UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIROUNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIROFACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICASFACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIAPARASITOLOGIA

Métodos Fenotípicos para Caracterização Métodos Fenotípicos para Caracterização dos Mecanismos de Resistência aos dos Mecanismos de Resistência aos

AntimicrobianosAntimicrobianos

Prof. Robson LeãoProf. Robson Leão

Natural ou intrínseca

Aeróbios

Anaeróbios aminoglicosídeos

Adquirida Cromossômica Mutação de genes

Resistência é transmitida da célula-mãe para célula-filha

Plasmidial

Transmissível Resistência múltipla

Produção: ß-lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases.

Metronidazol

Quinolonas

Para que eu preciso saber disso????

Riscos e Desvantagens do Uso Indiscriminado e Profilático dos Antimicrobianos:

1- Cada espécie de bactéria apresenta características próprias;

2- Fenômeno de resistência bacteriana;

3- Modificações produzidas na microbiota normal;

4- Efeitos colaterais de natureza tóxica, irritativa ou alérgica;

5- Drogas dispendiosas.

Benefícios e vantagens na profilaxia?!

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Variável entre os países, regiões e origem hospitalar ou comunitária das estirpes; Algumas espécies apresentam resistência/sensibilidade difundida em todo mundo;

A pressão seletiva do uso de antimicrobianos exerce papel fundamental na magnitude e

disseminação da resistência.

SENTRYSENTRY

SENTRYSENTRY

SENTRYSENTRY

SENTRYSENTRY

SENTRYSENTRY

SENTRYSENTRY

SP, RJSP, RJRS, SCRS, SC

SENTRY – Sistema de Vigilância para Monitoramento dos Principais Patógenos Relacionados a Infecções

Hospitalares

Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)

Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.

A subcomissão do NCCLS é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

Recomendações na escolha dos antimicrobianos

Padronização das técnicas

Critérios para a interpretação dos resultados

Parâmetros para o controle qualidade do teste.

Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo NCCLS)

MRSAMRSA GISAGISA

GRSAGRSAVREVRE

ESBLESBLP. aeruginosa MRP. aeruginosa MRAcinetobacter MR

Acinetobacter MR

Metalo-Metalo-lactamase

lactamase

O que fazer diante das “super-bactérias”??O que fazer diante das “super-bactérias”??

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Fenótipos de resistência relevantes na prática médica:Fenótipos de resistência relevantes na prática médica:

1- 1- MRSA/ORSA=MRSA/ORSA=StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus resistente à metilicina e resistente à metilicina e oxacilinaoxacilina

Primeiro caso foi descrito em hospitais da Europa nos anos 60, Primeiro caso foi descrito em hospitais da Europa nos anos 60, e nos anos 70 já se tornava um problema de saúde públicae nos anos 70 já se tornava um problema de saúde pública Acima de 50% dos isolados de Acima de 50% dos isolados de S. aureus S. aureus em UTIem UTI Mutação cromossômica: produção de novas PBP, mediada pelo Mutação cromossômica: produção de novas PBP, mediada pelo gene gene mec Amec A..

2- 2- MRS = MRS = Staphylococcus Staphylococcus coagulase negativa (SCN) resistente à coagulase negativa (SCN) resistente à metilicina e oxacilinametilicina e oxacilina

Durante muito tempo, considerados como destituídos de patogenicidade, usualmente relatados como contaminantes. Hoje, importante papel nas infecções hospitalares e as taxas tem sido correlacionadas com o uso crescente de procedimentos médicos invasivos e o aumento no número de imunocomprometidos. 75% dos SCN isolados de UTI’s são resistentes a meticilina.

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Antimicrobianos

Taxas de resistência aos antimicrobianos em 100 cepas de SCN, determinadas pelo método de difusão em ágar – HUPE UERJ, 1999-2000.

Caracterização da Resistência à Meticilina

Testes Convencionais: Teste de difusão em ágar e diluição em ágar, caldo (CMI) e Teste E.

