Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Os Efeitos do Laser de Baixa Potência na Cicatrização em Lesões Térmicas: Análise
Quantitativa do Colágeno.
Luís Ferreira Monteiro Neto
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos - SP
2004
Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Os Efeitos do Laser de Baixa Potência na Cicatrização em Lesões Térmicas: Análise
Quantitativa do Colágeno.
Luís Ferreira Monteiro Neto
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
São José dos Campos - SP
2004
Dedicatórias A minha esposa, Renata Bedaque Mugayar Monteiro, pois sem sua sabedoria, paciência e amor jamais teria suportado os obstáculos que me fizeram chegar até aqui e me deram tranqüilidade e harmonia, sabendo que nossos filhos estavam em boas mãos. Aos meus filhos Matheus e Amanda que no futuro me desculpem por ficar tanto tempo ausente e às vezes perder momentos importantes da vida de vocês, saibam que tudo isso é por vocês. Aos meus pais, Iracy e Vladimir (in memorian), que tantas vezes abriram mão dos seus sonhos para que os meus pudessem ser realizados. A minha família por todo apoio e por acreditarem em mim. A Deus por caminhar sempre ao meu lado, mesmo quando não merecia.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco, orientador e educador pelo conhecimento, atenção e paciência e pelo pleno apoio na realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. Aos meus diretores padres Prof. Ms. Paulo Vendrame , Prof. Dr. Afonso de Castro, Prof. Edmilson Tadeu, pelo acolhimento recebido durante a realização deste trabalho e principalmente pela ajuda espiritual. Ao meu coordenador Prof. Ms.Evandro Emanoel Sauro , que foi mais que um coordenador, muitas vezes me tratou como filho incentivando e motivando no decorrer deste tempo, obrigado por acreditar em mim.
As Colegas fisioterapeutas, Lorão, Preta, Tathiana, Rafael, Luciano, Juliana, obrigado pela imensa colaboração no trabalho. Ao Prof. Cristiano Manoe l pela atenção e ensinamentos no trabalho experimental. Ao Prof. Dr. Altino de Menenez do laboratório de analises clinicas do Hospital das Clínicas de Marilia, pela colaboração. As colegas Claudia e Ivone , da secretaria do IP&D por toda ajuda dada neste período. Aos colegas de mestrado, em especial ao colega Prof. Ms. Marcos Pereira Brito pelos ensinamentos de como a vida deve ser levada de maneira simples e com lealdade.
RESUMO
O objetivo deste trabalho é descrever, de forma comparativa, os efeitos da
irradiação Laser de baixa potência GaAlAs e InGaAlP, no processo de cicatrização
tecidual, demonstrando em estudos quantitativos se há aumento do colágeno nas
amostras analisadas. A partir dessa análise, intenciona-se demonstrar qual a técnica que
é mais eficaz, comparando estatisticamente os resultados obtidos. Sendo assim, optou-se
por realizar este estudo experimental, pois sabe-se que as agressões em um tecido
causadas por lesões térmicas atingem desde a camada mais superficial até as camadas
mais profundas da pele. No presente trabalho foram utilizados seis grupos de ratos da
raça Wistar, sendo 4 grupos experimentais, um controle e um placebo, os quais sofreram
lesões térmicas seguidas de irradiação com o Laser de 830 nm e 685 nm. Cada
comprimento de onda recebeu a densidade de energia de 4 Jcm2 e 40 J/cm2. Para todos
os grupos a potência foi 35 mW. O grupo placebo, serviu apenas para ser simulada a
irradiação com o Laser e o controle não recebeu irradiação. As amostras foram coradas
em hematoxilina eosina e tricômico de masson, e quantificadas as estruturas
representativas do colágeno. Observou-se que todos os grupos irradiados (685-4, 685-40,
830-4 e 830-40) apresentaram maior quantidade de colágeno, comparados com o
controle e placebo. As melhores respostas foram obtidas com os grupos 685 nm em
ambas as densidades de energia e no 830 nm com 40 J/cm2.
Palavras-Chaves: Laser de baixa potência, Cicatrização de ferida, Queimadura,
Colágeno
ABSTRACT
The main goal of this study is to describe in a comparative way, the effects of the
GaAIAs and InGaAlP low power Laser irradiation in the process of tissue cicatrization,
showing through quantitative studies if there is increase of the collagen in the analysed
samples. Through this analysis, we intend to demonstrate which technique is more
effective, comparing statistically the obtained results. Thus, we decided to carry out this
experimental study, because it’s known that the aggressions in a tissue caused by termal
injuries go from the superficial to the deepest layers of the skin. In the present study, we
used six groups of wistar rats, 4 experimental groups, a control group and a placebo one,
which suffered termal lesions injuries followed by a 830nm and 685nm Laser
irradiation. Every wave length received a 4 J/cm2 and 40 J/cm2 density of energy. For all
the groups, the power was 35mW. The placebo group was just to be simulated the Laser
irradiation and the control group didn’t receive irradiation. The samples were stained in
hematoxilin, eosin and tricotomic of masson and quantified the representative structures
of the collagen. It was observed that all the irradiated groups (685-4, 685-40, 830-4 and
830-40) presented the largest amount of collagen, compared to the control and placebo
groups. The best answers were obtained with the 685nm groups in both densities of
energy and in the 830nm with 40 J/cm2.
Key Words: Low power Laser, Wound cicatrisation, Burn, Collagen
Sumário Pág. 1- Introdução ...................................................................................................... 01
1.1- Pele ................................................................................................................ 03
1.1.2- Epiderme ...................................................................................... 04
1.1.3- Derme............................................................................................ 04
1.1.4- Anexos da Pele.............................................................................. 05
1.1.5- Funções da Pele............................................................................. 05
1.2- Queimadura ............................................................................................... 07
1.3- Processo Inflamatório Agudo.................................................................... 09
1.4- Processo de Cicatrização .......................................................................... 12
1.4-1. Tipos de Cicatrização................................................................................ 13
1.4-2. Fatores que Interferem na Cicatrização .................................................... 14
1.5- Laser.......................................................................................................... 17
1.5-1. Generalidades............................................................................................ 18
1.5-2. Laserterapia na cicatrização ...................................................................... 20
2. Objetivos ....................................................................................................... 24
2.1- Objetivo Geral........................................................................................... 25
2.1-1. Objetivo Específico................................................................................... 25
3- Material e Método ........................................................................................... 26
3.1 - Aprovação pelo Comitê de Ética 27
3.2- Animais de Experimentação 27
3.3 - Caracterização dos Grupos .................................................................. 27
3.4 - Local da Pesquisa ............................................................................... 28
3.5 - Equipamentos ..................................................................................... 28
3.6 - Características do Emissor Laser........................................................ 30
3.7 - Procedimento Cirúrgico...................................................................... 30
3.8 - Terapia Laser de baixa Potência ........................................................ 32
3.9 - Procedimento Laboratorial .................................................................. 34
3.10 - Análise Morfométrica ....................................................................... 34
3.11 - Análise Morfométrica ....................................................................... 34
4- Resultados ........................................................................................................ 41
4.1 – Análise Histológica por Microscopia de Luz .......................................... 42
4.2 – Análise Estatística ................................................................................... 43
4.3 – Análise Quantitativa ................................................................................ 43
4.4 – Grupo Controle (GC) .............................................................................. 44
4.5 – Grupo Placebo (GP) ................................................................................ 45
4.6 – Grupo Irradiado com Laser de 830 nm e 40 J/cm2 (830-40) ................. 46
4.7 – Grupo Irradiado com Laser de 830 nm e 4 J/cm2 (830-4) ...................... 47
4.8 – Grupo Irradiado com Laser de 685 nm e 40 J/cm2 (685-40) .................. 48
4.9 – Grupo Irradiado com Laser de 685 nm e 4 J/cm2 (685-4) ...................... 49
4.10- Espectrofotometria .................................................................................. 52
5- Discussão .......................................................................................................... 53
6- Conclusões ........................................................................................................ 58
Referências Bibliográficas ................................................................................... 60
Anexo .................................................................................................................... 74
Lista de Tabelas e Figuras
Tabela 1 – Classificação dos Laser de baixa potência e seus comprimentos de onda (TÚNER & HODE, 2003). ............................................................................................20 Tabela 2 – Características do Laser de baixa potência utilizado na pesquisa ................30 Tabela 3 – Divisão dos grupos e procedimentos. ...........................................................33 Tabela 4 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................44 Tabela 5– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão ..................................45 Tabela 6– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão ..................................46 Tabela 7 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................47 Tabela 7– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão . ................................48 Tabela 9 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................49 Tabela 10 – Média de colágeno entre as colorações de H&E e Masson ........................50 Tabela 11 – Média percentual de colágeno comparativa por grupo ...............................51 Tabela 12 – Resultados do teste de Tukey HSD, para o percentual de colágeno............52
Figura 1 - Aparelho lser de baixa potência e Óculos de proteção .............................29
Figura 2 – Microscopio, Câmera digital, Microcomputador .....................................29
Figura 3 – Instrumental elaborado para executar a lesão térmica e Termômetro digital...............................................................................................................................31 Figura 4 – Instrumental utilizado para fixação do laser.................................................32 Figura 5 – Tela do programa IMAGELAB, para análise de imagens...........................35 Figura 6 – Representação na forma de histograma obtida através da digitalização de uma lâmina histológica em Masson........................................................................................36 Figura 7 – Representação na forma de histograma obtida através da digitalização de uma lâmina histológica em H&E.., ........................................................................................36 Figura 8 – Campos digitalizados e equalizados na coloração de MASSON, Grupo 830nm, 40 J/cm2 ..................................................................................................37 Figura 9 – Campos digitalizados e equalizados na coloração em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2 ............................................................................................................................38 Figura 10 – Histograma de cores (R:0-0,G:98-138 e B:0-0) da imagem (esquerda),imagem original (acima) e o resultado da segmentação (abaixo) usando os tons de verde (98 a 138). para definir o colágeno....................................................................................................39 Figura 11 – Determinação do percentual de colágeno em Masson, Grupo 830nm, 40 J/cm2 .........................................................................................................................................40 Figura 12 – Determinação do percentual de colágeno em H&E, Grupo 685 nm, 4 J/cm2 .........................................................................................................................................40 Figura 13 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................44
Figura 14 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................45 Figura 15 – Média de colágeno em Masson eH&E.......................................................46 Figura 16 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................47 Figura 17 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................48 Figura 18 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................49 Figura 19 – Média de colágeno entre os grupos............................................................50
Lista de Abreviaturas e Símbolos
A : Área
GaAs : Arseneto de Gálio
GaAlAs : Arseneto de Gálio e Alumínio
COBEA : Código Brasileiro de Experimentação Animal
CO : Comprimento de onda
C02 : Dióxido de Carbono
DE : Densidade de Energia
DP : Densidade de Potência
ATP : Adenosina Trifosfato
cm : Centímetro
cm2 : Centímetro quadrado
E : Energia
g : Gramas
H&E : Hematoxilina e Eosina
He-Ne : Hélio Neônio
InGaAIP : Fosfeto de Índ io Gálio e Alumínio
J : Joule
J/cm2 : Joule por Centímetro quadrado
LBP : Laser de Baixa Potência
LLLT : Low Level Laser Therapy
ml : Mililitro
mm : Milímetros
mm2 : Milímetros quadrados
mW : Miliwatts
Nd:YAG : Neodímio dopado em matriz cristalina de Y3Al5O12
nm : Nanômetro
W : Watts
1. INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
A utilização do laser de baixa intensidade nos processos de reparação
dos tecidos biológicos vem sendo investigados desde a década de 60, quando
Mester (1966) relatou os efeitos benéficos do na bioestimulação tecidual. A
partir daí vários trabalhos vem sendo desenvolvidos para avaliar os possíveis
efeitos do laser e seu comportamento no reparo tecidual e na melhora das
respostas em diversas condições (RIGAU i MAS, 1996; PARIZOTTO, 1999).
