Guarapuava, 18 agosto de 2011
CARACTERIZAÇÃO FÍSICA, QUÍMICA E
BIOLÓGICA DE NOVOS
FOTOSSENSIBILIZADORES PARA
UTILIZAÇÃO EM TERAPIA FOTODINÂMICA
Tania Toyomi TominagaDepartamento de FísicaUNICENTRO, Guarapuava, PR
Seminário PET – Física UNICENTRO
Terapia Fotodinâmica (TFD)
Interação simultânea: fotossensibilizador (FS), luz e O2
ORTEL, B.; SHEA, C. R.; CALZAVARA, P. P. Molecular mechanisms of photodynamic therapy, v. 14, p. 4157-4172, 2009
luzFS
estado
fundamental
FSestado
excitado
O2
tecido
radicais
livres, oxigênio
singlete
toxicidade
celular
Terapia Fotodinâmica (TFD)
•O2̄
•OH
transferência
H, elétrons
transferência
energiaOxigênio singlete
morte
celular
Mecanismo Tipo II
Mecanismo Tipo I
FOOTE, C. S. Photochemistry and Photobiology, v. 54, p. 659, 1991
Pacientes tratados com TFD
Terapia Fotodinâmica (TFD)
A degeneração macular (DMR)
A mácula é a região central da retina. Ocorre acúmulo de substâncias nas células da mácula que levam a uma desestruturação dessa região com conseqüente perda da visão. Avisãocentral é comprometida
Tratamento convencional - destrói também a retina adjacente às lesões.
Visudyne - verterporfirina tem o poder de se ligar a moléculas de colesterol e se concentra fortemente nas membranas neovascularessub-retinianas.
TERAPIA FOTODINÂMICA NA OFTALMOLOGIA
PARA MANCHAS DE SOL
ACNE
RUGAS
VERRUGAS
PSORÍASIS
TERAPIA FOTODINÂMICA NA DERMATOLOGIA
INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA DE MICRORGANISMOS
E. coli
C. albicans S. aureus
TERAPIA FOTODINÂMICA NA ODONTOLOGIA
A terapia fotodinâmica antimicrobiana tem sido uma alternativa de na odontologia
PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZADOR
Seletividade e alta afinidade por células malignas
Substância com estrutura química definida
Solubilidade e estabilidade em água
Fotossensibilidade não prolongada
Baixa toxicidade
Metabolização rápida
Elevado coeficiente de absorção em l > 600 nm
MOAN, J.; PENG, Q. Photodynamic Therapy. França: European Society for Photobiology, 2003 284 p.
JANELA TERAPÊUTICA (600-800 nm)
Representação esquemática de um corte de tecido humano e o percentual de penetraçãoda luz
SHLIAKHTSIN, S. V.; TRUKHACHOVAA, T. V.; ISAKAUA, H. A.; ISTOMINB, Y. P. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 6, p. 97-104, 2009
FOTOSSENSIBILIZADORES DE PRIMEIRA GERAÇÃO
Derivados de hematoporfirina
NH
N HN
N
R1CH3
R2H3C
CH3H3C
COOR4COOR3
Estrutura monomérica do Photogem
300 400 500 600 700
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ab
sorç
ão
óti
ca
comprimento de onda (nm)
Photofrin®, Photosan® e Photogem
Espectro de absorção ótica PG 15 µg mL-1, em PBS, pH = 7,4
FOTOSSENSIBILIZADORES DE SEGUNDA GERAÇÃO
a) clorinas e bacterioclorinas
b) ftalocianinas e naftalocianinas
300 400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Absorb
ância
comprimento de onda (nm)
Espectro de absorção ótica Zn-tetra-carboxi-ftalocianina15 µg mL-1, em PBS, pH = 7,4
FOTOSSENSIBILIZADORES DE SEGUNDA GERAÇÃO
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
H3C
H3C
O
Hipericum perforatum:popularmente conhecida como Erva de São João
Hipericina
300 400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ab
sorç
ão
óti
ca
comprimento de onda (nm)
Modificações no anel tetrapirrólico Composição química definida Pouca fotossensibilização cutânea
Espectro de absorção óticaHipericina, 15 µg mL-1, em PBS, pH= 7,4
♦ potencial como antiviral, antibactericida, antipsoriático e agente
antitumoral
♦ composto exibe atividade anticancer no escuro, que pode ser
aumentada cerca de 100 vezes na presença da luz
♦ alguns autores sugerem que HY é provavelmente o mais poderoso
fotossensibilizador encontrado na natureza
HIPERICINA
PAPEL DO FÍSICO NA TERAPIA
FOTODINÂMICA
FONTES DE LUZ
Laser
Led
Lâmpadas de Halogênio
Sistema de LED permite a
iluminação de áreas maiores.
Este sistema é comercializado
pela MM-Optics, São Carlos,
SP
Mardoqueu Martins da Costa, físico e autor da pesquisa
O instrumento é fruto de um trabalho conjunto da Escola de Engenharia (EESC) e do Instituto de Física (IFSC).
Fluorescência e luz para detectar alterações no epitélio de pacientes.
