UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE AGRONOMIA
JOEL CABRAL DOS SANTOS
MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA
(Saintpaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO
DE PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)
AREIA-PB
2014
ii
JOEL CABRAL DOS SANTOS
MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA
(Saitipaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO DE
PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)
Trabalho de graduação apresentado ao Curso de Agronomia da Universidade Federal da Paraíba-Centro de Ciências Agrárias-Campus II-Areia-PB, como requisito para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.
Orientadora: Dra. Núbia Pereira da Costa
Co-orientador: Dr. Jacinto de Luna Batista
AREIA-PB
2014
iii
MEIOS ALTERNATIVOS PARA CULTIVO IN VITRO DE VIOLETA AFRICANA
(Saitpaulia spp.) E EFEITO DE DESCONTAMINANTES NO CULTIVO IN VITRO DE
PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochenilifera Salm-Dyck)
JOEL CABRAL DOS SANTOS
Monografia defendida em 23 de julho de 2014
Banca Examinadora
Profa. Dra. Núbia Pereira da Costa
Orientadora - CCA/UFPB
Prof. Dr. Américo Perazzo Neto
Examinador - CCA/UFPB
Bióloga. Lucinalva Azevedo dos Santos
Examinadora - CCA/UFPB
Eng.º Agrônomo. Tarciso Botelho Pereira Filho
Examinador – CCHSA/UFPB
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"Saí lá da minha terra Zabelê
Enfrentei intempéries nessa vida
Pra vencer muitas vezes a saída
É deixar o que gosta pra crescer
Com o diploma na mão eu posso ver
Que a metade do caminho foi andado
Mais na frente enxergo o mestrado
Doutorado e quem sabe mais vitórias
Mas sabendo que atrás de tantas glórias
Tem caminho sofrido já trilhado."
CAZUZA SALVADOR
A minha mãe (Maria do Desterro), a nova geração, minha princesa Amanda, Ana Luísa, Ana
Beatriz, Gustavo, Fernando e Flávio. Aos irmãos Dejailma, Janiel, Joelma e Deja.
DEDICO
v
AGRADECIMENTOSA toda minha família, especialmente a minha amada mãe Maria do Desterro ou
simplesmente Neném, por todo apoio e incentivo nas minhas escolhas, mesmo sem
compreender algumas vezes o que de fato estava eu a fazer.
A família, Coletivo ATISSAR , Romério, Sandra, Anael, Anaely, Almir, Iago,
Raphael, David, Lucas, Alan, Dianne (e outros que por este coletivo já passaram) sem vocês,
sem a força e sem os ensinamentos deste coletivo não teria eu chegado até aqui.
Leandra (meu amor), por todo amor, carinho, paciência, incentivos dedicados a mim
para conquistas dos meus sonhos. Sou muito Feliz por ter você em minha vida. Te amo...
Aos orientadores Profª. Núbia e Prof. Jacinto, por todos os ensinamentos acadêmicos e
da vida, pelos incentivos para que chegasse ao objetivo alcançado e por todos os conselhos e
para tomada de decisões.
A Iris por toda ajuda e incentivo, e também a sua equipe administrativa Marleide,
Luciene, Ronaldo, Renata.
A todos que de alguma forma contribuíram para construção dessa conquista, Fabiana,
Maelson, Lucy, Zé Moreira e tantos outros.
A todos os colegas e amigos da turma de Agronomia 2010.1, Renato (Caixa d`água),
Zé Marcos, Paulo (Paulo Crime), Daniel (o Bebo), Ítalo, Gilmar, Arliston, Jadison, Rafael
(Fiu-fiu), Anderson, Camila, Amanda...
Renato (Perêra), Mileny (Mimi), Mariana (Nevinha) , Carolline (Diva) por toda troca
de conhecimentos e ensinamentos, tantos momentos felizes, levaremos pra sempre essa
amizade tão bela que construímos ao longo destes anos.
Aos colegas do grupo PET - Agrobio.
Aos companheiros de quarto, Rinaldo (Binho), Cazuza (Caca), Lemerson, Ronaldo
(Baixinho) Rommel (Prata). E tantos colegas feitos ao longo destes quatro anos e meio, Haron
(Senador), Jair, Neto (Pipoca), Adelmo.
Aos companheiros de laboratório João Ítalo e Francisco (Chico) por toda ajuda na
realização deste trabalho, Lucinalva, Tarciso, Agenor...
Aos colegas do laboratório de Entomologia Robério (Presidene), Vinicius...
A nova família, que me acolheu em Areia, Adriana, Dona Zefinha, Minininha,
Conceição (Piquena), Belinha, Cecilia e Bruna.
A Universidade Federal da Paraíba, a todos os professores do CCA pelos
ensinamentos aqui recebidos.
vi
SUMÁRIO
RESUMO GERAL....................................................................................... viii
GENERAL ABSTRACT............................................................................. ix
CAPÍTULO I - CONSIDERAÇÕES GERAIS.......................................... 11
1. INTRODUÇÃO GERAL............................................................................. 12
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.............................................................. 13
2.1 Espécies estudadas....................................................................................... 13
2.1.1 Violeta africana.............................................................................................. 13
2.1.2 Palma.............................................................................................................. 14
2.2 Micropropagação e meios de cultivo.......................................................... 16
2.3 Uso da Luz Natural...................................................................................... 18
2.4 Enraizamento e Desenvolvimento............................................................... 20
2.5 Aclimatização................................................................................................ 21
2.6 Descontaminação.......................................................................................... 22
REFERÊNCIAS........................................................................................... 24
CAPÍTULO II - ENRAIZAMENTO E DESENVOLVIMENTO IN
VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE BROTOS DE VIOLETA
AFRICANA EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE FÉCULA
DE MANDIOCA E EM MEIO LÍQUIDO ESTACIONÁRIO................ 37
RESUMO.................................................................................................... 38
ABSTRACT................................................................................................. 39
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 41
2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 42
2.1 Local e período de realização dos experimentos....................................... 42
2.2 EXPERIMENTO 1: Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in
vitro e na aclimatização de violeta
africana.......................................................................................................... 42
2.2.1 Tratamentos.................................................................................................... 43
2.2.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 43
2.2.3 Aclimatização................................................................................................. 43
2.2.3.1 Tratamentos.................................................................................................... 44
vii
2.2.3.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 44
2.2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos............... 44
2.3 EXPERIMENTO 2: Uso de PVC como ponte no meio líquido............... 45
2.3.1 Tratamentos.................................................................................................... 45
2.3.2 Parâmetros avaliados...................................................................................... 45
2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos......... 46
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 46
3.1 Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na
aclimatização de violeta africana............................................................... 46
3.1.2 Aclimatização................................................................................................. 49
3.2 Efeito do uso de PVC como ponte no meio líquido................................... 51
4. CONCLUSÕES............................................................................................ 54
REFERÊNCIAS........................................................................................... 54
CAPÍTULO III - EFEITO DE DESCONTAMINANTE NO
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE PALMA FORRAGEIRA
(Nopalea cochinileifera Salm-Dick).. ......................................................... 58
RESUMO...................................................................................................... 59
ABSTRACT....................................... .......................................................... 59
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 61
2. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 62
2.1 Local e período de realização dos experimentos....................................... 62
2.1.1 Descontaminação e inoculação dos explantes................................................ 62
2.1.2 Tratamentos.................................................................................................... 63
2.1.3 Parâmetros avaliados...................................................................................... 63
2.1.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos............... 63
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 64
4. CONCLUSÕES............................................................................................ 66
REFERÊNCIAS........................................................................................... 67
viii
RESUMO GERAL
SANTOS, Joel Cabral. Meios Alternativos para Cultivo In vitro de Violeta Africana
(Saintipaulia spp) e efeito de descontaminantes no cultivo in vitro de Palma Forrageira
(Nopalea cochenilifera Salm-Dyck). 2014. 68f. Universidade Federal da Paraíba. Orientadora:
Núbia Pereira da Costa.
RESUMO: A violeta africana (Saintpaulia spp) é uma das plantas ornamentais de interior das
mais importantes, destacando-se pela beleza e delicadeza de suas flores. A palma miúda ou
doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado pela sua resistência a cochonilha
do carmim. A cultura de tecidos de plantas vem se tornando uma técnica bastante utilizada,
mas para que esta técnica torne-se viável os custos devem ser reduzidos. Objetivou-se com
este trabalho avaliar o desenvolvimento de violeta africana e palma forrageira em meios e
ambientes alternativos para o cultivo in vitro. O trabalho foi realizado no Laboratório de
Biologia Celular e Cultura de tecidos do CCA/UFPB – Areia – PB. O trabalho foi divido em
três experimentos, utilizando-se o delineamento inteiramente ao acaso. No primeiro, brotos de
violeta africana com 0,5 cm contendo de duas a três folhas foram colocados para enraizar em
meio MS + 20 g L-1 de sacarose geleificado com ágar ou fécula de mandioca. Após o
enraizamento as plantas foram levadas para aclimatização, onde foram avaliados o percentual
de enraizamento e sobrevivência; número de folhas e de raízes; comprimento de parte aérea e
de raiz. No segundo experimento, os brotos foram colocados para enraizar em meio
semissólido e líquido utilizando pontes de PVC com papel filtro ou algodão, realizou-se as
seguintes avaliações: sobrevivência e enraizamento; número de folhas e de raízes;
comprimento de parte aérea e de raiz; massa fresca de parte aérea e de raiz; massa seca de
parte aérea e de raiz, com cinco repetições e três brotos por potes no enraizamento e três
plantas por vaso na aclimatização. No último experimento testou-se concentrações de
hipoclorito de sódio associado ou não a Tween 20 na descontaminação de palma para o
cultivo in vitro em casa de vegetação, as variáveis analisadas foram; percentagem de
contaminação; oxidação e presença de brotações, com 12 tratamentos e seis repetições. A
fécula de mandioca na concentração de 100 g L1 pode substituir o ágar no meio de cultura do
cultivo in vitro de violeta africana sendo esta concentração a mais eficiente no enraizamento e
na aclimatização. A ponte de PVC com papel filtro pode ser utilizada no enraizamento in vitro
da violeta africana em meio liquido. A manutenção dos cladódios em ambiente higienizado
associado a todos os tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na
ix
descontaminação de explantes de palma forrageira (N. cochenillifera), havendo uma maior
presença de brotações nas concentrações de 10 e 20% de NaOCl, e ocorrendo a diminuição
quando associado ao Tween 20..
Palavras-chave: Cultura de tecidos, Cultivo in vitro em telado, Meio estacionário.
GENERAL ABSTRACT
SANTOS, Joel Cabral. Alternative means for in vitro cultivation of african violet
(saintpaulia spp.) And decontaminating effect on in vitro cultivation of forage palm
(Nopalea cochenilifera Salm-Dyck). 2014. 68f. Universidade Federal da Paraíba. Guider:
Núbia Pereira da Costa.
