Comissão Nacional de Energia Nuclear
Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear
Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais
Sara Roberta dos Santos
AVALIAÇÃO DE APTÂMEROS MARCADOS COM 99m
Tc PARA
IDENTIFICAÇÃO DE FOCOS INFECCIOSOS DE Staphylococcus aureus
Belo Horizonte
2014
Sara Roberta dos Santos
AVALIAÇÃO DE APTÂMEROS MARCADOS COM 99m
Tc PARA
IDENTIFICAÇÃO DE FOCOS INFECCIOSOS DE Staphylococcus aureus
Belo Horizonte
2014
Dissertação apresentada ao curso de Pós
Graduação em Ciência e Tecnologia das
Radiações, Minerais e Materiais, como requisito
parcial à obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Ciência e Tecnologia das
Radiações
Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade
Co-orientadora: Dra. Cristiane Rodrigues Corrêa
Dedico este trabalho a minha mãe Miriam e
ao Otávio pelo apoio e carinho.
AGRADECIMENTOS
A Deus,
Ao meu orientador Antero pela oportunidade, ensinamentos e confiança,
A minha coorientadora Cristiane pelos ensinamentos e constante apoio durante todo o projeto,
Aos professores Valbert e Simone pela colaboração e acolhida no Laboratório de
Radioisótopos, permitindo assim que este projeto fosse possível,
Ao professor André pela colaboração, ensinamentos e paciência,
A professora Rogéria Serakides pela colaboração,
Ao Leonardo pela colaboração e treinamentos,
Aos colegas do Laboratório de Radioisótopos/UFMG,
Aos colegas do Laboratório de Radiobiologia/CDTN,
Ao laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica do setor de Patologia do departamento
de Clínica e Cirurgia Veterinária da UFMG,
As técnicas Natália e Leimar do laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica pela
ajuda na elaboração das lâminas histológicas,
Aos funcionários do biotério Adelaide e Batista,
Aos funcionários do LIG/CDTN,
Aos professores da pós-graduação pelos ensinamentos,
Aos colegas do CDTN,
Aos familiares e amigos pelos momentos de descontração,
A CNEN/CDTN pelo apoio financeiro,
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram neste projeto.
RESUMO
Staphylococcus aureus é uma espécie de grande importância médica, pois está
frequentemente associado com diversas infecções em seres humanos. Essa bactéria pode
causar doenças que vão desde infecções simples, até infecções potencialmente letais como
endocardite, pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico, septicemia, osteomielite,
entre outras. O S. aureus é o agente mais comumente encontrado em infecções na pele e
tecidos moles, infecções ósseas e de próteses ósseas. Tendo em vista a dificuldade de
identificação destes focos infecciosos torna-se importante o desenvolvimento de novas
técnicas diagnósticas. O diagnóstico por cintilografia apresenta vantagens sobre outros
métodos, pois é capaz de identificar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos
invasivos e é capaz de realizar um diagnóstico precoce antes mesmo de haver modificações
anatômicas. Assim, a medicina nuclear poderia contribuir para um diagnóstico preciso de
infecções bacterianas, desde que radiofármacos específicos fossem desenvolvidos. Aptâmeros
são oligonucleotídeos que apresentam alta afinidade e especificidade para seus alvos
moleculares e vem se apresentado como uma classe de moléculas promissoras para o
desenvolvimento de radiofármacos. Aptâmeros radiomarcados, específicos para os agentes
infecciosos, poderiam dar uma contribuição significativa para o diagnóstico de infecções
através da cintilografia. Neste estudo, aptâmeros selecionados para S. aureus foram marcados
com 99m
Tc e utilizados para identificação desta bactéria em ensaios in vitro e in vivo. Os
aptâmeros foram inicialmente marcados com 32
P e incubados com células de S. aureus em
ensaio in vitro, mostrando alta afinidade pelas células de S. aureus quando comparados com a
biblioteca de oligonucleotídeos com sequências aleatórias, utilizada como controle. Os
aptâmeros foram marcados com 99m
Tc e incubados com células de S. aureus em ensaio in
vitro e demostraram afinidade pelas células de S. aureus quando comparados com a
biblioteca, porém ligações inespecíficas foram também verificadas. A estabilidade da
marcação foi avaliada e os aptâmeros radiomarcados foram estáveis em solução salina 0,9%,
em plasma de camundongos Swiss e em excesso de cisteína. Em ensaios in vivo em modelo
experimental com camundongos Swiss, com infecção intramuscular na coxa direita, os
aptâmeros marcados com 99m
Tc injetados por via intravenosa, foram capazes de identificar a
infecção causada por S. aureus, apresentando uma relação alvo/não alvo de 4,035 ± 0,46 após
4 h da injeção do radiomarcado. Foram utilizados como controle camundongos infectados
com C. albicans, que apresentaram uma relação alvo/não alvo de 2,02 ± 0,42 e camundongos
com inflamação asséptica induzida por zimosan nos quais a relação alvo/não alvo foi de 1,146
± 0,226. Imagens cintilográficas mostraram uma elevada captação do radiofármaco pelos rins
e eliminação pela bexiga em todos os grupos. O grupo infectado por S. aureus apresentou
maior captação na coxa direita infectada sendo visível a diferença em relação a coxa esquerda
(controle) no tempo de 1 h. Para os outros grupos (C. albicans e zimosan) não foram
visualizadas diferenças. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que aptâmeros
marcados diretamente com 99m
Tc são promissores no diagnóstico de infecção pela
cintilografia.
Palavras-Chave: aptâmeros; infecção; Staphylococcus aureus; 99m
Tc.
ABSTRACT
Staphylococcus aureus is specie of great medical importance because it is often associated
with many infections in humans. This bacterium can cause diseases ranging from simple
infections to life-threatening infections such as endocarditis, pneumonia, meningitis, toxic
shock syndrome, septicemia, osteomyelitis, among others. S. aureus is the most commonly
agent found in infections of the skin and soft tissues, bone infections and bone prostheses.
The difficulty in early detection of specific foci caused by bacteria has raised the need to
search for new techniques for this purpose. Diagnosis by scintigraphy has advantages over
other methods because it is able to identify damage tissues without the need of invasive
procedures and is able to perform an early diagnosis even before anatomic changes. Thus,
nuclear medicine could contribute to an accurate diagnosis of bacterial infections, since
specific radiopharmaceuticals were developed. Aptamers are oligonucleotides that have high
affinity and specificity for their molecular targets and are emerging as a new class of
molecules for radiopharmaceuticals development. Radiolabeled aptamers specific to the
infectious agents, could give a significant contribution to the infection diagnosis by
scintigraphy. In this study, aptamers selected to S. aureus were labeled with 99m
Tc and used
for the bacteria identification in vitro and in vivo. The aptamers labeled with 32
P and
incubated in vitro with S. aureus cells showed high affinity for the bacterial cells when
compared with the library of oligonucleotides with random sequences used as control. The
aptamers labeled with 99m
Tc also showed affinity for S. aureus cells when compared with the
library, but unespecific binding was also verified. The 99m
Tc labelled aptamers were stable in
0.9% saline, plasma of Swiss mice and in excess of cysteine. The in vivo biodistribution
studies using Swiss mice with intramuscular infection in the right thigh showed that the
aptamers labeled with 99m
Tc were able to identify the infection foci caused by S. aureus
displaying a target/non-target ratio of 4,035 ± 0.46 after 4 h. Mice infected with C. albicans
presented a target/non-target ratio of 2.02 ± 0.42 while mice with aseptic inflammation
induced by zymosan showed a target/non-target ratio of 1,146 ± 0,226. Scintigraphic images
revealed a high uptake of the radiopharmaceutical by the kidneys and fast elimination by the
bladder. The images also showed higher uptake in the right thigh (infected) in relation to the
left (control) for the S. aureus infected mice. In the control groups (C. albicans e zymosan)
was not possible to visualize any difference. The results indicate the radiolabeled aptamers as
a promising alternative for the development of radiopharmaceuticals for infection.
Keywords: aptamers; infection; Staphylococcus aureus; 99m
Tc.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Staphylococcus aureus em imagem de microscopia convencional......... 24
Figura 2: Causas comuns de infecções associadas a prótese..................................
25
Figura 3: Biofilme de S. aureus em infecção de prótese........................................
26
Figura 4: Gerador 99
Mo/99m
T..................................................................................
28
Figura 5: Diagrama do decaimento do 99
Mo em 99m
Tc...........................................
28
Figura 6: Mecanismo da Resposta Inflamatória.....................................................
31
Figura 7: Prótese direita de quadril infectada.........................................................
38
Figura 8: Estruturas de aptâmeros...........................................................................
39
Figura 9: Esquema da metodologia SELEX...........................................................
42
Figura 10: Diagrama da metodologia SELEX........................................................
43
Figura 11: Esquema da metodologia CELL-SELEX com o passo de seleção
negativa....................................................................................................................
46
Figura 12: Aptâmeros SA20, SA23 e SA34........................................................... 58
Figura 13: Diagrama esquemático da cromatografia em camada delgada..............