Testes Comerciais: Vitek, ATB, MicroScan, dentre outros:

Caracterização da Resistência à Meticilina

Caracterização da Resistência à Meticilina

Testes Moleculares: Detecção do gene mecA

Caracterização da Resistência à Meticilina

Testes Imunoenzimáticos Teste do látex PBP 2a

Outros:

S. aureus– S. aureus R à meticilina Vancomicina– R vancomicina

• 1996 – foi isolada amostra com susceptibilidade reduzida no Japão

• 1997 – 2 casos de infecções por VISA nos EUA• 2002 – isolamento de VRSA nos EUA

– VISA – MIC = 8-16 g/mL– VISA – MIC > 32 g/mL

MRSAMecanismo de Resistência

Produção de uma proteína específica – PBP 2a ou PBP 2’ Produção de uma proteína específica – PBP 2a ou PBP 2’ codificada pelo gene codificada pelo gene mec Amec A

Afinidade reduzida a Afinidade reduzida a ß-lactâmicosß-lactâmicos mecA mecA → Cassete Cromossômico Estaficlocócico (→ Cassete Cromossômico Estaficlocócico (SCCmecSCCmec))

→ → elemento genético móvelelemento genético móvel

→ → SCCmecSCCmec I, II, III, IV e V I, II, III, IV e V

MRSAMRSA

CA-MRSACA-MRSA

HA-MRSAHA-MRSA

CA-MRSAManifestações clínicas

Infecções leves: abscessos e celulitesInfecções leves: abscessos e celulites

Infecções graves: pneumonias Infecções graves: pneumonias necrozantes, osteomielites e septicemias necrozantes, osteomielites e septicemias podendo levar a óbitos. podendo levar a óbitos.

Epidemiologia

1º caso CA-MRSA – 1º caso CA-MRSA – Aborígenes australianos Aborígenes australianos na década de 90na década de 90

Emergência mundialEmergência mundial

Surtos em populações Surtos em populações especificasespecificas

CA-MRSA Primeiros casos – década de 90Primeiros casos – década de 90 Apresentam características distintas da cepas HA-Apresentam características distintas da cepas HA-

MRSA:MRSA:

→ → SCCmec IV e VSCCmec IV e V

→ → Suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos, Suscetibilidade a várias classes de antimicrobianos, resistência somente aos resistência somente aos ß-lactâmicosß-lactâmicos

→ → PVLPVL Ausência de fatores de risco específicos – indivíduos Ausência de fatores de risco específicos – indivíduos

saudáveis saudáveis

Cepas obtidas de Porto Alegre a partir de infecções de pele e tecidos Cepas obtidas de Porto Alegre a partir de infecções de pele e tecidos molesmoles

4 cepas → PFGE – clone OSWP (Oceania)4 cepas → PFGE – clone OSWP (Oceania)

USA300USA300

CA-MRSA no Brasil

Fatores de Risco Ao contrário do HA-MRSA, surtos de CA-MRSA tem sido Ao contrário do HA-MRSA, surtos de CA-MRSA tem sido

reportados entre indivíduos saudáveis e sem fatores de reportados entre indivíduos saudáveis e sem fatores de risco associados. risco associados.

Definição de infecção por CA-MRSA – CDC:Definição de infecção por CA-MRSA – CDC:

→ → Ausência de história previa de isolamento de MRSAAusência de história previa de isolamento de MRSA

→ → Ausência de hospitalização e/ou cirurgia durante os 12 Ausência de hospitalização e/ou cirurgia durante os 12 meses anteriores ai isolamento do MRSAmeses anteriores ai isolamento do MRSA

→ → Ausência de relato de catereres percutâneos, próteses, Ausência de relato de catereres percutâneos, próteses, ou de outros artigos e procedimentos invasivos no ou de outros artigos e procedimentos invasivos no momento da coleta ou nos últimos 12 meses que a momento da coleta ou nos últimos 12 meses que a antecederamantecederam

SCCmec Elemento genético móvelElemento genético móvel Carreia complexos de genes Carreia complexos de genes mecmec e e ccrccr

5 tipos:5 tipos:

I,II,III I,II,III → HA-MRSA→ HA-MRSA

IV e V → CA-MRSAIV e V → CA-MRSA

Tipo IV: menor tamanho. Perda de genes de resistência?Tipo IV: menor tamanho. Perda de genes de resistência?

Origem das cepas de CA-MRSA:1ª hipótese → deleções de genes de resistência de

HA-MRSA2ª hipótese → transferência de SCCmec para MSSA

Leucocidina de Panton-Valentine (PVL)

É uma exotoxina, composta de 2 subunidades que são É uma exotoxina, composta de 2 subunidades que são codificadas pelos genes codificadas pelos genes lukS-PVlukS-PV e e lukF-PVlukF-PV (genes (genes pvl)pvl) → → lise em PMNslise em PMNs

Isolados de CA-MRSA responsáveis por doenças carreiam Isolados de CA-MRSA responsáveis por doenças carreiam PVL com prevalência praticamente universal PVL com prevalência praticamente universal → Associada → Associada aos casos de infecções mais gravesaos casos de infecções mais graves

EExemplo: pneumonias associadas a xemplo: pneumonias associadas a S. aureusS. aureus pvl-positiva pvl-positiva está mais frequentemente associada com sepse, febre está mais frequentemente associada com sepse, febre alta, leucopenia e hemoptíase, derrame pleural e morte.alta, leucopenia e hemoptíase, derrame pleural e morte.