ABSTRACT: The african violet (Saintipaulia spp.) is one of the most important ornamental
houseplants distinguished by its beauty and delicacy of their flowers. The small forage cactus
or sweet forage cactus (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) stands out for its resistance to
cochineal carmine. The plant tissue culture is becoming a very common technique. But for
this technique to become viable, costs must be reduced. The objective of this work was to
evaluate the development of african violet and forage cactus in alternative tissue culture
media and alternative environments to cultivate in vitro. The work was performed at the Cell
Biology and Tissue culture Laboratory of the CCA/UFPB - Areia - PB. The work was divided
into three experiments, using a completely randomized design. In the first, sprouts of african
violet with 0,5 cm containing two to three leaves were planted on MS medium + 20 g L-1
jellified sucrose agar and/or cassava starch to root. After rooting, the plants were taken for
acclimatization. Were evaluated the percentage of rooting and survival; number of leaves and
roots; length of sprout and root. Then, the sprouts were placed to root into medium semisolid
and liquid using PVC bridges with filter paper or cotton, made the following assessments:
survival and rooting; number of leaves and roots; length of sprout and root; fresh weight of
sprout and root; dry weight of sprout and root. To the rooting were used five replications and
three sprouts/pots and to acclimatization were used three plants/vase. In the last experiment
we tested concentrations of sodium hypochlorite associated or not with Tween 20 in
decontaminating forage cactus cultivation in vitro in a greenhouse. The variables analyzed
were percentage of contamination; oxidation and the presence of sprouts. Were used 12
x
treatments and six replications. The cassava starch concentration of 100 g L1 can replace the
agar in the culture medium of the culture of violet in vitro, being the most efficient
concentration on rooting and acclimatization. The bridge PVC with filter paper can be used in
the in vitro rooting african violet subjected to liquid medium. Maintenance of cladodes in
sanitized environment associated with all treatments with NaOCl with or without Tween 20 is
effective in decontamination of explants of forage Palm (N. cochenillifera), with a greater
presence of shoots at concentrations of 10 and 20% of NaOCl, and occurring to decrease
when associated with the Tween20.
Key words: Tissue culture, In vitro cultivation in screenhouse, Stationary medium
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CAPÍTULO I
CONSIDERAÇÕES GERAIS
12
1. INTRODUÇÃO GERAL
Entre as várias técnicas utilizadas na propagação vegetativa, tem-se o cultivo in vitro,
que se fundamenta na totipotencialidade celular, teoria proposta por Haberlandt em 1902,
onde cada célula vegetal possui potencial genético para gerar um novo organismo, idêntico ao
que lhe deu origem (GEORGE, 2008). Esta forma de cultivo é considerada um requisito
essencial na transformação genética da maioria das espécies de plantas, uma vez que, nessa
condição, é possível regenerar plantas completas a partir de uma única célula geneticamente
alterada pela introgressão estável do gene exógeno (PASQUALI; ZANETTINI, 2007;
SARTORETTO et al., 2008).
A micropropagação é uma técnica muito utilizada para aquelas espécies de difícil
propagação, ou que ainda tenha elevado valor econômico e possua algum tipo de dificuldade
em sua propagação. É uma importante estratégia para o melhoramento, clonagem e
multiplicação de plantas em larga escala e para obtenção de plantas livres de vírus, com alta
qualidade fitossanitária e genética (VILLASLOBOS; THORPE, 1991).
Os fatores que mais elevam os custos na produção de mudas através do cultivo in vitro
estão relacionados com a infraestrutura e energia elétrica, pois neste método os cultivos
permanecem em condições artificiais de luz e temperatura por um longo período de tempo,
ocorrendo assim um elevado consumo de energia pelo emprego de equipamentos para
manterem as condições desejadas (STANDAERT DE METSENAERE, 1991; KODYM;
ZAPATA-ARIAS, 1999).
Outro fator que contribui diretamente para o elevado custo desta técnica é a
composição dos meios de cultura, cujos componentes podem ser substituídos, em muitos
casos, por frutas, legumes e açúcar de uso doméstico (CAMPOS, 2002) e fertilizantes
minerais (NPK) (FERREIRA et al., 2010).
Sendo assim, o ágar é um dos componentes mais dispendiosos para a cultura de
tecidos de plantas (CALDAS et al., 1998; JUNGHANS et al., 2009), espera-se com a
substituição deste, por materiais alternativos, resultados que possam fazer com que haja a
redução de custos na técnica de cultivo in vitro (FARIA et al., 2006).
Assim objetivou-se com este trabalho, testar agentes geleificantes em substituição ao
agar e meio estacionário no cultivo in vitro de violeta africana e estabelecimento in vitro de
palma forrageira em casa de vegetação em função dos agentes contaminantes.
13
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Espécies estudadas
2.1.1 Violeta africana
A violeta africana (Saintipaulia ionantha Wendl), é uma espécie florífera, da família
Gesneriaceae, englobando mais de 120 provimentos e mais de 2000 espécies conhecidas
(TOMBOLATO et al., 1987). Tida como uma das mais populares plantas ornamentais,
existindo no mercado mundial mais de cinquenta cultivares (STANCATO et al., 2009),
Caracteriza-se por ser uma planta herbácea, possui folhas ovais, de coloração verde-escura e
de uma textura veludosa, suas flores são de cores diversas. Esta é uma das mais importantes
flores envasadas de interior (FRÁGUAS et al., 2002).
A violeta é uma espécie florífera perene, podendo florescer em qualquer época do ano,
é uma das espécies ornamentais mais difundidas e apreciadas, por ser uma planta de vaso,
podendo ser utilizadas como decoração em todos os ambientes (TOMBOLATO et al., 1987).
Possui flores simples ou dobradas com grande variação de cores: branca, rosa, roxo, azul ou
bicolor, que florescem o ano todo e duram de 5 a 7 dias (BIANCHINI; PANTANO, 1991). As
violetas apresentam características que as tornam populares: é de fácil cultivo, não ocupam
grandes espaços, por seu colorido podem ornamentar os mais diversos ambientes (VIOLETA
AFRICANA, 2002).
A floricultura tem se tornado uma atividade muito próspera (TERCEIRO NETO,
2004), tal segmento vem desempenhando papel significativo dentro do agronegócio brasileiro
(BORSOI, 2009). Este potencial está ligado às diversas condições climáticas do Brasil,
favorecendo o cultivo de uma grande quantidade de espécies tanto de clima tropical quanto
temperado, com possibilidade de produção em todas as estações do ano, dando garantias a
atividade, contribuindo para o aspecto social e gerando distribuição de renda, uma vez que a
floricultura é realizada na maioria por pequenos produtores (FRANÇA; MAIA, 2008;
BRAGA, 2006).
14
2.1.2 Palma
No Nordeste brasileiro predominam três cultivares de palma forrageira, das quais dois
pertencem à Opuntia fícus-indica Mill, vulgarmente conhecidas como redonda ou orelha-de-
onça e a gigante, graúda ou azeda e uma pertencente à espécie Nopalea cochenillifera Salm
Dick, denominada de miúda, língua-de-vaca ou doce (MAIA NETO, 2000).
A palma forrageira apresenta múltiplos usos, nativa do México, país que a explora
desde o período pré-hispânico, detendo a maior riqueza de cultivares (REYES-AGUERO et
al., 2005). A região Nordeste do Brasil concentra a maior área cultivada de palma forrageira
do mundo, estimada em 600 mil hectares distribuídos nos Estados da Bahia, Sergipe, Alagoas,
Pernambuco, Paraíba, Ceará e Rio Grande do Norte (LOPES, 2012). É um recurso alimentar
muito importante para os animais, pois ela é adaptada às condições edafoclimáticas da região
semiárida, essa forrageira tem sido frequentemente utilizada na alimentação de bovinos
sobretudo nos períodos de estiagem prolongada, pois possibilita altas produções de matéria
seca por unidade de área (SANTOS et al., 1997), além de ser excelente fonte de energia, rica
em carboidratos não-fibrosos (WANDERLEY et al., 2002) e nutrientes digestíveis totais
(MELO et al., 2003).
A palma forrageira (Opuntia spp.) é uma planta bem adaptada às condições semiárida,
em virtude de adaptações morfofisiológicas. Esta espécie possui mecanismo fotossintético do
tipo CAM (mecanismo ácido das crassuláceas), absorvendo gás carbônico CO2 no período
noturno e fixa-o em oxalacetato, e depois em malato e/ou aspartato, que serão transformados
em carboidratos pelo ciclo de Calvin durante o dia. Estas plantas evitam a perda de água por
abrirem seus estômatos à noite (temperatura baixa e alta umidade) e fechando-os durante o dia
(temperatura elevada e baixa umidade) obtendo assim alta eficiência no uso da água (TAIZ;
ZEIGER, 2013).
Além disso, o sistema radicular é adaptado às condições semiáridas, bem como, pode-
se observar a presença de espinhos e gloquídeos, os quais são úteis contra a perda de água;
outra adaptação é a morte e renovação de um percentual das raízes, conforme a falta de água
por períodos mais prolongados e o retorno da umidade ao solo (SAMPAIO, 2005).
A palma além de ser um alimento volumoso suculento é, dentre as forrageiras
disponíveis na região, a que possui a maior capacidade de produção de matéria fresca, e não
precisa ser armazenada como silagem ou feno, mantendo seu valor nutritivo durante todo o
período de estiagem (OLIVEIRA, et al., 2010). Utilizada em outros países em projetos de
preservação do solo para zonas áridas, produção de hortaliças, cochonilha para a produção de
15
carmim e inúmeros subprodutos como queijo vegetariano, bebidas, remédios e cosméticos,
biomassa para fins energéticos (combustível ou biogás), (SÁENZ et al., 2006; CHIACCHIO
et al., 2006).
É também cultivada para produção de frutos em zonas semiáridas no mundo inteiro
com bons rendimentos. Apesar de possuir uma área restrita para apreciação e valorização, o
“fruto de palma”, tem amplas possibilidades e potencialidades de vir a ser uma alternativa
para a diversificação da produção, gerando uma fonte adicional de renda para os agricultores
(LEDERMAN, 2005). Tem-se assim, na produção desta cultura um grande potencial no que
diz respeito ao desenvolvimento das zonas áridas e semiáridas, sobretudo, nos países em
desenvolvimento, onde a exploração racional e econômica de suas espécies ajudará na
conservação do meio ambiente e segurança alimentar dos rebanhos (CHIACCHIO et al.,
2006).
Quando se procede o plantio de palma em grandes áreas, nem sempre a quantidade de
propágulos são suficientes, sendo usados cladódios doentes, desuniformes e sem a suculência
adequada para o enraizamento. Assim, várias pesquisas estão sendo realizadas para obtenção
de sua micropropagação in vitro, a exemplo de Llmoca-Zárate e Paredes-López. (1999), que
obteve melhores resultados quando acrescentou ao meio de cultivo MS (MURASHIGE;
SKOOG, 1962), 6-benzilaminopurina (BAP) a 1,00mg/L e ácido indolacético (AIA) a
5,00mg/L.
A produtividade desta cultura tem reduzido ao longo dos anos. Isso devido ao ataques
de patógenos e pragas, como a cochonilha do carmim. Espécies do gênero Dactylopius que
são criadas em cactáceas e podem se transformar em pragas se a cultura não for conduzida
tecnicamente ou se forem disseminadas livremente nas plantas cultivadas (WARUBY et al.,
2005). As cochonilhas atacam a palma, sugam as raquetes inoculando toxinas, isso fará com
que haja o enfraquecimento das plantas, provocando o amarelecimento e a queda dos
cladódios. Em ataques mais severos, quando não é adotada medida de controle, podem
ocorrer a morte da planta e a destruição do palmal (CAVALCANTI et al., 2001). Ataques
dessa cochonilha em palma cultivada foram observados nos estados de Alagoas, Pernambuco,
Paraíba, Rio Grande do Norte e Ceará (SANTOS et al., 2006).
16
2.2 Micropropagação e meios de cultivo
A técnica bem sucedida da cultura de tecido tem sido uma prática muito utilizada para
propagação assexuada de plantas, oferecendo algumas vantagens sobre os métodos
convencionais de propagação, entre elas: plantas sadias, uniformes e vigorosas durante todo o
ano; propagação vegetativa de espécies difíceis de serem propagadas por outros métodos;
obtenção de um grande número de plantas em curto espaço físico e de tempo (FRÁGUAS et
al., 2002, SCHUCH; ERIG, 2005), Couto (2003) relata que o cultivo in vitro apresenta-se
como metodologia viável para produção em grande escala de plantas de importância
econômica devido as suas vantagens, destacando-se entre elas, a manutenção das
características genéticas.