61
Figura 14: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de
aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss
infectados na coxa direita com S. aureus.................................................................
84
Figura 15: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de
aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss
infectados na coxa direta com C. albicans...............................................................
85
Figura 16: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de
aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss
com uma inflamação desenvolvida por administração de zimosan na coxa direita.
86
Figura 17: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em
microscopia óptica....................................................................................................
89
Figura 18: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em
microscopia óptica....................................................................................................
89
Figura 19: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica....................................................................................................
90
Figura 20: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica....................................................................................................
91
Figura 21: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica....................................................................................................
91
Figura 22: Fotomicrografia de inflamação intramuscular induzida por zimosan
em microscopia óptica..............................................................................................
92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sensibilidade e Especificidade em diagnóstico de próteses de joelho e
quadril utilizando imagens de leucócitos marcados com 99m
Tc...............................
37
Tabela 2: Eluentes utilizados na CCD.....................................................................
61
Tabela 3: EC50 para células de S. aureus da linhagem ATCC 8325-4..................
68
Tabela 4: Determinação da radioatividade incorporada aos pellets de S. aureus
da linhagem ATCC 25923........................................................................................
68
Tabela 5: Estabilidade em solução salina 0,9%......................................................
69
Tabela 6: Estabilidade no plasma............................................................................
70
Tabela 7: Estabilidade em excesso de cisteína.......................................................
70
Tabela 8: Estabilidade dos coligantes tricina e EDDA em solução salina 0,9%....
70
Tabela 9: Rendimento da marcação dos aptâmeros SA20, SA23, SA34 e da
biblioteca com 99m
Tc................................................................................................
72
Tabela 10: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e
SA34, marcados com 99m
Tc no grupo infectado por S. aureus (n=6) obtidos no
tempo de 4h..............................................................................................................
74
Tabela 11: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e
SA34, marcados com 99m
Tc no grupo infectado por C. albicans (n=6) obtidos no
tempo de 4h..............................................................................................................
75
Tabela 12: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e
SA34, marcados com 99m
Tc, no grupo com a indução de inflamação estéril por
zimosan (n=6), obtidos no tempo de 4h...................................................................
76
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Ensaio de ligação do aptâmero SA20 marcado com 32
P a células de
S. aureus...................................................................................................................
66
Gráfico 2: Ensaio de ligação do aptâmero SA23 marcado com 32
P a células de S.
aureus.......................................................................................................................
67
Gráfico 3: Ensaio de ligação do aptâmero SA34 marcado com 32
P a células de S.
aureus.......................................................................................................................
67
Gráfico 4: Ensaio de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m
Tc a células de S. aureus.....................................................................................
71
Gráfico 5: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc
em camundongos Swiss (n=6) no grupo infectado com S. aureus em
%ID/g.......................................................................................................................
78
Gráfico 6: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc
em camundongos Swiss (n=6) no grupo infectado com C. albicans em
%ID/g.......................................................................................................................
78
Gráfico 7: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc
em camundongos Swiss (n=6) no grupo com o desenvolvimento de inflamação
por zimosan em %ID/g.............................................................................................
79
Gráfico 8: Comparação da %ID/g nas coxas infectadas (S. aureus e C. albicans)
e inflamada (zimosan)..............................................................................................
80
Gráfico 9: Relação alvo/não alvo (coxa infectada/coxa não infectada) nos grupos
S. aureus, C. albicans e Zimosan.............................................................................
82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%ID/g- Percentual da dose injetada por grama de tecido
111In- Índio 111
123I- Iodo 123
18F- Flúor 18
32P- Fósforo 32
99Mo- Molibdênio-99
99mTc –Tecnécio-99 metaestável
99mTcO2- Tecnécio-99 metaestável hidrolisado
99mTcO4
- - Tecnécio-99 metaestável livre
A. fumigatus- Aspergillus fumigatus
ATP- Trifosfato de adenosina
C. albicans- Candida albicans
cAMP- Amp cíclico
CCD- Cromatografia de camada delgada
CD71- Receptores de transferrina
CELL SELEX- SELEX para células
células NK- Células natural killers
CNTs- Nanotubos de carbono
Cpm- Contagem por minuto
Cpm/g- Contagem por minuto por grama de tecido
DNA- Ácido desoxirribonucleico
DOTA-Ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-tetraacético
dsDNA- DNA fita dupla
DTPA- Ácido dietilenotriaminopentacético
EDDA- Ácido etilenodiaminoacético
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF- Fator de crescimento epitelial
FDA- Food and drug administration
FDG- Fluorodesoxiglicose
HIG- Imunoglobulina G policlonal humana
HIV- Vírus da imunodeficiência humana
hLF- Lactoferrina humana
HMPAO- Hexametil propilenamina
HNP 1-3- Peptídeo neutrofílico humano
HYNIC- Ácido hidrazinonicotínico
IAEA- Agência Internacional de Energia Atômica
ICAMs- Moléculas de adesão intercelular
IL-1- Interleucina-1
IL-12- Interleucina-12
IL-1ra- Receptor antagonista IL-1 radiomarcado
IL-6- Interleucina-6
IL-8- Interleucina-8
Kd- Constante de dissociação
KDa- Quilodalton
mAbs- Anticorpos monoclonais
MAG2- Acetil mercapto diglicina
MAG3- S-acetil-mercaptoacetiltriglicina
Na99m
TcO4- Pertecnetato de sódio
NPs- Nanopartículas metálicas
PCR - Polimerase Chain Reaction
PDGF- Fator de crescimento derivado de plaquetas
PET- Tomografia por Emissão de Pósitrons
PMSA- Antígeno de membrana próstata específico
QDs-quantum dots
RNA- Ácido ribonucléico
S. aureus- Staphylococcus aureus
SDS- Dodecil Sulfato de Sódio
SELEX- Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
SPECT- Tomografia computadorizada por emissão de fóton único
ssDNA- DNA fita simples
TSST-1- Toxina da síndrome do choque tóxico
UBI 29-41- Fragmento do peptídeo ubiquicidina
VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO..................................................................................................
19
2- OBJETIVOS....................................................................................................... 21
2.1) Objetivo geral.................................................................................................... 21
2.2) Objetivos específicos........................................................................................ 21
3- JUSTIFICATIVA...............................................................................................
22
4- REFERENCIAL TEÓRICO............................................................................. 24
4.1) Staphylococcus aureus...................................................................................... 24
4.2) Diagnóstico por Cintilografia............................................................................ 27
4.2.1) Tecnécio-99m (99m
Tc).................................................................................... 28
4.2.2) Características ideais de um radiofármaco..................................................... 29
4.3) Infecção x Inflamação - Técnicas diagnósticas por imagem............................ 30
4.3.1) Radiofármacos atualmente utilizados em diagnóstico de infecção................ 32
4.3.1.1) 67
Ga-citrato................................................................................................. 32
4.3.1.2) Citocinas e Quimiocinas............................................................................. 32
4.3.1.3) Peptídeos antimicrobianos.......................................................................... 33
4.3.1.4) Vitaminas.................................................................................................... 33
4.3.1.5) Anticorpos monoclonais (mAbs) antigranulócitos..................................... 34
4.3.1.6) Imunoglobulina G policlonal humana......................................................... 34
4.3.1.7) 99m
Tc-albumina nanocolóide....................................................................... 35
4.3.1.8) 18
F-Fluoro-desoxi-glicose (18
F-FDG)......................................................... 35
4.3.1.9) Antibióticos radiomarcados........................................................................ 35
4.3.1.10) Agentes antifúngicos radiomarcados........................................................ 36
4.3.1.11) Leucócitos radiomarcados......................................................................... 36
4.3.2) Considerações................................................................................................ 38
4.4) Aptâmeros........................................................................................................ 39
4.4.1) A Técnica SELEX.......................................................................................... 40
4.4.2) Alvos para SELEX......................................................................................... 44
4.4.3) A técnica SELEX para células (CELL SELEX)............................................ 45
4.4.4) Propriedades dos aptâmeros........................................................................... 47
4.4.5) Aplicações dos aptâmeros.............................................................................. 49
4.4.5.1) Aplicações em terapia................................................................................. 49
4.4.5.1.1) Aplicações em angiogênese..................................................................... 49
4.4.5.1.2) Aplicações em oncologia......................................................................... 50
4.4.5.1.3) Aplicações como agentes anticoagulantes............................................... 51
4.4.5.1.4) Aplicações em tratamento de inflamação................................................ 51
4.4.5.1.5) Aplicação no tratamento de doenças infecciosas..................................... 52
4.4.5.1.6) Aplicações em diabetes............................................................................ 53
4.4.5.2) Aplicações em diagnóstico.......................................................................... 53
4.4.5.2.1) “Beacons” competitivos........................................................................... 53
4.4.5.2.2) Sensores eletroquímicos........................................................................... 54
4.4.5.2.3) Diagnóstico com conjugados de aptâmeros a nanopartículas.................. 54
4.4.5.2.4) Diagnóstico por cintilografia utilizando aptâmeros................................. 55
5) MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................