Com a crescente utilização do laser de baixa intensidade na área clinica
visando reduzir o tempo de reparo em lesões dermatológicas como úlceras e
lesões abertas sendo estas condições patológicas incapacitantes (LUCAS;
GEMERT; HAAN, 2003; FLEMMING; CULLUM; NELSON, 1999) leva os
pesquisadores a buscar condições e parâmetros mais favoráveis e
comprimentos de ondas mais adequados a essas condições patológicas.
Isso motivou diversos trabalhos experimentais visando descrever os
efeitos do laser utilizando diversos parâmetros e lasers para promover uma
melhor resposta no processo de reparação tecidual (VERA MENDEZ, 2002;
NASCIMENTO, 2002).
No presente trabalho desenvolveu-se um estudo experimental com ratos
submetidos a lesões térmicas a fim de investigar se o uso de diferentes
densidades de energia e comprimentos de onda aumenta a quantidade de
colágeno no processo de reparação tecidual nos primeiros oito dias nestes
animais, utilizando-se do laser de baixa intensidade. Para maior controle foi
utilizado a mesma densidade de potência para ambos comprimentos de onda.
1.1 PELE
1.1 PELE
A pele em termos de superfície e peso é um dos maiores órgãos do
corpo, sendo composta por duas camadas: a epiderme e a derme que estão
fixadas às estruturas subjacentes através da hipoderme.
A hipoderme não faz parte da pele, apenas une a derme aos órgãos
subjacentes e é responsável pelo deslizamento desta, sobre as estruturas na
qual se apóia (SLATTER,1998; SPENCE,1991). A hipoderme é composta
principalmente de gordura com trabéculas de colágeno frouxas e fibras
elásticas, sendo que os vasos cutâneos a atravessa para irrigar as regiões
superjacentes (SLATTER,1998).
1.1.1 Epiderme
A Epiderme é formada por epitélio estratificado pavimentoso
queratinizado, por ser avascular suas células obtém alimento através da difusão
dos leitos capilares da derme. Esta camada é responsável pela retenção hídrica
e regulação térmica protegendo ainda o sistema corporal contra a invasão de
agentes externos, restringindo a perda de água do corpo (O’SULLIVAN;
SCHMITZ,1993).
Para Creed (1958), Lovell e Getty (1957), a epiderme da pele de animais
de pequeno porte com pêlo áspero consiste de três camadas principais: estrato
cilíndrico, estrato espinhoso e estrato córneo.
1.1.2 Derme
A derme, é formada por 90% de fibras colágenas reticulares e elásticas
(SWAIN, 1980). Ela ainda possui nervos e receptores, vasos sangüíneos,
linfáticos, músculos eretores dos pêlos, folículos pilosos e estruturas
glandulares derivadas do ectoderma, além de células como: fibroblastos,
macrófagos, plasmócitos e mastócitos que encontram-se distribuídos por toda a
derme (SLATTER, 1998).
1.1.3 Anexos da Pele
Como anexos da pele encontramos as glândulas sudoríparas, glândulas
sebáceas, pêlos e unhas. As glândulas sudoríparas secretam solução aquosa
de cloreto de sódio, com traços de uréia, fosfatos e sulfatos, com intuito de
dissipar o calor; e as glândulas sebáceas, com função de lubrificação e a
secreção de substâncias tóxicas à determinadas bactérias (JUNQUEIRA,
1996).
1.1.4 Funções da Pele
A pele desempenha várias funções como: base dos receptores
sensoriais responsáveis pelo sentido do tato trata-se de uma fonte organizadora
e processadora de informações; mediadora de sensações; barreira entre o meio
ambiente; fonte imunológica de hormônios para diferenciação de células
protetoras; proteção contra os efeitos da radiação, traumas mecânicos e
elétricos; barreira contra materiais tóxicos e organismos estranhos; regulação
da pressão e do fluxo sangüíneo e linfático; regulação da temperatura;
metabolismo e armazenamento de gordura; reservatório de alimento e água;
importante na respiração; sintetiza compostos importantes como a vitamina D;
barreira contra microrganismos, participando também da homeostasia
(GUIRRO; GUIRRO,2002; JUNQUEIRA; CARNEIRO,1999). A pele também é
denominada como o maior órgão corporal, compreendendo 15% do peso total
de um indivíduo, além de participar da síntese de vitamina D e ser um órgão
sensorial (O’SULLIVAN; SCHMITZ,1993).
A pele é a primeira e última linha de defesa, participando ainda da
queratinização, descamação, produção de substâncias antibacterianas, ácidos
graxos livres insaturados, flora bacteriana simbiótica (GOMES; SERRA;
PELLON,1995).
1.2 QUEIMADURA
1.2 QUEIMADURA
A queimadura é uma lesão cutânea ou mucosa provocada pelo calor ou
por outros agentes físicos. Existem rês tipos de determinação dos graus de
queimaduras: a lesão de primeiro grau é aquela queimadura que atinge a
camada mais externa da pele (epiderme), não provocando modificações
hemodinâmicas, sendo que a região atingida se encontra hiperemiada na
ausência de bolhas ou flictenas,; a lesão de segundo grau atinge tanto a
epiderme quanto parte da derme e se caracteriza principalmente pela formação
de bolhas ou flictenas; já a lesão de terceiro grau acomete a totalidade das
camadas da pele e em muitos casos outros tecidos, como o tecido celular
subcutâneo, músculos e tecido ósseo (GOMES; SERRA; PELLON, 1995).
Essas lesões vão levar a um aumento da permeabilidade vascular,
fazendo com que ocorra perda de água, proteínas no local da lesão, ocorrendo
diminuição do volume sangüíneo suficiente para produzir choque e até a morte
(ROBBINS et al 1986).
Devido ao desaparecimento do tecido protetor, o ambiente torna-se
propício à infecção bacteriana e ao aumento da perda de líquidos em regime
constante de evaporação. A cicatrização, nesses casos, é feita por granulação
e migração do epitélio não agredido presente nas bordas da ferida(DOURADO
1994).
1.3 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO
1.3 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO
Trata -se de resposta imediata a uma lesão, provocando desta forma uma
reação local tecidual no organismo, a um fator irritante dependendo da
gravidade da lesão, podendo causar reação inflamatória na área circulante
devido destruição tecidual.
A inflamação é a resposta do organismo à lesão. Seu objetivo é proteger
o corpo contra a invasão de corpos estranhos e preparar o tecido lesado para a
reparação. O processo de reparo, também conhecido como cicatrização, ocorre
depois da resposta inflamatória (KNIGHT, 2000).
O processo inflamatório é uma tentativa de remover o elemento irritante,
os detritos e as células mortas. Ela também prepara o caminho para o reparo.
Ocorre diversas mudanças tissulares no local da lesão. Há uma proliferação
das células de tecido conjuntivo. Os linfócitos produzem anticorpos que
combatem a infecção e os leucócitos fagocitam as bactérias e as células mortas
ou outros materiais estranhos(THOMSON; SKINNER; PIERCY,1994).
A lesão ao tecido provoca morte celular e ruptura dos vasos sangüíneos.
A finalidade fundamental da fase inflamatória do reparo consiste em livrar a
área de debris e de tecido morto, e em destruir qualquer infecção invasora
anterior ao reparo(KITCHEN; BAZIN, 1998).
A resposta inflamatória é estreitamente entrelaçada como processo de
reparação. Durante a reparação, o tecido agredido é substituído pela
regeneração das células parenquimatosas nativas ou pelo preenchimento do
defeito por tecido fibroblástico (ROBBINS et al ,1996).
O aumento da permeabilidade vascular, que na verdade fica confinado
às pequenas vênulas, logo ocorre, sendo a chave para todos os eventos
inflamatórios subseqüentes(SLATTER, 1998). Qualquer evento que danifique a
estrutura ou a função do tecido altera a capacidade de as células realizarem
seus mecanismos homeostáticos normais ocasionando a resposta inflamatória.
1.4 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
1.4 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
A cicatrização é um evento biológico complexo, o qual envolve
inflamação, proliferação celular e diferenciação. O reparo envolve ações
integradas das células, matriz e mensageiros químicos, e visam restaurar a
integridade do tecido com maior rapidez possível(KITCHEN; BAZIN,1998).
A reparação é um estágio caracterizado pela síntese e deposição de
colágeno. Os estímulos nocivos são removidos, e inicia o crescimento de leitos
capilares na região, aumenta a atividade fibroblástica, formação de colágeno e
desenvolvimento de tecido de granulação. O fechamento de feridas em
músculos e pele leva geralmente 5 a 8 dias. Durante esse estágio é produzido
um tecido conectivo imaturo que é fino e desorganizado(KISNER;
COLBY,1992).
No caso de queimaduras são vários os fatores que entram em ação, e
contribuem invariavelmente para prolongar as curas das lesões, resultando
quase sempre em inflamação, edema e cicatrizes.
1.4.1 Tipos de Cicatrização
A cicatrização de uma ferida pode ser feita logo de início, sem
complicações (cicatrização por primeira intenção) ou lentamente, entravada por
diversos fatores tais como: infecção, necrose, perda de substância (cicatrização
por segunda intenção) ou com uma cicatriz mais marcada (MANUILA;
MANUILA; NICOULIN, 1997). O processo de cicatrização natural de queimados
se dá na maioria dos casos, através da cicatrização por segunda intenção
(VEÇOSO,1993).
A cicatrização por segunda intenção é quando a perda celular e tecidual
é mais extensa, o processo de reparação é mais complicado, a regeneração de
células parenquimatosas é incapaz de recompor integralmente a arquitetura
original. Formam-se quantidades muito maiores de tecido de granulação
(ROBBINS et al,1986).