No Brasil o uso de mudas micropropagadas para implantação de novas áreas de cultivo
tem apresentado crescimento significativo nos últimos dez anos, principalmente, por
produtores mais tecnificados (SIQUEIRA et al., 2013). No entanto Silva et al. (2005),
afirmam que as mudas micropropagadas são mais caras que as produzidas convencionalmente
mesmo com todas as vantagens apresentadas. Costa et al. (2007), destacam que o uso desta
técnica em escala comercial pode ser limitado pelo seu oneroso custo de produção de mudas,
especialmente pelo elevado custo dos reagentes e equipamentos utilizados e pela relativa
baixa eficiência no desenvolvimento e multiplicação de algumas espécies.
Para que essa atividade traga resultados benéficos aos produtores é imprescindível o
uso de novas tecnologias. Assim a produção de mudas pelo cultivo de células, se torna uma
opção viável para produção de mudas em escala comercial, apresentado fidelidade genética e
livre de patógenos, em um reduzido espaço de tempo, podendo assim atender ao mercado
(TERCEIRO NETO, 2004).
A propagação in vitro é uma técnica bem sucedida, principalmente com plantas
ornamentais com muitas vantagens sobre os métodos convencionais de propagação,
permitindo a obtenção de um grande número de plantas de boa qualidade fitossanitária com
pureza varietal, como também, a aquisição de mudas em qualquer época do ano (FRÁGUAS
et al., 2002). Dentre outras vantagens da micropropagação, deve-se ressaltar a propagação
rápida mediante à indução de múltiplos brotos, resultando em material propagativo com
potencial de produção contínua (COSTA et al., 2007).
Embora seja bastante utilizada para uma gama de espécies de plantas com os mais
variados fins, o uso comercial da micropropagação e de seus produtos é ainda limitado,
principalmente pelo elevado custo dos reagentes e equipamentos utilizados. Hoje já se
17
encontra na literatura trabalhos onde se buscam técnicas que possam ser reproduzidas, pois
estas precisam ser adaptadas as características de cada cultura ou cultivar, devido as
características genéticas de cada uma, podendo apresentar resultados contrários com as
mesmas condições de cultivo (COSTA et al., 2007).
A micropropagação é realizada em quatro fases, que se inicia com o estabelecimento
da cultura in vitro, seguida pela fase multiplicação in vitro, enraizamento in vitro ou ex vitro e
aclimatização (SILVA, 2013). Nas duas primeiras fases, os explantes são cultivados
obrigatoriamente em meios de cultivo. Os componentes destes meios são em sua grande
maioria, sais minerais (macronutrientes N, P, K S, Ca, Mg), micronutrientes (Fe, Mn, Zn, B,
Cl, Mb, Co ), açúcares ( sacarose, glicose ou frutose), vitaminas e aminoácidos (tiamina,
niacina, piridoxina, glicina), Inositol, fiotohormônios (auxinas, citocininas, giberilinas, entre
outros que raramente são utilizados, ou então são produzidos pelos explantes), (PASQUAL et
al.,1998; TOMBOLATO; COSTA, 1998; CID; TEIXEIRA, 2010).
Existe uma grande quantidade de formulações de meios básicos, as quais são utilizadas
na micropropagação in vitro, podendo-se citar: O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962),
em suas mais diversas concentrações e combinações tem sido utilizados em inúmeras espécies
com sucesso (CENTOFANTE et al., 2009); O meio WPM (LLOYD; MCCOWN, 1980) em
que as espécies lenhosas são cultivadas (PASQUAL, 2001), QL (QUOIRIN; LEPOIVRE,
1977), entre outros. O meio MS o mais amplamente utilizado no cultivo in vitro (SANTOS-
SEREJO et al., 2006). Os meios podem ser de consistência semissólida ou liquida (GUERRA;
NODARI, 2006), onde o processo de solidificação se dá pela adição de agentes geleificantes
(polímeros). A maioria dos cultivos são realizados com uso de meios de cultura semissólidos,
utilizando o ágar ou o phytagel como agentes geleificante do meio (MACEDO et al., 2003;
PEDROSO et al., 2001).
O ágar é um polissacarídeo de alto peso molecular, geleificante mais utilizado por
oferecer boas características, uma vez que apresenta um bom suporte para as plântulas, por ser
estável, com alta claridade, natureza atóxica e resistência aos metabólitos da cultura
(MCLACHLAN, 1985). Apesar destas vantagens, o ágar é um dos componentes mais caros
para a cultura de tecidos de plantas, desta forma a substituição desse componente por um
geleificante alternativo reduziria os custos com a técnica do cultivo in vitro (FARIA et al.,
2006).
Scholten e Pierik (1998), afirmam que o ágar é um agente solidificante que pode afetar
o crescimento e o desenvolvimento das culturas in vitro. Trabalhos realizados por Erig et al.
(2004), Costa et al. (2007) e Pereira et al., (2012) apresentam resultados da viabilidade do
18
uso de agentes de baixo custo, como a utilização de alguns amidos ou gomas vegetais para a
substituição do ágar. Para Erig et al., (2004); Ferri et al., (1998); Fortes et al., (1994) e Pereira
et al., (2003), podem ser citadas como vantagens destes polímeros, o baixo custo e a
facilidade de se encontrar no mercado quando comparados com o ágar, bem como um forte
aliado para maior eficiência econômica dos laboratórios.
Para Maciel (2011), os meios líquidos são ideais na micropropagação, por evitarem o
emprego de agentes geleificantes do meio de cultura. Com o uso de meios de cultura líquidos
se consegue uma boa eficiência para a micropropagação de várias cultura, como o abacaxi
(ESCALONA et al., 1999; FEUSER et al., 2001) e a cana-de-açúcar (LORENZO et al.,
1998). Trazendo como vantagens o rápido preparo, redução dos custos e maior difusão dos
componentes do meio (SIQUEIRA et al., 2013).
Estudando o emprego de meios alternativos, Guerra (1999), observou que os melhores
resultados foram obtidos quando utilizou meio líquido estacionário com ponte de papel filtro
na micropropagação de abacaxizeiro. Pereira (2003) relata que no estabelecimento de
protocolo para micropopropagação de Solanum tuberosum L. os meios de consistência
líquida, proporcionaram um significativo aumento na taxa de multiplicação (PEREIRA,
2003). Para Siqueira et al. (2013) isso se deve à maior facilidade de absorção dos nutrientes e
reguladores de crescimento, além da maior relação entre o explante e o meio. A alteração do
estado físico do meio de cultura modifica a resistência física e de contato dos explantes com o
meio, podendo influenciar no desenvolvimento de plântulas in vitro (CHEN; ZIV, 2001).
2.3 Uso da Luz Natural
No cultivo in vitro tradicional os explantes são cultivados em salas de crescimento,
onde estes são mantidos em regime de luz artificial, em sua maioria por um fotoperíodo de
16h de luz dia, seguido de 8h escuro, com temperatura constante de 25ºC ± 2, mantidas por
aparelhos de ar-condicionado, um ambiente totalmente climatizado.
Kodym e Zapata-Arias, (1999) afirmam que em 90% dos trabalhos científicos as
lâmpada fluorescentes brancas-frias são citadas como a principal fonte de luz utilizada na sala
de crescimento. Sendo que a iluminação é responsável por, aproximadamente, 65% do total
dos gastos de energia elétrica utilizada no laboratório de micropropagação, enquanto que,
25% são gastos com refrigeração, e o restante (10%) com esterilização, aquecimento, entre
outras, fazendo com que ocorra um elevado consumo de energia, isto por causa do emprego
19
de equipamentos sofisticados na manutenção das condições ambientais (STANDAERT DE
METSENAERE, 1991; KOZAI et al., 2003).
Para que esse método de propagação se torne viável, é necessário reduzir o elevado
custo de funcionamento e manutenção das salas de crescimento (BRAGA, et al., 2009; ERIG;
SCHUCH, 2005). Em meio às alternativas para diminuição dos gastos com energia elétrica na
produção de plantas in vitro, Kodym e Zapata-Arias (1999, 2001); Sendin (2001); Rocha
(2005), citam como um dos itens mais importantes, a substituição das salas de crescimento
pelo uso de luz natural, associado ou não a redução e ou eliminação da sacarose.
Para Costa (2009) além da substituição das lâmpadas fluorescentes pela luz natural se
apresentar como uma saída para redução dos custos na produção de plantas cultivadas in vitro,
o uso da luz natural oferece condições ambientais tanto de temperatura quanto de irradiância
semelhantes ao ambiente ex vitro, diminuindo assim o estresse e a morte das plantas na
aclimatização, por gerar melhorias anatômicas.
Borges et al.(2011), trabalhando na micropropagação de crisântemo com o sistema de
luz natural e artificial em diferentes concentrações de meio de cultivo, obtiveram os melhores
resultados para número de folhas, brotos e raízes e também para comprimento de parte aérea
com as plântulas cultivada in vitro no uso de luz natural, quando comparados aos dados no
cultivo com uso de luz artificial.
Fato também comprovado por Kodym e Zapata-Arias (1999) onde obtiveram maior
número de brotações de Musa sp. em casa de vegetação sob luz natural quando comparado
com sala de crescimento. Resultados semelhantes foram obtidos por Dignart (2009) no cultivo
in vitro de Cattleya sp. em casa de vegetação.
Silva et al. (2008), constataram que a perda de água em plântulas de abacaxizeiro
(Ananas comosus L. Merr), foi maior quando retiradas dos recipientes, advindas do sistema
convencional quando comparado com as planta cultivadas in vitro sob o regime de luz natural
após serem retiradas do recipiente, sendo que as plantas micropropagadas sob a luz natural
após duas horas apresentavam 18% de água a mais. Os autores afirmam que, o emprego de
luz natural, durante a fase de enraizamento in vitro, proporciona melhor desempenho
agronômico e anatômico das plantas de abacaxizeiro durante a fase de aclimatização.
Algumas são as vantagens apresentadas pelo uso da luz natural relatados por Kodym e
Zapata-Arias (1999); Zobayed et al. (2001); Afreen et al. (2002); Kozai et al. (2003) tais
como; eliminação dos gastos com luz artificial; redução dos custos de manutenção; aumento
do crescimento das plantas; melhoria das características fisiológicas da planta, devido às
condições ambientais de cultivo serem mais naturais, redução do estresse da planta durante a
20
aclimatização, aumentando assim a sobrevivência das mudas; possibilidade de utilização de
instalações simplificadas reduzindo os custos das construções.
Contudo Erig e Schuch (2005), chamam a atenção para o fato de que a disponibilidade
de luz varia com a intensidade do sol, pois a irradiância não é mesma nas diferentes estações
do ano, dependendo essa intensidade luminosa das condições climáticas apresentada durante
cada dia. Ainda segundo estes autores existem fortes razões para que seja realizadas mais
pesquisas e implementação no Brasil, principalmente pela grande disponibilidade de luz
natural ao longo do ano. Este é um dos fatores que devem ser levados em consideração na
escolha pelo uso ou não da luz natural, entretanto para Kodym e Zapata-Arias (1999), devem
ser levado em considerações também a espécie a ser micropropagada, a técnica in vitro
utilizada (heterotrófica, fotomixotrófica ou fotoautotrófica) e o meio de cultivo a ser utilizado
(BORGES et al., 2011).
2.4 Enraizamento e Desenvolvimento
Para Berilli (2010), outro fator que vem sendo bastante discutido no meio científico da
micropropagação é o enraizamento in vitro e ex vitro. Silva (2007), afirma que para se obter
uma alta taxa de sobrevivência na aclimatização, é necessário que as plantas produzam novas
raízes em substratos, e que estes substratos ofereçam adequadas condições tanto físicas quanto
nutricionais. O completo e bom desenvolvimento do sistema radicular acarreta na diminuição
de perdas durante a aclimatização, pelo fato de que as mudas irão ser mais vigorosas
(DAMIANI; SCHUCH, 2009).