58
5.1) Aptâmeros......................................................................................................... 58
5.2) Microrganismos e condições de cultura............................................................ 59
5.3) Animais............................................................................................................. 59
5.4) Marcação dos aptâmeros com 32
P..................................................................... 59
5.5) Ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32
P a células de S. aureus..... 59
5.6) Detecção da Radioatividade por Cintilação Líquida......................................... 60
5.7) Marcação dos aptâmeros com 99m
Tc................................................................ 60
5.8) Testes de estabilidade dos aptâmeros marcados............................................... 61
5.8.1) Teste de estabilidade em solução salina......................................................... 62
5.8.2) Teste de estabilidade em excesso de cisteína................................................ 62
5.8.3) Teste de estabilidade no plasma..................................................................... 62
5.9) Ensaio in vitro de afinidade dos aptâmeros marcados com 99m
Tc.................... 62
5.10) Estudos de Biodistribuição e Cintilografia..................................................... 63
5.11) Histologia........................................................................................................ 64
5.12) Análise Estatística........................................................................................... 65
6-RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................
66
6.1) Ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32
P para células de S. aureus 66
6.2) Marcação com 99m
Tc e avaliação da estabilidade dos aptâmeros marcados..... 69
6.3) Ensaio in vitro de afinidade dos aptâmeros marcados com 99m
Tc.................... 71
6.4) Biodistribuição.................................................................................................. 72
6.5) Cintilografia...................................................................................................... 84
6.6) Histologia.......................................................................................................... 88
6.6.1) Grupo 1:Infectado com S. aureus.................................................................. 88
6.6.2) Grupo 2: Infectado com C. albicans.............................................................. 90
6.6.3) Grupo 3: Zymosan......................................................................................... 92
7- CONCLUSÕES..................................................................................................
93
8- PERSPECTIVAS...............................................................................................
94
9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................
95
ANEXO-A............................................................................................................... 108
19
1- INTRODUÇÃO
Staphylococcus aureus é uma espécie de grande importância médica, pois está
frequentemente associado com diversas infecções em seres humanos. O S. aureus pode causar
desde infecções simples até infecções potencialmente letais como endocardite, septicemia,
pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico e osteomielite (SANTOS et al, 2007). Essa
bactéria é o agente mais comum em infecções de pele e tecidos moles, sendo frequentemente
isolado em feridas cirúrgicas infectadas que podem ser focos para o desenvolvimento de
infecções sistêmicas (ROBERT & CHAMBERS, 2005). Além disso, S. aureus está entre as
espécies mais prevalentes em infecções pós-artroplastias de joelho e quadril, correspondendo
a 75% dos casos de infecções de próteses perioperatórias e a 50 % dos casos de infecção por
via hematógena (MUNHOZ et al 2004; GEMMEL et al, 2012). As infecções ósseas e de
próteses caracterizam-se pela dificuldade de diagnóstico e tratamento, podendo incluir
intervenções cirúrgicas e longos períodos de antibioticoterapia (GEMMEL et al, 2012 ).
Assim, a identificação precoce de focos infecciosos provocados por S. aureus é crucial para o
sucesso do tratamento. A erradicação incompleta destes focos pode provocar reincidências,
aumentando as taxas de mortalidade. O diagnóstico é geralmente difícil devido à ausência de
sintomas e dificuldade na diferenciação entre inflamação (asséptica) e infecção (séptica)
(FIDEL et al, 2010).
O diagnóstico por cintilografia é uma modalidade da Medicina Nuclear que emprega técnica
de imageamento molecular com o uso de radiofármacos. O imageamento molecular permite a
visualização, caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e
molecular em organismos vivos. Essa técnica diagnóstica apresenta vantagens sobre outros
métodos, pois é capaz de caracterizar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos
invasivos e é capaz de realizar um diagnóstico precoce antes mesmo de haver modificações
anatômicas. A cintilografia permite a visualização de uma imagem de corpo inteiro,
evidenciando assim, a localização das áreas afetadas (GOMES et al, 2011).
Os radiofármacos atualmente empregados no diagnóstico de infecções apresentam uma série
de limitações, pois muitos não são capazes de diferenciar processos sépticos de assépticos e,
de forma geral, não são capazes de identificar o agente responsável pela infecção.
Radiofármacos como 67
Ga-citrato, citocinas e quimiocinas marcadas, o 18
F-FDG, vitaminas e
99mTc-albumina nanocolóide não são específicos para infecção. Os leucócitos e peptídeos
antimicrobianos marcados são específicos para a infecção, mas não são capazes de identificar
20
o agente responsável pela infecção. Imagens tardias (24 h) de leucócitos radiomarcados são
capazes de diferenciar infecção de inflamação e ainda são consideradas o padrão ouro em
medicina nuclear para o diagnóstico de infecções, mas a preparação do radiofármaco é
laboriosa e requer a manipulação de sangue potencialmente contaminado. Os antibióticos e
agentes antifúngicos marcados são potencialmente capazes de identificar o agente responsável
pela infecção, mas a especificidade desses radiofármacos tem sido amplamente discutida e os
resultados tem se apresentado controversos (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
Aptâmeros são oligonucleotídeos que apresentam alta afinidade e especificidade para seus
alvos moleculares e vem se apresentado como uma classe de moléculas promissoras para o
desenvolvimento de radiofármacos (CIBIEL et al, 2012). Aptâmeros radiomarcados,
específicos para os agentes infecciosos, poderiam dar uma contribuição significativa para o
diagnóstico de infecções através da cintilografia. Neste estudo, aptâmeros selecionados para
S. aureus foram marcados com 99m
Tc e utilizados para identificação desta bactéria em ensaios
in vitro e in vivo.
A proposta do presente projeto, de utilização de aptâmeros radiomarcados para a identificação
por cintilografia de infecções bacterianas, é inédita. Embora os aptâmeros estejam sendo
intensamente pesquisados para utilização como radiofármacos, a utilização destes para
detecção de focos de infecção é original, não existindo na literatura trabalhos nesta direção.
21
2- OBJETIVOS
2.1) Objetivo geral
-Avaliar aptâmeros marcados com 99m
Tc para a identificação de infecção causada por
S. aureus em modelo experimental;
2.2) Objetivos específicos
-Marcar os aptâmeros com 32
P e avaliar a ligação destes as células de S. aureus;
-Marcar aptâmeros com 99m
Tc;
-Avaliar a estabilidade dos aptâmeros marcados com 99m
Tc em salina, plasma e
excesso de cisteína;
-Avaliar, em ensaios in vitro, a ligação dos aptâmeros marcados com 99m
Tc em células
de S. aureus;
-Avaliar a biodistribuição dos aptâmeros marcados com 9m
Tc após administração
intravenosa em camundongos Swiss com infecção experimental por S. aureus e
Candida albicans e inflamação experimental com zimosan.
-Obter imagens cintilográficas após a administração intravenosa dos aptâmeros
marcados com 9m
Tc em camundongos com infecção experimental por S. aureus e C.
albicans e inflamação experimental com zimosan.
-Avaliar o desenvolvimento da infecção e inflamação intramuscular por meio de
análises histológicas.
22
3- JUSTIFICATIVA
O diagnóstico precoce e específico de infecções bacterianas é essencial para a sobrevida dos
pacientes. Tendo em vista a dificuldade de diagnóstico de infecções ósseas e de próteses,
torna-se importante o desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas. De acordo com dados
da literatura, as bactérias Gram-positivas são predominantes nas contaminações das próteses
articulares, em especial S. aureus, estando entre as bactérias mais prevalentes em infecções
pós-artroplastias de joelho e quadril (GEMMEL et al, 2012).
Revisões da literatura internacional revelam que 1 à 5% dos implantes de próteses articulares
tornam-se infectados. No entanto, implantes de próteses articulares, principalmente de quadril
e joelho, vêm se tornando cada vez mais frequente ao longo dos anos, devido ao aumento na
expectativa de vida da população. Além disso, a infecção é considerada a mais devastadora
das complicações dos implantes, resultando em sintomas dolorosos e persistentes, internações
prolongadas com longos períodos de antibioticoterapia, intervenções cirúrgicas repetidas e até
a perda definitiva do implante, com encurtamento do membro afetado, deformidades, e
eventualmente óbito. Os principais fatores de risco para tal complicação são: idade avançada,
imunossupressão, desnutrição, obesidade, diabetes melito, infecção pelo HIV em estágio
avançado, presença de foco infeccioso à distância e antecedente de artroscopia ou infecção em
artroplastia prévia. Além disso, tempo cirúrgico prolongado (superior a 150 minutos),
transfusão sanguínea e realização de artroplastia bilateral em um mesmo tempo cirúrgico são
outros fatores relacionados a maior ocorrência de infecção (LIMA & OLIVEIRA, 2010).
As próteses articulares podem ser infectadas através de três vias distintas: implantação direta,
hematogênica e reativação de infecção latente. A penetração de microrganismos durante a
cirurgia pode ocorrer a partir de fontes endógenas e exógenas. São exemplos a microbiota
cutânea do paciente e dos membros da equipe cirúrgica; o ambiente; e até implantes
contaminados. As bacteremias, a partir de focos à distância, podem gerar contaminação da
prótese por via hematogênica. Os focos mais frequentemente relatados na literatura mundial
são: trato respiratório, cutâneo, urinário, dentário e gastrointestinal (LIMA & OLIVEIRA,
2010).
