela 2. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do
envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A............................................ 30
Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do
envolvimento da serotonina endógena ........................................................... 31
XVII
Resumo
Os derivados piperazínicos constituem uma importante classe de compostos
químicos com largo espectro de atividades biológicas, tais como atividade anti-
infecciosa, anti-cancerígena, antinociceptiva, anti-hipertensiva, vasorrelaxante e
ansiolítica, tornando-se candidatos atrativos para desenvolvimento de novos
fármacos analgésicos e anti-inflamatórios. O objetivo do presente trabalho foi avaliar
os efeitos do composto piperazínico LQFM-008 (4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil)
piperazina-1-carboxilato) em testes agudos de nocicepção e inflamação, buscando
caracterizar quais os mecanismos de ação estariam envolvidos no efeito
antinociceptivo. Para este estudo foram utilizados camundongos machos, pesando
entre 25 e 35g. No teste da formalina os tratamentos com LQFM-008 nas doses de
48 e 96 µmol/kg (v.o.) reduziram o tempo de reatividade à dor tanto na fase
neurogênica quanto na fase inflamatória do teste. A atividade anti-inflamatória foi
confirmada, uma vez que LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg (v.o.) reduziu a
formação do edema de pata induzido por carragenina em todas as horas deste teste
e no teste de pleurisia LQFM-008 na dose de 96 µmol/kg também reduziu a
migração de leucócitos e a exsudação proteica. Nos testes de flexão de cauda e da
placa quente, o tratamento com LQFM-008 48 e 96 µmol/kg (v.o.) aumentou a
latência ao estímulo térmico, sugerindo o envolvimento de mecanismos centrais no
efeito antinociceptivo de LQFM-008. O pré-tratamento dos animais com naloxona
(7,5 µmol/kg s.c.) reverteu o efeito antinociceptivo de LQFM-008 apenas na primeira
fase do teste da formalina, no entanto, os pré-tratamentos com NAN-190 (1,3
µmol/kg i.p.) e PCPA (500 µmol/kg i.p.) reverteram o efeito antinociceptivo de LQFM-
008 em ambas as fases do teste. Assim o derivado piperazínico LQFM-008
apresenta atividade antinoceptiva e anti-inflamatória em testes agudos, sendo efeito
antinociceptivo decorrente de uma ação central com envolvimento dos receptores
opióides e da via serotoninérgica.
Palavras-chave: Efeito antinociceptivo, Efeito anti-inflamatório, Derivados
piperazínicos, LQFM-008, Via serotoninérgica.
XVIII
Abstract
The piperazines derivatives are an important class of chemical compounds with a
broad spectrum of biological activities such as anti-infectious activity, anti-
carcinogenic, anti-nociceptive, anti-hypertensive, anxiolytic and vasorelaxant and are
attractive candidates for development of new analgesics and anti-inflammatories
drugs. The aim of this study was evaluate the effects of piperazine compound LQFM-
008 (4-[(1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl]1-piperazine carboxylic acid ethyl ester) in
acute tests of nociception and inflammation and characterize that the mechanisms
are involved in the antinociceptive effect. For this study were used male mice
weighing between 25 and 35g. In the formalin test, the treatments with LQFM-008 at
doses of 48 and 96 µmol/kg (p.o.) reduced the licking time at both neurogenic and
inflammatory phases of this test. The anti-inflammatory activity was confirmed, since
LQFM-008 at doses of 48 and 96 µmol/kg (p.o.) reduced the formation of paw edema
induced by carrageenan at all hours of the test and LQFM-008 in pleurisy test at
dose of 96 µmol/kg (p.o.) also reduced leukocyte migration and protein exudation. In
the tail-flick and the hot plate tests, the treatment with LQFM-008 at doses of 48 and
96 µmol/kg (p.o.) increased the latency to thermal stimulus, suggesting the
involvement of central mechanisms in the antinociceptive effect LQFM-008. The pre-
treatment of animals with naloxone (7.5 µmol/kg s.c.) reversed the antinociceptive
effect of LQFM-008 only in the first phase of the formalin test, however, the pre-
treatment with NAN-190 (1.3 µmol/kg i.p.) and PCPA (500 µmol/kg i.p.) reversed the
antinociceptive effect of LQFM-008 in both phases of the test. Thus, the piperazine
derivative LQFM-008 exhibit antinociceptive and anti-inflammatory activities in acute
test and the antinociceptive effect is resulting from a central action with involvement
of opioid receptors and the serotonin pathway.
Key words: Antinociceptive effect, Anti-inflammatory effect, Piperazines derivatives,
LQFM-008, pathway serotonergic.
1
Introdução
2
1.1 Inflamação
Em resposta a lesões teciduais provocadas por diferentes tipos de estímulos
agressivos que podem ser físicos, químicos ou biológicos desencadeia uma cascata
de eventos fisiológicos, imunológicos e bioquímicos denominada inflamação que tem
como propósito proteger, restringir e reparar danos teciduais (1, 2).
A resposta inflamatória pode ser classificada quanto ao seu tempo de duração
em inflamação aguda, que é uma resposta ativa e auto-limitada, resultando no
reparo tecidual e retorno à homeostase; e inflamação crônica, que surge a partir da
desregulação dos mecanismos de restauração dos tecidos e estímulos inflamatórios
persistentes, tornando-se fatores importantes na progressão de doenças crônicas de
origem inflamatória, como por exemplo, artrite e aterosclerose (3, 4, 5, 6).
Durante o processo inflamatório há a participação de vários mediadores e
células que promovem importantes alterações, levando ao aparecimento dos
primeiros sinais clássicos da inflamação aguda, chamados de sinais cardinais (7, 8).
Os sinais cardinais foram descritos um século depois de Cristo (I d.C.) pelo escritor
romano Aulus Cornelius Celsus que relatou quatro sinais da inflamação, sendo estes
o tumor (inchaço), rubor (vermelhidão), calor e dor. Posteriormente, no século XIX,
Rudolph Virchow, um médico polonês considerado o pai da patologia moderna,
adicionou o quinto sinal cardinal da inflamação, a “perda da função” que acontece
quando não há resolução adequada do processo inflamatório (9).
Por serem mediadores pré-formados que estão armazenados nas células, a
histamina e serotonina são os primeiros a serem liberados durante o processo
inflamatório, sendo responsáveis pela vasodilatação e aumento da permeabilidade
membranar (10).
A histamina é uma amina biogênica cuja síntese é realizada a partir do
aminoácido L-histidina pela ação da enzima histidina descarboxilase. Esta amina é
sintetizada e armazenada principalmente em mastócitos e basófilos, os quais, em
resposta a qualquer estímulo agressivo, sofrem degranulação e a liberam. A
histamina exerce seus efeitos mediante a interação com quatro tipos de receptores
histaminérgicos H1, H2, H3 e H4. Ao se ligar nos receptores H1 ela promove
contração da musculatura lisa de vários órgãos e aumento da permeabilidade
capilar, nos receptores H2 promove aumento da secreção de ácido gástrico e
relaxamento da musculatura lisa. H3 está envolvido no feedback negativo da
3
liberação de histamina e H4, expressos principalmente em células do sistema
hematopoiético como eosinófilos e mastócitos, promove a liberação de citocinas
quimiotáticas (11, 12, 13).
Já a serotonina (5-hidroxitriptamina) é sintetizada nas células enterocromafins
a partir do triptofano, por meio da enzima Triptofano hidroxilase 1 (TPH1). A maior
parte do armazenamento da 5-HT é feita nestas células, porém a 5-HT circulante é
captada e armazenada pelas plaquetas, que ao entrar em contato com o endotélio
lesado, liberam essa amina que é responsável pelo aceleramento da aglutinação
plaquetária, vasodilatação via estimulação da produção e liberação de óxido nítrico e
vasoconstrição em casos de lesões endoteliais mais profundas, através da ativação
de receptores 5HT2 presentes no músculo liso (14).
Outro importante mediador que participa do processo inflamatório é a
bradicinina que é produzida a partir do cininogênio. Quando se liga aos receptores
constitutivos do tipo B2 a bradicinina promove aumento da permeabilidade vascular
e aumento do fluxo sanguíneo, além da estimulação de fibras nociceptivas. Os
receptores do tipo B1 são poucos expressos em condições normais, no entanto, em
condições patológicas são rapidamente induzidos e quando ativados são
responsáveis por induzir uma série de efeitos pró-inflamatórios como migração de
leucócitos, liberação de prostaglandinas, citocinas, quimiocinas e leucotrienos,
contribuindo consequentemente para quadros de hiperalgesia (11, 15, 16).
Outros mediadores liberados no processo inflamatório são neuropeptídios,
neurocinina A, somatostatinas, encefalinas, CGRP (calcitonin gene related peptide)
e substância P, sendo estes dois últimos, mediadores pró-inflamatórios responsáveis
pela inflamação neurogênica (11).
Uma importante classe de mediadores lipídicos, os eicosanoides, é formada
durante a inflamação a partir do ácido araquidônico (AA), um precursor endógeno
formado por 20 carbonos contendo quatro duplas ligações. Na presença de
qualquer tipo de estímulo agressor, a enzima fosfolipase A2 é ativada e então
catalisa a hidrólise dos fosfolipídeos presentes nas membranas celulares, liberando
o ácido araquidônico que é rapidamente metabolizado por duas grandes vias
enzimáticas: a via das cicloxigenases (COX) e a via das lipoxigenases (LOX) (9, 17).
A COX, também conhecida como prostaglandina endoperóxido sintetase,
promove a oxidação e ciclização do ácido araquidônico levando à formação de
prostaglandinas instáveis (PGG2) que por sua vez recebe quatro moléculas de O2
4
após uma redução de dois elétrons, resultando na formação de uma prostaglandina
altamente instável, a PGH2, que sofre isomerização originando os eicosanóides
(PGE2, PGD2, PGF2), prostaciclina (PGI2) e tromboxano A2 (TXA2). Especificamente,
a prostaglandina E2 é formada por meio da ação da enzima prostaglandina E sintase
em leucócitos, enquanto que a prostaciclina é formada através da ação da
prostaciclina sintase em células endoteliais e os tromboxanos são formados nas
plaquetas por meio da ação enzimática da tromboxano sintase (18, 19, 20, 21).
Atualmente já foram descobertos três tipos de cicloxigenases. A COX-1,
constitutivamente expressa e amplamente distribuída, é responsável pelos níveis
basais de prostaglandinas. Já a COX-2 é induzida durante o processo inflamatório,
sendo responsável pela formação dos mediadores lipídicos pró-inflamatórios, no
entanto, esta enzima também é expressa constitutivamente em alguns tecidos como
rins e cérebro. A COX-3 foi descrita como uma variação da COX-1, esta compartilha
todas as características catalíticas das COX-1 e COX-2 sendo encontrada no córtex
canino e no sistema nervoso central e coração de humanos (22). Há a hipótese de
que esta terceira isoforma possui atividade anti-inflamatória podendo induzir a
formação de prostaglandinas ciclopentenônicas e resolvinas e, além disso, tem sido
constatada sua expressão em períodos de remissão de doenças inflamatórias
crônicas (23).