Mohammed e Vidaver (1990); Klerk et al. (1997), entre outro autores, afirmam que
uma etapa chave no cultivo in vitro é a formação de raízes adventícias, onde um maior
número de brotos enraizados, com raízes de qualidade representa um eficiente sistema de
enraizamento, onde este bom desenvolvimento é constatado pelas variáveis: número e
comprimentos de raízes, ausência de calos e por apresentar uma boa eficiência após seu
plantio em solo.
Em seu trabalho com enraizamento de porta-enxertos de Prunus, Rocha (2006),
destaca que para a indução de raízes in vitro, geralmente, os meios de cultura são acrescidos
de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo estas, as variáveis que mais influenciam
no sucesso do enraizamento.
21
Para Aldrufeu (1987), a fase de enraizamento in vitro em meio geleificado como ágar
pode produzir raízes não funcionais. Skrebsky et al. (2006), chamam a atenção para um fator
importante envolvido na aclimatização ex vitro que é o substrato utilizado na propagação das
mudas, onde estes podem contribuir ou impedir no crescimento das mesmas de acordo com as
propriedades físico-químicas do meio utilizado.
Para Rocha et al. (2006), a constituição do meio de enraizamento pode afetar
diretamente a o seu desenvolvimento, apesar do ágar ser utilizado na maioria dos meios de
cultivo in vitro, tanto na multiplicação quanto no enraizamento, se tem observado que os
sistemas radiculares das brotações de frutíferas lenhosas formados nestes meios é quebradiço
e sem pelos radiculares.
Segundo Leite et al. (2002), no processo de enraizamento in vitro podem ser utilizados
na substituição do ágar substratos inertes, a exemplo da vermiculita embebida em meio de
cultura líquido, a qual pode ser uma alternativa mais barata do que o ágar. O uso de
substâncias inertes que funcionem como suporte para os brotos também foram testadas com
sucesso como no trabalho realizado por Faria et al. (2006), os autores selecionaram a espuma
de poliuretano como substituto ao ágar no meio de cultura para o crescimento in vitro da
Oncidium baueri Lindl.
2.5 Aclimatização
Por produzir mudas de alta qualidade, livre de patógenos e pragas, a cultura de tecidos
é um método de propagação muito almejado. Depois de produzida no laboratório, estas mudas
podem ser transportadas e levadas ao campo, porém, antes de chegar ao campo, estas
precisam passar por um período de aclimatização. A transferência de plântulas produzidas sob
condições controladas, para um ambiente sob condições naturais, deve ser progressiva
evitando estresses (SILVA et al., 1995), visto que transferir o material de ambiente protegido,
estéril, com açúcares e com umidade saturada, para ambiente não-estéril, sem açúcares e com
reduzida umidade, tem como consequência à morte de plantas, reduzida taxa de crescimento e
aumento no tempo para que estas plantas possam ser transplantadas (SOUZA JÚNIOR et al.,
2001).
A aclimatização de mudas é o processo pelo qual as plantas produzidas em laboratório
são transferidas para um ambiente com as condições climáticas naturais, havendo a passagem
gradual da planta da condição in vitro para a casa de vegetação, de maneira a minimizar os
22
impactos decorrentes da mudança brusca de ambiente (MOREIRA et al., 2006; PEREIRA et
al., 2005). A aclimatização representa a fase seguinte do processo de adaptação que ocorre,
essencialmente, em ambiente natural, também referida por alguns autores por enviveiramento
(GUERRA; NODARI, 2006).
Durante este processo, as microplantas irão passar por mudanças súbitas nas condições
ambientais, já que serão transferidas de um ambiente in vitro para o meio externo. Assim as
microplantas precisarão desenvolver mecanismos de controle de transpiração e condutância
estomática (DÍAZ-PEREZ et al., 1995), ativar os mecanismos de controle de perda de água
pelas células (SUTTER, 1988) e aumentar a taxa fotossintética em condições de atmosfera
mais rica em CO2 (VANTELGEN et al., 1992). Esse processo é crítico, pois a plântula passa
para um novo ambiente, onde ocorre déficit hídrico, ha mudança de estado heterotrófico para
autotrófico, a disponibilidade dos nutrientes será alteradas, e a planta estará sujeita a ataques
de patógenos (GRATAPAGLIA; MACHADO, 1990).
Assim, em função das alterações na morfologia e fisiologia induzidas durante a
micropropagação onde é reduzida a capacidade dessas plantas em suprir a necessidade de
energia e carbono por meio da fotossíntese e de manter um balanço hídrico favorável, a
aclimatização se faz necessária (ALBERT, 2004). No entanto uma das possibilidades de
redução de custos na produção de mudas micropropagadas é a diminuição do período de
aclimatização das mudas. Pois, quanto maior o período de aclimatização, maiores são os
custos com mão-de-obra, irrigação e adubação (MELLO et al., 2000).
2.6 Descontaminação
Um bom resultado no cultivo in vitro é consequência do sucesso das fases deste
processo, sendo que os resultados positivos desta fases estão ligados entre si, pois o
desempenho da etapa posterior esta relacionada com a etapa anterior (GEORGE 1993). O
estabelecimento in vitro é a primeira fase do processo de micropropagação, este tem inicio na
seleção da parte da planta que será utilizado como explante (ERIG; SCHUCH, 2003), onde o
sucesso desta fase depende da eficácia da descontaminação do explante que será introduzido
no meio de cultura
Para Erig e Schuch (2003), nesta fase inicial de microporpagação, a contaminação
pode levar a grandes perdas. Souza et al,. (2006) afirma que quando essa contaminação é
23
exógena é possível a controlar sem que ocorra maiores problemas, enquanto que a
contaminação endógena pode trazer grandes prejuízos financeiros e genético.
Visando anular ou minimizar a contaminação Erig e Schuch (2003), ressaltam que a
planta matriz deve passar por pré-tratamentos como aplicação de fungicidas e bactericidas.
Incialmente as planta devem ser mantida em ambientes protegidos como m casa de vegetação
ou câmara de crescimento, que evitam danos causados por fatores bióticos ou abióticos e,
posteriormente ataques de fungos e bactérias (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
Entre os principais problemas ocasionados pela contaminação, pode se destacar a
competição dos microrganismos pelos nutrientes com explantes, eliminação no meio de
cultivo de compostos tóxicos aos tecidos e ainda colonização dos tecidos impedindo o seu
desenvolvimento (MONTARROYOS, 2000).
Inúmeras são as soluções para desinfecção e descontaminação dos explnates (ERIG;
SCHUCH, 2003). Gattapaglia e Machado (1998) ressaltam a mais utilizadas como, o álcool e
soluções a base de cloro, como exemplo, o hipoclorito de sódio e o hipoclorito de cálcio,
sendo o hipoclorito de sódio o mais utilizado em laboratórios de cultura de tecidos, pela
facilidade de ser encontrado no mercado.
Montarroyos (2000) afirma que as combinações dos princípios ativos podem variar e,
segundo Erig e Schuch (2003) devendo ocorrer uma adequação de acordo com cada espécie e
cada tecido vegetal a ser utilizado como explante. Além do agente descontaminante, deve-se
levar em consideração a concentração do mesmo e tempo que o material vegetal irá ficar
exposto a tal agente.
Alves et al,. (2013) no cultivo de palma (Opuntia atropes Rose e Nopalea
cochenillifera Salm Dyck) utilizou as seguintes combinações. hipoclorito de sódio 1% + 10
gotas de Tween® 20, por 15 minutos e hipoclorito de sódio 1% + cloreto de mercúrio 0,2%;
por 10 minutos.
Vasconcelos et al., (2007), utilizaram álcool etílico a 70%, durante um minuto e, em
seguida, com hipoclorito de sódio a 2%, durante 10 minutos para desifestação da Nopalea
cochenillifera Salm Dyck , obtendo apenas 10% de contaminação. Paz e Silveira (20013
aplicaram diferentes doses e tempos de imersão em álcool, hipoclorito de sódio e fungicidas,
mesmo assim não conseguiriam minimizar a contaminação, ocasionando altos índices de
oxidação.
Essa oxidação é decorrente da liberação de compostos fenólicos, precursores da
síntese de lignina, pelo tecido injuriado. Esse acúmulo de polifenóis e produtos de oxidação,
como melanina, suberina, lignina, cutina e calose em torno da superfície excisada, modificam
24
a composição do meio de cultivo e a absorção de metabólitos (ANDRADE et al., 2000).
SATO et al. (2001), afirmam que esses compostos fenólicos são oxidados pelas enzimas
polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, podendo
causar sua morte, além de escurecer o meio de cultura.
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CAPÍTULO II
ENRAIZAMENTO E DESENVOLVIMENTO IN VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE
BROTOS DE VIOLETA AFRICANA EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
FÉCULA DE MANDIOCA E EM MEIO LÍQUIDO ESTACIONÁRIO
38
RESUMO: A violeta africana (Saintpaulia spp.) é umas das mais importantes plantas
ornamentais de cultivo em vaso devido a suas belas flores. Objetivou-se com este trabalho
avaliar o enraizamento e desenvolvimento in vitro de brotações de violeta africana utilizando
fécula de mandioca, como alternativa em substituição ao ágar, bem como a aclimatização
destas mudas, em meio líquido estacionário com pontes. O trabalho foi realizado no
laboratório de Biologia Celular e Cultura de Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do
CCA/UFPB – Areia – PB. Os brotos de violetas foram oriundos de terceiro subcultivo, com
aproximadamente 0,5 cm contendo de duas a três folhas. Este capítulo foi dividido em dois
experimentos. Experimento 1: Os tratamentos foram constituído de meio MS + 20 g L-1 de
sacarose onde foram gelificados, T1 = 07 g L-1 de ágar (convencional / testemunha); T2 = 100
g L-1 de fécula de mandioca; T3 = 150 g L-1 de fécula de mandioca; T4 = 200 g L-1 de fécula
de mandioca. Foram feitas as seguintes avaliações: percentual de sobrevivência e de brotos
enraizados; número de folhas; número de raiz; comprimento da parte aérea e comprimento de
maior raiz. Para aclimatização foram utilizados vaso preto comercial com substrato
vermiculita + terra vegetal na proporção de 1:1, garrafas PET cortadas com aproximadamente
10 cm de altura, utilizadas como câmara úmida, as plantas permaneceram no laboratório por
uma semana, em seguida foram transferidas para casa de vegetação, onde permaneceram por
mais 43 dias sob tela com 50% de sombreamento. Utilizou-se DIC com quatro tratamentos e
cinco repetições com três brotos por pote para o enraizamento e três plantas por vaso na
aclimatização, e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade,
utilizando o software SAS 9.2. Experimento 2: Inicialmente, foram preparadas as “pontes”,
utilizando PVC e sobre estas, foram postos papel filtro e algodão para serem colocadas dentro
de recipientes para servirem de apoio aos explantes. As pontes de PVC foram cortadas com
auxílio de estilete, com tamanho de aproximadamente 5,5 x 5 cm, no centro de cada ponte, foi
feito um corte de 4 cm para a fixação do papel e um furo para fixar o algodão. Os tratamentos
utilizados constituíram-se de meio semissólido e líquido, o meio utilizado foi MS + 20 g.L -1
de sacarose, onde T1 = 07 g L-1 de ágar (convencional / testemunha); T2 = ponte de PVC com
Papel Filtro; T3 = ponte de PVC com Algodão. Os parâmetros avaliados foram os mesmos do
experimento anterior. Utilizou-se o DIC com três tratamentos, dez repetições de três brotos
por pote de cultivo. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o software SAS 9.2. A
fécula de mandioca na concentração de 100 g L1 fécula pode substituir o ágar no meio de
cultura do cultivo in vitro de violeta sendo esta concentração a mais eficiente no enraizamento
39
e na aclimatização. A ponte de PVC com papel filtro pode ser utilizada no enraizamento da
violeta africana in vitro em meio íiquido.