A diferenciação entre próteses perdidas por mecanismos assépticos e sépticos é importante
para que se possa direcionar o tratamento correto e ainda é um desafio pela dificuldade no
diagnóstico.
23
Dentre as técnicas de diagnóstico por imagens disponíveis, a radiografia simples não
apresenta sensibilidade nem especificidade. A tomografia computadorizada e a ressonância
magnética apresentam limitações com a produção de artefatos devido a presença do implante
metálico. Já cintilografia não apresenta essas limitações, sendo a melhor opção para
diagnóstico de infecções prostéticas desde que radiofármacos específicos estejam disponíveis
(TRAMPUZ & ZIMMERLI, 2005). O diagnóstico por cintilografia apresenta a vantagem de
ser um procedimento não invasivo e é capaz de realizar um diagnóstico precoce, pois permite
a caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e molecular em
organismos vivos (GOMES et al, 2011).
Dentre os radiofármacos atualmente disponíveis para o diagnóstico de infecções, muitos não
são específicos, indicando apenas um aumento na permeabilidade vascular. Alguns são
específicos como leucócitos e peptídeos antimicrobianos marcados, mas não são capazes de
identificar o agente responsável pela infecção. A diferenciação entre infecção bacteriana e
fúngica é também importante visto que drogas diferentes, antibióticos ou antifúngicos, são
utilizadas, respectivamente, em cada caso.
Os aptâmeros poderiam ser utilizados para o diagnóstico de infecções por cintilografia, pois
são altamente específicos para os seus alvos. A especificidade e afinidade dos aptâmeros são
comparáveis aos anticorpos monoclonais além de apresentarem vantagens adicionais como
serem produzidos rapidamente em condições in vitro, serem facilmente modificado para
adicionar propriedades desejáveis como a incorporação de bioconjugados (ex: metais
radioativos, biotina, drogas) ou alterações que interferem em sua estabilidade e
biodistribuição. Os aptâmeros são ainda estáveis à temperatura ambiente, não são
imunogênicos e circulam livremente pelo sangue apresentando rápida depuração plasmática.
Pelo fato dos aptâmeros apresentarem as características de alta afinidade e especificidade para
seus alvos, radiofármacos baseados em aptâmeros podem levar a imagens mais definidas e
consequentemente contribuir para um diagnóstico precoce (YOU et al, 2003; MISSAILIDIS
& PERKINS, 2007).
24
4- REFERENCIAL TEÓRICO
4.1) Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva do grupo dos cocos com
aproximadamente 0,5 a 1,5µm de diâmetro, imóveis, não-esporulados, geralmente não-
encapsulados e catalase positivos. Essa bactéria pode apresentar diversas formas, que vão
desde cocos isolados, aos pares, em cadeias curtas ou agrupamentos irregulares (com aspecto
de cacho de uvas) (Figura 1). O S. aureus pertence à família Micrococcae e o gênero
Staphylococcus possui 33 espécies, sendo que S. aureus é a espécie de maior importância
médica, pois está frequentemente associada com diversas infecções em seres humanos. As
linhagens de S. aureus crescem em meios comuns, caldo ou ágar simples, pH 7, à temperatura
ótima de 37°C (SANTOS et al, 2007).
O S. aureus é encontrado naturalmente na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis.
Entretanto, pode provocar um amplo espectro de doenças que vão desde infecções simples
(espinhas, furúnculos e celulites) até infecções potencialmente letais como endocardite,
septicemia, pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico e osteomielite (SANTOS et al,
2007). Essa bactéria está entre as mais prevalentes em infecções pós-artroplastias de joelho e
quadril (MUNHOZ et al 2004; GEMMEL et al, 2012). As bactérias Gram-positivas
correspondem a 65% dos casos de infecções de próteses de joelho e quadril (Figura 2A)
(GEMMEL et al, 2012 ). As próteses atualmente são formadas de combinações de metais
Figura 1: Staphylococcus aureus em imagem de microscopia convencional. Coloração de
gram em aumento de 1000x. (Fonte: Trinidad Sabalete ©) Disponível em: http://fundacionio.org/img/bacteriology/cont/Staphylococcus_aureus.html
25
(cobalto-crômio ou titânio) e plástico (polietileno) e quando implantadas são cercadas por
osso e membrana de tecido fibroso. Em caso de infecção essa membrana se torna espessa e o
microrganismo forma um biofilme que permanece protegido da ação de antibióticos e do
sistema imune (Figura 2B).
A)
B)
O S. aureus corresponde a 75% dos casos de infecções de próteses perioperatórias, em que
ocorre a inoculação do microrganismo durante a cirurgia de implantação e corresponde a 50%
dos casos de infecção por via hematógena, em que o microrganismo invade a prótese estéril
por um processo de bacteremia. As infecções ósseas e de próteses caracterizam-se pela
dificuldade de tratamento que pode incluir intervenções cirúrgicas e longos períodos de
antibioticoterapia (GEMMEL et al, 2012 ).
A distribuição desse microrganismo é ampla devido à capacidade de resistência à dessecação
e ao frio, podendo permanecer viável por longos períodos em partículas de poeira. O
S. aureus encontrado na pele ou fossas nasais pode, a partir desses sítios, alcançar outras
regiões da pele e mucosas e caso essas barreiras estejam comprometidas por trauma ou
cirurgia, essa bactéria pode alojar no tecido e provocar uma infecção. A colonização nasal é
assintomática e o indivíduo não desenvolve infecção, mas pode ser veículo de transferência da
bactéria no mecanismo de infecções por contato (SANTOS et al, 2007). Assim, em hospitais,
o hospedeiro assintomático pode ser um paciente, um visitante ou um profissional de saúde,
trazendo riscos para outros pacientes e em especial aos pacientes que fazem diálise,
queimados, diabéticos, HIV positivos, imunossuprimidos e com intervenções cirúrgicas
Figura 2: Causas comuns de infecções associadas a prótese. A) Principais agentes de infecções de
próteses de joelho e quadril. B) Formação do biofilme. (Fonte: Adaptado de GEMMEL et al, 2012)
26
recentes (LOWY, 1998). O S. aureus é o agente mais comum em infecções de pele e tecidos
moles, sendo frequentemente isolado em feridas cirúrgicas infectadas que podem ser focos
para o desenvolvimento de infecções sistêmicas (ROBERT & CHAMBERS, 2005).
As doenças provocadas por S. aureus podem ser decorrentes da invasão direta dos tecidos, de
bacteremia primária ou, exclusivamente, ser devidas as toxinas que a bactéria produz. A
bacteremia pode causar infecções em sítios anatômicos distantes, como endocardites,
osteomielites, abscessos metastáticos em tecidos subcutâneos, pulmões, fígado, rins e cérebro.
A relação de S. aureus com infecções ósseas é devido à produção de adesinas que são
proteínas que permitem a adesão aos componentes da matriz óssea. Além disso, o S. aureus
pode formar biofilmes, na superfície de materiais estranhos ao organismo como cateteres
endovenosos e próteses (Figura 3). As toxinas estafilocócicas são responsáveis pela necrose
epidérmica tóxica (síndrome da pele escaldada) e pela síndrome do choque tóxico. As
enterotoxinas produzidas por S. aureus são responsáveis pelas intoxicações alimentares
(SANTOS et al, 2007; DINGES et al, 2000).
A capacidade de colonização e a patogenicidade de S. aureus são consequências de seus
fatores de virulência que são classificados em 3 categorias: a) fatores relacionados com a
aderência às células do hospedeiro ou à matriz extracelular; b) fatores relacionados com a
evasão da defesa do hospedeiro, como diversas enterotoxinas, toxina da síndrome do choque
tóxico (TSST-1), proteína A, lipases e cápsula; c) fatores relacionados a invasão na célula e
penetração nos tecidos ou adesão a superfícies de cateteres e próteses incluindo toxinas α, β, γ
e δ-hemolisinas (SANTOS et al, 2007) .
Figura 3: Biofilme de S. aureus em infecção de prótese. Setas indicam células
aderidas a superfícies do metal. Micrografia eletrônica (25000x) com barra de
escala 1 µm. (Fonte: TRAMPUZ & ZIMMERLI, 2005).
27
Dessa forma, devido à patogenicidade de S. aureus, a identificação rápida e precisa da
infecção é crucial para o sucesso do tratamento. A erradicação incompleta destes focos pode
provocar reincidência após a interrupção do tratamento, aumentando as taxas de mortalidade.
O diagnóstico destes focos infecciosos é geralmente difícil devido à ausência de sintomas ou
sinais (FIDEL et al, 2010).
O diagnóstico correto é essencial para evitar o uso indiscriminado de antibióticos que podem
levar a seleção de linhagens resistentes de S. aureus como pôde ser observado ao longo das
últimas décadas (LEVY, 2000).