CA-MRSA in Cystic Fibrosis

Chest / 133 / 6 / June, 2008.Chest / 133 / 6 / June, 2008.

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

3- 3- VRSA/GISA (VISA) = VRSA/GISA (VISA) = StaphylococcusStaphylococcus sp resistente/sensibilidade sp resistente/sensibilidade intermediária à glicopeptídeosintermediária à glicopeptídeos

A partir de 1996 no Japão (VISA)A partir de 1996 no Japão (VISA) Posteriormente: EUA, França, Alemanha, outrosPosteriormente: EUA, França, Alemanha, outros Brasil: resistência intermediária em RJ, SP e Porto AlegreBrasil: resistência intermediária em RJ, SP e Porto Alegre Mutação cromossômica: hiperprodução de PBP, espessamento Mutação cromossômica: hiperprodução de PBP, espessamento da parede celular e aprisionamento das drogas por excesso dos da parede celular e aprisionamento das drogas por excesso dos componentes da paredecomponentes da parede

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Caracterização da Resistência Intermediária a glicopeptídeos (GISA ou ViSA):

Teste de difusão em ágar com halos de inibição inferiores a 14 mm para vancomicina; Confirmar resultados determinando a CMI (8-16 mcg/mL) intermediário.

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

4- 4- EnterococcusEnterococcus spp. resistente à vancomicina (VRE) spp. resistente à vancomicina (VRE)

• A partir de 1986 no Reino Unido A partir de 1986 no Reino Unido • Posteriormente: EUA, Europa, Japão, América Central e do SulPosteriormente: EUA, Europa, Japão, América Central e do Sul• Brasil: Brasil: 1996-Curitiba; 1997-SP; 2000–RJ; 2001–Porto Alegre• Resistência plasmidial e cromossômica: produção de Resistência plasmidial e cromossômica: produção de precursores alterados do peptideoglicano, que não são precursores alterados do peptideoglicano, que não são reconhecidos pela vancomicinareconhecidos pela vancomicina

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

VRE no Rio de JaneiroVRE no Rio de Janeiro

Rio de Janeiro: HUPE/UERJ - Enterococcus gallinarum Hospital da rede pública - E. faecalis Hospital da rede privada - E. faecium

Niterói: HU Antônio Pedro/UFF - Enterococcus faecalis Hospital da rede privada - E. faecium

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Caracterização da Resistência a glicopeptídeos (VRE):

Inicialmente teste de difusão em ágar; Diluição em ágar ou caldo

Resistência à Vancomicina

Baixo nível: CMI 8 – 32 mcg/mL

Resistência Elevada: CMI ≥ 64 mcg/mL

Teste moleculares: Van A, Van B, Van D, E, G, R, X e outros.

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

5- 5- Enterococcus Enterococcus sp sp HLAR ( (High-Level Aminoglycoside Resistance)

Elevado nível de resistência à aminoglicosídeosElevado nível de resistência à aminoglicosídeos Mutação no alvo ribossômico (Estreptomicina)Mutação no alvo ribossômico (Estreptomicina) Inativação enzimática (Estreptomicina e Gentamicina)Inativação enzimática (Estreptomicina e Gentamicina)

Caracterização a Níveis Elevados de Antimicrobianos - HLAR:

Teste de difusão em ágar – disco difusão: (concentração elevadas de aminoglicosídeos).

HLAR conc. do disco R I S

Gentamicina 120 μg 6 7-9 >10

Estreptomicina 300 μg 6 7-9 >10

CLSI-2006

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

6- 6- Enterobactérias produtoras de ESBL (Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro -Lactamase de Espectro EstendidoEstendido))

Resistência transferível: hidrólise de cefalosporinas de amplo Resistência transferível: hidrólise de cefalosporinas de amplo espectro (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), degradam todos espectro (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e cefamicinas.carbapenens e cefamicinas.Geralmente, inibidas pelos inibidores de Geralmente, inibidas pelos inibidores de -Lactamase (ácido -Lactamase (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)clavulânico, sulbactam e tazobactam) Vários genes: TEM, SHV, PER, GES, CTX, OXA...Vários genes: TEM, SHV, PER, GES, CTX, OXA...