O processo de cicatrização das queimaduras predispõe à formação de
cicatrizes hipertróficas e contraturas, como são caracterizados pelo importante
aumento na vascularização, de fibroblastos, deposição de colágeno, material
intersticial e edema (ARTZ; MONCRIEF; PRUITT,1980).
1.4.1 Fatores que Interferem na cicatrização
Embora o reparo seja poderosamente programado, algumas ocorrências
podem dificultar o seu processamento. Muitos fatores gerais e locais podem
interferir no mecanismo de reparo e influenciar a evolução natural deste
processo. 0 mais importante deles, é o estado nutricional do indivíduo. KAY et
al. (1987), através da realização de um estudo prospectivo envolvendo a
análise do processo cicatricial em pacientes submetidos à amputação das
extremidades inferiores, relataram que, no grupo representado pelos indivíduos
mal-nutridos, cerca de 40% da amostra, exibiu complicações sistêmicas ou
locais no período pós-operatório.
Durante muito tempo, vem sendo demonstrado, que a carência de
proteínas representa um sério comprometimento na síntese enzimática, bem
como na produção de moléculas essencialmente polipeptídicas, tais como
anticorpos, hormônios, colágeno, entre outros (FAULK et al., 1974). A síntese
do colágeno depende da vitamina C, a qual se constitui em um componente
fundamental na etapa de maturação molecular desta proteína, e a sua
deficiência é acompanhada de uma cicatrização defeituosa e da formação de
um colágeno imaturo, sem força tênsil (GROSS, 2000).
Segundo Ehrlichman et al. (1991), o oxigênio molecular é um fator central
no processo de reparo. Ele é necessário para a realização de todos os
fenômenos biológicos dependentes de energia, tais como a replicação celular,
síntese protéica, exportação de proteínas e a hidroxilação da prolina e lisina,
para a posterior incorporação destes aminoácidos às cadeias alfa da molécula
de colágeno. De fundamental importância, é a elevada tensão superficial do
oxigênio nos tecidos a fim de potencializar a resistência às eventuais infecções.
O oxigênio molecular é imprescindível para a produção de radicais superóxidos
tóxicos, os quais, em contrapartida, são usados para eliminar as bactérias que
tenham sido eventualmente fagocitadas pelos granulócitos (PAUL, 1999).
Como o sistema imunológico representa um elemento fundamental na
geração das diversas citocinas que participam ativamente do processo de
reparo, indivíduos em estado de imunossupressão podem apresentar um
retardo considerável na cicatrização (HULSEWÉ et al., 1999).
De acordo com Timimi et al. (1998), algumas patologias sistêmicas, tais
como o diabetes mellitus, podem dificultar a cicatrização de um ferimento,
basicamente em virtude da microangiopatia e uma maior predisposição à
infecção apresentada por parte dos seus portadores. Indivíduos com
arteriosclerose ou anormalidades venulares podem apresentar um impedimento
da cicatrização em virtude do retardo na drenagem venosa e suprimento
sangüíneo inadequado.
Do ponto de vista local, a permanência da crosta que recobre a lesão é de
vital importância para a proteção dos tecidos subjacentes em formação. A sua
remoção precoce pode resultar em atraso da cicatrização, principalmente
gerando um rompimento da fina rede capilar neoformada. A área da ferida
também precisa estar desprovida de qualquer fator de natureza infecciosa,
corpos estranhos e restos de tecidos desvitalizados, os quais poderiam
perturbar a cicatrização. Adicionalmente, alguns fatores mecânicos, como o
movimento precoce envolvendo a área do ferimento podem retardar o reparo
(ANDRADE, 1999).
1.5 LASER
1.5 LASER
1.5.1 Generalidades
Laser é o acrônimo de "Light amplification by estimuled emition of
radiation", ou seja, "luz amplificada por emissão estimulada de radiação"
(HERCH; TERESI, 1987; LOW; REED, 2001; TUNÉR; HODE, 2002).
No inicio do século XX, Albert Einstein em 1917, em seus estudos
descreveu os princípios físicos da emissão estimulada de radiação. Maiman em
1960, construiu o primeiro aparato laser de rubi, sendo este um laser de alta
potência. O primeiro laser terapêutico foi desenvolvido por Javan em 1961,
utilizando o meio ativo He-Ne com um comprimento de onda de 632,8 nm.
(KARU, 1987; KITCHEN, 1991; BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).
Em 1966, na Hungria, Mester publicou uma série de relatos de casos
clínicos descrevendo a propriedade de bioestimulação laser sobre o processo
de cicatrização de úlceras em membros inferiores, utilizando lasers de rubi e
argônio (MESTER, 1968; COLLS, 1984; VEÇOSO, 1999)
Nas décadas de 70 e 80, começaram a ser desenvolvidos diodos laseres
semicondutores, os quais exibiam um maior potencial de penetração tecidual, e
podiam operar nas formas contínua ou pulsada. O primeiro relato da utilização
clínica de um diodo laser de GaAlAs, surgiu em 1981, sendo um estudo
comparativo, que avaliava a resposta analgésica de pacientes tratados com
laserterapia(TUNÉR; HODE, 2002). A partir dos anos 90, houve o aparecimento
de diferentes diodos laser, com uma variedade de comprimentos de onda,
constituindo-se em aparelhos de tamanhos reduzidos, alta facilidade de
transporte e manuseio e de custo relativamente baixo ( HENDERSON, 1997).
O laser possui propriedades e características únicas diferenciando de
outras fontes luminosas, sendo elas coerência, colimação e
monocromaticidade. A coerência, diz respeito à propagação ordenada em fase
das ondas eletromagnéticas ao longo do tempo e do espaço (KITCHEN, 1991;
BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).
Sobre a colimação, o laser apresenta um paralelismo muito acentuado.
As suas ondas eletromagnéticas exibem um mesmo sentido e direção, de modo
que o ângulo de divergência do laser é muito pequeno (KITCHEN, 1991;
BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).
A emissão de uma radiação com uma linha espectral muito estreita, ou
seja, com um comprimento de onda muito bem definido, constitui o que se
reconhece por monocromaticidade, sendo importante devido a seletividade dos
tecidos (KITCHEN, 1991; BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).
Os diferentes tipos de lasers podem ser obtidos variando a substância
estimulada que emite a radiação. Os lasers podem ser classificados
dependendo da potência de emissão, sendo divididos em dois grandes grupos:
os lasers de alta potência e os lasers de baixa potência. O meio ativo do laser
define suas características e seu nome, podendo ser sólidos, líquidos, gasosos
ou quaisquer uns destes componentes associados um ao outro (ALMEIDA –
LOPES, 1999; VEÇOSO,1999; LOW; REED, 2001;).
Os lasers terapêuticos comumente utilizados em terapia, e seus respecti vos
comprimentos de onda estão listados na tabela 1.
Tabela 1. Classificação dos Laser de baixa potência e seus comprimentos de onda
Tipo de Laser Comprimento de Onda
HeNe 633 nm
InGaAlP 633-700 nm
GaAlAs 780-890 nm
GaAs 904nm
CO2 10.600 nm
Rubi 694 nm
Nd:YAG 1.064 nm Fonte : TÚNER & HODE
1.5.2 Laserterapia na Cicatrização
Os lasers utilizados na reparação tecidual situam-se no espectro
eletromagnético entre o visível e o infravermelho próximo (KARU, 1998).
Varias especialidades da área da saúde tem utilizado a laserterapia em
diversas aplicações clínicas, como analgesia, modulação do processo
inflamatório e reparação tecidual. Entretanto a utilização do laser de baixa
potência no reparo tecidual tem demonstrado ser a primeira indicação
terapêutica (TUNER; HODE, 2002).
Diversos estudos foram realizados descrevendo os efeitos da
laserterapia tanto em pesquisas in Vitro (ABERGEL et al., 1984;
PASSARELLA et al., 1984;KARU et al., 1995; RIGAU, 1996; YU et al., 1997;
GROSSMAN et al., 1998; HOUGHTON; BROWN, 1999; KARU; 1999; LUBART;
FRIEDMANN; LAVIE, 2000; STADLER et al., 2000; KREISLER et al., 2001;
ALMEIDA-LOPES et al., 2001) como In Vivo (BASFORD, 1995, RIGAU i MAS
et al., 1996; MORRONE et al., 1998; TATURANAS, 1998; LICHTENSTEIN,
1999; SIMUNOVIC; IVANKOVICH; AL-WATBAN; ANDRES; 2000; LAGAN et
al., 2002).
O aumento na sintese de colágeno é um dos efeitos mais importantes no
processo de cicatrização, utilizando-se a laserterapia (RIGAU, 1996). Sendo
esta estrutura biológica objeto de estudos em diversos trabalhos (PARIZZOTO,
1999; ALMEIDA-LOPES, 2001)
Entretanto resultados conflitantes a respeito da eficácia da laserterapia
na reparação foram descritos por diversas pesquisas (MALM; LUNDEBERG,
1991; SCHALAGER et al.; 2000; WALKER et al., 2000; YILMAZ et al., 2002).
Uma das justificativas encontradas vai ao encontro das afirmações de Rigau
(1998), pois estes estudos indicam que devido a escolha de parâmetros ópticos
variados, utilizando-se de fluências baixas ou extremamente elevadas podem
ter causados os efeitos indesejados nos achados (HALL,1994;
HOUGHTON;BROWN, 1999).
Bisht et al. (1994) estudaram os efeitos do laser de baixa potência,
utilizando um HeNe em feridas cutâneas abertas em ratos albinos, a densidade
de potência trabalhada foi 5mW e a densidade de energia foi de 4 J/cm2
durante cinco minutos. Foi observado uma aceleração significativa do processo
de cicatrização, com aumento do tecido de granulação e rápida reepitelização
nos grupos tratados quando comparados aos controles.
Cambier (1996), estudou os efeitos do laser de He-Ne e AsGa em
cicatrização de queimaduras, seu modelo experimental, utlizou 20 ratos Fisher,
ele realizou duas lesões térmicas em cada animal, irradiando apenas uma das
lesões. Os animais foram divididos em dois grupos e tratados com diferentes
comprimentos de onda. Nenhuma diferença foi encontrada entre os lasers
utlizados comparado com o grupo controle.
Parizotto (1999), estudou os efeitos do laser terapêutico He-Ne no
processo de reapro tecidual de tendões, o colágeno foi seu obejto de estudo,
analisados por diferentes técnicas. A densidade de potência utilizada foi de
6mW, sendo o rato o modelo experimental adotado. A microscopia eletrônica de
varredura , apresentou resultados significativos na cicatrização do colágeno nos
grupos irradiados, comparados com o grupo controle. A dose foi um fator de
dependência nos resultados encontrados, A melhor resposta foi obtida com a
dose de 5 J/cm2, entretanto as doses de 50 J/cm2 e 0,5 J/cm2 também
apresentaram respostas favoráveis.