O diagnóstico tardio de infecções associados a linhagens resistentes levam ao aumento do
tempo de hospitalização requerendo um alto custo de internação quando comparado a um
tratamento de uma infecção precoce (SYDNOR & PERL, 2011).
Portanto, é essencial o diagnóstico correto e precoce para que o tratamento seja específico e
eficaz. Para que isto ocorra é imprescindível a pesquisa de novas técnicas diagnósticas.
4.2) Diagnóstico por Cintilografia
O diagnóstico por cintilografia é uma modalidade da Medicina Nuclear que emprega técnica
de imageamento molecular com o uso de radiofármacos. O imageamento molecular permite a
visualização, caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e
molecular em organismos vivos (GOMES et al, 2011). A maior vantagem do imageamento
molecular é a habilidade de caracterizar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos
invasivos e é capaz de realizar um diagnóstico precoce antes mesmo de haver modificações
anatômicas.
A tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) é uma técnica sensível
de imageamento nuclear que fornece uma distribuição espacial 3D de radionuclídeos
emissores de fóton único dentro do corpo do paciente. A detecção dos raios gama é feita com
o uso de uma gama câmara que consiste de um cristal de cintilação, opticamente acoplado a
um conjunto de tubos fotomultiplicadores, que converte os raios gama em sinais elétricos.
Várias imagens em 2D, também chamados de projeções, são adquiridas a partir de múltiplos
ângulos ao redor do paciente, e subsequentemente reconstruídas para gerar imagens
transversais da distribuição interna das moléculas injetadas. O SPECT detecta os raios gama
diretamente no local de acumulação dos traçadores. A técnica SPECT utiliza radionuclídeos
com energias na faixa de 30 e 300 Kev. Os radionuclídeos comumente utilizados em SPECT
28
são 99m
Tc, 111
In, 131
I, 123
I, 67
Ga. O 99m
Tc é o mais utilizado deles devido suas propriedades
físicas (GOMES et al, 2011).
4.2.1) Tecnécio-99m (99m
Tc)
O 99m
Tc possui uma meia vida curta de 6h, sendo emissor gama puro com energia de 140
Kev, características que contribuem para níveis reduzidos de radiação ao paciente. Além
disso, o 99m
Tc é facilmente obtido em gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m que apresenta
um baixo custo de obtenção (Figura 4) (WELCH & REDVANLY, 2003).
O gerador Molibdênio-99/Tecnécio-99m consiste em uma coluna de alumina em que o 99
Mo
encontra-se adsorvido. O 99
Mo possui meia vida de 66 h decai por decaimento beta (β) em
99mTc (Figura 5). O
99mTc não possui afinidade pela coluna de alumina e então é eluído com
uma solução estéril de cloreto de sódio 0,9% na forma de pertecnetato de sódio (Na99m
TcO4).
Figura 5: Diagrama do decaimento do 99
Mo em 99m
Tc. (Fonte: MARQUES et al, 2001)
Figura 4: Gerador 99
Mo/99m
Tc. (Fonte: OLIVEIRA et al, 2006)
29
O tecnécio é um metal de transição da família VIIB com número atômico igual a 43. Não há
na natureza um isótopo de tecnécio estável. O estado ground do tecnécio, 99
Tc, possui meia
vida de 2,5 x105 anos. O tecnécio pode existir em 8 estados de oxidação (-1 a +7). Os
estados +7 e +4 são os estados mais estáveis e existem em óxidos, sulfetos, haletos e
pertecnetatos. Os estados de oxidação mais baixos (-1, +1, +2, +3) são estabilizados na
complexação com ligantes. O número de coordenação do complexo-99m
Tc pode variar de 4 a
9 (ZOLLE, 2007).
O tecnécio obtido no gerador na forma de íon pertecnetato (99m
TcO4- ) apresenta o estado de
oxidação igual a +7 e portanto, não é uma espécie reativa. Assim, é necessário reduzir o
estado de oxidação do tecnécio para que se possa combinar com uma variedade de grupos
doadores de elétrons como –COO-, -OH
-, -NH2
-, -SH, formando uma ligação covalente
coordenada. Vários agentes redutores podem ser empregados como cloreto estanoso, citrato
de estanho, tartarato de estanho, ácido clorídrico concentrado, sulfato ferroso. Dentre esses
agentes, o cloreto estanoso é o agente redutor mais comumente utilizado (ZOLLE, 2007). O
99mTc é reduzido no estado +4 por cloreto estanoso em meio concentrado de HCl, conforme a
equação abaixo:
O tecnécio reduzido, por sua vez, pode se ligar a molécula de interesse constituindo assim um
radiofármaco. Um radiofármaco é um composto radioativo que apresenta dois componentes:
um radionuclídeo e um fármaco. Pode ser utilizado em diagnóstico e tratamento de doenças.
Em medicina nuclear, 95% dos radiofármacos são usados em diagnóstico (ZOLLE, 2007). Os
radiofármacos possuem mínimo efeito farmacológico, pois é utilizado em quantidades traços,
sendo também chamados de radiotraçadores. Os radiofármacos administrados em humanos
devem ser estéreis e livre de pirogênios (SAHA, 2010).
4.2.2) Características ideais de um radiofármaco
Um radiofármaco ideal deve ser produzido facilmente, deve ser de baixo custo e prontamente
disponível em uma instalação de medicina nuclear. O radionuclídeo deve apresentar uma
baixa meia vida que não deve ser maior que o tempo necessário para a execução do estudo.
Além disso, o radionuclídeo com finalidade de diagnóstico não deve emitir partículas α e β,
pois essas partículas podem causar um dano maior ao tecido que a radiação gama. Um
299m
TcO4- +16H
+ +3Sn
+2 2
99mTc
+4 +3Sn
+4 +8H2O
30
radiofarmáco ideal deve ainda, apresentar uma alta relação alvo/não alvo, rápida depuração
plasmática e ter máxima eficácia no diagnóstico com mínima radiação ao paciente (SAHA,
2010).
4.3) Infecção x Inflamação - Técnicas diagnósticas por imagem
Inicialmente, uma inflamação não é sinônimo de infecção. A inflamação é uma resposta do
organismo a uma lesão, seja ela causada por bactérias, traumas, agentes químicos, calor ou
qualquer outro fenômeno. Já a infecção é causada estritamente por um patógeno (vírus,
bactérias, fungos, etc). Uma infecção é comumente acompanhada por uma inflamação aguda
que dura cerca de horas a dias, permanecendo até que seja eliminado o organismo patogênico
(SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
A inflamação caracteriza-se por dilatação dos vasos sanguíneos locais; aumento da
permeabilidade dos capilares, permitindo a saída de grande quantidade de líquido para os
espaços intersticiais; migração de grande quantidade de granulócitos e monócitos para os
tecidos. Dentre os agentes causadores dessas reações estão a histamina, bradicinina,
serotonina, prostaglandinas, diversos produtos do sistema do complemento (GUYTON &
HALL, 2006).
Os macrófagos são a primeira linha de defesa inata contra a infecção e quando ativados pelos
produtos da infecção e da inflamação deixam de ser sésseis e se soltam de suas fixações e
passam a ser móveis, sendo então mobilizados aos locais necessários. A segunda linha de
defesa são os neutrófilos e dentro da primeira hora após o início da inflamação, grande
número de neutrófilos invadem a área inflamada. Os macrófagos ativados secretam
quimiocinas, como por exemplo, a interleucina-8 (IL-8) que tem o papel de recrutar células
para os locais da infecção. As quimiciocinas não atuam sozinhas no recrutamento celular. O
recrutamento de fagócitos ativados aos locais de infecção é mediado pelas moléculas de
adesão que são induzidas na superfície do endotélio dos vasos sanguíneos locais. Essas
moléculas de adesão por sua vez são induzidas pelas citocinas TNF-α. Entre os exemplos de
moléculas de adesão estão as selectinas e as moléculas de adesão intercelular (ICAMs) que
são induzidas no endotélio ativado promovendo a interação com o leucócito permitindo o
extravasamento destes do interior dos vasos para os locais de infecção. O processo de
migração dos leucócitos para o exterior dos vasos é chamado de diapedese (Figura 6)
(JANEWAY et al, 2002).
31
Os alvos para diagnóstico de infecção e inflamação são: a) os patógenos; b) macromoléculas
que acumulam nos tecidos inflamados; c) os leucócitos e granulócitos; d) células endoteliais
ativadas, citocinas e mediadores do processo (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
Diversas técnicas podem ser utilizadas em diagnóstico por imagem de infecções. Técnicas
radiológicas de imagem como o ultrassom, tomografia computadorizada e ressonância
magnética possuem uma alta sensibilidade, mas uma baixa especificidade (SIGNORE &
GLAUDEMANS, 2011). Para o diagnóstico de infecções em próteses de joelho e quadril,
radiografias simples não são sensíveis nem específicas, não conseguindo diferenciar infecção
de inflamação. As técnicas de tomografia computadorizada e ressonância magnética em
diagnóstico de infecções de próteses de joelho e quadril têm valor limitado, pois ocorre a
formação de artefatos devido à presença dos implantes metálicos (GEMMEL et al, 2012).