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

Enterobactérias produtoras de ESBL (Enterobactérias produtoras de ESBL (-Lactamase de Espectro -Lactamase de Espectro EstendidoEstendido))

Primeira ESBL: 1983 - Primeira ESBL: 1983 - Klebsiella ozaenae Klebsiella ozaenae (Alemanha)(Alemanha) Posteriormente: Posteriormente: Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae (França)(França) Hoje: > 200 tipos de ESBL caracterizadosHoje: > 200 tipos de ESBL caracterizados K. oxytoca, E. coli, Enterobacter K. oxytoca, E. coli, Enterobacter sppspp, Proteus mirabilis, , Proteus mirabilis, P.aeruginosa, AcinetobacterP.aeruginosa, Acinetobacter spp. spp.

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado

Todos os métodos fenotípicos se baseiam na

inibição da atividade da enzima pelos inibidores de

-lactamases (IBL)

Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS) Teste de Adição de IBL aos discos de

cefalosp. Discos combinados Teste de dupla-difusão em disco Etest Métodos automatizados

Caracterização Beta – Lactamase de Espectro Ampliado

Disco difusão: Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados

ao ácido clavulânico Meio de Müller-Hinton

POSITIVO

Aumento do halo 5 mm da associação

CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX

Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI

E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

Jacoby & Han, 1996 Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.

Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL

1.Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,

3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico,

5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico

Detecção de amostras produtoras de ESBL

Discos combinados

1

23

4

56

Teste Positivo

Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação

Vantagens Teste simples; Não necessita de reagentes especiais

Limitações Distância entre os discos; Armazenamento dos discos com ácido

clavulânico; Interpretação

Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®

Vantagens Teste simples;

Limitações Substrato específico; Não detecção de amostras,

cuja as MICs situem acima das diluições testadas;

Custo

MicroScan – Painéis de Gram-negativos

Triagem para ESßLPoços que contêm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL associados ao clavulanato

ESßL plus Confirmation PanelAntimicrobiano (conecntação testada em g/ml)

Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64

Imipenem 0.5 – 16

Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados

Triagem para ESßL

Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 g/mL associados ao clavulanato

Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados

Vitek – Painéis de Gram-negativos

Fenótipos de resistência relevantes na prática médicaFenótipos de resistência relevantes na prática médica

7- 7- P. aeruginosa P. aeruginosa produtora deprodutora de Metalo - Metalo - lactamase: lactamase:

Resistência transferível: hidrólise de penicilina, cefalosporinas Resistência transferível: hidrólise de penicilina, cefalosporinas e carbapenemas (imipenem, meropenem, ertapenem)e carbapenemas (imipenem, meropenem, ertapenem) Primeiramente caracterizada do anos 90 em Enterobactérias, Primeiramente caracterizada do anos 90 em Enterobactérias, P. P. aeruginosaaeruginosa e e AcinetobacterAcinetobacter spp. (Japão) spp. (Japão) Brasil (SENTRY): 44,8% de resistência à imipenem em Brasil (SENTRY): 44,8% de resistência à imipenem em P. P. aeruginosaaeruginosa 43,9% por metalo 43,9% por metalo -lactamase-lactamase

Resistência nos Principais Grupos Bacterianos:

Resistência aos carbapenensMetalo--lactamases

Genes cromossômicos e plasmidiais (tranposons, integrons)

Zn++ como cofatores enzimáticos

Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol

Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil)

Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA)

GIM-1 (Alemanha)

SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)

outras ...

Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica

A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas

Medidas de Controle

Detecção de amostras produtoras de MBL Disco- aproximação IMBL

Distância de 15-25

mm

CAZ CAZ

IMBL

Distância de 4-5 cm

IMBLEDTA – 5 l 100 mM2-MPCA puro – 2 a 3 l

Ceftazidima

Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico

Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases

NEGATIVA POSITIVA

Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Etest

Critério de positividade : Redução 3.0 diluições

Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--

Lactamase in Distinct Brazilian Regions

Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K. pneumoniae testada, pelo método de disco-difusão.

KPC

Medidas de Combate à Resistência:

1. Reversão do estado de sensibilidade primitiva por perda de fatores de resistência ou por mutação;

2. Uso de altas concentrações do antimicrobiano pra superar o mecanismo de inativação;

3. Rodízio do uso de antimicrobianos em hospitais;

4. Uso da associação de antibióticos;

5. Descobertas de novas drogas antimicrobianas;

6. Inibição do mecanismo bioquímico da resistênica;

7. Vigilância epidemiológica e Sistemas de controle de Infecção Hospitalar;

8. Restrição do uso de antimicrobianos;

9. Educação para prescrição e o uso racional de antimicrobianos

Bactérias Multiresistentes ?!?!

Obrigado!!