Os eicosanoides, em especial as prostaglandinas, estão intimamente
associados à evolução da resposta inflamatória. As PGD2, PGE2 e PGI contribuem
consideravelmente para a formação do edema e chegada das células de defesa ao
tecido lesionado. Em relação ao envolvimento das prostaglandinas com a dor
inflamatória, tem sido relatado que as PGI2 e PGE2 estão relacionadas com a
hiperalgesia de curta e longa duração, respectivamente, por meio da sensibilização
de nociceptores, que se tornam mais responsivos a agentes álgicos endógenos
como a bradicinina. Além disto, o aumento da produção de prostaglandinas no local
da lesão e no sistema nervoso central durante o processo inflamatório contribui para
o surgimento de quadros febris (24, 25, 26).
Em contrapartida, algumas prostaglandinas, chamadas de ciclopentenônicas,
são responsáveis por promoverem efeitos anti-inflamatórios. A PGA2 é formada a
partir da PGE2 por meio de uma reação de desidratação não-enzimátia e está
relacionada com a inibição de citocinas pró-inflamatórias e inibição da produção de
quimiocinas. Da mesma forma, a prostaglandina 15d-PGJ2, derivada da PGJ2 que foi
5
descoberta na década de 1960 a partir da desidratação de PGD2, também é capaz
de desenvolver atividade anti-inflamatória a partir da redução da migração de
leucócitos e inibição das IL6, IL1β, IL12 e TNFα (27, 28, 29).
O ácido araquidônico pode seguir também a via das lipoxigenases, onde as
mesmas catalisam a formação dos ácidos hidroxieicosatetranóicos (HETE) e
consequentemente à formação dos leucotrienos, lipoxinas e outros compostos
biologicamente ativos. Existem três tipos de lipoxigenases: 5-lipoxigenase presente
em células mielóides; 12-lipoxigenases presentes nas plaquetas e a 15-lipoxigenase
presente nas células epiteliais/endoteliais. A 5-lipoxigenase com a ajuda da enzima
de ativação FLAP, converte o ácido araquidônico em leucotrieno A4 (LTA4) que, por
vias distintas, origina o leucotrieno B4 (LTB4) e os chamados cisteinil leucotrienos
(LTC4, LTD4, e LTE4), anteriormente conhecidos como substância de reação lenta da
anafilaxia (SRS-A). O LTB4 é um potente regulador da quimiotaxia e da adesão de
leucócitos nas células endoteliais, além de estimular a produção de várias citocinas
pró-inflamatórias. Os produtos finais da 12-lipoxigenase e 15-lipoxigenase são o
ácido 12-hidroxieicosatetraenóico e as lipoxinas (A e B), respectivamente, sendo as
lipoxinas mediadores anti-inflamatórios que contribuem para a resolução do
processo (Figura 1) (9, 30, 31, 32).
Figura 2. Cascata do ácido araquidônico e formação de mediadores lipídicos, adaptado de
TAVARES, 2012 (33).
6
As citocinas são glicoproteínas ou polipeptídeos, hidrossolúveis com peso
molecular entre 8 e 20 kDa. São produzidas por vários tipos de células no local
lesionado, inclusive por células imunológicas e atuam por mecanismos parácrino,
quando agem em células vizinhas ou autócrino, quando agem na própria célula
produtora. Uma mesma citocina pode ter várias ações em contextos biológicos
diferentes, algumas podem exercer a mesma ação ou podem cooperar para uma
ação final comum e, em contrapartida, pode acontecer de a ação de uma citocina
ser anulado pelo efeito de outra (34, 35).
Através do controle da expressão gênica, as citocinas são capazes de
influenciar nas funções celulares, diferenciação, proliferação e sobrevida de células
do sistema imunológico, além de regular a produção e atividade de outras citocinas,
modulando assim o destino do processo inflamatório. Existem cinco grupos distintos
de citocinas: as interleucinas (IL, numeradas sequencialmente de IL-1 a IL-35),
fatores de necrose tumoral (TNF – Tumor Necrosis Factor), quimiocinas (citocinas
quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento mesenquimal. Algumas
citocinas podem ter ações pró-inflamatórias ou anti-inflamatória, dependendo do
microambiente onde estão localizadas (35).
Dentre as pró-inflamatórias as principais são as IL-1β, IL-6 e TNF-α. A IL-1β é
produzida por macrófagos, monócitos e células gliais, sendo responsável por
produzir inflamação sistêmica através da indução da ciclooxigenase-2, com a
formação de PGE2 no hipotálamo, e consequente aparecimento de quadros febris.
Além disso, esta citocina induz a produção de substância P, PGE2, moléculas de
adesão endotelial e óxido nítrico a partir da ativação da enzima óxido nítrico sintase
(34, 35).
A IL-6 é produzida e secretada por diversos tipos de células, incluindo
monócitos, macrófagos, eosinófilos, hepatócitos e células da glia a partir da ação de
outras citocinas, principalmente pela TNF-α e IL-1. Essa citocina é responsável por
desencadear febre a partir da ativação da região termorreguladora do hipotálamo e,
além disso, possui ações pró-inflamatórias que envolvem a maturação e ativação de
neutrófilos, maturação de macrófagos e diferenciação/manutenção de linfócitos T
citotóxicos. Em contrapartida, esta interleucina contribui para a regeneração de
lesão neuronal através da regulação da expressão de neuropeptídios e promove
efeitos anti-inflamatórios de acordo com a sua concentração sérica, inibindo IL-1 e
7
TNF-α e estimulando a síntese de IL-1ra, a qual apresenta efeitos anti-inflamatórios
(35, 36, 37).
O Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), também conhecido como
caquetina, é um dos primeiros e mais potentes mediadores liberados durante o
processo inflamatório e possui como fontes primárias de síntese os monócitos,
macrófagos e linfócitos T. Esta citocina atua principalmente através de dois
receptores de superfície celular, TNFR1 expresso em células epiteliais e neurônios e
TNFR2 expresso principalmente em macrófagos e monócitos do gânglio da raiz
dorsal, sendo o primeiro responsável por respostas inflamatórias e apoptose celular
e o segundo pela estimulação da proliferação de linfócitos-T, fibroblastos e células
natural killer. TNF-α é também um importante indutor de catabolismo muscular e
caquexia, além de possui funções adicionais como estimulação da
expressão/liberação de moléculas de adesão, citocinas e fatores de crescimento (34,
36, 37).
Um dos grupos de citocinas que merece destaque é o das quimiocinas que
reúne mais de 50 citocinas com funções quimioatraentes. As quimiocinas são
pequenos polipeptídeos, com cerca de 90 a 130 resíduos de aminoácidos, que
possuem como funções a quimiotaxia, ativação e adesão de diferentes tipos de
leucócitos, desempenhando um papel fundamental no processo inflamatório com o
recrutamento de células do sistema imune para o local da lesão, entretanto, tem sido
atribuídas novas funções às quimiocinas, tais como angiogênese, modulação da
inflamação e febre (38, 39).
A ação das quimiocinas é mediada por receptores transmembranais
acoplados à proteína G, que quando ativados desencadeiam uma cascata de
transduções de sinais com a formação de segundos mensageiros como o AMPc, IP3
e cálcio, promovendo a expressão de moléculas de adesão como integrinas, L-
selectinas e ligantes de carboidratos para selectina P e E na membrana dos
leucócitos (38). Em paralelo, os macrófagos ativados pelo agente agressor
produzem as citocinas TNF-α e IL-1β que estimulam as células endoteliais a
produzirem P-selectina e E-selectina bem como ligantes de integrina para que
ocorra a adesão dos leucócitos ao endotélio. As interações selectina-ligante de
selectina são de baixa afinidade facilitando assim o rolamento dos leucócitos na
superfície do endotélio, em contrapartida as interações integrina - ligantes de
integrina medeiam uma ligação firme promovendo a adesão dos leucócitos ao
8
endotélio. As quimiocinas então atuam sobre os leucócitos aderentes e os estimulam
a migrar através dos espaços interendoteliais obedecendo ao gradiente de
concentração químico em direção ao local da inflamação (11, 40).
Desta maneira, os leucócitos polimorfonucleares são as primeiras células de
defesa a chegarem ao local da inflamação, onde se acumulam para neutralizar o
patógeno e/ou eliminar detritos celulares por fagocitose. À medida que os neutrófilos
se acumulam no tecido inflamado, ocorre uma segunda onda de infiltração celular
com a chegada dos monócitos, os quais se diferenciam em macrófagos e, além de
tentarem remover o agente agressor, promovem a remoção restos celulares de
neutrófilos que morreram por apoptose (Figura 2). Após terem completado suas
tarefas, os macrófagos são removidos do tecido inflamado via sistema linfático ou
por apoptose. A ativação contínua das etapas deste processo ou a falha na
capacidade de resolver a resposta inflamatória mesma tornam a lesão crônica,
sendo prejudicial para o tecido (9).
Figura 2. Caracterização temporal da resposta inflamatória aguda a partir da ação dos mediadores
associados, adaptado de Lawrence, Willoughby e Gilroy, 2002 (41).
A resposta inflamatória é estreitamente regulada tanto por mediadores pró-
inflamatórios responsáveis pela resposta inicial contra os estímulos nocivos, quanto
por mediadores anti-inflamatórios que contribuem para o fim da inflamação e retorno
9
à homeostase. As citocinas IL-4, IL-10, IL-13 e fator transformador de crescimento β
(FTCβ) são as principais citocinas anti-inflamatórias liberadas na fase de resolução
da inflamação, atuando sobre linfócitos T e B, mastócitos, monócitos e macrófagos,
promovendo principalmente a inibição de citocinas pró-inflamatórias. (35, 42).
Durante a fase de resolução da inflamação são biossintetizados mediadores
lipídicos, tais como resolvinas, protectinas, lipoxinas e maresinas que estimulam e
aceleram a resolução através de diferentes mecanismos no tecido lesionado,
evitando assim a evolução do processo inflamatório agudo para crônico. As
lipoxinas (A4 e B4) são derivados de ácidos graxos endógenos como, por exemplo,
o ácido araquidônico, e são responsáveis por inibir a infiltração de neutrófilos
polimorfonucleares além de estimular o recrutamento de macrófagos para o tecido
lesado (9).
As resolvinas, protectinas e maresina são mediadores lipídicos induzidos
endogenamente durante o processo de resolução da inflamação. São
biossintetizados a partir de ácidos graxos poli-insaturados essenciais derivados da
dieta como, por exemplo, o ômega-3. Estes mediadores possuem como tarefas a
redução da infiltração de neutrófilos, a limpeza da lesão por meio da fagocitose de
neutrófilos apoptóticos, além de contribuirem para a regeneração do tecido. Existem
dois principais grupos da família das resolvinas com estruturas químicas distintas,
sendo o grupo E (RvE1 e RvE2) derivado do ácido eicosapentaenoico (EPA) e o
grupo D (RvD), derivado de ácido docosahexaenóico (DHA). Ambos os grupos
também estão intimamente envolvidos no processo de resolução da inflamação (9,
42, 43).