As técnicas de medicina nuclear, ao contrário, permitem detectar alterações fisiopatológicas
precoces antes que haja alterações anatômicas, características importantes para o diagnóstico
de infecções, pois é crucial um diagnóstico precoce para a sobrevida dos pacientes. Além
Figura 6: Mecanismo da Resposta Inflamatória. A ativação de citocinas induzem a expressão
de moléculas de adesão no endotélio (selectinas e integrina-ICAM). Os neutrófilos se unem
então ao endotélio por intermédio das moléculas de adesão permitindo o extrasavamento
destes do interior dos vasos para os locais de infecção por diapedese. Os macrófagos ativados
secretam quimiocinas que tem o papel de recrutar células para os locais de infecção.
Disponível em: http://musclegeek.wordpress.com/2012/02/09/what-the-heck-is-inflammation-
and-how-does-it-affect-me/
32
disso, as técnicas de Medicina Nuclear permitem avaliar a eficácia da terapia, monitorando a
evolução de cura dos pacientes e possíveis reincidências (SIGNORE & GLAUDEMANS,
2011).
Mesmo com as vantagens das técnicas da Medicina Nuclear sobre as técnicas radiológicas no
diagnóstico de infecções, muitos dos radiofármacos utilizados atualmente não são capazes de
diferenciar processos sépticos de assépticos e, de forma geral, não são capazes de identificar o
agente responsável pela infecção. Assim, há a necessidade de desenvolvimento de novos
radiofarmácos específicos e capazes de diagnosticar o agente responsável, como bactérias e
fungos.
4.3.1) Radiofármacos atualmente utilizados em diagnóstico de infecção
4.3.1.1) 67
Ga-citrato
O 67
Ga-citrato se liga na forma iônica a transferrina plasmática que é uma glicoproteína que
transporta o íon ferro. Ele utiliza os receptores de transferrina (CD71) para acessar a célula e
depois se torna altamente estável dentro dela. O aumento do fluxo sanguíneo e da
permeabilidade vascular resulta no acúmulo de transferrina ligada ao 67
Ga. O 67
Ga também se
liga a lactoferrina que está presente em altas concentrações nos focos infecciosos. O
radiofármaco 67
Ga-citrato apresenta baixa especificidade, pois acumula tanto em áreas
inflamadas quanto infectadas e apresenta uma longa meia vida (78 h) e alta energia gama,
características desfavoráveis para a imagem cintilográfica além de causar um aumento da
dose absorvida pelo paciente. A melhor relação alvo/não alvo é obtida em 48-72h
(BEKERMAN et al, 1984).
4.3.1.2) Citocinas e Quimiocinas
Citocinas são proteínas e glicoproteínas com importante papel no controle homeostático do
sistema imune. Elas podem atuar de forma autócrina, afetando o comportamento das células
que liberam as citocinas, ou de forma parácrina, afetando o comportamento de células
adjacentes. As citocinas liberadas pelos macrófagos ativados são interleucina-1 (IL-1),
interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12), TNF-α e a quimiocina interleucina-8 (IL8). As
quimiocinas são uma classe de citocinas que apresentam propriedades quimioatraentes,
induzindo células com receptores apropriados a migrarem através do gradiente de quimiocina.
33
As quimiocinas são liberadas por fagócitos e atuam como quimioatraentes para leucócitos
recrutando-os para os locais de infecção.
Durante um processo infeccioso ou inflamatório ocorre um aumento na expressão de
citocinas. A IL-1 (pró-inflamatória) e a IL-8 marcadas com 123
I e 99m-
Tc, apresentaram rápida
depuração plasmática e alta afinidade por receptores específicos. Porém, não foram
específicas para a infecção, pois não distinguiram inflamação de infecção. A 123
I- IL-1
acumulou em áreas infectadas, porém, apresentou efeitos colaterais de cefaleia e hipotensão
mesmo em baixas doses, impedindo aplicações clínicas em seres humanos (BARRERA et al,
1998). Um receptor antagonista IL-1 radiomarcado (IL-1ra) foi desenvolvido com a mesma
afinidade para receptores IL-1, mas sem atividade biológica. Com o IL-1ra marcado com 123
I
pôde-se observar a captação em focos infecciosos, mas a captação foi similar aos agentes não
específicos marcados (VAN DER LAKEN et al, 1998).
4.3.1.3) Peptídeos antimicrobianos
Os peptídeos antimicrobianos são produzidos por fagócitos, células endoteliais e outros tipos
celulares, sendo um importante componente do sistema imune inato. A expressão desses
peptídeos é induzida em consequência ao contato com microrganismos ou com produtos da
atividade microbiana, como lipopolissacarídeos ou citocinas pró-inflamatória. Vários
peptídeos antimicrobianos têm sido investigado como radiofármacos como a lactoferrina
humana (hLF), fragmento do peptídeo ubiquicidina (UBI 29-41), peptídeo neutrofílico
humano (HNP 1-3), peptídeos bacteriófagos e peptídeos sintéticos (SIGNORE &
GLAUDEMANS, 2011).
O fragmento do peptídeo ubiquicidina (UBI 29-41) marcado com 99m
Tc ligou-se
preferencialmente, a bactérias e fungos em ensaios in vitro e acumulou em locais de infecção
em ensaios com animais experimentais, mostrando uma rápida depuração renal, mínima
excreção hepatobiliar e capacidade de detectar focos infecciosos em humanos. O agente foi
rapidamente eliminado, mas a captação nas lesões infecciosas e a relação alvo/não alvo foram
baixas (MENDELEZ et al, 2004).
4.3.1.4) Vitaminas
As avidinas são uma família de proteínas presentes nos ovos de aves, anfíbios e répteis. A
biotina (vitamina B7) é um composto de baixo peso molecular que se liga a avidina com alta
afinidade. A avidina/111
In-biotina é um radiofármaco não específico que se acumula em locais
34
com aumento da permeabilidade vascular. A avidina é injetada previamente e após 4 h a
biotina marcada é injetada por injeção intravenosa. A biotina irá, portanto se ligar a avidina
nos locais onde houve acúmulo devido ao aumento da permeabilidade vascular. O
radiofármaco avidina/111
In-biotina é rapidamente eliminado pelos rins e apresenta baixa
captação em tecidos normais. A relação alvo/não alvo é boa e podem-se obter imagens em
menor tempo, mas não é um radiofármaco específico para infecção (RUSCKOWSKI et al,
1992).
4.3.1.5) Anticorpos monoclonais (mAbs) antigranulócitos
A utilização de mAbs para receptores de superfície em granulócitos permite o estudo direto
dessas células in vivo. No entanto, estudos têm demonstrado que somente a menor
porcentagem do anticorpo injetado realmente liga diretamente às células. A maior parte
concentra na área infectada por ligações não específicas como resultado do aumento da
permeabilidade (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
Resultados controversos foram obtidos utilizando 99m
Tc-suleomab (LeukoScan®). BECKER
et al (1994), obteve uma cintilografia com o uso de LeukoScan® que mostrou rápida
localização em infecções ósseas e de tecidos moles. Em outros estudos, no entanto, foram
apurados menor especificidade para diagnóstico de infecções músculo-esqueléticas que o
imageamento com leucócitos marcados (GRATZ et al, 2003). HARWOOD et al (1999),
realizaram um estudo com pacientes diabéticos com úlceras no pé, no qual o 99m
Tc-suleomab
mostrou alta sensibilidade (91%), mas baixa especificidade (56%).
O 99m
Tc-besilesomab (Scintimun®) têm sido utilizado no estudo de endocardite, abscesso
pulmonar, infecção em pé diabético e em infecções de prótese de joelho e quadril. Infecções
ósseas periféricas podem ser visualizadas, mas a sensibilidade diminui quando a infecção é
localizada próxima a coluna, por causa da absorção fisiológica da medula (PELTIER et al,
1993). Assim, o 99m
Tc-besilesomab é menos adequado para diagnóstico de osteomielite
vertebral. Para doenças inflamatórias na medula esse método é menos acurado que leucócitos
radiomarcados devido a captação não específica da medula.
4.3.1.6) Imunoglobulina G policlonal humana
A Imunoglobulina G policlonal humana (HIG) é um anticorpo IgG específico não antigênico
que pode ser marcado com 99m
Tc ou 111
In por Kits diagnósticos comercialmente disponíveis.
O mecanismo da captação em áreas infectadas não está completamente elucidado, uma vez
35
que se acumula em focos de infecção ao acaso. O acúmulo parece ser principalmente,
resultado do aumento da permeabilidade vascular, não sendo assim, específico para infecção
(SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
4.3.1.7) 99m
Tc-albumina nanocolóide
Nanocolóides são partículas pequenas de 30-80 nm de diâmetro derivados da albumina. Após
entrarem nas áreas infectadas por extravasamento nos tecidos, eles acumulam por fagocitose
no interior dos macrófagos no sistema reticulo-endotelial. Os nanocolóides são caracterizados
por rápida depuração sanguínea e uma relação alvo/não alvo satisfatória. É facilmente
produzido e de baixo custo, mas não é específico para infecção (LIBERATORE et al, 1992).