Palavras-chave: Fécula, meio de cultura, aclimatização, enraizamento, PVC
ABSTRACT: The African violet (Saintipaulia spp.) is one of the more important ornamental
houseplants. The objective of this study was to evaluate the in vitro rooting and development
of sprouts of african violet using cassava starch as an alternative to replace agar as well as the
acclimatization of these seedlings, acclimatization liquid medium with bridges. The work was
performed at the Laboratory of Cell Biology and Plant Tissue Culture and at greenhouse
located in the CCA/UFPB - Areia - PB. The sprouts of violets were coming from the third
subculture, with approximately 0,5 cm containing two to three leaves. This chapter is divided
into two experiments. Experiment 1: The treatments consisted of MS medium + 20 g L-1
sucrose which were gelled, T1 = 0,7 g L-1 agar (conventional/control); T2 = 100 g L-1 of
cassava starch; T3 = 150 g L-1 of cassava starch; T4 = 200 g L-1 of cassava starch. Were
evaluated: percentage of survival and rooted sprouts; number of leaves; number of roots;
sprout length and length of the longest root. For acclimatization commercial black vase with
vermiculite + topsoil 1:1, PET bottles cut to approximately 10 cm in height, used as a moist
chamber, the plant remained in the laboratory for a week then were used were transferred to
greenhouse, where they remained for 43 more days under canvas with 50% shading. Was
used DIC with four treatments and five replications with three sprouts per pot for rooting and
three plants per pot during the acclimatization. The means were compared by Tukey test at
5% probability using SAS 9.2 software. Experiment 2: Initially, were prepared as "bridges"
using PVC and were placed filter paper and cotton in the containers to serve as a support for
the explants. The bridges PVC were cut with bistouries - sizes of approximately 5,5 x 5,0 cm
in the center of each bridge. A cut was made 4 cm for fixing the paper and a post hole pair
cotton. The treatments consisted of semi-solid and liquid medium. The medium was MS + 20
gL-1 sucrose, where T1 = 07 g L-1 agar (conventional/ control); T2 = bridge PVC with filter
paper; T3 = PVC with Cotton Bridge. The parameters evaluated were the same as in the
previous experiment. Was used a DIC with three treatments, ten repetitions and three sprouts
per growing pot. Data were subjected to analysis of variance and means were compared by
Tukey test at 5% probability using SAS 9.2 software. The cassava starch concentration of 100
g L-1 can replace starch in the agar culture medium cultivation in vitro of violet being the
40
most efficient concentration on rooting and acclimatization. The bridge PVC with filter paper
can be used in the in vitro rooting African violet in liquid medium.
Key words: Starch, medium, acclimatization, rooting, PVC
41
1. INTRODUÇÃO
A violeta africana (Saintpaulia spp.) é uma espécie que vem sendo cultivada no Brasil
há muito tempo, isto se deve ao fato de ser uma espécie delicada e o colorido das suas flores,
um atrativo. Sua origem se deu nas montanhas de Usambra, Leste da África, onde foi
encontrada pela primeira vez em 1892 pelo Barão Walter Von Saint Paul (PASQUAL et al.,
1996).
O mercado mundial de flores está crescendo, destacando-se principalmente os Estados
Unidos, seguidos por outros países como: Holanda e Itália. A principal demanda para a
floricultura é o mercado interno, pois possui um grande potencial de expansão (JUNQUEIRA;
PEETZ, 2008).
A cultura de tecidos de plantas, também conhecida como cultivo in vitro ou
micropropagação, vem se tornando uma técnica bastante utilizada visando suprir a demanda
cada vez mais tecnificada e com uma alta capacidade de multiplicação em grande escala, de
mudas livres de patógenos (MENDES et al., 1996).
Para que a técnica da micropropagação de mudas torne-se viável, e de menor custo,
podendo assim competir com as demais formas de propagação tradicional, os custos devem
ser reduzidos (ALTMAN, 1999). Também é necessário o ajuste de alguns fatores como às
desordens fisiológicas, contaminações por microrganismos, baixo percentual de taxa de
sobrevivência na aclimatização ex vitro (KURATA; KOZAI, 1992; KOZAI; KUBOTA,
2001) além do que, manter funcionando as salas de crescimento com controle de luz e
temperatura onera em muito os custos (STANDAERT DE METSENAERE, 1991; KODYM;
ZAPATA-ARIAS, 1999).
Todo o ágar consumido nos laboratórios do Brasil é importado, o que agrega mais custo
às pesquisas (PEREIRA et al., 2012). Alguns trabalhos no sentido de substituir o ágar vem
sendo desenvolvidos, como a exemplo de goma de cajueiro, amido de milho e fécula de
mandioca, subprodutos da indústria alimentícia.
No cultivo in vitro o emprego do meio líquido seria muito importante, uma vez que
substituem os agentes solidificantes, como exemplo, o ágar, que onera bastante esta técnica. O
cultivo mais uniforme é obtido, quando se utiliza o sistema de cultivo líquido, além disso,
entre outras vantagens pode-se citar a facilidade de retirar o meio sem que haja mudança de
recipiente, a esterilização é mais fácil, visto que pode ser realizada por meio de filtragem, as
repicagens podem ser reduzidas e recipientes maiores podem ser usados (ETIENNE;
BERTHOULY, 2002).
42
Assim com este trabalho, objetivou-se avaliar o enraizamento e desenvolvimento in vitro
de brotações de violeta africana utilizando fécula de mandioca, como alternativa em
substituição do ágar, bem como a aclimatização destas mudas, e o enraizamento em meio
líquido estacionário com pontes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Local e período de realização dos experimentos
O trabalho de pesquisa foi conduzido no laboratório de Biologia Celular e Cultura de
Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do Departamento de Ciências Biológicas – DCB do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB. Entre os meses de
junho/2013 e fevereiro/2014.
2.2 EXPERIMENTO 1: Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na
aclimatização de violeta africana.
Foram utilizadas brotações do terceiro subcultivo de violeta africana, com tamanho de
aproximadamente 0,5 cm contendo de duas a três folhas. A fécula de mandioca utilizada
como agente geleificante, foi a tradicional comumente encontrada em supermercado e feiras
livres da região, sendo que a utilizada no referido experimento foi adquirida em um
supermercado da cidade de Areia-PB.
Procedeu-se o processo de formulação dos meios, os recipientes utilizados foram
frascos de vidros com capacidade de 250 ml com tampas BIO SAMA® PP – 74. Nesses
recipientes, foi adicionado o meio MS (Murashige & Skoong 1962) suplementado com 20 g/L
de sacarose, onde foi adicionado ágar comercial ou fécula de mandioca nas concentrações
previstas para cada um dos tratamentos, o pH foi ajustado para 5,8; a esterilização foi
realizada em autoclave a 120ºC durante 20 minutos a pressão de 1atm. Foi utilizado 50 ml de
meio em cada pote. A inoculação dos explantes foi realizada em capela de fluxo laminar.
Após a inoculação os potes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25ºC
± 2 mantido por aparelho de ar-condicionado e fotoperíodo de 16 horas/luz branca controlado
por timer programado.
43
2.2.1 Tratamentos
Os tratamentos utilizados constituíram-se de diferentes concentrações de fécula de
mandioca e uma concentração de ágar:
Meio 1 (T1) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 07 g L-1 de ágar (convencional /
testemunha);
Meio 2 (T2) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 100g de fécula de mandioca;
Meio 3 (T3) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 150g de fécula de mandioca;
Meio 4 (T4) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + 200g de fécula de mandioca.
2.2.2 Parâmetros avaliados
Foram realizadas avaliações 90 dias após a inoculação, sendo analisado o percentual
de brotos enraizados - % BE, número de folhas - NF; número de raiz - NR; comprimento da
parte aérea – CPA (mm) e comprimento de maior raiz – CMR (mm) com auxilio de
paquímetro digital. Ao serem retiradas do meio de cultivo in vitro, as raízes das plantas foram
lavadas para retirado o excesso do meio aderido às raízes e posteriormente realizada as
avaliações.
2.2.3 Aclimatização
Após as avaliações do enraizamento e desenvolvimento dos brotos, iniciou-se o
processo de aclimatização. Foram utilizados como recipientes vasos preto comercial, com
capacidade de 200 ml e garrafas de politereftalato de etileno – PET, para formar a câmara
úmida, estas foram cortadas na altura de 10 cm a partir da base e com furos na base. Em cada
tratamento 15 plantas foram distribuídas em cinco vasos. O substrato utilizado em todos os
tratamentos foi composto de vermiculita + terra vegetal na proporção de 1:1. As plantas
permaneceram em ambiente de laboratório por um período de sete dias, para que ocorresse
uma mudança gradual de ambiente evitando assim estresse e consequentemente morte das
plântulas, em seguida as mesmas foram levadas para casa de vegetação.
Os furos dos recipientes que funcionaram como câmara úmida só foram realizados
após uma semana, para evitar a desidratação das plântulas. A câmara úmida permaneceu por
44
mais 22 dias, proporcionando um microclima com elevada umidade, assemelhando-se às
condições do interior do recipiente de micropropagação. Foram feitas regas quando
necessárias, e estas ocorreram quando visualmente se observava que a umidade do substrato e
da câmara estavam baixas
As mudas permaneceram em casa de vegetação por mais 43 dias, até completa
aclimatização, sob tela com 50% de sombreamento. Aos 60 dias foram realizadas as
avaliações relacionadas a percentual de sobrevivência e ao desenvolvimento das plantas.
2.2.3.1 Tratamentos
Os tratamentos foram os mesmo que constituíram o do enraizamento e
desenvolvimento das mudas de violeta africana, ou seja, influencia de diferentes
concentrações de fécula de mandioca no meio de cultura.
2.2.3.2 Parâmetros avaliados
Avaliou-se o percentual de sobrevivência (% SV), número de folhas (NF); número de
raízes (NR); comprimento da parte aérea - CPA (mm) e comprimento da maior raiz – CMR
(mm) com auxilio de um paquímetro digital.
2.2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos
Adotou-se nestes experimentos o delineamento inteiramente casualizado (DIC), quatro
tratamentos (Meio 1; Meio 2; Meio3 e Meio 4) com cinco repetições de três brotos por pote
de cultivo, bem como três plantas por vaso na aclimatização. Os dados foram submetidos à
análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade, utilizando o software SAS.9.2 (2010).
45
2.3 EXPERIMENTO 2: Uso de PVC como ponte no meio líquido
Foram utilizados brotações do terceiro subcultivo de violeta africana, com tamanho de
0,5 cm contendo de duas a três folhas. Inicialmente, foram preparadas as “pontes”, utilizando
PVC (policloreto de vinila, de uso comum em forro de residências) e sobre estas, foram
postos papel filtro e algodão à serem colocadas dentro dos recipientes para servirem de apoio
aos explantes. As pontes de PVC foram cortadas com auxílio de estilete, com tamanho de
aproximadamente 5,5 x 5 cm, de tal forma que a sua passagem no recipiente ocorresse sem
nenhuma barreira, no centro de cada ponte, foi feito um corte de 4 cm para a fixação do papel
ou do algodão. Os recipientes utilizados foram frascos de vidros com capacidade 250 ml com
tampas BIO SAMA® PP – 74. Nesses recipientes, foram adicionados o meio MS (Murashige
& Skoong 1962) suplementando com 20 g/L de sacarose, e para a testemunha adicionou 7g de
ágar comercial, o pH foi ajustado a 5,8; a esterilização foi realizada em autoclave a 120ºC
durante 20 minutos. Foi utilizada 50 ml de meio em cada pote. Os brotos foram inoculados
em capela de fluxo laminar.