1.2 Dor
Etimologicamente, a palavra “dor” na língua portuguesa vem do latim: dolore,
que significa sofrimento; e “pain” na língua inglesa provém do grego: poiné, que
significa pena. Ao longo da história da humanidade, vários indivíduos tentaram
definir a dor. Homero acreditava que ela era resultado de “flechadas atiradas por
deuses”, como uma forma de punição para os humanos. Aristóteles definiu a dor
como uma “paixão da alma”, caracterizada como um sentimento de sofrimento e
“padecimento”. Já Platão considerava que a dor além de se originar de uma
10
estimulação periférica, também envolvia a experiência emocional originada no
espírito. Por fim, o filósofo francês René Descartes propôs que o sistema nervoso
periférico era responsável por veicular informações sensitivas do meio ambiente
para o encéfalo, que processaria o sítio das sensações e motricidade, sendo a alma
capaz de perceber qualquer estímulo sobre o corpo ou no seu interior (44, 45, 46).
Nos dias atuais a Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP) define
a mesma como uma “experiência sensorial e emocional desagradável associada a
uma lesão tecidual real ou potencial”. Portanto, a dor apresenta dois componentes: a
experiência sensorial denominada nocicepção e a experiência emocional conhecida
como percepção. A nocicepção, ou sensação nociceptiva, resulta da detecção de
estímulos capazes de comprometer a integridade física de um organismo. A
percepção é uma função integrativa modulada pela emoção e condição psicológica
(47). Sendo assim, dor seria o termo mais adequado quando se refere ao ser
humano, enquanto nocicepção seria mais indicado para animais experimentais, uma
vez que não se entende a percepção nos mesmos (45, 48).
A dor pode ser classificação de acordo com a duração, topografia,
intensidade, dentre outros critérios. Em relação ao tempo ela pode ser transitória,
aguda ou crônica. Do ponto de vista fisiológico ela pode ser nociceptiva, inflamatória
ou neuropática (49).
A dor transitória é provocada pela ativação de nociceptores em determinado
tecido, porém sem o acompanhamento de lesão, possuindo como função a proteção
contra futuras lesões físicas que possam ser provocadas por agentes do ambiente
ou apenas informar sobre deformações de tecidos corporais que poderiam originar
uma lesão. Já a “dor aguda” é provocada pela estimulação dos nociceptores em
resposta à lesão de algum tecido corporal. Se a dor aguda persistir mesmo após a
recuperação da lesão, o que pode demorar alguns dias ou semanas, ela já não é
mais classificada como aguda, mas sim como “dor crônica” (50, 51).
A dor nociceptiva é proveniente da ativação de receptores nociceptivos e está
relacionada à lesão de tecidos ósseos, musculares ou ligamentares, já a dor
neuropática ocorre em áreas ou órgãos envolvidos em lesões ou doenças
neurológicas (52, 53, 54). Mais recentemente, devido à possível ocorrência desses
dois tipos de dor ao mesmo tempo e das dificuldades em diagnosticá-las, alguns
autores recomendam o uso do termo “dor predominantemente neuropática” ou “dor
predominantemente nociceptiva”, dependendo do padrão clínico de apresentação
11
(52, 53). A dor de origem inflamatória resulta da interação entre o tecido lesionado e
os neurônios sensoriais nociceptivos periféricos por meio da participação de
mediadores inflamatórios. Existem mediadores inflamatórios que apenas
sensibilizam os nociceptores e mediadores e estímulos que desencadeiam a
resposta nociceptiva (45).
Os nociceptores são terminações nervosas livres de neurônios pseudo-
unipolares primários, possuindo um ramo axonal distal, que se dirige à periferia, e
outro ramo axonal proximal, que se dirige ao corno dorsal da medula espinal ou ao
tronco cerebral. Estes nociceptores são capazes de detectar e transduzir estímulos
físicos, sejam eles mecânicos ou térmicos, e estímulos químicos como, por exemplo,
à bradicinina, capsaicina, serotonina, prótons etc. Eles podem ser classificados
como nociceptores térmicos que são ativados por estímulos térmicos extremos,
normalmente maiores que 45°C ou menores que 5°C; receptores mecânicos que são
ativados por estímulos mecânicos intensos; e os receptores polimodais que
respondem tanto a estímulos térmicos quanto químicos ou mecânicos de alta
intensidade (44, 45, 55).
As fibras nociceptivas primárias inervam amplamente pele, mucosas,
músculos, articulações e vísceras. Estas fibras possuem o seu corpo celular
presente no gânglio da raiz dorsal de onde sai um prolongamento axônico que se
divide em dois, um se dirigindo para os tecidos periféricos e o outro para a medula
espinhal ou para o tronco encefálico (45, 56, 57, 58).
Estas fibras primárias são classificadas de acordo com seu diâmetro
(pequeno ou médio), seu grau de mielinização e sua velocidade de condução do
potencial de ação. As fibras A-delta são de médio diâmetro (2 a 6 µm), finamente
mielinizadas e possui velocidade de condução do potencial de ação de 12 a 30 m/s,
sendo responsáveis pela dor aguda, respondendo principalmente a estímulos
mecânicos e térmicos. As fibras C são de pequeno diâmetro (0,4 a 1,2 µm), não
mielinizadas e de velocidade de condução do potencial de ação mais lenta (0,5 a 2
m/s), responsáveis pela dor difusa e de longa duração e são chamadas de
polimodais, pois respondem a estímulos mecânicos, térmicos e químicos (Figura 3)
(47, 59, 60).
Existem também as fibras A-beta, de grande diâmetro (maior que 10 µm),
altamente mielinizadas e com alto limiar de ativação, sendo responsáveis por
detectarem estímulos táteis (Figura 3). Em situações normais estas fibras não
12
respondem a estímulos térmicos ou mecânicos, porém, durante um processo
inflamatório seu limiar de ativação diminui e as mesmas passam a responder a tais
estímulos. Quando ocorre algum tipo de plasticidade neuronal proveniente de
processos patológicos essas fibras passam a interpretar estímulos táteis inócuos
como estímulos nociceptivos, originando o fenômeno chamado de alodinia, onde
estímulos não dolorosos passam a promover dor (45, 61, 62).
Figura 3. Transmissão de estímulos nociceptivos. As fibras nociceptivas primárias (A-beta, A-delta e
C) são responsáveis por detectar e transmitir informações sobre a lesão tecidual. Estas se propagam
para o corno dorsal da medula espinal e transmitem a informação para os neurônios de segunda
ordem que conduzem as informações nociceptivas até o cérebro, onde essas informações serão
interpretadas de acordo com experiências de percepção de cada indivíduo. Projeções descendentes
originadas no tronco encefálico funcionam como um mecanismo intrínseco de controle da dor.
Adaptado de OAKLANDER, 2013 (63).
A função básica dos nociceptores é transmitir informações sobre a lesão
tecidual aos neurônios de ordem superior. Sendo assim, as fibras aferentes
primárias se propagam para o corno dorsal da medula espinal em regiões
13
específicas, onde fazem sinapses com os neurônios secundários. O corno dorsal da
medula espinal é subdividido em uma série camadas, chamadas de lâminas,
baseando-se em características citoarquitetônicas, como diferença de tamanho e
densidade dos neurônios. As lâminas I e II, região conhecida como substância
gelatinosa, são comumente chamadas de superficiais e são os principais alvos dos
neurônios aferentes primários, sendo que a maioria dos neurônios da lâmina I
respondem exclusivamente a estímulos nociceptivos e a lâmina II é formada quase
que exclusivamente por interneurônios excitatórios e inibitórios. Mais profundamente
existem também as lâminas V, VI, VII e X. As fibras A-delta fazem sinapses com
neurônios secundários presentes nas lâminas I, II e também na V, e as fibras C,
principalmente, com neurônios da lâmina II. As lâminas III, IV e V contêm neurônios
que recebem aferências de fibras A-beta, respondendo predominantemente a
estímulos táteis que, em condições fisiológicas normais, não produzem dor. A lâmina
V recebe aferências de fibras A-beta, A-delta, C e também de estruturas viscerais
(56, 57, 64, 65, 66).
A transmissão sináptica entre as fibras aferentes primárias e os neurônios
secundários no corno dorsal da medula espinal é mediada pela liberação de
diversos neurotransmissores, dentre eles o ATP (67), glutamato (68) (69), SP (70;
71; 72), peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) (71).
O glutamato é considerado um dos principais neurotransmissores envolvidos
na transmissão de sinapses excitatórias no corno dorsal da medula espinal. Suas
ações são promovidas a partir da ativação de dois grupos de receptores, os
metabotrópicos e os ionotrópicos, sendo este último dividido em três grupos distintos
que incluem os receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), o ácido α-amino-3-hidroxi-5-
metilisoxazol-4-propiônico (AMPA) e o cainato (73, 74).
Ocorre em algumas sinapses liberação concomitante de glutamato e
substância P (SP). A SP é um peptídeo da família das taquicininas que, além de
prolongar as ações do glutamato, promove também a sensibilização de
nociceptores, bem como a redução do limiar de excitabilidade das sinapses e,
consequentemente a ativação de nociceptores silenciosos. Está envolvida
principalmente na transmissão de estímulos nociceptivos de fibras aferentes
primárias do tipo C, agindo por meio da ativação dos receptores de neurocininas
(NK1 e NK2). Quando ocorre algum tipo de lesão tecidual, esta substância
14
produzirá ações vasculares pró-inflamatórias que contribuirão para o processo de
hiperalgesia e alodinia (75, 76).
O CGRP é responsável por modular a transmissão nervosa tanto no nível de
sistema nervoso central quanto na inflamação periférica, sendo sintetizado e
liberado principalmente pelas fibras do tipo C. Na medula espinal ele é capaz de
aumentar a excitação neuronal, retardar o metabolismo da SP e aumentar a
liberação de SP e de glutamato (35, 59).
No corno dorsal da medula espinal existem três populações de neurônios com
os quais as fibras aferentes primárias fazem conexões: os interneurônios
subdivididos em excitatórios e inibitórios; os neurônios que estão envolvidos na
atividade reflexa e os neurônios de projeção que conduzem as informações
nociceptivas até os centros supra-espinais por meio de tratos neuronais específicos
(47).
Existem basicamente duas vias ascendentes para a condução da dor da
medula até o cérebro: a via neoespinotalâmica e a via palioespinotalâmica. A
primeira conduz à dor somática e bem-localizada; já a segunda conduz à dor
visceral, de localização difusa. No cérebro, nas regiões como o bulbo, a ponte, o
mesencéfalo, o tálamo e o hipotálamo, existem os neurônios de terceira ordem que
levam os estímulos nociceptivos para as áreas sensoriais do córtex cerebral, onde
os mesmos serão interpretados de acordo com experiências de percepção (46, 77).
Como mecanismos intrínsecos de controle da dor, há uma série de sistemas
neuroniais distintos que modulam os eventos que ocorrem durante o processamento
da informação nociceptiva em nível espinal. Um exemplo são os interneurônios
inibitórios que se projetam para outras regiões do corno dorsal, constituindo um
importante mecanismo de regulação da transmissão nociceptiva. Outro mecanismo
neuronal de controle da dor acontece por meio de projeções descendentes
originadas no tronco encefálico, onde ocorrem sinapses excitatórias com neurônios
serotoninérgicos e noradrenérgicos, que por sua vez descem até o corno dorsal da
medula e realizam conexões inibitórias com neurônios aferentes primários reduzindo
a liberação de glutamato, aspartato e CGRP e consequentemente a descarga de
estímulos nociceptivos. A transmissão da informação nociceptiva na medula
espinhal também pode ser regulada por inibição de interneurônios excitatórios ou
por estimulação de interneurônios inibitórios que fazem sinapses na substância
15
gelatinosa, onde liberam neurotransmissores e neuromoduladores tais como o ácido
gama aminobutírico (GABA), opióides endógenos e glicina, entre outros (45, 47, 78).