4.3.1.8) 18
F-Fluoro-desoxi-glicose (18
F-FDG)
O 18
F-FDG é um análogo da glicose que apresenta o 18
F no lugar do grupo hidroxila do
carbono 2. O 18
F-FDG é fosforilado, pela hexoquinase, e então é transportado para dentro da
célula. Entretanto, em contraste com a glicose, o metabolismo não prossegue além da
fosforilação, devido ao grupo (-OH) ser indispensável na etapa seguinte. Assim, o 18
F-FDG-
6P acumula na célula proporcionalmente a atividade glicolítica, evidenciando o metabolismo
celular. O 18
F-FDG é comumente utilizado em diagnóstico tumoral, pois as áreas neoplásicas
habitualmente têm um metabolismo mais intenso (WELCH & REDVANLY, 2003).
No entanto, o 18
F-FDG pode ser utilizado em diagnóstico de infecção devido à alta absorção
por granulócitos ativados. O 18
F tem uma meia vida de 110 minutos e, portanto é adequado
para imagem após 60 minutos de injeção. Contudo, o 18
F-FDG não é um traçador específico
porque ele evidencia alta atividade glicolítica de qualquer célula e pode, portanto fornecer
resultados falso-positivos. Outra desvantagem é o alto custo e disponibilidade limitada
(SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
4.3.1.9) Antibióticos radiomarcados
Antibióticos radiomarcados apresentam a vantagem de serem radiofármacos específicos para
infecção, pois o alvo desses radiofármacos são bactérias e assim poderiam diferenciar
infecção bacteriana de inflamação estéril.
O agente mais utilizado é o 99m
Tc-ciprofloxacina (Infecton ®), sendo um antibiótico de amplo
espectro do grupo das fluoroquinolonas. Esse antibiótico se aplica tanto para bactérias Gram-
positivas quanto Gram-negativas inibindo a síntese de DNA pela ligação à DNA girase. A
36
99mTc-ciprofloxacina é excretada pelos rins e possui baixa absorção intestinal. Em um estudo
coordenado pela Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA), a 99m
Tc-ciprofloxacina
mostrou ser bastante sensível e específica a infecções (BRITTON et al, 2002). Alguns anos
depois, sua especificidade foi extensivamente discutida, pois sua capacidade de discriminar
infecção de doença asséptica foi duvidosa (SOLANKI et al, 2003). Em geral, não há provas
convincentes de sua eficácia.
Outros antibióticos têm sido marcados com 99m
Tc, como alafosfalina, cefoperzaona,
ceftizoxima, ceftriaxona, enrofloxacina, pefloxacina, norfloxacina, canamicina, maioria da
classe das quinolonas (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
4.3.1.10) Agentes antifúngicos radiomarcados
Seguindo a mesma abordagem de antibióticos marcados, novos traçadores têm sido propostos
para a visualização específica de infecções fúngicas. O fluconazol marcado com 99m
Tc se liga
ao citocromo P450 fúngico, foi desenvolvido para a detecção de C. albicans e Aspergillus
fumigatus em camundongos. Ele acumula preferencialmente em infecções por C. albicans,
enquanto que a acumulação em bactérias, A. fumigatus e inflamação estéril foi
significativamente menor em estudos in vivo (LUPETTI et al, 2002).
A quitinase é uma enzima que hidrolisa a ligação glicosídica da quitina. Essa enzima foi
marcada com 123
I para a detecção de células fúngicas. A captação parece estar correlacionada
com o número de células viáveis, mas os radioligantes foram desalogenados, resultando em
alta captação da tireóide e estômago (GEMMEL et al, 2009).
4.3.1.11) Leucócitos radiomarcados
Leucócitos radiomarcados ainda são considerados o padrão ouro em medicina nuclear para o
diagnóstico de infecções e inflamação aguda. Pertencendo ao grupo de leucócitos estão os
neutrófilos correspondendo a 59% do grupo, linfócitos (34%), monócitos (4%), eosinófilos
(3%) e basófilos (0,5%).
A técnica de marcação ex vivo de leucócitos radiomarcados com 99m
Tc foi desenvolvida em
1976. Uma amostra de sangue de 50 mL é coletada do paciente e os leucócitos são separados
das células vermelhas em condições in vitro. Esses leucócitos são então marcados com 99m
Tc-
exametazina (HMPAO) ou com 111
In-oxina e são reinjetados no paciente. Os leucócitos
radiomarcados são caracterizados por alta especificidade, pois só acumulam em consequência
37
da migração ativa em áreas inflamadas e permanecem no local em casos de infecção
(SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).
Imagens tardias (24 h) de leucócitos radiomarcados aumentam a acurácia do diagnóstico,
sendo possível a diferenciação de infecção de inflamação asséptica. O 111
In é indicado para
imagens tardias por apresentar uma meia vida mais longa de 67 h e energia de 173 e 247 Kev,
enquanto o 99m
Tc apresenta uma meia vida curta de 6 h com energia de 140 Kev (DATZ,
1994).
A imagem feita após 24 h da injeção de leucócitos marcados com 111
In-oxina possui uma
sensibilidade para infecção de 95%, enquanto que em imagens de 4 h a sensibilidade é de
33%. A captação é mais intensa em imagens de 24 h do que em imagens de 4 h (DATZ,
1994).
Infecções crônicas apresentam um infiltrado de células mononucleares como macrófagos e
linfócitos. Vários estudos demonstram que a sensibilidade do diagnóstico de leucócitos
marcados diminui para infecções crônicas. Entretanto, em um estudo feito por DATZ &
THORNE (1986), com 155 pacientes, sendo que 89 apresentavam infecção crônica (mais de
duas semanas) a sensibilidade foi de 90% para infecções agudas e 86% para infecções
crônicas. Portanto, essas diferenças não são estatisticamente significativas.
Em diagnóstico de infecções de prótese de joelho e quadril, LARIKKA et al (2001) mostrou
que a sensibilidade e a especificidade aumentam em imagens tardias com leucócitos marcados
com 99m
Tc, conforme os dados da tabela abaixo:
Tabela 1: Sensibilidade e Especificidade em diagnóstico de próteses de joelho e quadril
utilizando imagens de leucócitos marcados com 99m
Tc.
Imagem de 4 h Imagem tardia (24 h)
Prótese Quadril Joelho Quadril Joelho
Sensibilidade 50% 87% 83% 100%
Especificidade 90% 77% 100% 82%
38
Além de ocorrer um aumento na especificidade e sensibilidade, a imagem apresenta maior
reprodutibilidade em imagens tardias no diagnóstico de infecções de prótese de joelho e
quadril, conforme pode ser observado na Figura 7.
Apesar da acurácia no diagnóstico com a utilização de leucócitos radiomarcados, a preparação
do radiofármaco é laboriosa, devendo ser realizada em condições estéreis, envolvendo um
procedimento complicado e demorado que leva aproximadamente 3 h de preparo por
profissionais treinados. Além disso, a manipulação de sangue potencialmente contaminado
pode ser perigosa para técnicos envolvidos no preparo e pacientes.
4.3.2) Considerações
Muitos dos radiofármacos atualmente disponíveis para o diagnóstico de imagem de infecções
não são específicos para a infecção, como 67
Ga-citrato, citocinas e quimiocinas marcadas,
18F-FDG, vitaminas e
99mTc-albumina nanocolóide.
Os leucócitos e peptídeos antimicrobianos marcados são específicos para a infecção, mas não
são capazes de identificar o agente responsável pela infecção. Os antibióticos e agentes
antifúngicos marcados são capazes de identificar o agente responsável pela infecção, mas essa
classe de radiofármacos apresenta ainda controvérsias no diagnóstico, pois a especificidade
desses radiofármacos é amplamente discutida. Portanto, a pesquisa de novos radiofármacos
capazes de diferenciar infecção de inflamação e de identificar o microrganismo causador da
infecção é uma necessidade premente. Aptâmeros poderiam dar uma contribuição
significativa para o diagnóstico de infecções, devido as suas características de alta
Figura 7: Prótese direita de quadril infectada. Imagens de leucócitos
marcados com 99m
Tc nos tempos de 4 h (esquerda) e 24 h (direita). Setas
indicam a captação de leucócitos que pode ser melhor visualizada na
imagem de 24 h. (Fonte: GEMMEL et al, 2012).
39
especificidade para o seu alvo, podendo assim diagnosticar uma infecção bacteriana
específica, como a identificação de infecções causadas por S.aureus proposta neste projeto.