Após a inoculação os potes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura
de 25ºC ± 2 mantido por aparelho de ar-condicionado e fotoperíodo de 16 horas/luz branca
controlado por timer programador manual, para que ocorresse o processo de formação do
sistema radicular.
2.3.1 Tratamentos
Os tratamentos utilizados constituíram-se de meio semissólido e líquido:
Meio 1 (T1/AGAR)= MS + 20 g.L-1 de sacarose + 07 g L-1 de ágar (convencional /
testemunha);
Meio 2 (T2/PVC-PF) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + ponte de PVC com Papel Filtro;
Meio 3 (T3/PVC-A) = MS + 20 g.L-1 de sacarose + ponte de PVC com Algodão.
2.3.2 Parâmetros avaliados
Foram realizadas avaliações aos 91 dias após a inoculação, sendo analisado o
percentual de enraizamento (% ENR), número de folhas (NF); número de raízes (NR);
46
comprimento da parte aérea - CPA (mm), comprimento de maior raiz - CMR (mm) estas duas
variáveis foram avaliadas com auxilio de paquímetro digital, massa fresca de parte aérea
(MFPA), massa fresca de raiz (MFR), massa seca de parte aérea (MSPA), massa seca de raiz
(MSR), para estas avaliações foi utilizada balança analítica de precisão.
2.4 Delineamento experimental e análise estatística dos experimentos
Adotou-se nesse experimento o delineamento inteiramente casualizado (DIC), três
tratamentos (ÁGAR; PVC-PF e PVC-A) com dez repetições de três brotos por pote de
cultivo. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o software SAS.9.2 (2010).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Efeito da fécula de mandioca no enraizamento in vitro e na aclimatização de violeta
africana.
De acordo com os dados apresentados na Tabela 1, pode-se observar que 100% das
plantas emitiram raizes em todos os meios estudados. Para a variável número de folhas (NF) o
tratamento em que se utilizou MS + 200 g/L de fécula de mandioca (T4) apresentou a menor
média 16,67 seguido do meio MS + 100 g/L de fécula de mandioca (T2) 20,87, os demais
tratamentos apresentaram resultados iguais estatisticamente, MS + 7 g de ágar (T1); MS +
150 g/L de fécula de mandioca (T3) 26,03; 22,33 consecutivamente. Para o número de raízes
(NR) as melhores médias foram obtidas nos T1 e T2 sendo de 33,71 e 29,33 folhas
respectivamente, porém este último não diferiu estatisticamente dos tratamentos T3 e T4. No
comprimento de parte aérea (CPA) as melhores médias podem ser observadas nos T4
28,13mm e T2 28,05mm, porém não diferindo estatisticamente do T3 (25,28mm), o T1
apresentou o menor valor médio de 18,40, diferindo negativamente dos demais tratamentos.
Os maiores valores médios para o comprimento de raiz (CMR) que foram obtidos nos
tratamentos T2, T4 e T3, com 13,23; 13,12 e 11,68 mm, respectivamente, sendo que o T1
apresentou novamente a menor média 8,66 mm mas se igualando estatisticamente ao T3.
47
Todos os meios geleificados com a fécula de mandioca apresentaram uma consistência
menos firme quando comparado ao ágar, deixando assim o meio não tão sólido, fato também
comprovado por Erig et al.(2004), que substituiu parcialmente o ágar do meio por amido de
mandioca, na multiplicação in vitro de macieira
Outro fato relevante que pode ser constatado, foi que os meios que levaram na sua
composição a fécula, mostraram-se com um maior grau de dificuldades para realizar a sua
remoção das raízes das plantas bem como apresentou uma maior dificuldade para efetuar a
contagem e medição dessas raízes, fazendo com que o manipulador tenha uma maior atenção,
sendo que esta dificuldade aumentava a medida que a concentração de fécula era maior.
Com relação ao número de folhas, foi observado que o tratamento F3 apesar de
apresentar a menor média, apresentou folhas mais bem desenvolvidas com uma uniformidade
entre as repetições e os três explantes de cada repetição, a mesma característica pôde ser
observada no meio com ÁGAR.
Tabela 1. Percentual de enraizamento e valores médios das variáveis, número de folhas - NF,
número de raízes - NR, comprimento de parte aérea - CPA (mm) e comprimento de
maior raiz - CMR (mm) e de violeta africana, nos tratamento, T1= MS + 7g de ágar
(AGAR); T2= MS + Fécula de Mandioca 100 g/L (F1), T3= MS + Fécula de
Mandioca 150 g/L (F2) e T4= MS + Fécula de Mandioca 200 g/L (F3).
TRAT % ENR NF NR CPA (mm) CMR (mm)
T1 100 a 26,43 a 33,71 a 18,40 b 8,64 b
T2 100 a 20,87 bc 29,33 ab 28,05 a 13,23 a
T3 100 a 22,33 ab 23,93 b 25,28 a 11,68 ab
T4 100 a 16,67 c 23,67 b 28,13 a 13,12 a
*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidades.
Trabalhando com enraizamento de Prunus sp. in vitro, Tibola et al., (2004),
encontraram o melhor resultado para número médio de raízes (4,94) quando substituíram
totalmente o ágar por vermiculita, seguido da substituição parcial ágar + vermiculita (3,33) e
ágar/tradicional (2,56), se assemelhando com o presente trabalho. Erig et al. (2004) também
trabalhando com a substituição parcial ou total do ágar por agentes geleificantes alternativos
48
no meio de cultivo, em multiplicação de macieira, para número médio de gemas, o meio MS
+ ágar e MS + Agar + amido de milho apresentaram valores iguais estatisticamente.
Ainda foi observado que ao usar o meio de cultura WPM (Wood Plant Media
(LLOYD e McCOWN, 1980) os autores puderam constatar que os valores para o número
médios de gemas foi igual, quando usou somente ágar e substituição parcial por amido de
milho ou de mandioca, mostrando assim que a utilização de amido/fécula é tecnicamente
viável, como agente geleificante no meio de cultura.
Costa et al. (2007), verificaram que a percentagem de desenvolvimento das gemas de
abacaxi da cultivar Rio Branco foi significativamente superior quando estas foram cultivadas
em meios suplementados com fécula de mandioca, combinado ou não com ágar. Para o
número de folhas, altura de brotações e aspecto geral das brotações, os referidos autores não
encontraram nenhuma diferença significativa.
Lima-Nishimura et al. (2003), ressaltam que apesar da desvantagem apresentada
pelos amidos, que é a pouca transparência, que dificulta a detecção de contaminantes, fato
também detectado por Erig et al. (2004) e também constatado no presente trabalho, onde os
meios são mais esbranqueçidos com pouca transparência, sendo que esta desvantagem é
superada quando se consideram a sua abundância na natureza, baixo custo e sendo este entre
os polissacarídeos, a substância de maior importância fisiológica (FERRI et al., 1998).
Viaganó et al. (2007), concluíram com seu trabalho de enraizamento in vitro de porta
enxerto de Prunus cv. Mr. S. 1/8 que é possível um alto percentual de enraizamento
substituindo parcialmente o ágar por vermiculita. Este fato também foi constatado neste
trabalho na substituição total do ágar por 100 g de fécula de mandioca. Ferri et al., (1998)
trabalhando no enraizamento in vitro de macieira, encontraram o melhor valor médio (6 raizes
por explantes) no meio solidificado com 50 g de fécula de mandioca.
Os dados aqui encontrados diferem dos encontrados por Galdiano Júnior et al.
(2012), onde a substituição total do ágar pela fécula de mandioca foi prejudicial ao
crescimento de Cattleya loddigesii in vitro, pois foram verificadas as menores médias para
todas as variáveis avaliadas. Para Caldas et al. (1998); Erig et al., (2004) e Costa et al. (2007)
a escolha de um ou outro agente geleificante depende da espécie de planta e, também, das
condições de cultivo, como por exemplo, o meio de cultura.
A fécula de mandioca é um polissacarídeo facilmente encontrado nas feiras livres e
em supermercados da região Nordeste, 1000 g de amido de mandioca custa em média R$ 3,50
na cidade de Areia-PB, enquanto que 500 g de ágar custa em média R$ 500,00. A quantidade
mínima de fécula (100g/L) acrescida ao meio de cultura apresentou para a maioria das
49
variáveis estudadas, média melhor ou igual estatisticamente às plantas cultivadas no meio
onde se utilizou ágar, se apresentando assim, como um bom substituto no cultivo in vitro.
Com base nessas observações pode se calcular a relação custo benefício destes solidificantes.
A cada dez litros de meio de cultivo, utilizando esta concentração de solidificante ter-se-á um
gasto bem reduzido se comparado ao ágar. O custo médio de produção de um litro de meio
solidificado com 100g de amido de mandioca, baseado na pesquisa de preço realizado no
município de Areia-PB é de R$ 0,35 em quanto que o mesmo solidificado com ágar sai em
média por R$ 7,00. Tendo assim uma diferença de R$ 6,65 em cada litro de meio de cultura.
Isto representa uma grande economia principalmente para as biofábricas de plantas.
3.1.2 Aclimatização
As temperaturas na casa de vegetação durante a aclimatização foi de média máxima 34
e média mínima de 23o C, a umidade relativa de 74 %.. Na Tabela 2 estão apresentados os
resultados de sobrevivência e desenvolvimento dos brotos enraizados cultivados em diferentes
concentrações de fécula de mandioca. Pode-se observar que para a percentagem de
sobrevivência (%SOB) não houve diferenças significativas, sendo que os maiores percentuais
93,33% e 80% foram obtidas no T2 (MS + 20g de sacarose + 100g de fécula de mandioca) e
T3 (MS + 20g de sacarose + 150g de fécula de mandioca) respectivamente, seguidos das
médias do tratamento T4 (MS + 20g de sacarose + 200g de fécula de mandioca) 66,67% e T1
(MS + 20g de sacarose + 7g de Ágar) 60%. Para variável NF (número de folha) o T2
apresentou a melhor média 22,21 apesar de não diferir estatisticamente dos tratamentos T3 e
T1, onde as médias destes não apresentaram diferença do tratamento T4.
Nos T2, T3 e T1 observa-se que não houve significância entre as médias apresentadas
13,21; 12,75 e 8,44 respectivamente para o NR (número de raiz), sendo que o T4 apresentou a
menor média 8,60. Para as variáveis CPA (comprimento de parte aérea) CMR (comprimento
de maior raiz) os tratamento foram iguais estatisticamente entre si,
Lemos et al. (2001), conduziram aclimatização de plantas de bananeiras
micropropagadas em sistemas de biorreatores, e obtiveram cerca de 70% de mudas
aclimatadas. Sutter (1988), destaca que, submetidas a aclimatização, as plantas oriundas do
cultivo in vitro são colocada em uma condição de estresse, como alta transpiração associada à
alta condutividade hídrica, provocando baixa funcionalidade ou ausência de controle sobre o
fechamento dos estômatos, acarretando altas taxas de mortalidades.
50
TABELA 2. Valores médios das variáveis, percentagem de sobrevivência (% SOB) número
de folhas -NF, número de raízes -NR, comprimento de parte aérea -CPA (mm)
e comprimento de maior raiz -CMR (mm), de violeta africana, de nos
tratamento: T1= MS + 7g de ágar (AGAR); T2= MS + Fécula de Mandioca
100 g/L (F1), T3= MS + Fécula de Mandioca 150 g/L (F2) e T4= MS + Fécula
de Mandioca 200 g/L (F3) aos 60 dias de aclimatizadas.