DIAGNÓSTICO
TRATAMENTO NA ODONTOLOGIA
A terapia fotodinâmica antimicrobiana tem sido uma alternativa de na odontologia
As nanopartículas como possíveis carregadores de agentes para o aumento da eficácia da terapia fotodinâmica antimicrobiana, ou no aumento dos sinais ópticos de espectroscopia Raman ou FTIR para diagnóstico diferencial de microorganismos, células ou neoplasias
PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
Fotossensibilizadores são introduzidos por via
intravenosa: efeitos colaterais ou causar entupimento das
veias.
Investigações com estruturas presentes no sangue, tais
como a albumina e membranas, subsidia a compreensão da
interações e ação farmacológica.
ESTUDO FEITO POR ABSORÇÃO ÓTICA,
FLUORESCÊNCIA E FOTOACÚSTICA
INTERAÇÃO DOS FOTOSSENSILIZADORES COM PROTEÍNAS
CARACTERIZAÇÃO DOS FS
•AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS FS
•DETERMINAÇÃO DE RADICAIS LIVRES - RPE
•TESTES EM CÉLULAS
FOTOXIDAÇÃO DO ÁCIDO ÚRICO
FISCHER, F.; GRASCHEW, G.; SINN, H-J.; MAIER-BORST, W.; LORENZ, W. J.; SCHLAG, P. M. Clinica Chimica Acta, v. 274, p. 89-104, 1998
Espectro de absorçãoIntensidade da banda 292 nm
Irradiação LED 5min sob agitação
200 300 400 500 600 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ab
so
rbâ
ncia
(u
.a.)
Comprimento de onda (nm)
235
292
FS 5 µg/ mL + Ácido Úrico 10 µg/mL
Espectro de absorção ótica do ácido úrico em PBS, pH = 7,4
Método indireto determinar rendimento quântico de formação de oxigênio singlete
Ácido úrico supressor de oxigênio singlete dosímetro químico
)(tAE
AF
irrFS
AU
l
0
510
FOTOXIDAÇÃO DO ÁCIDO ÚRICO
300 400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ab
sorb
ân
cia
comprimento de onda (nm)
tempo de irradiação
0
2 min
5 min
8 min
15 min
Eo = 180 J/s
Espectro de absorção ótica do ácido úrico eFS em PBS, em função do tempo pH = 7,4
Fotossensibilizador Atividade Fotodinâmica (m2 J-1)
HY 26 ± 5
PG 7 ± 1
AF HY PG
gera mais 1O2
Atividade Fotodinâmica dos FSs
DETECÇÃO DE RADICAIS LIVRES - RPE
Radicais livres – formados nos processos
tipo I
O2•̄ superóxido, HO• hidroxila
Espectroscopia de Ressonância Magnética
(RPE) – Spin trapping
ESPECTRÔMETRO DE RPE
N
O
HH3C
H3C O2
N
O
H
OHH3C
H3C
O N
O
H
OHH3C
H3C
DMPO DMPO-OH
Reação do DMPO com radical O2•- formando o aduto DMPO-OH.
Radicais livres não estáveis reagem com spin trap (compostos diagmagnéticos)
para formar radicais livres estáveis
SPIN TRAPPING
Espectro de RPE do aduto DMPO- OH
3340 3360 3380 3400 3420 3440
Inte
nsid
ad
e
experimental
Campo Magnético (Gauss)
simulado
Aduto DMPO-Hidroxila em solução de Hipericina (50 mL/mL) e DMPO (0.5 M).Tempo de irradiação 15 min, LED vermelho.
aN= 15,08 G; aH=14.95
3360 3380 3400 3420 3440
0
3
6
Simulado
Experimental
Inte
nsi
dad
e
Campo Magnético (Gauss)
Espectro de RPE do aduto DMPO- OOH
Aduto DMPO-superoxido em solução de Hipericina (50 mL/mL) e DMPO (0.5 M).Tempo de irradiação 15 min, LED vermelho.
aN= 13,02 G; aH=10,51 G; aH=1.41 G
CARACTERIZAÇÃO
BIOLÓGICA
CULTURA CELULAR
Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora
do organismo original, mantendo suas características próprias
Linhagem de cresce aderida ao substrato
células epiteliais meio de cultura + 10 % SFB + antibióticos
mantida em estufa 37 °C atmosfera de CO2
Manipulação em capela de fluxo laminar Estufa de cultura celular
Experimentos citotóxicos
leitor de placas
manipulação em capela de
fluxo laminar
placa 96 poços
biotable 630 nm
1x105 cél. mL-1
placa de 96 poços
24 h
incubação
2 h
irradiação
48 h
ensaio MTT
índice
sobrevivência
0 5 10 15 20 25 30 35
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30 35
0
20
40
60
80
100
(b)
IS (
%)
[FS] mg/mL
(a)IS
(%
)
escuro
[FS] mg/mL
ENSAIO CITOTÓXICO DOS FSDETERMINAÇÃO VIABILIDADE COM MTT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
4
8
12
16
20
[FS
] (m
g m
g p
rote
ína
-1 )
Tempo (h)
HY
PZ
PG
0,5 1 2 4 6 8 10 12 14 24
ACUMULAÇÃO INTRACELULAR DE HY, PG E PZEM CÉLULAS HEP-2
LED – conjunto de LEDs - diodos emissores de luz
BIOTABLE
630 nm I= 18 mW cm-2 590 nm I= 10 mW cm-2
CONSIDERAÇÕES FINAIS
OBRIGADA PELA
ATENÇÃO !!!
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