O sistema inibitório descendente possui quatro principais regiões do sistema
nervoso central que estão interligadas: 1) sistemas corticais e diencefálicos; 2)
substância cinzenta periaquedutal (PAG) e periventricular que são ricas em
encefalinas e receptores opióides; 3) partes do bulbo rostroventral, especialmente o
núcleo magno da rafe e núcleos adjacentes que recebem impulsos excitatórios da
PAG; 4) o corno dorsal bulbar e medular que recebe terminais de axônios do núcleo
magno da rafe e núcleos adjacentes (79, 80, 81, 82, 83).
De forma geral a via descendente inibitória funciona da seguinte forma: os
centros corticais e diencefálicos enviam projeções neuronais para a PAG que por
sua vez envia projeções descendentes para o núcleo rostroventromedial (RVM) da
medula, o qual é definido funcionalmente como a linha média ponto-medular em que
a estimulação eléctrica ou micro-injeção opióide produz antinocicepção
comportamental (84, 85). Os neurônios desse núcleo, por sua vez, se projetam para
o corno dorsal da medula espinal, onde formam conexões sinápticas com terminais
aferentes primários, neurônios de segunda ordem e interneurônios modulando a
transmissão do estímulo nociceptivo (Figura 4) (86, 87). Porém, vale ressaltar que
cada via que compões o sistema descendente inibitório possui algumas
particularidades.
A via descendente conta com o sistema opióide endógeno, fibras
serotoninérgicas, noradrenérgicas e colinérgicas, os quais contribuem para a
modulação da transmissão do estímulo doloroso (88, 89, 90, 91, 92, 93).
Os opióides agem por meio da ativação de quatro tipos de receptores, µ, δ, κ
e receptor do tipo opioide-1 - ORL-1, os quais são amplamente distribuídos pelo
sistema nervoso central, podendo ser encontrados dentro do corno posterior da
medula espinal e em núcleos cerebrais específicos como córtex insular, amídala,
hipotálamo, região PAG e RVM, sendo os receptores µ responsáveis pela maioria
dos efeitos analgésicos dos opióides e por alguns efeitos colaterais como, por
exemplo, sedação, euforia, depressão respiratória e dependência (94, 95, 59).
16
.
Figura 4. Via descendente inibitória. Os centros corticais superiores enviam projeções neuronais para
a região cinzenta periaquedutal (PAG) que por sua vez envia projeções descendentes para o núcleo
rostroventromedial (RVM) da medula. Os neurônios do RMV projetam-se para o corno dorsal da
medula espinal, onde formam conexões sinápticas com interneurônios e fibras nociceptivas,
modulando a transmissão do estímulo doloroso. A= Amígdala; IC= Córtex insular; H= Hipotálamo
(59).
Há evidências que relatam a liberação de opióides endógenos, conhecidos
como endorfinas, tanto em nível espinal quanto supra-espinal, os quais se ligam aos
receptores opióides promovendo efeito analgésico. Em nível espinal os opióides
podem atuar de forma pré-sináptica inibindo a liberação de diferentes
neurotransmissores nas terminações aferentes primárias no corno posterior e/ou
podem atuar de forma pós-sináptica para reduzir a excitabilidade dos neurônios no
corno dorsal da medula espinal. Agonistas destes receptores como a morfina,
podem produzir analgesia através de ambos os mecanismos pré e pós-sinápticos
em vários locais do sistema nervoso central (94, 59, 96).
Em adição ao sistema opióide, as fibras serotoninérgicas originadas no núcleo
magno da rafe também participam da modulação da dor em nível espinal. No corno
dorsal da medula espinal essas fibras liberam serotonina que irá interagir com
receptores específicos presentes em neurônios aferentes primários, interneurônios e
neurônios aferentes secundários, resultando no bloqueio da transmissão do estímulo
nociceptivo aos centros superiores (Figura 5) (87, 97, 78). Foi observado que a
17
estimulação elétrica do núcleo magno da rafe aumenta a liberação de 5-HT no corno
dorsal da medula promovendo analgesia, podendo este efeito ser bloqueado pelo
pré-tratamento com PCPA (80, 98, 99, 100). No entanto, a 5-HT pode produzir
efeitos antinociceptivos e pró-nociceptivos, dependendo do receptor em que atua,
sendo identificados atualmente mais de 15 subtipos de receptores para 5-HT (97).
Figura 5. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras serotoninérgicas. Fibras serotoninérgicas
originadas no núcleo magno da rafe se projetam até o corno dorsal da medula espinal onde liberam
5-HT que ativa receptores 5-HT3 presentes em interneurônios inibitório, os quais ao serem
estimulados, liberam GABA e encefalinas que ativam receptores GABAérgicos e opióides presentes
em fibras aferentes secundárias, causando hiperpolarização nas mesmas e consequentemente
impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo aos centros supra-espinais. A serotonina pode se
ligar também em receptores 5-HT1B/1D e 5-HT1A , presentes em fibras aferentes primárias e
secundárias, respectivamente, contribuindo para a inibição da transmissão do estímulo nociceptivo
(78)
A ação moduladora de fibras noradrenérgicas também tem contribuído
bastante para o controle intrínseco da dor. O locus coeruleus, localizado no tronco
encefálico especificamente na ponte, é o maior grupo de neurônios noradrenérgicos
existentes no cérebro. Estes neurônios são capazes de influenciar no
comportamento relacionado com a dor a partir de conexões realizadas com várias
outras regiões do sistema nervoso central (101, 102).
18
Foi mostrado que a estimulação elétrica da PAG ou RVM pode promover
antinocicepção correlacionado ao aumento dos níveis de noradrenalina no líquido
cefalorraquidiano, sendo este efeito bloqueado por antagonistas adrenérgicos (87,
88, 103, 104, 105). Ambas as regiões enviam projeções para o locus coeruleus que
por sua vez envia fibras noradrenérgicas diretamente para o corno dorsal da medula
espinal liberando noradrenalina que irá interagir especificamente com receptores α2A
α2B/2C presentes em neurônios secundários e primários, respectivamente, e em
receptores α1A presentes em interneurônios inibitórios, inibindo a transmissão
nociceptiva de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos, bem como inibindo a
liberação de neurotransmissores excitatórios (Figura 6) (104, 106, 107, 108, 109,
78). Vários estudos tem mostrado que a ativação destes receptores na medula
exerce um forte efeito antinociceptivo (107, 110, 111).
Figura 6. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras noradrénergicas. Fibras noradrenérgicas
originadas no locus coeruleus projetam-se para o corno dorsal da medula espinal liberando
noradrenalina que irá interagir especificamente com receptores adrenérgicos α1A presentes em
interneurônios inibitórios, os quais liberam GABA e endorfinas que ativam receptores GABAérgicos e
opióides presentes em neurônios secundários, causando hiperpolarização nas mesmas e
consequentemente impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo aos centros superiores. A
noradrenalina pode também se ligar a receptores adrenérgicos α2A α2B/2C presentes em neurônios
secundários e primários, respectivamente, inibindo a transmissão nociceptiva (78).
19
Além dos receptores α 2-adrenérgicos, foi demonstrada uma elevada
densidade de receptores muscarínicos no corno dorsal da medula espinal, os quais
também podem contribuir para a modulação da transmissão nociceptiva. Foi
observado que o bloqueio destes receptores com atropina promove diminuição do
limiar nociceptivo em ratos (95, 112, 113) e que a administração intratecal de
agonistas muscarínicos ou inibidores da enzima acetilcolinesterase produz um
potente efeito analgésico em camundongos, ratos e seres humanos (112, 114, 115,
116, 117). Estes receptores também podem mediar efeitos antinociceptivos de
opióides (118) e de agonista α 2-adrenérgico (119) favorecendo assim a via
descendente inibitória da dor (95).
20
Justificativa
21
2. Justificativa
Dentre as diferentes formas de controle da dor e também da inflamação
temos o uso de medicamentos incluindo analgésicos opióides e não-opióides, anti-
inflamatórios não esteroidais (AINE) e analgésicos adjuvantes como, por exemplo,
antidepressivos, anticonvulsivantes e anestésicos (120).
Os analgésicos opióides são medicamentos psicoativos prescritos para o
alívio da dor e cuidados paliativos, os quais exercem seus efeitos por meio da
interação com diferentes tipos de receptores, sendo os princípais μ, κ e δ que estão
presentes no hipotálamo, substância cinzenta periaquedutal, corno dorsal da medula
e nos nervos aferentes periféricos. Como se sabe, o uso de opióides gera uma
grande variedade de efeitos colaterais, incluindo sedação, tolerância a drogas,
dependência física e psíquica, entre outros, sendo necessárias medidas de controle
referente à prescrições para evitar o mau uso e dependência (120, 121, 122). Já os
AINEs são constantemente utilizados por apresentarem efeitos anti-inflamatórios,
antitérmicos e analgésicos, porém possuem seu uso limitado por apresentarem
efeitos colaterais no trato gastrointestinal, juntamente com a inibição da agregação
de plaquetas e a toxicidade renal (120, 123).
A busca por novos agentes analgésicos e/ou anti-inflamatórios que causem o
mínimo possível de efeitos colaterais tornou-se um grande desafio para os
pesquisadores desta área, visto que a dor pode influenciar fortemente no estilo de
vida de milhões de pessoas que sofrem com dores persistentes, levando à
ocorrência de sérias consequências negativas como a falta de apetite, padrões
anormais de sono e comprometimento das atividades diárias. Além disto, as terapias
atualmente disponíveis para o tratamento da dor e de doenças inflamatórias nem
sempre são eficazes e apresentam diversos efeitos secundários, que muitas vezes
limitam o tratamento (124).
Nesse contexto, os compostos piperazínicos surgem como candidatos
atrativos para desenvolvimento de novos analgésicos e anti-inflamatórios, uma vez
que, constituem uma importante classe de compostos químicos com um largo
espectro de atividades biológicas como, por exemplo, atividade anti-infecciosa, anti-
cancerígena e antinociceptiva (125). Pesquisas relatam que alguns derivados
piperazínicos possuem capacidade de atuarem em receptores histaminérgicos e
22
serotoninérgicos e por isso podem desempenhar importante papel no controle da dor
e da inflamação (115, 126).
LQFM-008 é um derivado piperazínico originalmente desenhado a partir da
clozapina através da estratégia de simplificação molecular. Segundo estudos
realizados por BRITO et al., 2012, o derivado piperazínico LQFM-008 além de
apresentar alguns efeitos neurotóxicos em doses superiores a 600 µmol/kg,
demonstrou ter atividade do tipo ansiolítica associada à participação de receptores
serotoninérgicos 5-HT1A (127). Outros estudos envolvendo este mesmo composto
revelaram que o mesmo também possui propriedade hipotensiva, anti-hipertensiva e
vasorrelaxante envolvendo vias serotoninérgicas, colinérgicas e do óxido nítrico
(128).