TRAT % SOB NF NR CPA mm CMR mm
T1 60,00 a 18,22 ab 8,44 b 34,95 a 28,89 a
T2 93,33 a 22,21 a 13,21 a 45,92 a 28,80 a
T3 80,00 a 20,42 ab 12,75 a 38,87 a 25,51 a
T4 66,67 a 15,50 b 8,60 b 34,95 a 24,48 a
*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidades.
O resultados médios aqui apresentados para o NF foram bem superiores aos
encontrado por Terceiro Neto et al. (2004) na aclimatização de violeta africana
micropropagadas in vitro em diferentes substratos, onde a maior média 8,93 para o substrato
plantagro. Costa (2003) lembra que o número de folhas nem sempre é um critério adequado
para se estimar o crescimento vegetal, podendo ser muito variável em relação à idade da
planta.
Tibola et al.(2004) obtiveram a maior taxa de sobrevivência na aclimatização de porta-
enxertos de Prunus sp quando os brotos foram cultivados em meios compostos por ágar e
vermiculita ou apenas vermiculita.
Araújo et al. (2002), observaram que o enraizamento in vitro de A. vera exerceu
influência sobre a sobrevivência das plântulas na fase de aclimatização, sendo uma fase
indispensável na micropropagação desta espécie. O mesmo pode ser observado no trabalho
aqui realizado, onde o T1 apresentou boas condições para o enraizamento da violeta,
refletindo assim na aclimatização das mesmas, onde as melhores médias foram as do meio
solidificado com 100g de fécula de mandioca exceto para CMR.
51
3.2 Efeito do uso de PVC como ponte no meio líquido
Verifica-se na Tabela 3, que o tratamento MS + ponte PVC com papel filtro (T1-PVC-
PF, meio liquido), apresentou significativamente os melhores resultados para as variáveis:
número de raiz (NR) 15,11, comprimento de parte aérea (CPA) 21,45mm, comprimento de
maior raiz (CMR) 22,52 mm, massa fresca de parte aérea (MFPA) 1,3230 g, massa fresca de
raiz (MFR) 0,1260 g e massa seca de raiz (MSR) 0,0122 g, superando o meio tradicional
(sólido) que utilizou ágar para o cultivo. Para o número de folha (NF) e massa seca de parte
aérea, o T1 e T2 foram iguais estatisticamente com 13,80/13,93 e 0,0469/0,0535
respectivamente. Nas variáveis NF, NR e CMR o meio tradicional (T1) diferiu do meio MS +
ponte de PVC com algodão (T3), não apresentando diferenças significativas para as demais
variáveis. Ou seja, o meio líquido utilizando a ponte de PVC com algodão apresentou-se, na
maioria das variáveis estudadas, igual ao meio semissólido, diferindo apenas em três das nove
variáveis apresentadas. O meio líquido estacionário PVC-PF foi superior ao meio líquido
PVC-A em todas as variáveis analisadas, não diferindo estatisticamente na vairavel % ENR.
Camolesi et al. (2010), avaliando o enraizamento in vitro de mudas micropropagadas
de bananeiras em diferentes meios de cultivo, obtiveram o maior número de raízes para
cultivar Nanicão Jangada e Nanicão Grand Naine, quando estas foram cultivadas em meio
líquido (6,32 e 5,70 raízes por broto respectivamente), diferindo significativamente da cultivar
Maçã que apresentou 4, 92 raízes. Para Lins et al. (2003), plantas que no final do cultivo in
vitro apresentam um sistema radicular bem desenvolvido, tanto qualitativamente quanto
quantitativo, são mais consistentes na aclimatização. Sugere-se assim que os resultados
obtidos em meio líquido podem variar de acordo com a espécie ou cultivar que se trabalha.
Os resultado aqui encontrados para massa fresca corroboram com os de Siqueira et al.
(2013), em seu trabalho com micropropagação da bananeira “Maçã” cultivada sobre
diferentes quantidade de meio líquido estacionário, onde obtiveram resultados maiores para
massa fresca e seca quando os explantes foram cultivados em meios líquidos no volumes de
20 a 25 mL.
Os mesmos autores não obtiveram diferenças significativas na taxa de multiplicação
destas plantas quando comparado o meio líquido com o meio semissólido, obtendo uma
média geral de 1,54 brotos por explantes nos tratamentos de meio líquido e semissólido,
resultados que diferiram dos encontrado por Costa et al., (2007) que obteve a menor taxa de
brotos no meio liquido no cultivo da cultivar Grand Naine.
52
Pode ser verificado por Lemos et al. (2001), que quando se utilizou o meio líquido
estacionário ou imersão temporária, os explantes aproveitaram melhor o meio de cultivo, onde
a água, nutrientes e reguladores de crescimento puderam ser absorvidos com mais facilidade
por todas as partes, isso devido a maior relação existente entre o explante e o meio.
Em pequenos recipientes com uma grande quantidade de meio, como por exemplo, em
tubos de ensaio contendo 25 mL de meio líquido estacionário, que foram utilizados por
Domingues et al. (1995), os explantes ficam completamente imersos no meio, a aeração é
deficiente, ocorrendo assim o acúmulo de gases prejudiciais ao desenvolvimento das plantas
(LEMOS et al., 2001) e ainda com possiblidade de déficit de CO2 e assim apresentar baixas
médias de multiplicação (SIQUEIRA et al., 2013). Também pela imersão contínua em meio,
os tecidos e órgão das plantas podem sofrer com a hiperidricidade, que dependendo da espécie
e do meio, pode causar sérios danos fisiológicos que irão afetar o crescimento e
desenvolvimento da planta (TEIXEIRA, 2001).
Ainda para Siqueira et al.(2013), é viável que os volumes entre 20 e 25 mL de meio
líquidos forneçam a quantidade adequada de nutrientes, podendo volumes inferiores causarem
depleção muito rápida. Sendo que para prevenção e obtenção de ótimo crescimento de plantas
nesse meio e nestes volumes, seria necessária a sua renovação frequente. Requerendo assim
mais mão de obra ou investimento de automação do sistema como o uso de BIT`s
(Biorreatores de Imersão Temporária) ou agitadores mantido sob agitação constante do meio
por uso de maquinas agitadoras.
O uso de PVC com suportes de papel ou algodão como ponte é uma ótima saída para
se trabalhar com meio líquido em potes de cultivo contendo uma quantidade de 50 mL de
meio de cultura, sem trazer problemas como a hiperidricidade dos explantes, pois o mesmo
permite que o explante permaneça em constate contato com uma quantidade adequada de
meio, onde a absorção se torna mais fácil, ainda oferecendo as condições de arejamento de um
meio semissólido ou sólido.
O emprego dos meios líquidos é feito com o uso de máquinas agitadoras ou
biorreatores de imersão temporária, demandando assim um alto investimento para aquisição
de equipamentos, pois no sistema estacionário se tem grandes problemas com a oxigenação e
hiperidricidade. O uso do PVC apresenta uma redução nos custos de produção in vitro, uma
vez que este material é de baixo custo e encontrado facilmente no mercado, seu preço médio
é de R$ 16,00 o m2, além disso, as mesmas pontes podem ser utilizadas em vários cultivos,
antes de serem descartadas.
53
TABELA 3. Valores médios das variáveis, percentagem de sobrevivência (% SOB), número de folhas (NF), número de raízes (NR), comprimento de parte aérea (CPA) e comprimento de maior raiz (CMR), massa fresca de parte aérea (MFPA), massa fresca de raiz (MFR), massa seca de parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) de violeta africana, de acordo com cada tratamento, MS + 7g de ágar (AGAR); MS + ponte de PVC com papel filtro (PVC-PF) e MS + Ponte de PVC com algodão (PVC-A).
TRAT % ENR NF NR CPA (mm) CMR (mm) MFPA (g) MFR (g) MSPA (g) MSR (g)
AGAR 100 a 13,80 a 11,40 b 15,05 b 13,61 b 0,9103 b 0,0725 b 0,0469 ab 0,0066 b
PVC-PF 100 a 13,93 a 15,11 a 21,45 a 22,52 a 1,3230 a 0,1260 a 0,0535 a 0,0122 a
PVC-A 76 a 11,32 b 8,52 c 14,29 b 6,83 c 0,6386 b 0,0490 b 0,0469 b 0,0065 b
*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidades..
54
4. CONCLUSÕES
A fécula de mandioca pode ser utilizada no meio de cultura no cultivo in vitro de
violeta africana como agente geleificante em substituição ao ágar, sendo a concentração de
100 g fécula L1 de meio cultura a mais indicada.
A concentração de 100 g fécula L1 de meio de cultura durante o enraizamento
mostrou-se a mais eficiente na aclimatização das plantas de violeta.
O meio liquido utilizando ponte de PVC com papel filtro foi a mais eficiente e pode
ser utilizado no enraizamento e desenvolvimento in vitro de violeta africana em substituição
ao meio semissólido.
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58
CAPÍTULO III
EFEITO DE DESCONTAMINANTE NO ESTABELECIMENTO IN VITRO DE
PALMA FORRAGEIRA (Nopalea cochinileifera Salm-Dick)
59
RESUMO: A palma miúda ou doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado
pela sua resistência a cochonilha do carmim, espécie do gênero Dactylopius. O objetivo nesse
trabalho foi de avaliar a eficiência da descontaminação utilizando concentrações de
hipoclorito de sódio associadas ou não a tween 20 no estabelecimento in vitro da palma-doce
N. cochenillifera Salm-Dyck em casa de vegetação. Utilizou-se como fonte de explantes
brotos e destes, gemas com 0,5 cm2 que foram submetidas à descontaminação e inoculação
em MS + 20 g de sacarose L-1 + 0,5 mg L-1 BAP e incubados em sala de cultivo. Os
tratamentos foram constituídos de NaOCl 2,5% de cloro ativo nas concentrações de 0, 10, 20,
30, 40 e 50% (v/v), e nas mesmas concentrações acrescidas de duas gotas de Tween 20. O
cultivo foi realizado em casa de vegetação e aos 21 dias foi realizada a avaliação para
verificar a efetividade dos tratamentos quanto à presença de contaminação, oxidação e
presença de brotações. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com 12
tratamentos e seis repetições. Os dados obtidos foram submetidos a teste de regressão
binomial utilizando o software SAS 9.2. A manutenção dos cladódios em ambiente
higienizado associado a todos os tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na
descontaminação de explantes de palma forrageira (N. cochenillifera), havendo uma maior
presença de brotações nas concentrações de 10 e 20% de NaOCl, e ocorrendo a diminuição
quando associado ao Tween 20.
Palavras-chave: Descontaminação, temperatura ambiente, fotoautotrofismo
ABSTRACT: The small or sweet forage cactus (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) stands
out for its resistance to cochineal carmine, species of the genus Dactylopius. The objective of
this study was to evaluate the efficiency of decontamination using concentrations of sodium
hypochlorite associated or not with Tween 20 in vitro establishment of sweet cactus Nopalea
cochenillifera Salm-Dyck in greenhouse. Was used as a source of explants and these sprouts,
axillary buds of 0,5 cm2 were subjected to decontamination and inoculation MS + 20 g L-1
sucrose + 0.5 mg L-1 BAP and incubated in a culture room. The treatments consisted of
NaOCl 2,5% of active chlorine in the concentrations 0, 10, 20, 30, 40 and 50% (v/v), and the
same concentrations plus two drops of Tween 20. The culture were realized in the greenhouse
and at 21 days the assessment was conducted to verify the effectiveness of treatments for the
presence of contamination, oxidation and the presence of sprouts. Were used a completely
randomized design with 12 treatments and six replications. Data were subjected to binomial
60
regression using SAS 9.2 software. Maintenance of cladodes in sanitized environment
associated with all treatments with NaOCl with or without Tween 20 is effective in
decontamination of explants of forage Palm (N. cochenillifera), with a greater presence of
shoots at concentrations of 10 and 20% of NaOCl, and occurring to decrease when associated
with the Tween20.