Schlager (2000), utlizou dois comprimentos de onda em seu estudo, um
de 690nm e 635nm, para ambos os grupos a densidade de energiautlizada foi
de 1,5 J/cm2. O modelo experimental utilizado foi 30 ratos, divididos em 3
grupos, sendo 2 grupos irradiados e um grupo controle. Os parâmetros
analisados neste estudo foram, vermelhidão, diâmetro e edema. O resultado
encontrado foi que não houve diferença entre e dentre os grupos tratados
comparados com o controle.
Simunovic et al (2000), realizaram um estudo com diversos comprimentos
de onda, no processo de cicatrização. Um dos aspectos analisados em seu
estudo foi a formação do colágeno. As fluências utilizadas na pesquisa foram
de 4 J/cm2 para o laser de 632,8nm, 20 J/cm2 para o laser de 904nm e 24
J/cm2 utilizando ambos os comprimentos de onda. Em relação ao colágeno,
melhores resultados foram econtrados utilizando 4 J/cm2, sendo que com dose
mais elevadas apresentaram menor efeito ou inibição no processo de
reparação.
Nascimento (2001), elaborou um estudo com a finalidade de avaliar se a
variação na intensidade e comprimento de onda poderiam interferir no processo
de reparo em feridas cirurgicas, foram avaliados dois comprimentos de onda,
um de 670nm e outro de 685nm. O modelo experimental utilizado, foram 30
ratos, sendo 18 animais irradiados e divididos em dois subgrupos, com cada
grupo subdividido em 3 grupos diferenciando as densidades de potência
utilizadas, que foram 2, 15 e 25mW. Doze animais foram utlizados como
controle. Após o período experimental de 8 dias, os animais foram sacrificados.
Os resultados apresentaram um efeito positivo do laser no processo de
cicatrização, com o melhor efeito com o uso do laser de 670nm com 25mw de
densidade de potência. Resultados positivos fo ram encontrados com ambos os
comprimentos de onda quando comparados com o grupo controle.
Vera Mendez (2002), estudou a influência da dose e do comprimento de
onda no reparo tecidual em feridas cutâneas em ratos. Em seu estudo foi
utililizado os comprimentos de 830nm e 685nm isolados e em conjunto, com
doses de 20 J/cm2 e 50 J/cm2, os animais foram divididos em sete grupos. Após
a irradiação laser, fotam sacrificados de forma seriada no período de 3, 5 e 7
dias. Os resultados obtidos, evidenciaram um melhor aumento na produção de
colágeno quando comparados com o grupo controle. Os grupos trabalhando
com os comprimentos de onda de 830nm e 685nm com doses de 20 J/cm2 e 50
J/cm2 e o de 830nm com 50 J/cm2 apresentaram o melhor resultado no final do
período experimental.
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Observar as principais alterações na quantidade de colágeno no
processo de cicatrização com enfoque no oitavo dia após a indução das lesões
térmicas cutâneas em ratos submetidos a terapia laser de baixa intensidade.
2.1.1 Objetivo especifico
Analisar o comportamento do processo de cicatrização tecidual no oitavo
dia, nos grupos experimentais com relação ao grupo controle
Registrar quais densidades de energia e comprimentos de onda
apresentam melhores respostas no processo de cicatrização tecidual
analisados através de espectrofotometria.
3. MATERIAL E MÉTODO
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética
Neste trabalho foram aplicados os princípios éticos de experimentação
animal de acordo com o COBEA ( Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal), tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
Salesianas de Lins (ANEXO I).
3.2 Animais de experimentação
Foram utilizadas 60 ratos machos (Rattus Norvegicus Albinus) da
variedade Wistar adultos jovens, com peso corporal médio de 209 gramas
(variação 170 – 250g), fornecidas pelo Biotério das Faculdades Salesianas de
Lins. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas individuais, em
temperatura ambiente controlada, mantidos em fotoperíodo de 12 horas com
livre acesso à água e alimentação padrão. Os 60 animais foram distribuídos
aleatoriamente em 6 grupos com 10 animais em cada.
3.4 Caracterização dos grupos
Grupo Controle - (GC)
Neste grupo, os animais, não receberam qualquer tipo de tratamento e
após o período de sete dias, foram sacrificados.
Grupo Placebo – (GP)
Neste grupo, os animais, receberam apenas a simulação do protocolo de
tratamento, sem irradiação laser e após o período de sete dias, foram
sacrificados.
Grupo Experimental – 685nm – 4j/cm2 - (685-4)
Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo InGaAlP
com DE igual a 4J/cm2 após o período de sete dias, fo ram sacrificados.
Grupo Experimental – 685nm – 40j/cm2 (685-40)
Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo InGaAlP
com DE igual a 40J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.
Grupo Experimental – 830nm – 4j/cm2 – (830-4)
Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo AsGaAI
com DE igual a 4J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.
Grupo Experimental – 830nm – 40j/cm2 – (830-40)
Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo AsGaAI
com DE igual a 40J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.
Cada animal foi irradiado uma vez por dia durante sete dias.
3.5 Local da Pesquisa
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Eletrotermofototerapia da
Faculdade Salesiana de Lins, SP. Os animais foram mantidos antes e após o
procedimento experimental no Biotério da Faculdade Salesianas, em gaiolas
individuais e apropriadas, em condições ambientais de temperatura,
luminosidade, controle de ruídos, limpeza e cuidados especiais favoráveis. A
dieta foi livre e padronizada e água “ad libidum”.
3.6 Equipamentos
Foi utilizado um aparelho de Laser de baixa potência, Microscópio óptico,
acoplado a uma câmara digital, Computador Athlon XP 1.7+ (Figura 2), para
análise e aquisição das imagens histológicas; Micrótomo para cortes das
amostras; Termômetro digital .
Figura 1 – Aparato laser e Óculos de proteção
(MONTEIRO NETO,2003)
Figura 2 – Microscópio, Câmera digital, Microcomputador
(MONTEIRO NETO, 2003)
3.7 Características do emissor Laser
O laser de baixa intensidade utilizado e suas características técnicas e
comprimentos de onda foram descritos conforme o manual do fabricante na
tabela 2.
Tabela 2. Características do Laser de baixa potência utilizado na pesquisa
EMISSOR VISÍVEL EMISSOR INFRAVERMELHO
Comprimento de onda : 685 nm Comprimento de onda : 830 nm
Potência do emissor : 50 mW
Contínuo
Potência do emissor : 400 mW
Contínuo
Meio ativo : InGaAlP Meio ativo : GaAlAs
Área do feixe : 2mm2 Área do feixe : 2mm2
Divergência : 1,5º Divergência : 1,5º
3. 8 Procedimento Cirúrgico
Os animais eram anestesiados mediante injeções Ketalar® (cloridrato de
ketamina) em proporções equivalentes na quantidade de 0,10ml da solução por
100g de peso, anestesia que se mostrou suficiente para o desenvolvimento de
todo o protocolo experimental. Foi realizada a técnica anti-séptica com
clorexidina a 1%(DM – Indústria Farmacêutica Ltda) de uso tópico e secagem
com gaze estéril, para ser feita a tricotomia nos animais com tesoura de pinça e
uma lâmina de barbear. A tricotomia foi feita na região superior do lado direito
no dorso de cada animal, e após o ato, os animais foram recolocados em
gaiolas limpas individualmente possuindo ração e água a vontade.
No segundo dia, com temperatura ambiente de 27ºC, os animais foram
novamente sedados e submetidos novamente a assepsia, seguida de lesão
térmica e aplicação do laser. Este procedimento foi adotado desta forma para
padronizar o inicio da aplicação do laser para todos os grupos.
A lesão térmica foi realizada com um instrumental elaborado com uma
haste de madeira e na extremidade uma chapa de alumínio de 1cm2,que após
ser aquecida a uma temperatura de 130ºC e aferida por termômetro digital
(Figura 3), era aplicada na região retrocitada por 3 segundos. Esse
procedimento foi realizado em cada animal.
Após cada lesão, o material era resfriado em um copo com água natural
e posteriormente era feita a anti-sepsia do mesmo.
Figura 3 – Instrumental elaborado para executar a lesão térmica e
Termômetro digital (MONTEIRO NETO, 2003)
3.9 Terapia Laser de Baixa Intensidade
A irradiação do laser foi realizada imediatamente após cada lesão, sendo
de forma contínua, nos espectros de onda vermelho (685nm) e Infravermelho
(830nm), com a mesma técnica, pontual, sem contato, em cinco regiões da
lesão, sendo um ponto em cada extremidade e um ao centro para todos os
grupos, o sentido da irradiação foi o sentido horário partindo-se da borda da
lesão mais próxima a cabeça do animal como referência. Os animais foram
imobilizados manualmente sem sedação para o procedimento de irradiação. A
caneta do laser era fixada a um instrumento que auxiliava sua aplicação
conforme a figura 4.
Figura 4 – Instrumental utilizado para fixação do laser
( MONTEIRO NETO 2003)
O aparelho era sempre calibrado antes de sua aplicação e aferido pelo
ponto de calibração do próprio aparelho, antes do inicio de cada sessão. Para
maior confiabilidade o laser utilizado foi adquirido para o propósito da pesquisa
e aferido no fabricante.
Para os animais dos grupos 685-40 e 830-40 foram realizadas
exposições diárias de 33 segundos por ponto, correspondendo à dose de
energia de 40J/cm2, perfazendo um tempo de dois minutos e quarenta e cinco
segundos, com dose total de 200 J/cm2 por sessão.
Para os animais dos grupos 685-4 e 830-4 foram realizadas exposições
diárias de 4 segundos por ponto, correspondendo a dose de energia de 4J/cm2,
perfazendo um tempo de 20 segundos, com dose total de 20 J/cm2 por sessão.
Ao final do 8º dia os animais foram identificados e sacrificados por
overdose intramuscular de anestésico geral e translocação cervical. A seguir
cada animal foi contido na mesa cirúrgica, efetuando-se a retirada das amostras
do tecido. A Tabela 3 resume a divisão dos grupos e procedimentos.
Tabela 3. Divisão dos grupos e procedimentos (MONTEIRO NETO, 2003).
Tabela 3 – Esquema de Irradiação
Dias de sacrifício após a lesão
Grupo e Período de Irradiação
(dias)
Tempo de
Irradiação em segundos/ponto
Dose (Jcm2)
No de animais
irradiados
Número Total de animais
(GC) 0 0 0 0 10
(GP) 7 33 0 10 10
(685-4) 7 4 4 10 10
(685-40) 7 33 40 10 10
(830-4) 7 4 4 10 10
8
(830-40) 7 33 40 10 10
60
3.10 Procedimento Laboratorial
Após a retirada das amostras de tecido, o material coletado era fixado
com alfinetes, em uma placa de parafina, colocado em um recipiente individual
e identificado, ficando em imersão com formol a 5%, que foi substituído 24
horas depois por formol à 10%. Todo o material foi transportado até o Serviço
de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Marilia.