Com base nestes resultados e visando complementar os dados sobre o
composto LQFM-008, buscamos neste estudo avaliar as possíveis atividades anti-
inflamatórias e antinociceptiva do mesmo, bem como a elucidação dos seus
mecaninos de ação, a fim de contribuir para o futuro desenvolvimento de novos
fármacos mais eficazes, seguros e com menores riscos de efeitos adversos.
23
Objetivos
24
3. Objetivos
3.1. Objetivos gerais
O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos anti-inflamatório e
antinociceptivo de LQFM-008 (etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-
carboxilato), a partir de testes agudos de nocicepção e inflamação, buscando
caracterizar quais os mecanismos de ação estariam envolvidos em tais efeitos.
3.2. Objetivos específicos
Investigar o efeito antinociceptivo de LQFM-008 por meio de modelos agudos
de nocicepção: dor induzida pela formalina; dor induzida por estímulo térmico:
flexão de cauda e placa quente;
Investigar a atividade anti-inflamatória de LQFM-008 nos testes de edema de
pata induzido por carragenina e pleurisia induzida por carragenina;
Investigar a participação do sistema opíoide nos mecanismos de ação
envolvidos no efeito antinociceptivo de LQFM-008;
Investigar a participação do sistema serotoninérgico nos mecanismos de ação
envolvidos no efeito antinociceptivo de LQFM-008.
25
Materiais e métodos
26
4. Materiais e métodos
4.1 Síntese do LQFM-008
O composto etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-carboxilato
(LQFM-008) como peso molecular de 314,17 foi sintetizado no Laboratório de
Química Farmacêutica Medicinal (LQFM) na Faculdade de Farmácia (FF) da
Universidade Federal de Goiás (UFG) sob a orientação do Prof. Dr. Ricado
Menegatti, segundo a rota sintética descrita por BRITO et al., 2012 (127).
Figura 7. Estrutura do composto LQFM-008: etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-
carboxilato.
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos adultos pesando entre
25 e 35 g e com idade entre 9 e 12 semanas, fornecidos pelo biotério central da
UFG e mantidos em condições controladas de temperatura e iluminação (ciclo
claro/escuro normal de 12 h), ração e água ad libitum. O manuseio dos animais em
todos os modelos experimentais foi executado de acordo com os protocolos
experimentais aprovados pelo comitê de Ética em pesquisa da CEUA/UFG, sob n°
047/14.
4.3 Fármacos e reagentes
Os reagentes e fármacos usados foram: Carragenina (Sigma Chemical, EUA);
Dimorf® (Cristália-Ltda, Brasil); Formaldeído (Synth, Brasil); Indometacina (Sigma
Chemical, EUA); Naloxona (Sigma, St. Louis, USA); NAN-190, Hidrobrometo de 1-(2-
metoxifenil)-4-[4-(2-phthalimido)-butil]-piperazina (Sigma Chemical, EUA); PCPA, p-
27
clorofenilalanina (Sigma-Aldrich, Brasil);LQFM008, sintetizada no laboratório de
Química Farmacêutica Medicinal da Faculdade de Farmácia –UFG. LQFM-008 foi
dissolvido e solubilizado em 2% de Tween-80 em água destilada, já o PCPA foi
dissolvido e solubilizado em 2% de Tween-80 em solução salina. Todos os outros
fármacos foram solubilizados em solução salina 0,9%, com exceção da morfina e da
indometacina, as quais foram solubilizadas apenas em água destilada.
4.4 Métodos farmacológicos usados para avaliar o composto LQFM-008
4.4.1 Avaliação da atividade antinociceptiva
4.4.1.1 Teste da dor Induzida por Formalina
Foram utilizados grupos experimentais de camundongos (n = 8) tratados pela via
oral com veículo (10 mL/kg), LQFM-008 (24, 48 e 96 µmol/kg), indometacina (28
µmol/kg), ou pela via subcutânea com morfina (17,5 µmol/kg). Uma hora após os
tratamentos por v.o. ou 30 minutos após o tratamento pela via s.c, foram injetados
20 μL de formalina 3% v/v (formaldeído 1,2% v/v) na pata posterior direita dos
animais. Após a injeção do agente flogístico os animais foram observados
individualmente durante 30 minutos em caixa de acrílico com fundo especular para
auxiliar a visualização e foi cronometrado o tempo em que os mesmos lambiam ou
mordiam a pata lesionada, permitindo avaliar dois tipos de dor, a de origem
neurogênica que ocorre durante os primeiros 5 minutos devido à estimulação direta
nas terminações nociceptivas, e a de origem inflamatória que ocorre no período de
15 a 30 minutos, sendo produzida pela liberação de mediadores inflamatórios (129).
4.4.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória
4.4.2.1 Edema de pata induzido por carragenina
Inicialmente os grupos de camundongos (n=8) foram tratados com veículo 10
mL/kg v.o, ou LQFM-008 (24, 48 e 96 µmol/kg), ou indometacina 28 µmol/kg v.o.
Uma hora após o tratamento foi injetado 50 µL de carragenina (1%) intraplantar na
28
pata posterior direita. A pata posterior esquerda (contra lateral) foi utilizada como
controle, e recebeu uma injeção contendo o mesmo volume (50 µL) de solução
salina (NaCl 0,9 %). O volume basal de ambas as patas foi medido com o uso do
aparelho Pletismômetro e após a injeção de carragenina o edema foi avaliado nos
intervalos de tempo de 1, 2, 3 e 4 horas. A formação do edema foi avaliada pela
diferença de volume entre as patas (130).
4.4.2.2 Pleurisia induzida por carragenina
Os grupos de camundongos (n=8) receberam pelo plexo orbital, 200 μL da uma
solução de azul de Evans a 2,5% duas horas antes dos tratamentos via oral com
veículo (10 mL/kg), LQFM-008 (96 µmol/kg) ou dexametasona (5 µmol/kg). 60
minutos após os tratamentos os animais receberam uma injeção de 100μL de
carragenina 1% na cavidade pleural a fim de promover a formação processo
inflamatório ou 100μL de salina 0,9% como controle do teste. Quatro horas após a
indução do processo inflamatório foi feita a coleta do exsudato pleural e uma
alíquota foi usada para fazer a contagem do número de leucócitos totais e outra
alíquota foi utilizada para a determinação da concentração do azul de Evans (131).
4.4.3 Testes para avaliar o efeito antinociceptivo central
4.4.3.1 Teste da flexão de cauda
Os grupos de animais (n= 8) foram tratados pela via oral com veículo (10
mL/kg), LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg ou pela via subcutânea com
morfina (17,5 µmol/kg). O terço distal da cauda dos animais foi exposto a uma fonte
de calor como estímulo nociceptivo, utilizando um analgesímetro térmico (Modelo
Tail Flick EFF300L Insight®). O tempo até a retirada da cauda, também chamado
de período de latência, foi utilizado como índice de nocicepção. O tempo máximo
permitido de exposição ao estímulo foi de 20 s. As latências foram medidas em
segundos nos tempos: -30, 0, 30, 60, 90, 120 e 150 minutos dos tratamentos (132).
29
4.4.3.2 Teste da placa quente
Foram utilizados grupos experimentais de camundongos (n = 8) tratados com
veículo (10 mL/kg), LQFM-008 48 e 96 µmol/kg v.o. ou morfina (17,5 µmol/kg s.c.),
os quais foram colocados sobre a superfície de uma placa de metal previamente
aquecida a 55,5 + 0,5ºC. Foi cronometrado o tempo em segundos que o animal
levou para lamber, abanar ou levantar uma das patas traseiras, sendo este
comportamento nociceptivo considerado como indicativo da latência a dor (133). O
tempo máximo permitido de permanência dos animais na placa quente foi de 20
segundos, para não causar danos teciduais aos mesmos. O tempo para a
reatividade a dor foi medido em segundos nos tempos -30, 0, 30, 60, 90, 120, 150 e
180 dos tratamentos.
4.4.4 Testes para avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade
antinociceptiva de LQFM-008
4.4.4.1 Avaliação do envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-
008
Com o objetivo de verificar a participação do sistema opióide no efeito
analgésico da LQFM-008, foi utilizando o teste da dor induzida pela formalina. Os
grupos foram pré-tratados, pela via subcutânea, com salina 10 mL/kg ou com
naloxona 7,5 µmol/kg (antagonista opióide) e foram subdivididos em grupos (n=8)
que receberam os seguintes tratamentos, após 15 min., veículo 10 mL/kg (v.o.),
LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.) ou Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.), tabela 1. Sessenta
minutos depois do tratamento oral ou trinta minutos após o tratamento subcutâneo,
os animais receberam formalina (3%, v/v) na pata direita e foram observadas,
conforme descrito no item 4.4.1.1.
30
Tabela 1. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do envolvimento
dos receptores opióides.
Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (s.c.) Tratamentos
Sal + Veículo Salina 10 mL/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
Nal + Veículo Naloxona 7,5 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
Sal + LQFM-008 Salina 10 mL/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
Nal + LQFM-008 Naloxona 7,5 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
Sal + Morfina Salina 10 mL/kg Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.)
Nal + Morfina Naloxona 7,5 µmol/kg Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.)
4.4.4.2 Avaliação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito do
LQFM-008
Com o objetivo de avaliar a possível participação dos receptores 5HT1A no
efeito antinociceptivo de LQFM-008, foi feito o teste da dor induzida pela formalina
utilizando NAN-190, antagonista 5HT1A. Os grupos foram pré-tratados, pela via
intraperitoneal, com salina 10 mL/kg ou com NAN-190 1,3 µmol/kg e foram
subdivididos em grupos (n=8) que receberam os seguintes tratamentos, após 15
min., veículo 10 mL/kg (v.o.) ou LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.). Tabela 2. Sessenta
minutos depois do tratamento oral os animais receberam formalina (3%, v/v) na pata
direita e foram observadas, conforme descrito no item 4.4.1.1.
Tabela 2. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do envolvimento
dos receptores 5HT1A.
Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (i.p.) Tratamentos
Sal + Veículo Salina 10 mL/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
NAN + Veículo NAN-190 1,3 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
Sal + LQFM-008 Salina 10 mL/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
NAN + LQFM-008 NAN-190 1,3 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
31
4.4.4.3 Avaliação do envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-
008
Para pesquisar uma possível ação indireta de LQFM-008 sobre os receptores
serotoninérgicos os animais foram pré-tratados, pela via intraperitoneal, com salina
10 mL/kg ou com PCPA 500 µmol/kg, uma vez por dia, durante 4 dias consecutivos.
Em seguida, 1h após a ultima injeção de PCPA ou Salina, os animais foram tratados
com veículo 10 mL/kg (v.o.) ou LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.). e, sessenta minutos
após este tratamento, foram submetidos ao teste da formalina, conforme descrito no
item 4.4.1.1. Tabela 3.
Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do envolvimento
da setoronina endógena
Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (i.p.) Tratamentos
Sal + Veículo Salina 10 mL/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
PCPA + Veículo PCPA 500 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)
Sal + LQFM-008 Salina 10 mL/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
PCPA + LQFM-008 PCPA 500 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)
4.4.5 Análise estatística
Os dados foram analisados como médias ± erro padrão das médias. As
diferenças entre dois grupos foram detectadas pelo teste t de Student e entre três ou
mais grupos pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de
Newman-keuls ou ANOVA de duas vias seguida do pós teste Bonferroni. As
diferenças foram consideradas significativas quando p ≤ 0,05 (134). A análise
estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 5.0®.
32
Resultados
33
5. Resultados
5.1 Efeito antinociceptivo de LQFM-008
5.1.1 Efeito do LQFM-008 no teste da dor Induzida pela Formalina
Na primeira fase do teste de dor induzida pela formalina (0-5 min.) os
tratamentos com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg ou morfina (17,6
µmol/kg) reduziram significativamente o tempo de reatividade à dor em 16, 34 e
90%, respectivamente, quando comparados com o grupo controle, tratado com
veículo 10 mL/kg. Na segunda fase (15-30 min.), os tratamentos com LQFM-008 nas
doses de 48 e 96 µmol/kg reduziram o tempo de reatividade à dor em 26 e 40%,
respectivamente, e conforme esperado, os controles positivos indometacina (28
µmol/kg) e morfina também reduziram o tempo de reatividade a dor em 40 e 96%,
respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo 10 mL/kg), (Figura 8). A
partir deste teste foi possível estabelecer uma ID50 para LQFM-008 que foi de 44,19
mg/kg na primeira fase do teste e 37,21 mg/kg na segunda fase.
1ª Fase
0
20
40
60
80
100
*
***
***
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
2ª Fase
0
50
100
150
200
250Veículo 10 mL/kg v.o.
LQFM-008 24 µmol/kg v.o.
LQFM-008 48 µmol/kg v.o.
LQFM-008 96 µmol/kg v.o.
Indometacina 28 µmol/kg v.o.
Morfine 17,5 µmol/kg s.c.
******
***
***
* p 0,05
*** p 0,001
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
Figura 8. Efeito do LQFM-008, no teste da dor induzida por formalina, primeira fase (0-5 min) e
segunda fase (15-30 min.). As barras verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do
tempo de reatividade a dor dos animais expresso em segundos (n=8). Indometacina e morfina foram
utilizadas como controles positivos. * p ≤ 0,05 *** p ≤ 0,001 indicam os níveis de significância das
diferenças entre os grupos tratados e o grupo controle (tratado com veículo) na primeira fase e na
segunda fase, segundo análise de variância seguido do pós-teste Newman-Keuls.
34
5.2 Efeito anti-inflamatório de LQFM-008
5.2.1 Efeito do LQFM-008 no teste do edema de pata induzido por carragenina
No edema de pata induzido por carragenina, os tratamentos com LQFM-008
nas doses de 24, 48 e 96 µmol/kg (v.o.) ou indometacina 28 µmol/kg (v.o.) reduziram
o edema na 1° hora em 14, 29, 26, e 35%, respectivamente. A partir da 2° hora em
diante apenas os tratamentos com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg (v.o.)
ou indomentacina 28 µmol/kg (v.o.) foram capazes de reduzir significamente o
edema. Sendo assim, na 2ª hora foi observada uma redução de 28, 26 e 44 %,
respectivamente. Já na 3ª hora a redução do edema foi de 35, 29, e 53 %,
respectivamente, e por fim, na 4ª foi observada uma redução de 31, 28 e 52 %,
respectivamente. (Figura 9).
0 1 2 3 40
30
60
90
120
150
180Veículo 10 mL/kg v.o.
LQFM-008 24 µmol/kg v.o.
LQFM-008 48 µmol/kg v.o.
LQFM-008 96 µmol/kg v.o.
Indometacina 28 µmol/kg v.o.******
***
*** ****** ***
*
* p < 0.05*** p < 0.001
Tempo (Horas)
Dif
ere
nça e
ntr
e a
s p
ata
s (
µL
)
Figura 9. Efeito do LQFM-008 no edema de pata induzida por carragenina. Os símbolos e barras
verticais indicam média ± erro padrão das médias das diferenças de volume (µL) entre as patas em
diferentes tempos após a aplicação da carragenina na pata direita e salina na esquerda. Os grupos
de animais (n=8) foram tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM008 (24; 48 e 96 µmol/kg) ou
indometacina 10 mg/kg. * p ≤ 0,05 e *** p ≤ 0,001. Indicam o nível de significância das diferenças
entre os grupos tratados e o controle, segundo análise de variância de duas vias seguida do pós-teste
de Bonferroni.
35
5.2.2 Efeito do LQFM-008 no teste da pleurisia induzida por carragenina
No teste da pleurisia induzida por carragenina, os tratamentos com LQFM-008
96 µmol/kg ou dexametasona 5 µmol/kg foram capazes de reduzir significamente a
migração celular em 26 e 58% respectivamente, quando comparado ao grupo
controle (7,790 ± 0,1991 Leucócitos x 106/mL) (Figura 10). Estes mesmos
tratamentos também reduziram significamente a exsudação proteica em 24 e 44%
em relação ao grupo controle (3,417 ± 0,2306 µg/mL - Concentração do Azul de
Evans) (Figura 11).
0
2
4
6
8
_______
Veículo
10 mL/kg
_______
Veículo
10 mL/kg
_______
LQFM-008
96 µmol/kg
_______
Dex
5 µmol/kg
______ _________________Salina Carragenina 1%
Leu
có
cit
os x
10
6/m
L
***
***
#
*** p 0,001
# p 0,05
Figura 10. Efeito do LQFM-008 na migração celular. As barras verticais representam as médias
± erro padrão das médias, do número de leucócitos (leucócitos x 106/mL) na pleurisia induzida
por carragenina (n=8). Dexametasona foi utilizada como controle positivo. *** p ≤ 0,001 indica o
nível de significância da diferença entre os grupos tratados com LQFM-008 ou Dexamentasona
e o grupo controle (tratado com veículo) e # p ≤ 0,05 indica o nível de significância da diferença
entre o grupo tratado com salina e o grupo controle, segundo análise de variância seguido do
pós-teste Newman-Keuls.
36
0
1
2
3
4
***
#
_______
Veículo
10 mL/kg
_______
Veículo
10 mL/kg
_______
LQFM-008
96 µmol/kg
_______
Dex
5 µmol/kg
______ _________________Salina Carragenina 1%
**
** p 0,01
*** p 0,001
# p 0,05[A
zu
l d
e E
van
s]
(µg
/mL
)
Figura 11. Efeito do LQFM-008 na exsudação de proteínas. As barras verticais representam as
médias ± erro padrão das médias, da concentração de corante azul de Evans na pleurisia induzida
por carragenina (n=8). Dexametasona foi utilizada como controle positivo. ** p ≤ 0,05 e *** p ≤ 0,001
indicam o nível de significância das diferenças entre os grupos tratados com LQFM008 ou
Dexamentasona e o grupo controle (tratado com veículo) e # p ≤ 0,05 indica o nível de significância
da diferença entre o grupo tratado com salina e o grupo controle, segundo análise de variância
seguido do pós-teste Newman-Keuls.
5.3 Efeito de LQFM-008 nos testes para avaliação da atividade antinociceptiva
central
5.3.1 Efeito do LQFM-008 no teste de flexão de cauda
Os tratamentos via oral com ambas as doses de LQFM-008, 48 e 96 µmol/kg,
foram capazes de aumentar a latência ao estímulo térmico. LQFM-008 na dose de
48 µmol/kg demonstrou ter uma significativa atividade antinociceptiva nos tempos de
60 e 90 minutos, onde foi capaz de aumentar o tempo de latência ao estímulo
térmico em 77 e 94%, respectivamente. A dose de 96 µmol/kg de LQFM-008
também foi capaz de aumentar significamente a latência ao estímulo térmico nos
tempos de 30, 60 e 90 minutos, em 82, 116 e 92%, respectivamente. Como
esperado, o tratamento com o controle positivo do teste, morfina 17,5 µmol/kg (s.c.),
aumentou a latência ao estímulo térmico de 30 a 180 minutos do tratamento em 82;
37
236, 235, 237, 127 e 69%, respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo
10 mL/kg) (Figura 12).
-30 0 30 60 90 120 150 1800
3
6
9
12
15
18 Veículo 10 mL/kg v.o.
LQFM-008 48 µmol/kg v.o.
LQFM-008 96 µmol/kg v.o.
******
***
***
***
***
***
***
*** p 0,001
Morfina 17,5 µmol/kg s.c.
***
Tempo (min)
Latê
ncia
(s)
Figura 12. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste de flexão de cauda. Nas
ordenadas estão representados os tempos de latência ao estímulo térmico expressos em segundos.
Os símbolos indicam as médias ± erro padrão das médias dos tempos para reação dos animais (n=8)
ao estímulo térmico nos diferentes tempos do tratamento. ***p ≤ 0,001 indica o nível de significância
das diferenças entre os grupos tratados e o veículo, segundo análise de variância de duas vias
seguida do pós-teste Bonferroni.
5.3.2 Efeito do LQFM-008 no teste de placa quente
No teste da placa quente os tratamentos com o LQFM-008 tanto na dose de
48 µmol/kg quanto na dose de 96 µmol/kg foram capazes de aumentar
significamente a latência ao estímulo térmico. O tratamento com LQFM-008 na dose
de 48 µmol/kg aumentou a latência ao estímulo térmico nos tempos de 60, 90, 120,
150 e 180 minutos em 61, 100, 92, 51, 55%. Já o tratamento com LQFM008 na dose
de 96 µmol/kg apresentou atividade antinociceptiva nos tempo de 30 a 180 minutos,
aumentando significamente a latência ao estímulo térmico em 63, 84, 121, 122, 95,
96%. O controle positivo morfina 17,5 µmol/kg (s.c.) também aumentou o tempo de
reatividade ao estímulo térmico de 30 a 180 minutos do tratamento em 255, 335,
354, 271, 186, 111%, respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo 10
mL/kg) (Figura 13).
38
-30 0 30 60 90 120 150 1800
3
6
9
12
15
18
21Veículo 10mL/kg v.o.
LQFM-008 48 µmol/kg v.o.
LQFM-008 96 µmol/kg v.o.
Morfina 17,5 µmol/kg s.c.
***
*** ***
***
***
******
****** ******
****** ***
** **** ** p 0,01
*** p 0,001
Tempo (min)
Latê
ncia
(s)
Figura 13. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste da placa quente. Nas
ordenadas estão representados os tempos de latência ao estímulo térmico expressos em segundos.
Os símbolos indicam as médias ± erro padrão das médias dos tempos para reação dos animais (n=8)
ao estímulo térmico nos diferentes tempos do tratamento. ** p ≤ 0,01 e *** p ≤ 0,001 indicam os níveis
de significância das diferenças entre os grupos tratados e o controle, segundo análise de variância de
duas vias seguida do pós-teste Bonferroni.
5.4 Mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva de LQFM-008
5.4.1 Envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-008
O pré-tratamento dos animais com naloxona 7,5 µmol/kg (antagonista dos
receptores opióides) reverteu completamente o efeito antinoceptivo de LQFM-008 96
µmol/kg (v.o.) e da morfina 17,5 µmol/kg (s.c.) na primeira fase do teste da
formalina. Já na segunda fase, a naloxona não foi capaz de reverter o efeito de
39
LQFM-008, porém reverteu completamente o efeito da morfina (Figura 14).