Keywords: Decontamination, room temperature, photoautotrophic
61
1. INTRODUÇÃO
A palma forrageira Opuntia ficus indica (L) Mill, é muito utilizada no nordeste
brasileiro, na alimentação humana e animal. Originaria do continente americano, adaptou-se
muito bem as regiões Semiáridas do Brasil, sobretudo por ser muito resistente a longos
períodos de estiagem, característica bastante seletiva (ALMEIDA NETO et al., 2005). A
palma Miúda ou doce (Nopalea cochenillifera Salm Dyck) tem se destacado pela sua
resistência a cochonilha do carmim, espécie do gênero Dactylopius, e por apresentar maior
valor nutritivo comparada com outros genótipos como a Gigante e a Redonda cultivados no
Estado da Paraíba (VASCONCELOS et al., 2007).
No processo de cultivo in vitro tradicional em salas de crescimento o que mais onera
são os gastos com energia elétrica, assim vêm se buscando alternativas a essas condições
controladas, como a substituição das salas totalmente climatizadas por condições ambientais,
tais como o uso de luz natural e temperatura ambiente no cultivo in vitro. Uma das principais
vantagens do cultivo com o uso de deluz natural é que além da economia se obtêm plantas
mais adaptadas às condições ambientais sofrendo menos na aclimatização (STANDAERT DE
METSENAERE, 1991; KODYM; ZAPATA-ARIAS, 1999; KOZAI et al., 2003)
Nos últimos anos, foram desenvolvidas técnicas de cultivo in vitro para mais de mil
espécies, incluindo as cactáceas. As Opuntias se multiplicam por estaquia dos cladódios, e a
necessidade de grandes quantidades de material demandado por grandes plantações é um sério
problema prático, sendo usados cladódios doentes, desuniformes e sem a suculência adequada
para o enraizamento (FROTA et al., 2004)
Por essas razões, aplicam-se técnicas de cultivo in vitro para se obter um sistema
eficiente de multiplicação em grande escala. Essa eficiência implica uma alta taxa de
multiplicação, uniformidade genética, peso e volume reduzido em comparação com o método
convencional (VILLALOBOS, 2001). As técnicas de cultura de tecidos vegetais in vitro têm
sido aplicadas com êxito em várias espécies de Opuntias (FROTA et al., 2004) e para
Nopalea cochenilifera, com o objetivo de obtenção de um sistema eficiente de multiplicação
da palma forrageira (VASCONCELOS et al.,2007; ALVES et al., 2013).
Frota et al., (2004) testaram o efeito do BAP e do AIA na multiplicação e
enraizamento in vitro de 10 clones de Opuntia fícus indica L. obtendo a concentração de 1,00
mg/L, e 5,00 mg/L proporcionando a melhor média de raízes respectivamente para BAP e
AIA. Trabalho realizado por Vasconcelos et al., 2007, estabeleceu protocolo para a
multiplicação in vitro da palma miúda, indicando 0,1 mg L-1 de AIA para ser utilizado na
62
etapa de multiplicação. Já Alves et al. (2013), ao testarem o efeito de BAP na regeneração em
Opuntia e Nopalea recomenda valores de 3,7 μM BAP, e 4,5 μM BAP respectivamente.
De acordo com Oliveira et al. (2000), um dos principais problemas do cultivo in vitro
é a contaminação por fungos e bactérias no laboratório, levando a grande perda dos explantes.
Estudando o protocolo de estabelecimento para Opuntia ficus indica, Paz e Silveira (2013)
não obtiveram resultados satisfatório por causa da alta taxa de contaminação ocorrida na
multiplicação.
Um outro problema enfrentado no cultivo in vitro é a oxidação, esse processo ocorre
devido à liberação de compostos fenólicos, pelos tecidos injuriados (ALVES et al., 2013).
Para García-Saucedo et al. (2005), os compostos fenólicos podem modificar a composição
química do meio de cultura e dificultar a absorção dos nutrientes provocando a oxidação e
morte dos explantes, compostos que estão presentes em grandes quantidades nos tecidos da
Opuntia spp.
Desta forma objetivou-se neste trabalho avaliar a eficiência da descontaminação com
diferentes concentrações de hipoclorito de sódio associadas ou não a Tween 20 no
estabelecimento in vitro da palma-doce Nopalea cochenillifera Salm-Dyck em casa de
vegetação com uso de luz natural e temperatura ambiente.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Local e período de realização dos experimentos
O trabalho de pesquisa foi conduzido no Laboratório de Biologia Celular e Cultura de
Tecidos Vegetais e em casa de vegetação do Departamento de Ciências Biológicas – DCB do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB. Entre os meses de
agosto a setembro de 2011.
2.1.1 Descontaminação e inoculação dos explantes
Utilizou-se como fonte de explantes brotos (mantidos em ambiente de laboratório) da
Nopalea cochenillifera Salm-Dyck, cultivar Palmepa PB1, obtida na Estação Experimental de
Lagoa Seca-PB, pertencente a Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária-EMEPA-PB.
63
Os brotos foram lavados em água corrente e descontaminados em álcool 70% (v/v) por
um minuto e hipoclorito de sódio (NaOCl 2,5% de cloro ativo) com e sem Tween 20 na
concentração prevista para cada tratamento, submetidos a agitação mecânica por 20 minutos.
Após a descontaminação os brotos foram enxaguados na capela de fluxo laminar para retirada
do excesso do hipoclorito, cortados em segmentos de aproximadamente 0,5 cm2 e inoculados
em tubos de ensaio (2,5 x 15 cm) contendo 5 mL de meio de cultura. O meio utilizado foi MS
de Murashige Skoog (1962) 0,5mg/l BAP (6-benzilaminopurina) 7 g/L de Ágar, 20 g/L de
sacarose e pH ajustado para 5.8, em seguida autoclavado a 120ºC a 1atm por 20 minutos.
Após a inoculação os tubos foram vedados com papel alumínio e filme de PVC e levados para
a casa de vegetação.
2.1.2 Tratamentos
Os tratamentos utilizados constituíram-se de diferentes concentrações NaOCl
acrecidos ou não de duas gotas de Tween 20 em cada 100 mL se solução: T1= 0% NaOCl de ;
T2 = 10% de NaOCl; T3 = 20% de NaOCl; T4= 30% de NaOCl; T5= 40% de NaOCl; T6=
50% de NaOCl;T7= 0% de NaOCl+Twee 20; T8= 10% de NaOCl+Twee 20; T9= 20% de
NaOCl+Twee 20; T10= 30% de NaOCl+Twee 20; T11= 40% de NaOCl+Twee 20; T12=50%
de NaOCl+Twee 20.
2.1.3 Parâmetros avaliados
Foram realizadas avaliações diariamente durante 21 dias após a inoculação, sendo
analisada a contaminação, oxidação e presença de brotações.
2.1.4 Delineamento estatístico
Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e seis
repetições. Os dados obtidos foram submetidos a teste de regressão binomial utilizando o
software SAS 9.2 (2010)
64
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na casa de vegetação a UR mínima média foi 60% e máxima média de 85%,
temperatura mínima média de 17ºC e máxima média de 37ºC.
Verificou-se que não houve contaminação em nenhum dos tratamentos. Fato este que
diferiu dos dados encontrados por Paz e Silveira (2013), onde a contaminação chegou a 90%
na micropropagação de Opuntia fícus-indica, vale salientar que este experimento foi
conduzido em sala de crescimento. Vasconcelos et al., (2007) ao desinfestarem os cladódios
de N. cochenilefera mantidos em casa de vegetação com álcool 70% por um minuto e
hipoclorito de sódio 2% por 10 minutos, conseguiram manter a contaminação relativamente
baixa, 10%. Erig e Schuch (2003) ao lavarem em água corrente os brotos de macieira para
micropropagação aumentaram a contaminação bacteriana, diferindo do que ocorreu no
presente trabalho.
Segundo Pereira et al., (2003) os microrganismos contaminantes competem com os
explantes pelos nutrientes do meio de cultura, eliminando no meio metabólitos tóxicos,
podendo ocasionar a morte dos explantes. Este fato pode ser atribuído aos cladódios que
forma utilizado como fonte de explantes terem sido acondicionados em laboratório. Ambiente
protegido de intemperes e ataque de insetos, como sugerido por Grattapaglia e Machado
(1998).
Apesar de eficiente na descontaminação dos explantes, doses elevadas de hipoclorito
com e sem Tween provocam efeito fitotóxico, ocasionando a oxidação destes explantes
(Figura 1). Nas concentrações de 0 a 20% de NaOCl com e sem Tween não houve oxidação
significativa, no entanto, a partir da concentração de 20% com e sem Tween percebe-se um
aumento no percentual de oxidação dos explantes, este aumento permaneceu contínuo, para o
tratamento de Hipoclorito com Tween, até a concentração de 50%, atingindo valores
superiores a 50% de oxidação. Por outro lado, o tratamento com Hipoclorito sem Tween, a
partir da concentração de 40%, manteve o percentual de oxidação inferior a 34%.
65
Figura 1: Oxidação em explantes de palma-doce (N. cochenilefera) submetidos à
descontaminação com diferentes concentrações de NaOCl acrescido ou não de
Tween 20, em casa de vegetação, Areia-2011.
O tratamento com apenas hipoclorito, manteve níveis satisfatórios de brotação até a
concentração de 20%, a partir desta concentração, houve diminuição continua do percentual
de brotos, atingindo valores mínimos a partir da concentração de 40% (Figura 2). Por outro
lado a adição do Tween ao hipoclorito influenciou negativamente na presença de brotações,
associado a isto, doses mais elevadas do hipoclorito com o Tween promoveram menor
brotação.
Alves et al., (2013) relacionaram a baixa percentagem de brotações na multiplicação
de Opuntia atropes Rose e Nopalea cochenillifera Salm-Dick a alta taxa de oxidação. Os
autores utilizaram na descontaminação hipoclorito de sódio 1% +10 gotas de Tween 20, por
15 minutos e/ou hipoclorito de sódio 1% + cloreto de mercúrio 0,2%; por 10 minutos.
Resultados semelhantes também foram encontrados por Paz e Silveira 2013, no cultivo in
vitro de Opunita fícus indica, ocorrendo 100% de oxidação, redução na porcentagem de
brotações e até mesmo causando a morte dos explantes.
Cid (1999) revela que as oxidações dos fenóis pela polifenoxidase impedem em alguns
casos, a metabolização dos hormônios das classes das auxinas e das citocininas, estes, são
importantes na ativação do ciclo celular. Souza et al.(2011), afirmam que a oxidação inibe o
crescimento e a multiplicação das células, ocasionadas pela redução da velocidade do
66
metabolismo celular. Isto explica em parte o fato de que os tratamentos que receberam doses
de hipoclorito de sódio acima de 20% terem tido um porcentagem baixa de brotações.
Figura 2: Presença de brotações em explantes de palma-doce submetidos à descontaminação
com diferentes concentrações de NaOCl acrescido ou não de Tween 20, cultivados
em condições de telado, Areia-2011.
4. CONCLUSÕES
A manutenção dos cladódios em ambiente higienizado associado a todos os
tratamentos com NaOCl com ou sem Tween 20 é eficaz na descontaminação de explantes de
palma forrageira (N. cochenillifera);
As concentrações de 10 e 20% (v/v) de NaOCl apresenta maior presença de brotações
no cultivo in vitro de palma forrageira (N. cochenillifera) em casa de vegetação;
A presença de brotos é proporcionalmente reduzida com o aumento das concentrações
de NaOCl na presença de Tween 20.
67
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