Após este período, foram incluídos em blocos de parafina e submetidos a cortes
transversais de 7 µm de espessura. Os cortes foram montados em lâminas de
vidro e corados pelas técnicas de tricrômico de Masson e Hematoxilina/eosina,
para análise morfométrica da presença de colágeno. As lâminas foram
utilizadas para o cálculo da área representativa do colágeno.
.
3.11 Etapas da Análise Morfométrica
A análise morfométrica foi feita a partir de medidas de áreas de
colágeno. Foram medidos trinta campos da área da lesão em cada coloração e
realizada a média, para cada dose de laser usada, no período de irradiação,
juntamente com o grupo controle e placebo. Foi utilizado um Microscópio de
Luz (40x) acoplado a uma câmera digital com resolução de 1600x1200 pixel e
um computador, contendo o programa para análise de imagem, o IMAGELAB®
para medidas das áreas do colágeno (Figura 5). Os dados obtidos a partir da
medida das áreas, foram tratados estatisticamente.
Figura 5 – Tela do programa IMAGELAB, para análise de imagens (MONTEIRO NETO,
2003)
Antes do processo de analise e quantificação das estruturas, todos
os campos escolhidos foram digitalizados e convertidas para o formato
BMP, pois é um formato que apresenta a menor taxa de compressão da
imagem mantendo assim sua qualidade.
Após este processo as imagens foram equalizadas, esta etapa envolveu
a padronização por grupos do histograma de freqüência das imagens
digitalizadas. O histograma é obtido a partir da distribuição de intensidade dos
espectros RGB. As barras dos histogramas variam de 0 a 256, cada barra
representa uma intensidade de cor em determinado espectro. Em imagens
coloridas ele e representado por 3 histogramas ( Figura 6 e 7).
Figura 6 - Representação gráfica e na forma de histograma da mesma informação visual obtida
através da digitalização de uma lâmina histológica em Masson.
] Figura 7 - Representação gráfica e na forma de histograma da mesma informação visual obtida
através da digitalização de uma lâmina histológica em H&E.
A equalização é uma etapa para que a escala de cor ocupe o maior
intervalo possível, para que os detalhes da imagem fiquem mais visíveis para
avaliação e segmentação da quantidade de colágeno, delimitando-se assim os
intervalos de cor para analise. Neste procedimento os tons de cores são
redistribuídos para ocuparem o maior intervalo da escala, padronizando-os
entre os grupos (Figuras 8 e 9).
Foi utilizado também um filtro de média em cada imagem para
remoção de ruídos, pois isso pode interferir com as cores originais dos
pixels. Este processo foi realizado porque a interferência de campos
elétricos altera a forma com que os fotossensores lêem os comprimentos
de ondas dos espectros RGB.
Figura 8 – Campos digitalizados e equalizados na coloração de MASSON, Grupo 830nm,
40 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).
Figura 9 – Campos digitalizados e equalizados na coloração em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2
(MONTEIRO NETO, 2003).
As áreas de colágeno foram delimitadas na imagem utilizando-se da
técnica de segmentação da imagem. No processo de segmentação, o colágeno
a ser quantificado representado na imagem é separado do contexto. A
segmentação, define para o computador o que deve e o que não deve ser
enfocado na análise. Para este processo, a forma direta é definir um intervalo
de cor que define a estrutura a ser quantificada ( Figura 10).
Figura 10 - Histograma de cores (R:0-0,G:98-138 e B:0-0) da imagem (esquerda),imagem original (acima) e o resultado da segmentação (abaixo) usando os tons de verde (98 a 138). para definir o colágeno.
Para cada imagem quantificada e grupo, utilizou-se o mesmo
intervalo de cor, com uma variação de +ou- 5% para separar a estrutura a
ser quantificada. O intervalo de cor foi definido de forma empírica, através
de tentativa de acerto e erro, dentro do histograma de cor verde par ambas,
as colorações de MASSON e H&E.
As estruturas então foram quantificadas em percentual de colágeno
presente em cada campo analisado de todos os grupos, dados esses
quantificados e calculados pelo IMAGELAB® (Figura 11 e 12).
Figura 11 – Determinação do percentual de colágeno em Masson, Grupo 830nm, 40 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).
Figura 12 – Determinação do percentual de colágeno em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).
4 . RESULTADOS
4 . RESULTADOS
4.1 Análise histológica Microscopia de Luz
A análise por microscopia de luz foi utilizada apenas como parâmetro
para verificar se o processo de reparação estava ocorrendo de forma natural
em todos os grupos, evitando-se uma análise comparativa entre os grupos
irradiados.
A microscopia revelou lesão de pele ulcerada, na qual ocorreu a lise
celular e a coagulação das proteínas, formando na superfície uma crosta de
material hialino, associado a edema. Observou–se uma reação inflamatória
aguda, caracterizada por infiltrados polimorfonucleares que se acumulavam no
fundo da lesão. Nos locais onde havia perda tissular, ocorria formação de tecido
conjuntivo vascular neoformado. Notava–se hiperemia com aumento da
permeabilidade vascular e grande infiltrado mononuclear, composto
principalmente de macrófagos ativados, fagocitando debris celulares. A partir
desse ponto, se iniciava uma proliferação de vasos e fibroblastos que se
dirigiam ao sitio da lesão, formando o tecido de granulação e levando ao
espessamento da lamina própria.
Seguindo a cronologia da reparação, algumas áreas apresentam
desaparecimento progressivo do infiltrado de vasos e grande deposição de
fibras colágenas, para a formação da cicatrização.
4.2 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística pela analise
Variância, utilizando o teste de TUKEY para verificar a presença de diferenças
entre os grupos. Para verificar a significância da diferença percentual de fibras
colágenas, entre o grupo controle e os experimentais em cada amostra, fixou-se
em 0,05 ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade para ambos os
testes.
4.3 Analise quantitativa
Os dados quantificados obtidos através da digitalização de imagens para
% de fibras colágenas, correspondem à média de três campos por animal de
cada grupo obtendo-se vinte amostras, dez em cada coloração, no oitavo dia
após a lesão térmica. Estes resultados estão demonstrados nas Tabelas 4, 5,
6, 7, 8 e 9 que correspondem respectivamente às amostras retiradas no 8º dia
após a lesão térmica. Os valores da quantidade de colágeno presente em cada
campo digitalizado estão plotados nas figuras 13, 14, 15, 16,17 e 18.
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno - Grupo Controle
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
GC - Masson GC - H&E
4.4 Grupo controle (GC)
Tabela 4. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Figura 13. Média de colágeno em Masson e H&E.
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 47,4 46,9 2 46,8 46,9 3 48,0 47,6 4 38,7 39,2 5 47,3 48,1 6 44,5 43,7 7 49,2 48,5
8 32,2 31,3 9 40,7 39,5 10 40,8 40,2
Média
Desvio padrão 43,56 5,37
43,19 5,57
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno - Grupo Placebo
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
GP - Masson GP - H&E
4.5 Grupo Placebo (GP)
Tabela 5. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 42,6 41,5
2 43,5 43,8
3 41,8 40,2
4 48,2 46,8
5 47,0 46,2
6 45,3 39,5
7 35,8 38,2
8 40,5 41,2
9 45,6 44,5
10 42,7 41,8
Média
Desvio padrão 43,3 3,56
42,37 2,86
Figura 14. Média de colágeno em Masson e H&E.
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno - Grupo IV40
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
IV40 - Masson IV40 - H&E
4.6 Grupo irradiado com laser de 830nm; DE 40J/cm2 (830-40)
Tabela 6. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 62,0 63,2 2 65,1 66,3 3 64,4 66,8 4 65,3 65,1 5 63,1 64,8 6 62,0 63,8 7 62,6 63,2 8 64,3 63,2 9 61,1 62,2 10 62,6 63,5 Média
Desvio padrão 63,25 1,44
64,21 1,49
Figura 15. Média de colágeno em Masson e H&E.
MaxMinMean
Percentual de Colágeno - Grupo IV4
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
IV4 - Masson IV4 - H&E
4.7 Grupo irradiado com laser de 830nm; DE 4J/cm2 (830-4)
Tabela 7. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 57,1 58,7 2 56,0 59,3
3 59,4 59,8
4 55,8 57,8
5 54,9 55,8 6 56,7 57,6 7 55,8 56,3
8 56,2 56,8
9 54,4 56,5
10 58,2 58,3 Média
Desvio padrão
56,45 1,48
57,69 1,34
Figura 16. Média de colágeno em Masson e H&E.
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno - Grupo V4
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
V4 - Masson V4 - H&E
4.8 Grupo irradiado com laser de 685nm; DE 40J/cm2 (685-40)
Tabela 8. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 59,9 60,1 2 65,1 63,5 3 60,1 61,2
4 63,1 62,8 5 60,9 61,3
6 59,4 59,5 7 60,1 63,2 8 59,1 58,9
9 60,5 61,1 10 62,2 62,8
Média
Desvio padrão
61,04 1,88
61,44 1,60
Figura 17. Média de colágeno em Masson e H&E.
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno - Grupo V40
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
V40 - Masson V40 - H&E
4.9 Grupo irradiado com Laser de 685nm e DE 4 J/cm2 (685-4)
Tabela 9. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão
Animal Colágeno H&E Colágeno Masson
1 61,3 62,5 2 65,3 64,8 3 56,8 58,2 4 59,5 60,1 5 65,1 64,7 6 58,1 59,3 7 57,0 56,9 8 66,0 64,8 9 61,4 63,2 10 58,3 59,7
Média
Desvio padrão 61,11 3,88
61,42 2,94
Figura 18. Média de colágeno em Masson e H&E.
MáximoMínimoMédia
Percentual de Colágeno entre os grupos
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
GC GP V4 V40 IV4 IV40
Para o tratamento estatístico foi calculado a média entre ambas as
colorações por grupos, demonstrados na tabela 10.
Tabela 10. Média de colágeno entre as colorações de H&E e Masson
Média de colágeno por grupo em H&E/Masson
GC GP V4 V40 IV4 IV40 47,15 42,05 61,90 60,00 57,90 62,60 46,85 43,65 65,05 64,30 57,65 65,70 47,80 41,00 57,50 60,65 59,60 65,60 38,95 47,50 59,80 62,95 56,80 65,20 47,70 46,60 64,90 61,10 55,35 63,95 44,10 42,40 58,70 59,45 57,15 62,90 48,85 37,00 56,95 61,65 56,05 62,90 31,75 40,85 65,40 59,00 56,50 63,75 40,10 45,05 62,30 60,80 55,45 61,65 40,50 42,25 59,00 62,50 58,25 63,05
Os valores médios obtidos do percentual de colágeno, comparativos por
grupo estão plotados na figura 19.
Figura 19 . Média de colágeno entre os grupos.