1ª Fase
0
20
40
60
80
100
Sal Nal Sal Nal Sal Nal___________
Veículo
10 mL/kg v.o.
__________
LQFM-008
96 µmol/kg v.o.
__________
Morfina
17,5 µmol/kg s.c.
***
***
# # #
# # #
*** p 0,001
# # # p 0,001
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
0
50
100
150
200
250
2ª Fase
Sal Nal Sal NalSal Nal___________
Veículo
10 mL/kg v.o.
__________
LQFM-008
96 µmol/kg v.o.
__________
Morfina
17,5 µmol/kg s .c.
***
***
# # #
***
*** p 0,001
# # # p 0,001
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
Figura 14. Envolvimento da via opióide no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida pela
formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As barras
verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos
animais expresso em segundos. Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou
naloxona e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de
significância das diferenças em relação ao grupo salina + veículo, na primeira e segunda fase, e # #
# p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância seguido do pós-teste
Newman-Keuls.
40
5.4.2 Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito de LQFM-008
O pré-tratamento dos animais com NAN-190 1,3 µmol/kg foi capaz de reverter
completamente o efeito antinoceptivo da LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.) na primeira
fase e parcialmente na segunda fase do teste da formalina. (Figura 15).
1ª Fase
0
20
40
60
80
Salina NAN
10 mL/kg 1,3 µmol/kg_________________
Veículo
10 mL/kg v.o.
_________________
LQFM
96 µmol/kg v.o.
***
# # #
*** p 0,001
# # # p 0,001
Salina NAN
10 mL/kg 1,3 µmol/kg
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
2ª Fase
0
50
100
150
200
250
_________________
Veículo
10 mL/kg v.o.
Salina NAN
10 mL/kg 1,3 µmol/kg_________________
LQFM
96 µmol/kg v.o.
***
# #
*** p 0,001
# # p 0,01
Salina NAN
10 mL/kg 1,3 µmol/kg
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
Figura 15. Envolvimento da via serotoninérgica no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida pela
formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As barras
verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos
animais expresso em segundos.Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou NAN-
190 e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de
significância das diferenças em relação ao grupo salina + veículo, na primeira e segunda fase, e # #
# p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância seguido do pós-teste
Newman-Keuls.
41
5.4.3 Envolvimento da serotonina endógena no efeito de LQFM-008
O pré-tratamento dos animais com PCPA 500 µmol/kg durante quatro dias foi
capaz de reverter completamente o efeito antinoceptivo da LQFM-008 96 µmol/kg
(v.o.) na primeira fase e parcialmente na segunda fase do teste da formalina. (Figura
16)
1ª Fase
0
20
40
60
80
100
Salina PCPA
10 mL/kg 500 µmol/kg Salina PCPA
10 mL/kg 500 µmol/kg_________________
Veículo
10 mL/kg v.o.
_________________
LQFM-008
96 µmol/kg v.o.
*** p 0,001
# # # p 0,001
***
# # #
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
2ª Fase
0
50
100
150
200
250
_________________
Veículo
10 mL/kg v.o.
_________________
LQFM-008
96 µmol/kg v.o.
Salina PCPA
10 mL/kg 500 µmol/kg
Salina PCPA
10 mL/kg 500 µmol/kg
*** *** p 0,001
# # p 0,01
# #
Tem
po
de r
eati
vid
ad
e (
s)
Figura 16. Envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida
pela formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As
barras verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos
animais expresso em segundos. Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou PCPA
e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de
significância das diferenças em relação ao grupo salina + veículo, na primeira e segunda fase, e # #
p ≤ 0,01; # # # p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância
seguido do pós-teste Newman-Keuls.
42
Discussão
43
6. Discussão
A crescente busca e necessidade por substâncias inovadoras para obtenção
de tratamentos eficazes, seguros e com menos efeitos colaterais contribuiu de forma
significativa para a sofisticação da química farmacêutica medicinal, ciência que visa
o planejamento e desenvolvimento de novos fármacos a partir da descoberta,
inovação, síntese, modificação molecular, extração, identificação e isolamento de
substâncias bioativas, bem como suas respectivas relações entre estrutura química
e atividades biológicas (135).
A química medicinal dispõe de diversos métodos eficientes para otimização
de parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de diversos compostos. A
descoberta de novos fármacos a partir da modificação estrutural de compostos
conhecidos leva à identificação de novos compostos-protótipos que atuam pelo
mesmo mecanismo farmacológico do composto original. Esta estratégia é
largamente empregada na indústria farmacêutica que pesquisa novos fármacos a
partir da síntese de compostos cada vez mais ativos, com biodisponibilidade
satisfatória, baixa toxicidade e com poucos efeitos colaterais (135, 136).
Levando em conta estes princípios, foi desenvolvido o composto LQFM-008,
um derivado piperazínico originalmente desenhado a partir da clozapina através da
estratégia de simplificações moleculares. O primeiro estudo feito com este composto
em relação aos seus possíveis efeitos farmacológicos foi realizado por BRITO et al.,
2012 (127), onde foi observada uma atividade do tipo ansiolítica envolvendo a via
serotoninérgica. Além disto, foi realizado um estudo para avaliação geral da
atividade farmacológica de LQFM-008, mostrando que efeitos neurotóxicos são
observados somente com doses superiores a 600 µmol/kg. Outra pesquisa
envolvendo este mesmo composto revelou que o mesmo também possui
propriedades hipotensiva, anti-hipertensiva e vasorrelaxante, envolvendo vias
serotoninérgicas, colinérgicas e do óxido nítrico (128).
Os derivados piperazínicos representam uma importante classe de compostos
químicos com unidades estruturais privilegiadas favorecendo um amplo espectro de
atividades biológicas e presentes em fármacos de diferentes classes terapêuticas
como, por exemplo, antipsicóticos, antidepressivos, anti-histamínicos, entre outras.
Alguns estudos mostraram que derivados piperazínicos também apresentam
atividades anti-cancerígenas (137), anti-infecciosa (138) e antinociceptiva (125, 139).
44
Com o objetivo de avaliar uma possível atividade antinociceptiva e/ou anti-
inflamatória do composto LQFM-008, o primeiro teste empregado foi o teste da dor
induzida pela formalina. Este teste possui duas fases distintas que permitem avaliar
dois tipos de dor: a dor neurogênica que corresponde à primeira fase do teste e
ocorre nos 5 primeiros minutos após a aplicação da formalina, bem como a dor
inflamatória que corresponde à segunda fase do teste e ocorre entre 15-30 minutos
após a injeção de formalina. A dor neurogênica observada neste teste acontece
devido à estimulação química direta dos nociceptores pela formalina além da
participação de mediadores periféricos pré-formados. Já a dor inflamatória está
relacionada com o envolvimento de vários mediadores pró-inflamatórios como
histamina, bradicinina, serotonina, prostaglandinas, taquicininas e glutamato
responsáveis pela estimulação de nociceptores (130, 140, 141, 142, 143).
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que o tratamento dos
animais com o composto LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg reduziu o tempo
de reatividade à dor em ambas as fases, sendo que, com a maior dose testada
houve uma redução de 34% na primeira fase e de 40% na segunda fase. Ademais,
com a menor dose (24 µmol/kg) não foi visto efeito em nenhuma das fases. Com
estes resultados, foi possível observar uma ação sugestiva de atividade
antinociceptiva central do LQFM-008 devido à redução da dor nas duas fases do
teste, não sendo possível diferenciar este efeito de uma atividade anti-inflamatória
que é determinada quando há redução significativa apenas na segunda fase do
teste, fazendo-se necessário avaliar o composto em modelos mais específicos de
dor e inflamação.
Para investigação de uma possível atividade anti-inflamatória do composto
LQFM-008 foi realizado o teste de edema de pata induzido por carragenina, o qual
permite avaliar a ação de fármacos com propriedades anti-inflamatórias sobre a
formação do edema, bem como sobre o aparecimento de outros parâmetros
envolvidos no processo inflamatório, uma vez que sinais cardinais da inflamação
como o edema, hiperalgesia e vermelhidão são observados imediatamente após a
injeção subcutânea de carragenina, resultantes da ação de agentes pró-
inflamatórios como bradicinina, histamina, taquicininas e espécies reativas de
oxigênio (144).
Durante a formação do edema ocorrem vários eventos sobre a
microcirculação, começando com uma leve vasoconstrição, seguida de dilatação,
45
aumento do fluxo local e da permeabilidade vascular que leva ao extravasamento de
líquidos e proteínas para o interstício (145, 146). A injeção sub-plantar de
carragenina na pata dos animais provoca um processo inflamatório agudo, não
imune, onde há a formação do edema que é constituído de três fases. Na primeira
hora, logo após a injeção da carragenina, há aumento da permeabilidade vascular
mediada principalmente por histamina e serotonina. Na segunda hora, o aumento da
permeabilidade é ocasionado predominantemente por cininas e na terceira hora pela
ação das prostaglandinas (144, 147, 148, 149).
Os resultados mostram que o tratamento dos animais com LQFM-008 na
dose de 24 µmol/kg no teste do edema de pata induzido por carragenina, reduziu a
formação do edema apenas na primeira hora, porém, com as doses de 48 e 96
µmol/kg houve redução do edema em todas as horas do teste, mostrando assim,
que este composto possui atividade anti-edematogênica semelhante ao controle
positivo indometacina, e um provável efeito anti-inflamatório que pode estar
contribuindo para o efeito antinociceptivo visto na segunda fase do teste da
formalina.
Outro teste realizado para confirmar o efeito anti-inflamatório do LQFM-008 foi
o da pleurisia induzida por carragenina. Este modelo caracteriza-se pelo acúmulo de
exsudato na cavidade pleural além do influxo rápido de células polimorfonucleares,
seguido de infiltração de células mononucleares. A pleurisia induzida por
carragenina é um modelo de inflamação aguda usualmente utilizado para se avaliar
os efeitos anti-inflamatórios de novos compostos candidatos a fármacos, bem como
a importância de mediadores inflamatórios (131, 150, 151). Partindo do princípio que
em um processo inflamatório agudo ocorre aumento da permeabilidade vascular e
consequentemente extravasamento de líquidos e proteínas para o interstício, foi feita
uma adaptação no teste da pleurisia induzida por carragenina com o objetivo de
quantificar o volume da exsudação proteica para a cavidade pleural utilizando o
corante Azul de Evans, o qual possui a capacidade de se ligar a proteínas
plasmáticas. Este corante é bastante utilizado em diversos estudos experimentais de
processos inflamatórios induzidos em animais a fim de se determinar as respostas
vasculares frente a diferentes agentes farmacológicos, ressaltando a vantagem
sobre outros marcadores protéicos por não ser tóxico, ter alta solubilidade em água
e ser mensurável através da espectrofotometria (146, 152, 153).
46
O tratamento com LQFM-008 na dose de 96 µmol/kg no teste da pleurisia
induzida por carragenina utilizando Azul de Evans reduziu a migração celular e a
exsudação proteica em 26 e 24%, respectivamente, confirmando a atividade anti-
inflamatória do composto LQFM-008 observada na segunda fase da formalina e no
teste do edema de pata induzido por carragenina.