A média dos dados quantificados obtidos através da digitalização de
imagens para % de fibras colágenas comparativas entre os grupos, estão
demonstradas na Tabela 11.
A tabela mostra os valores médios do grupo controle e dos grupos
experimentais, no 8 dia após a lesão. Através da análise quantitativa de
colágeno dos animais submetidos ao experimento, pode-se observar, que os
animais do grupo controle e placebo apresentaram menor percentual de
colágeno em H&E (médias: 43,56% e 43,3%), como em masson (médias:
43,19% e 42,17%), quando comparados com os grupos irradiados. Dentre os
grupos irradiados o de 830nm e 40J/cm2 foi o que apresentou maior média de
colágeno em ambas as colorações (média: 63,25% e 64,21%).
Tabela 11. Média percentual de colágeno comparativa por grupo
Grupos Média dos grupos
Colágeno H&E Colágeno Masson
GC 43,56 43,19
GP 43,3 42,37
685-4 61,11 61,42
685-40 61,04 61,44
830-4 56,45 57,69
830-40 63,25 64,21
.
4.10 Espectrofotometria
Através da espectrofotometria foi possível obter e comparar os valores
da quantidade de colágeno nos diferentes grupos experimentais. A Tabela 12,
mostra os valores obtidos após o tratamento estatístico das diferenças
encontradas com a analise de variância para o colágeno. Observa-se que
ocorreram diferenças estatisticamente significativas quando relacionada o
variável colágeno dos grupos irradiados com o grupo controle e placebo.
Entre o grupo placebo e controle não houve diferença significativa. Foi
observado também diferença significativa entre os grupos de 685nm e 4J/cm2 e
40J/cm2 e 830nm e 40J/cm2 com relação ao grupo 830nm 4 J/cm2.
Tabela 12. Resultados do teste de Tukey HSD, para o percentual de colágeno
Teste de Tukey HSD; % Colágeno
GC GP 685-4 685-40 830-4 830-40
GC 0,998974 0,000138 0,000138 0,000138 0,000138
GP 0,998974 0,000138 0,000138 0,000138 0,000138
685-4 0,000138 0,000138 0,999999 0,042266 0,761461
685-40 0,000138 0,000138 0,999999 0,052356 0,708883
830-4 0,000138 0,000138 0,042266 0,052356 0,000836
830-40 0,000138 0,000138 0,761461 0,708883 0,000836
p < .005
Após a análise nota-se uma evidente diferença, entre grupos irradiados e
controles. Os efeitos do LBP podem ser observados na quantidade de colágeno
aumentada nos grupos irradiados, apresentando assim uma melhor resolução
da cicatrização nestes grupos.
5. DISCUSSÃO
5. DISCUSSÃO
O presente estudo objetivou verificar os efeitos do LBP na cicatrização
tecidual, quantificando as áreas representativas de do colágeno em animais
submetidos a lesões térmicas.
O modelo experimental utilizado foi o rato wistar,largamente difundido na
literatura e apropriadamente empregado no estudo de cicatrização envolvendo
a epiderme e derme ( colocar autores de estudo com ratos).
O período escolhido para avaliação foi o sétimo dia, após o procedimento
da lesão experimental, pois nesta fase ocorre a maior concentração de
colágeno (FONSECA et al., 1997).
O protocolo da indução da lesão térmica foi escolhido por ser de fácil
execução e isenta de complicações durante os procedimentos experimentais,
este tipo de procedimento é utilizado por diversas pesquisas por desencadear
reações inflamatórias intensas, servindo assim para poder avaliar os efeitos
biomoduladores do LBP (SANTANA-BLANK et al., 2000; SHCLAGER et al.,
2000; CAMBIER et al., 1996)
O laser escolhido foi o diodo nos comprimentos de onda de 630 nm e
830 nm, por ser de tamanho reduzido, fácil manuseio, seguro e fácil aplicação,
dentro dos espectros de onda amplamente utilizado em diversos trabalhos
(PETERSEN et al., 1999; SHCLAGER et al, 2000; LAGAN et al., 2001).
As amostras dos seis grupos foram coradas por H&E e tricômico de
masson, por serem técnicas utilizadas rotineiramente e recomendadas para
observação do colágeno (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que todos os grupos
evoluíram o para um processo de cicatrização normal no período estudado.
Entretanto observando a estrutura analisada, nota-se uma resolução da
cicatrização mais acentuada nos grupos irradiados com LBP, quando
comparados ao controle e placebo.
Os resultados observados neste estudo indicam claramente que a
irradiação com LBP, aplicada sobre a área da lesão na forma pontual,
apresentou efeitos positivos sobre a quantidade de colágeno nos grupos
irradiados, comparados com o grupo controle e placebo os achados foram mais
significativos. Essa diferença significativa da presença do colágeno pode ser
comprovada por uma melhor resolução do processo inflamatório, traduzindo-se
em maior atividade fibroblastica e conseqüentemente um maior percentual de
colágeno na área da lesão. Esse resultado poder ser atribuído aos efeitos
desencadeados pelo LBP no processo inflamatório, melhorando a cicatrização
tecidual local (GOMEZ-VILLAMANDOS, 1995; AL-WATBAN ,1996).
Os resultados quantitativos do colágeno analisados estatisticamente ,
demonstraram que os grupos irradiados apresentaram índices muito melhores
que o controle e placebo. A média de percentagem entre ambas as colorações
utilizadas, evidenciaram um aumento significativo do colágeno nos grupos
irradiados.
As amostras do grupo 685-4 (685nm , 4J/cm2) obteve um aumento
significativo no colágeno, comparados com o grupo controle e placebo, tanto na
média percentual do colágeno, como nos índices mínimos e máximo.
Resultados de uma melhor resposta na cicatrização de pele, tem sido descritos
por diversos autores, utilizando comprimentos de onda próximos ao utilizado e
doses de energia idênticas (BRAVERMAN et al, 1989; GHAMSARI et al., 1997;
WEBB, DYSON, LEWIS; 1998; REDDY, STEHNO-BITTEL, ENWEMEKA, 1998;
BISHT et al, 1999).
As amostras do grupo 685-40 (685nm, 40J/cm2) também apresentaram
um aumento significativo do colágeno comparados com o grupo controle e
placebo. Os índices encontrados, foram ainda maiores tanto na média como
menor percentual encontrado. O índice máximo foi um pouco inferior ao grupo
V4. A literatura apresenta que densidades de energia altas poderiam apresentar
efeitos inibitórios, como os encontrados por Al-Watban et al. (2000), em seus
estudos. Por outro lado outros trabalhos corroboram com nossos achados,
demonstrando que doses maiores podem apresentar resultados positivos na
cicatrização tecidual (SCHINDL et al.,1999 e 2002).
As amostras do grupo 830-4 (830nm , 4 J/cm2) apresentaram diferença
significativa na quantidade de colágeno, quando comparadas com o controle e
placebo. Este grupo também apresentou média e índices mínimo e máximos
superiores. Por outro lado foi o grupo que apresentou menores resultados no
percentual de colágeno. Em recente estudo (VERA MENDEZ, 2002) utilizando o
mesmo comprimento de onda e uma dose maior, também apresentou uma
menor resposta de cicatrização, comparadas com doses mais elevadas. Por
outro lado a literatura consultada apresenta resultados positivos utilizando, hora
comprimentos de ondas idênticos ou próximos com doses baixas (LAGAN et al.,
2001; TATARUNAS, MATERA, DAGLI, 1998)
As amostras do grupo 830-40 (830nm, 40J/cm2) apresentaram
diferenças significativas comparadas com o grupo controle e placebo. Este
grupo foi o que apresentaram as melhores médias e limites mínimo e máximo,
superiores a todos os grupos. Na literatura consultada os comprimentos de
onda no espectro visível são os mais indicados para o processo de reparo
tecidual (RIGAU, 2000; ALMEIDA-LOPES, 2002). Entretanto a utilização deste
comprimento de onda e sua resposta na formação de colágeno, possa ser
justificado por uma maior penetração do LBP, estimulando a produção de
colágeno mais profundamente, sendo um dos possíveis indicativos dos achados
neste grupo (AL-WATBAN, 2001). Os efeitos com positivos densidade de
energia elevada, também foram encontrados no trabalho de CAPON et al.
(2001).
Na analise comparativa entre os grupos irradiados, submetidos ao
tratamento estatístico, pode-se notar que não houve diferença significativa entre
as amostras dos grupos 685-4, 685-40 e 830-40. Por outro lado as amostras
do grupo 830-4, apresentou um menor índice de percentual de colágeno,
comprovados estatisticamente, quando comparados com os outros grupos
experimentais. Embora este grupo apresentou resultados inferiores, ainda
assim foram encontrados efeitos positivos da ação do LBP na cicatrização.
Paralelamente inúmeros autores tem encontrados resultados negativos,
utilizando CO próximos ao utilizado e com densidades de energia similares
(PETERSEN et al., 1999; HALL et al., 1994; ANNEROTH et al.,1988; LONGO
et al., 1987).
Em relação ao colágeno, alguns estudos confirmam que o laser tem a
capacidade de estimular a proliferação fibroblástica e induzir tais células a
produção de grandes quantidades de colágeno. (SKINNER et al., 1996; REDDY
et al., 1998).
Após analisar os resultados obtidos nesta pesquisa, com a utilização do
LBP em lesões térmicas, foi possível verificar que a quantidade de colágeno
estava aumentada nos grupos irradiados, sendo este aumento significativo
quando defrontados com os resultados do grupo controle e placebo. Obteve-se
uma melhor resposta, utilizando-se os comprimento de onda de 830nm e 40
J/cm2 e o Comprimento de onda de 685nm com 4 J/cm2 e 40 J/cm2.
6. CONCLUSÃO
6. CONCLUSÃO
Este trabalho mostra evidências que o LBP apresentou resultados positivos
sobre o processo de cicatrização tecidual com o a metodologia empregada,
pode-se concluir que:
1 - Os grupos irradiados com LBP apresentaram melhores resultados na
quantidade de colágeno que o grupo controle e placebo. Os efeitos positivos do
LBP, pode ser observado em todos os grupos.
2 – As densidades de energia e comprimento de onda por ordem decrescente
que apresentaram repostas superiores na formação do colágeno foram 830 nm
e 40 J/cm2, 685 nm e 40 J/cm2, 685 nm e 4 J/cm2 e 830 nm e 4 J/cm2.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABERGEL, R. P.; MEEKER, C. A.; LAM, T. S.; DWYER, R. M.; LESAVOY, M.
A.; UITTO, J. Control of connective tissue metabolism by lasers: Recent
developments and future prospects. Journal of the American Academy of
Dermatology. v. 11, n. 6, p. 1142-1150, 1984.
ALMEIDA-LOPES, L. Análise in vitro da Proliferação Celular de
Fibroblastos de Gengiva Humana Tratados com laser de Baixa potência.
1999. 131f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) - Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José
dos Campos,SP.
ALMEIDA- LOPES, L.et al. Comparison of the Low Level Laser Therapy Effects
on Cultured Human Gingival Fibroblasts Proliferation Using Different Irradiance
and Same Fluence. Lasers in Surgery and Medicine. v. 29, p. 179-184, 2001.
ALMEIDA LOPES, L.; BRUGNERA, A. Aplicações clínicas do laser não-
cirúrgico. São Paulo: Pancast. 1998.
ALLENDORF, J. D. F.; BESSLER, M.; HUANG, J.; KAYTON, M. L.; LAIRD, D.;
NOWYGROD, R.; TREAT, M. R. Helium-Neon laser irradiation at fluences of 1,
2, and 4 J/cm2 failed to accelerate wound healing as assessed by both wound
contracture rate and tensile strength. Lasers Surg. Med., n.20, p. 340-345,
1997.
AL-WATBAN, F.A . H.; ZHANG, X.Y. Comparison of chronic of the effects of
laser therapy on wound healing using different laser wavelengths. Laser
Therapy. v.8, n.2, p. 127-136, 1996.
AL-WATBAN, F.A . H.; ZHANG, X.Y. The Acceleration of Wound Healing is not
Attributed to laser Skin Transmission. Laser Therapy. v.11, n.1, p. 6-10, 1999.
AL-WATBAN, F. A .H.; ANDRES, B. Laser Photons and Pharmacological
Treatment in Wound Healing. Laser Therapy. v. 12, p. 3 -12, 2000.
AL-WATBAN, F. A .H.; ANDRES, B.L.; ZHANG, X. Wound Healirtq Efficacy of
Hene Laser (632.8nm) and Pharmacological Treatments in Normal Rats. Lasers
in the Life Sciences. v.9, p. 245 - 254, 2001.
ANDRADE, Z. A . Tecido Conjuntivo, Reparo, Regeneração e Cicatrização. In:
MONTENEGRO, M. R.; FRANCO, M.; Patologia Processos Gerais. 4ed. São
Paulo: Atheneu, 1999. p. 135- 151, cap. 8.
ANDREAS, S. et al. Low-intensity laser therapy: a review. Journal of
Investigative Medicine.. v. 48, n. 5, p. 312, sept. 2000.
ANNEROTH, G.; HALL, G.; RYDÉN, H., ZETTERQVIST, L. The effect of Low-
energy infrared laser radiation on woundhealing in rats. Brit. J. Oral & Max.
Surg. v. 26, p. 12-17, 1988
ARTZ, C. P.; MONCRIEF, J. A. PRUITT, B. A. Queimaduras. Rio de Janeiro:
Interamericana, 1980.
BASFORD, J.R. Low Intensity Laser Therapy: Still Not na Established Clinical
Tool. Lasers in Surgery and Medicine. v. 16, n. 4, p. 331-342, 1995.
BAXTER, G.D.et al. Low Level Laser Therapy: Current Clinical Practice in
Northern Ireland. Physiotherapy. v.77, n.3, p. 171-178, 1991.
BAXTER, G. D. Therapeutic Laser. New York: Churchill Livingstone,
1997. p. 1-19.
BISHT, D.; GUPTA, S. C.; MISRA, V.; MITAL, V. P.; SHARMA, P. Effect of
low intensity laser radiation on healing of open skin wounds in rats. Indian J.
Med. Res., v.100, p. 43-46, 1994.
BISHT, D.; MEHROTRA, R.; SINGH, P.A.; ATRI, S.C.; KUMAR, A. Effect of
helium-neon laser on wound healing . Indian J Exp Biol v.37, p. 187-9, 1999.
BJORDAL, J. M.; JOHNSON, M., I.; COUPPE, C. Clinical Electrtherapy- Your
Guide to Optimal Treatment. Norway: Norwegian Academic Press, 2001. p.39-
44; 134-148, cap. 5, 16.
BLAKISTON. Dicionário Médico. 2 ed. São Paulo: Andrei, 1982.
BRASILEIRO FILHO et al. Boglio lo Patologia Geral. 5ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1993. p. 73-77; 1030- 1032, cap. 6, 31.
BRAVERMAN, B.; McCARTHY, R. J.; IVANKOVICH, A. D.; FORDE, D.
E.; OVERFIELD, M.; BAPNA, M. S. Effect of Helium-Neon and infrared
laser irradiation on wound healing in rabbits. Lasers Surg. Med., 9: 50-
58, 1989.
CAMBIER, DIRK C. P. T.; VANDERSTRAETEN, GUY G.; MUSSEN, MAURICE,
J. Van der SPANKK, JUDITH T. P. T. Low-Power Laser And Healing of Burns :
A Preliminary Assay. Plastic Reconstruc. Surg. v.97, n.3, p. 555-558, 1996.
CAPON, A.; SOUIL, E.; GAUTHIER, B.; et al. Laser-assisted skin closure
(LASC) using a 815 nm diode-laser system accelerates and improves wound
healing Lasers Surg Med. v. 28, p. 168-175, 2001.
COLLS, J. La terapia láser, hoy. Barcelona: Edición Centro de Documentación
Láser; 1985.
COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T.; Patologia Estrutural e Funcional.
6ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p. 44- 78; 79-100, cap. 3, 4.
CREED, R.F.S: The histology of the mammalian skin, with special reference to
the dog and cat. Vet. Rec. v.70, p.171, 1958.
DOURADO, V. R. C. C. Tratamento em pacientes com queimaduras. São
Paulo: Lovise, 1994.
FAULK, W. P.; DEMAEYER, E. M.; DAVIES, A. J. S. Some e ffects of
malnutrition on the man. Am. J. Clin. Nutr. v.27, n.6, p. 638-646,1974.
FLEMMING, K.A, CULLUM, N.A, NELSON ,E.A. A systematic review of laser
therapy for venous leg ulcers. J. Wound Care., v.8, n.3, p. 111-114, 1999.
FONSECA, RAYMOND J. et al. Oral Maxillofac. Trauma . v.2, p. 803, 1997.
GENOVESE, W.J. Laser de Baixa intensidade: Aplicações Terapêuticas em
Odontologia. São Paulo: Lovise, 2000, 175p.
GHAMSARI, S.M.; TAGUCHI, K.; et al, Evaluation of low level laser therapy on
primary healing of experimentally induced full thickness teat wounds in dairy
cattle, Vet Surg , v.26, p.114-120, 1997.
GOMES, D. R.; SERRA, M. C.; PELLON, M. A. Queimaduras. Rio de Janeiro:
Revinter, 1995.
GOMEZ-VILLAMANDOS, R. J.; VALENZUELA, J. M. S.; CALATRAVA, I. R.;
GOMEZ-VILLAMANDOS, J. C.; JURADO, I. A. He-Ne laser therapy by
fibroendoscopy in the mucosa of the equine upper airway. Lasers Surg. Med.,
v.16, p . 184-188,1995.
GROSS, R. L. The effect of ascorbate on wound healing. Int. Ophthalmol.
Clin., v.40, p. 51-57, 2000.
GROSSMAN, N. et al. 780 nm Low Power Diode laser irradiation Stimulates
Proliferation of Keratinocyte Cultures: Involvement of reactive Oxygen Species.
Lasers Surg. Med. v. 22, n.4, p. 212-218, 1998.
GUIRRO, E; GUIRRO, R. Fisioterapia dermato-funcional: fundamentos,
recursos, patologias 3. ed. São Paulo, Manole, 2002.
______. Fisioterapia em estética: fundamentos, recursos e patologia. 2 ed.
São Paulo: Manole, 1996.
GUYTON, A. C.; HALL, I. E. Tratado de fisiologia médica. 10. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
HALL, G.et al. Effect of low level energy laser irradiation on wound healing, An
experimental study in rats. Swedish Dental Journal, v.18, p. 29-34, 1994.
HENDERSON, A R. A Guide to Laser Safety. London: Chapman & Hall, 1997,
p. 63-76, 191-204, cap. 2, 9.
HERCH, J. ;TERESI, D. El rayo láser. Barcelona: Salvat Editores S.A, 1987.
HOUGHTON, P.E.; BROWN, J.L. Effect of Low Level Laser on Healing in
Wounded fetal Mouse Limbs. Laser Therapy. v. 11, n.2, p. 54-70, 1999.
HULSEWÉ, K. W. E.; ACKER, B. A. C.; MEYENFELDT, M. F.; SOETERS, P.
B. Nutritional depletion and dietary manipulation: Effects on the immune
response. World J. Surg., v. 23, p.536-544, 1999.
JAVAN, A., BANNET, W. B. HERRIOT, T. R. apud. GOLDMAN, L. Biomedical
aspects of laser. New York, Springer Verlag, 1967. p.2.
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 9.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1999. p. 303- 314, cap. 18
KANA, J. S. et al. Effect of Low- Power Density Laser Radiation on Healing of
Open Skin Wounds in Rats. Laser Radiation in Skin Wounds. Arch. Surgery.
v. 116, p. 293-296, 1981.
KARU, T. Photobiological fundamentals of low-power laser therapy. IEEE
Journal of Quantum electronics.QE-23. v.10, p. 1703– 1717, 1987.
KARU, T.; PYATIBRAT, L.; KALENDO, G. Irradiation with He-Ne laser increases
ATP level in cells cultivated in vitro. Journal of Photochemistry and
Photobiology. v.27, n.3, p. 219-223, 1995.
KARU, T. The Science of Low- Power Laser Therapy. Amsterdam: Gordon
and Breach Science, 1998, 299p, cap. 4.
KARU, T. Primary and secondary mechanisms of action of visible to near- IR
radiation on cells. Journal of Photochemistry and Photobiology: B. Biol.
v.49, n.1, p. 1-17, 1999.
KAY, S. P.; MORELAND, J. R.; SCHMITTER, E. Nutritional status and
wound healing in lower extremity amputations. Clin. Orthop., n.217, p.253-
256, 1987.
KISNER, C.; COLBY, L. A. Exercícios terapêuticos. 2. ed. São Paulo: Manole,
1992.
KITCHEN, S. S. ; PARTRIDGE, C. J. A review of Low level laser therapy. Part I:
Background, physiological effects and hazards. Physiotherapy, v.77, p. 77-161,
1991.
KITCHEN, S.; BAZIN, S. Eletroterapia de Clayton. 10.ed. São Paulo: Manole,
1998. p. 46- 58; 191- 210, cap. 3, 13.
KNIGHT, K. L. Crioterapia em tratamento das lesões esportivas; São Paulo:
Manole, 2000.
KREISLER, M. et al. Effect of Diode Laser Irradiation on the Survival Rate of
Gingival Fibroblast Cell Cultures. Lasers in Surgery and Medicine. v.28, p.
445-450,2001.