Com intuito de se investigar o mecanismo de ação envolvido no efeito
antinociceptivo de LQFM-008 visto no teste de dor induzida por formalina, foram
realizados os testes de flexão de cauda que mostra uma ação central-espinhal e o
teste da placa quente que mostra uma ação supra-espinhal. Ambos os testes usam
o estímulo térmico para avaliar a atividade antinociceptiva mediada por mecanismos
centrais. O teste de flexão de cauda é realizado utilizando uma fonte de calor que é
emitida no terço distal da cauda do animal promovendo um movimento reflexo de
retirada devido à alta temperatura. Já o teste da placa quente é feito utilizando a
superfície de uma placa de metal previamente aquecida, onde os animais são
colocados e então é cronometrado o tempo em que o animal leva para reagir ao
estímulo térmico, sendo esta uma resposta supra-espinal. Vale ressaltar que
temperaturas muito elevadas em ambos os testes não são adequadas devido ao
risco de queimaduras (132, 133, 140).
Os tratamentos dos animais com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg
foram capazes de aumentar a latência ao estímulo térmico nos testes de flexão de
cauda e placa quente, porém ao comparar o efeito observado em ambos os teste
pode-se notar uma diferença temporal que mostra um efeito mais prolongado nas
respostas moduladas pelas vias supra-espinais à nocicepção. Sendo assim, o efeito
antinoceptivo do composto LQFM-008 verificado no teste de dor induzida por
formalina pode ser decorrente de uma ação analgésica envolvendo mecanismos
centrais.
Devido às suas características lipofílicas e o tamanho das moléculas, alguns
derivados piperazínicos possuem a capacidade de atravessar a barreira hemato-
encefálica e atuar no sistema nervoso central e por isso alguns deles são utilizados
no tratamento de perturbações mentais, tais como ansiedade e depressão (154,
155). Em estudos anteriores LQFM-008 demonstrou ter atividade ansiolítica
envolvendo a participação de receptores de serotonina 5-HT1A e, além disso, parece
ter potencial para ser um composto com propriedades antidepressivas (127).
47
Evidências relatam que fármacos antidepressivos possuem propriedades
analgésicas que são promovidas por uma série de possíveis mecanismos de ação,
podendo ser ocasionada através da ativação do sistema opióide endógeno ou pela
interação com a via descendente serotoninérgica e/ou adrenérgica do sistema de
controle da dor (156, 157, 158).
Objetivando investigar alguns dos mecanismos envolvidos na resposta
antinociceptiva produzida por LQFM-008, foi realizado o teste da formalina, a fim de
estudar o envolvimento dos receptores opióides com tal efeito. Os resultados
demonstram que os receptores opióides podem estar envolvidos no efeito
antinociceptivo de LQFM-008, uma vez que a naloxona, antagonista não-seletivo de
receptores opióides, não somente antagonizou o efeito antinociceptivo da morfina,
agonista não-seletivo de receptores opióides, como também reverteu o efeito
antinociceptivo promovido pela LQFM-008 na primeira fase do teste da formalina.
As vias descendentes inibitórias no sistema nervoso central constitui um dos
principais mecanismos de controle da dor e um dos locais de ação de analgésicos
opiódes. Os opióides são capazes de ativar indiretamente (através da inibição de
neurônios GABAérgicos no núcleo da rafe magna) os neurônios da via descendente
que por sua vez inibem os estímulos nociceptivos no corno dorsal da medula
espinal, por meio da liberação de 5-HT, o principal neurotransmissor desta via (159,
160, 161). No corno dorsal da medula os opióides ainda podem agir inibindo a
transmissão de neurotransmissores excitatórios pelos neurônios aferentes primários,
ou ainda hiperpolarizar o neurônio de segunda ordem, impedindo a transmissão do
estímulo nociceptivo para os tratos supra-espinais (159).
Foi evidenciado que o sistema descendente 5-HT desempenha um papel
importante na analgesia de morfina, agonista dos receptores opióides, visto que a
sua ação analgésica pode ser diminuída por uma depleção de 5-HT (162, 163).
De acordo com Millan, 2002 (78), os neurônios da via descendente inibitória,
originados no núcleo da rafe magna, projetam-se até o corno dorsal da medula
espinal, onde liberam 5-HT que ativa os receptores 5-HT3 presentes em
interneurônios inibitórios. Ao serem estimulados, via ativação de 5-HT3, os
interneurônios inibitórios liberam GABA e encefalinas que se ligam a receptores
GABAérgicos e receptores opiódes, respectivamente, presentes nos neurônios de
segunda ordem impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo. A serotonina
liberada no corno dorsal da medula espinal pode também se ligar em receptores 5-
48
HT1B/1D e 5-HT1A, presentes em fibras aferentes primárias e em fibras aferentes
secundárias, respectivamente, contribuindo para a inibição da transmissão
nociceptiva(Figura 5).
Com o objetivo de confirmar a ação do LQFM-008 sobre a via
serotoninérgica foi utilizado o NAN-190, um antagonista do receptor 5-HT1A no teste
de dor induzida por formalina. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com
NAN-190 (1,3 µmol/kg) conseguiu reverter completamente o efeito de LQFM-008 (48
µmol/kg) na primeira fase do teste de formalina e parcialmente na segunda fase do
teste, sugerindo a participação da via serotoninérgica no efeito antinociceptivo
central de LQFM-008.
A presença de receptores 5-HT1A na medula espinal e em áreas do cérebro
envolvidas nos processos de transmissão nociceptiva sugere um possível
envolvimento destes receptores em efeitos antinociceptivos. Muitos destes efeitos
foram obtidos usando testes de nocicepção que envolviam estímulos térmicos de
alta intensidade e duração curta, tais como os testes de movimento de cauda e em
placa quente. No modelo de dor induzida por formalina, foi visto que o composto 8-
OH-DPAT (8-hidroxi-2- [di-N-propilamino] tetralina), agonista 5-HT1A, administrado
sistemicamente foi capaz de produzir efeitos analgésicos (163).
AIRA et al., 2010 (164) relataram que agonistas 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2C ou 5-
HT3 podem diminuir os potenciais evocados por fibras-C na medula espinal de ratos
com dor neuropática induzida por ligação do nervo espinal. No mesmo ano, HUO et
al., (165) também sugeriram que o receptor 5-HT1A presentes no córtex orbital
ventrolateral estão envolvidos na mediação do efeito antinociceptivo descendente
na nocicepção inflamatória persistente.
Para verificar se LQFM-008 estava desempenhando uma ação indireta sobre
os receptores serotoninérgicos foi utilizado o PCPA, inibidor da síntese de
serotonina, no teste de dor induzida por formalina. Os resultados mostraram que o
pré-tratamento com PCPA (500 µmol/kg) conseguiu reverter completamente o efeito
de LQFM-008 (96 µmol/kg) na primeira fase do teste de formalina e parcialmente na
segunda fase do teste, sugerindo uma possível atividade indireta de LQFM-008,
dependente dos estoques endógenos de serotonina, que pode estar atuando
inibindo a recaptação de serotonina ou promovendo sua liberação (166, 167).
O efeito anti-inflamatório periférico de LQFM-008 observado nos testes de
pleurisia e edema de pata pode ser explicado por sua ação sobre as vias
49
serotoninérgicas que controlam funções neuroendócrinas, uma vez LQFM-008 pode
induzir um aumento deste neurotransmissor. Estudos mostraram que, após a
estimulação dos receptores da serotonina pode ocorrer um aumento do hormônio de
libertação de corticotropina (CRH) e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), no
hipotálamo, glândula pituitária e, possivelmente, também na glândula supra-renal,
levando a um aumento no cortisol do plasma e, consequentemente causando efeitos
anti-inflamatórios (168).
Assim o derivado piperazínico LQFM-008 (4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil)
piperazina-1-carboxilato) pode ser um prótotipo de fármaco analgésico, visto que, os
resultados obtidos no presente estudo indicam que o mesmo apresenta atividade
antinoceptiva e anti-inflamatória em testes agudos. Também constatamos que, este
efeito antinociceptivo é decorrente de uma ação central, com o envolvimento dos
receptores opióides e da via serotoninérgica.
50
Conclusão e Perspectivas
51
7. Conclusão e Perspectivas
Com base nos resultados obtidos do composto LQFM-008 neste estudo, conclui-se
que:
• O composto LQFM-008 apresentou atividade antinociceptiva. Sendo que no
teste da dor induzida pela formalina reduziu o tempo de reatividade à dor em
ambas as fases do teste, não permitindo descriminar um efeito anti-
inflamatório independente de um efeito analgésico central;
• A atividade anti-inflamatória de LQFM-008 foi confirmada nos testes de
pleurisia e edema de pata induzidos por carragenina, corroborando com o
efeito encontrado na fase inflamatória do teste da formalina;
• Nos testes de flexão de cauda e placa quente, foi observado que LQFM-008
foi capaz de aumentar à latência ao estímulo térmico, mostrando que o efeito
observado é decorrente de uma ação analgésica central;
• O pré-tratamento com naloxona foi capaz de reverter completamente o efeito
do composto na primeira fase do teste da formalina, porém não alterou o
efeito de LQFM-008 na segunda fase do teste, mostrando que parte do efeito
analgésico envolve uma ação opióide;
• O pré-tratamento com NAN-190 foi capaz de reverter completamente o efeito
do composto na primeira fase do teste e parcialmente na segunda fase
mostrando que o efeito analgésico envolve uma ação serotoninérgica central;
• O pré-tratamento com PCPA foi capaz de reverter completamente o efeito do
composto na primeira fase do teste e parcialmente na segunda fase
mostrando que o efeito analgésico central de LQFM-008 envolve uma ação
indireta sobre os receptores serotoninérgicos, dependente dos estoques
endógenos de serotonina.
52
Como perspectivas, esperamos conseguir esclarecer os mecanismos de ação
envolvidos no efeito anti-inflamatório de LQFM-008 a partir de testes in vivo e in vitro
específicos na inflamação que nos permite avaliar parâmetros como a atividade das
enzimas COX1, COX-2, LOX, fosfolipase A2 e mieoloperoxidase, as quais possuem
importante papel no processo inflamatório. Além disso, temos como objetivo futuro
analisar um possível envolvimento da via serotoninérgica com o efeito anti-
inflamatório de LQFM-008, utilizando modelos experimentais específicos de
inflamação concomitantemente com inibidores ou bloqueadores da via
serotoninérgica bem como fazer a dosagem de corticosterona em ratos ou
camundongos tratados com LQFM-008 para analisar uma possível ação
neuroendócrina exercida por este composto em animais normais ou submetidos a
tratamento com antagonistas de receptores 5-HT ou inibidores da síntese desta
monoamina.
Em relação ao efeito antinociceptivo de LQFM-008, desejamos realizar testes
de nocicepção em modelos animais, fazendo uso de diferentes vias de
administração, bem como de antagonistas específicos de subtipo de receptores
envolvidos na via descendente inibitória da dor, a fim de esclarecer melhor os
mecanismos de ação deste composto.
53
Referências Bibliográficas
54
Referências Bibliográficas
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