LAGAN, K.M.; CLEMENTS, B.A.; MCDONOUGH, S.; BAXTER, G.D. Low
intensity laser therapy (830nm) in the management of minor postsurgical
wounds: a controlled clinical study. Lasers in Surgery and Medicine, v.28, p.
27-32, 2001.
LAGAN, K.M. et al. Low-Intensity Laser Therapy I Combined Phototherapy in
the Management of Chronic venous Ulceration: A Placebo-Controlled Study.
Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery. v. 20, n.3, p. 109-116, 2002.
LICHTENSTEIN, D.; MORAG, B.; Low Level Laser Therapy in Ambulatory
Patients with Venous Stasis Ulcers. Laser Therapy. v. 11, n.2, p. 71-78, 1999.
LONGO, L.; et al. Effects of diodo Laser Silver Arsenide-Aluminium (Ga-Al-As)
904 nm on healing of experimental wounds. Lasers Surg. Med. v. 7, n. 5., p.
444-447, 1987.
LOPES, L. A.; MASSINI, R. J. Laseres e suas aplicações. São Paulo: DMC,
2001.
LOVELL, J. E.; GETTY, R: The ha ir follicle, epidermis, dermis and skin glands of
the dog. Am. J. Vet Res v.18,n.69, p.873885, Oct.1957.
LOW, J.; REED, A Eletroterapia Explicada- Princípios e Práticas. 3.ed. São
Paulo: Manole, 2001, p. 17-31; 389- 409, cap. 1, 14.
LOWE, A.S.; WALKER, M.D.; O’BYRNE, M.; BAXTER, G.D.; HIRST, D.G.
Effect of low intensity monochromatic light therapy (890nm) on a radiation-
impaired, wound-healing model in murine skin. Lasers Surg Med. v.23, p.291–
298, 1998.
LUBART, R.; FRIEDMANN, H.; LAVIE, R. Photobiostimulation as a Function of
Different Wavelengths. Laser Therapy, v. 12, p. 38-41, 1999.
LUCAS ,C.; VAN GEMERT, M.J, DE HAAN ,R.J. Efficacy of low-level laser
therapy in the management of stage III decubitus ulcers: a prospective,
observer-blinded multicentre randomised clinical trial. Lasers Med Sci. v. 18, n.
2, p. 72-77, 2003.
MAIMAN, T.H. Stimulated Optical Radiation in Ruby. Nature. v. 187, p. 493,
1960.
MALM, M.; LUNDEBERG, T. Effect of Low Power Gallium Arsenide Laser on
Healing of Venous Ulcers. Scandinavian Journal of Plastic and
Reconstructive Surgery and Hand Surgery, v. 25, p. 249-251, 1991.
MANUILA, L.; MANUILA, A; NICOULIN, M. Dicionário médico. Rio de Janeiro:
Andrei, 1997.
MELLO, J. B.; MELLO, G. P. S. Laser em Odontologia. São Paulo: Santos,
2001. p. 3- 85, cap. 1 a 7.
MESTER, E.; MESTER, A . F.; MESTER, A . The Biomedical Effects of Laser
Application. Lasers in Surgery and Medicine. v. 5, p. 31-39, 1985.
MESTER, E.; YASZSAGI-NAGY, E. The effect of laser radiation on wound
healing and collagen synthesis. Stud. Biophys., v. 35, p.227-230, 1973.
MONTENEGRO, M. R.; FRANCO, M. Patologia, processos gerais . São
Paulo: Atheneu, 1999.
MORRONE, G. et al. Muscular Trauma Treated with a Ga-AI-As Diode Laser: In
Vivo Experimental Study. Lasers Medical Science, v. 13, p. 293-298, 1998.
NASCIMENTO, P. M. . Efeito da Variação da Intensidade e do
Comprimento de Onda do Laser Não Cirúrgico em Feridas Cirúrgicas em
Dorsos de Ratos : Estudo Histológico. 2001. Dissertação (Mestrado em
Engenharia Biomédica) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
Universidade do Vale do Paraíba.
NELSON, J.S.; McCULLOUGH, J.L.; BERNS, M.W. Principles and Applications
of Photodynamic Therapy in Dermatology. In: ARNDT, K.A .; DOVER, J.S.;
OLBRICHT, S.M. Lasers in Cutaneous and Aesthetic Surgery. Philadelphia:
Lippincott - Raven, 1997, p. 349-381, cap. 17.
O’SULLIVAN, S. B., SCHMITZ, T.J. Fisioterapia: avaliação e tratamento. 2.
ed. São Paulo: Manole, 1993.
PARIZOTTO, N. A. Ação do laser de hélio-neônio sobre o processo de
reparo tecidual: um estudo do colágeno por microscopia eletrônica de
varredura, microscopia de força atômica e espectroscopia por
infravermelho.1998. Tese (Doutorado em Engenharia Elétrica) - UNICAMP.
PARIZOTO, N. A.; LOPES, L.A.; MASSINI, R. J. Thera laser: manual do
usuário. São Carlos: s.ed., 2001.
PASSARELLA. S. et al. Increase of proton electrochemical potential and ATP
synthesis in rat liver mitochondria irradiated in vitro by helium-neon laser. Febs
Letters. v.175, n.1, p. 95-99, 1984.
PAUL, W. E. Fundamental Immunology. 4. ed. Philadelphia: Lippncott-
Raven Publishers, 1999. 1589 p.
PETERSEN ,S.L.; BOTES, C.; OLIVIER, A ; GUTHRIE, A.J. The effect of low
laser therapy (LLLT) on wound healing in horses. Equine Veterinary Journal.
V.31, n.3, p. 228-231, 1999.
REDDY, G.K.; STENHO-BiTTEL,L.; ENWEMEKA, C. Laser Photostimulation of
Collagen Production in Healing Rabbit Achilles Tendons. Lasers in Surgery
and Medicine. v. 22, n.5, 281-287, 1998.
RIGAU i MAS, J. Acción de Ia Luz Láser a Baja Intensidad en Ia Modulación
de Ia Función Celular. 1996, 208f. Dissertação (Doutorado em Medicina).
Universitat Rovira í Virgili, Espanha.
ROBBINS, L. S. et al. Patologia estrutural e funcional. 3. ed. Rio de Janeiro:
Interamericana, 1986.
RUBIN, E.; FARBER, J. L. Patologia Rubin Farber. Rio de Janeiro: Interlivros,
1990.
SCHINDL, A.; SCHINDL, M.; SCHINDL, L.; JURECKA, W.; HONIGSMANN, H.;
BREIER, F. Increased dermal angiogenesis after low-intensity laser therapy for
a chronic radiation ulcer determined by a video measuring system. J. Am.
Acad. Dermatol., v.40, p . 481-484,1999.
SCHINDL, A., HEINZE, G., SCHINDL, M., PERNERSTORFER-SCHÖN, H.,
SCHINDL, L. Systemic Effects of Low Intensity Laser Irradiation on Skin
Microcirculation in Patients with Diabetic Microangiopathy.Microvascular
Research v.64, p. 240- 246, 2002.
SCHLAGER, A . et al. Low-Power Laser Light in the Healing of Burns: A
Comparison Between Two Different Wavelengths (635nm and 690nm) and a
Placebo Group. Lasers in Surgery and Medicine. v. 27, n. 1, p. 39-42, 2000.
SIMUNOVIC, Z.; IVANKOVICH, A .D.; DEPOLO, A . Wound Healing of Animal
and Human Body Sport and Traffic Accident Injuries Using Low-Level Laser
Therapy Treatment: A Randomized Clinical Study of Seventy- Four Patients with
Control Group. Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery. v. 18, n.2, p.
6773,2000.
SKINNER, S. M.; GAGE, J. P.; WILCE, P. A.; SHAW, R. M. A preliminary study
of the effects of laser radiation on collagen metabolism in cell culture. Aust.
Dent. J., v.41, p. 188-192,1996.
SLATTER, D. Manual de cirurgia de pequenos animais. 2. Ed. São Paulo:
Manole, 1998. vol. 1.
SPENCE, A. P. Anatomia humana básica. 2 ed. São Paulo: Manole, 1991.
STADLER, I. Et al. In Vitro Effects of Low- Level Laser Irradiation at 660nm on
Peripheral Blood Lymphocytes. Lasers in Surgery and Medicine. v. 27, p. 255-
261,2000.
SWAIN, S. F. Surgey of traumatized skin: management and reconstruction
in the dog and cat. Philadelphia: W. B Saunders, 1980.
TATURANAS, A . C.; MATERA, J. M.; DAGLI, M. L. Z. Estudo Clínico e
Anatomopatológico da Cicatrização Cutânea no Gato Doméstico. Utilização do
Laser de Baixa Potência GAAS (904 nm). Acta cir. Bras. v. 13, n. 2, 1998.
THOMSON, A.; SKINNER, A.; PIERCY, J. Fisioterapia de Tidy. 12.ed . São
Paulo: Santos, 1994.
TIMIMI, F. K.; TING, H. H.; HALEY, E. A.; RODDY, M.; GANZ, P.; CREAGER,
M. A. Vitamin C improves endothelium-dependent vasodilation in patients with
insulindependent diabetes mellitus. J. Am. Coll. Cardiol., v. 31, p. 552-557,
1998.
TUNER, J. ; HODE, L. It’s all in the parameters: a critical analysis of some well-
known negative studies on low-level laser therapy. J. Clin. Laser Med. Surg., v.
16, n. 5, p. 245-248, 1998.
TUNER, J.; HODE, L. Low level laser therapy. Clinical practice and
scientific background. Sweden: Prima Books; 2002.
VEÇOSO, M.C. Laser em Fisioterapia. São Paulo: Lovise, 1993, 143p.
VERA MENDEZ, T. M. T. Avaliação da influência da dose e do comprimento
de onda no processo de reparo subcutâneo de feridas submetidas à
laserterapia. 2002. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) -
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba.
WALKER, M. et al. Effect of Low- Intensity Laser Irradiation (660 nm) on a
Radiation- Impaired Wound -Healing Model in Murine Skin. Lasers in Surgery
and Medicine. v. 26, p. 41-47, 2000.
WEBB, C.; DYSON, M.; LEWIS, W. H. P. Stimulatory Effects of 660nm Low
Level Laser Energy on Hypertrophic Scar-derived Fibroblasts : Possible
Mecanism for Increase in Cell Counts. Lasers Surg. Med. V.22, p. 294-301,
1998.
YILMAZ, S. et al. Effects of Galium Arsenide Diodo Laser on Human Periodontal
Disease: A Microbiological and Clinical Study. Lasers in Surgery and
Medicine. v. 30, n. 1, p. 60- 66, 2002.
YU, W.; NAIM, J. 0 .; LANZAFAME, R.J. Effects of Photostimulation on Wound
Healing in Diabetic Mice. Lasers in Surgery and Medicine. v. 20, n.1, p. 56-63,
1997.
Top Related