4.4) Aptâmeros
Aptâmeros são oligonucleotídeos que apresentam alta especificidade e afinidade para uma
determinada molécula alvo. O nome (do inglês, “aptamers”) deriva do latim “aptus”, ou seja,
apto para ligar-se (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990). Eles podem se ligar a uma série de
moléculas alvo como proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, drogas, vitaminas,
compostos orgânicos e inorgânicos (YOU et al, 2003). Os aptâmeros podem ser de DNA fita
simples (ssDNA), RNA ou bases modificadas contendo entre 50-100 bases (FERREIRA &
MISSAILIDIS, 2007). Eles formam estruturas tridimensionais caracterizados por lopps,
grampos (do inglês hairpins), triplexos, G-quadruplexos, pseudoknots, caules (do inglês
stems), protuberâncias (do inglês bulges) (Figura 8). Baseados em suas estruturas
tridimensionais, os aptâmeros podem se ligar apropriadamente a uma variedade de alvos. A
ligação do aptâmero ao alvo resulta de compatibilidade estrutural, empilhamento de anéis
aromáticos, interações eletrostáticas e de Van de Waals, ligações de hidrogênio ou a
combinação desses efeitos (STOLTENBURG et al, 2007).
Figura 8: Estruturas de aptâmeros. A) grampo; B) pseudoknot; C) G-quadruplexo;
D) Representação tridimensional do aptâmeros anti-malachita complexado com
seu ligante representado em verde. (Fonte: RANDOM et al, 2013).
40
A afinidade e especificidade dos aptâmeros são comparáveis aos anticorpos monoclonais e
podem ser gerados para uma grande variedade de alvos, incluindo compostos tóxicos e
moléculas não imunogênicas, para as quais anticorpos não podem ser gerados. Além disso, os
aptâmeros são de dez a cem vezes menores que os anticorpos e não são imunogênicos,
características importantes para o desenvolvimento de agentes diagnósticos e terapêuticos
(JAYASENA, 1999; MISSAILIDIS & HARDY, 2009).
O conceito de seleção in vitro de ácidos nucléicos como ligantes a alvos moleculares é
creditado a três grupos de pesquisadores diferentes que publicaram seus achados em 1990.
ROBERTSON & JOYCE (1990) publicaram seus resultados mostrando que é possível mutar
e selecionar a ribozima de Tetrahymena para ter a capacidade de clivar uma sequência de
ssDNA. Após vários ciclos de mutação e amplificação, eles identificaram a primeira
sequência de RNA gerada in vitro capaz de clivar uma molécula de DNA específica
(ROBERTSON & JOYCE, 1990). Após essa publicação, TUERK & GOLD (1990)
publicaram seus dados, mostrando que randomizando oito nucleotídeos de RNA em “stem-
loop” conhecidos por se ligarem a polimerase T4 de bacteriófago, e realizando a seleção para
a ligação nesta proteína, obteve-se em uma sequência de RNA com afinidade aumentada. Esta
foi a primeira publicação que introduziu o termo SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment) (TUERK & GOLD, 1990). Ao mesmo tempo, ELLINGTON E
SZOSTAK (1990) publicaram seus dados com a seleção in vitro de RNA que se ligava a
corantes orgânicos. Ao contrário dos outros grupos, esse trabalho envolveu o uso de uma
biblioteca de RNA completamente aleatória como ponto de partida, que não era baseada em
nenhuma sequência conhecida (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990). Essa abordagem é o que
várias pessoas conhecem como seleção in vitro e o grupo introduziu o termo aptâmero para o
produto dessa seleção. Com esses resultados ficou claro que a técnica SELEX e os aptâmeros
apresentavam grande potencial e uma ampla gama de aplicações (BUNKA et al, 2010).
4.4.1) A Técnica SELEX
Os aptâmeros são obtidos através da técnica SELEX (do inglês “Systematic Evolution of
Ligands by Exponential Enrichment”) (TUERK & GOLD, 1990). A SELEX se inicia com a
obtenção de uma biblioteca de sequências de fita simples de nucleotídeos aleatórios (DNA ou
RNA) como uma diversidade entre 1014
a 1015
sequências diferentes. A biblioteca é
constituída por oligonucleotídeos contendo uma região aleatória (20-80 nucleotídeos)
flanqueada por uma região conservada. A região conservada permite a ligação de iniciadores
41
específicos para uma reação de PCR (do inglês “Polimerase Chain Reaction”)
(STOLTENBURG et al, 2007; BANERJEE & NILSEN-HAMILTON, 2013).
O pool de oligonucleotídeos é incubado com uma molécula alvo na presença de um tampão de
escolha. Durante a incubação uma pequena fração de moléculas tende a se ligar ao alvo. Os
oligonucleotídeos que se ligaram devem ser selecionados do restante da biblioteca através de
uma técnica padrão de separação física. Durante os últimos anos vários autores descreveram
diferentes métodos de separação como eletroforese capilar (MENDONSA & BOWSER,
2004; TANG et al, 2006), citometria de fluxo (DAVIS et al, 1997), centrifugação (RHIE et
al, 2003; HOMANN & GORINGER, 1999), cromatografia de afinidade com a imobilização
do alvo em sepharose ou agarose (LIU & STORMO, 2005; TOMBELLI et al, 2005),
ultrafiltração com filtros de nitrocelulose (BIANCHINI et al, 2001, TUERK & GOLD, 1990).
Após esta etapa, a separação do complexo alvo-aptâmero pode ser feita por diferentes
métodos, como tratamento com calor (STOLTENBURG et al, 2005), adição de uréia, SDS ou
EDTA (BIANCHINI et al, 2001; THEIS et al 2004; WEISS et al, 1997), eluição com ligantes
competidores (BRIDONNEAU et al, 1999). Para a quantificação dos oligonucleotídeos
enriquecidos pode ser utilizado isótopos radioativos (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990; SHI
et al, 2002) ou marcadores fluorescentes (STOLTENBURG et al, 2005; RHIE et al, 2003).
A população de sequências de oligonucleotídeos que se ligaram ao alvo é isolada e
amplificada por PCR para a obtenção de uma nova biblioteca. Esta biblioteca estará
enriquecida com sequências mais aptas para ligação na molécula alvo. Após a reação de PCR
o pool enriquecido está na forma de DNA fita dupla (dsDNA). Se a biblioteca é de RNA deve
ser utilizado a RNA polimerase T7 para a transcrição do dsDNA em RNA. Se a biblioteca é
de DNA pode ser utilizado diferentes métodos como a estreptavidina/biotina em que a biotina
é adicionada a fita não desejada e em seguida utiliza-se a eletroforese para distinguir ambas as
fitas. Outro método é a utilização de primers com modificações na fita indesejada para criar
diferenças de tamanho entre as fitas. Pode ser utilizado um primer com a adição de uma ribose
na ponta 3´(riboU) ou um primer com um espaçador de hexaetilenoglicol (HEGL) e uma
cauda poli A. A diferença de tamanho é visível em eletroforese e então a banda desejada é
cortada e processada (STOLTENBURG et al, 2007).
O pool enriquecido é incubado novamente com o alvo havendo assim, outros ciclos de seleção
e amplificação até que se obtenha um ligante específico de alta afinidade. Para a maioria dos
alvos, o enriquecimento é obtido entre 8 a 15 ciclos (Figura 9). Quando o ponto de saturação
42
for atingido, ou seja, a realização de novos ciclos de seleção e amplificação não aumenta a
afinidade, os aptâmeros obtidos devem ser clonados em vetores bacterianos e sequenciados
para posterior caracterização (TUERK & GOLD, 1990; MISSAILIDIS & PERKINS 2007).
As sequências individuais são então pesquisadas para se determinar a habilidade de se ligar à
molécula alvo. Normalmente, cinquenta ou mais sequências de aptâmeros podem ser
analisadas por alinhamentos de sequência em programas na internet como o CLUSTAL W.
Esta técnica permite identificar sequências homólogas separando os aptâmeros em grupos.
Padrões de sequência e regiões altamente conservadas são indicativos de locais envolvidos na
ligação com o alvo. A análise da estrutura secundária também fornece informações relevantes
e podem ser obtidas utilizando o programa mfold que também pode ser acessado pela internet.
O programa pode determinar que regiões consenso estão normalmente localizadas em stem-
loops, G-quadruplexos, psedoknots (STOLTENBURG et al, 2007).
Uma vez identificada uma sequência de interesse esta poderá ser sintetizada quimicamente.
Após a síntese, estudos de ligação para a determinação da especificidade e afinidade do
aptâmero devem ser feitos e a determinação do Kd (constante de dissociação) é primordial.
A afinidade dos oligonucleotídeos para os seus alvos podem ser influenciados pela
estringência das condições selecionadas. A estringência é aumentada progressivamente no
curso do processo SELEX. Além disso, pode ser atingida reduzindo a concentração do alvo
Figura 9: Esquema da metodologia SELEX. (Fonte: Modificado de LEE et al, 2010).
43
nos últimos ciclos da SELEX ou modificando as condições de ligação e lavagem (composição
do tampão, volume e tempo de incubação). Os aptâmeros selecionados podem ser submetidos
a modificações pós-SELEX com a finalidade de aumentar a estabilidade (STOLTENBURG et
al, 2007).
A técnica SELEX apresenta particularidades quando é feita a partir de uma biblioteca de
RNA. O processo de amplificação envolve a transcrição reversa de sequências de RNA em
DNA seguidas de PCR (RT-PCR). Um primer na ponta 5´seguido da sequência do promotor
T7 e um primer reverso é necessário para converter a biblioteca de ssDNA em biblioteca de
dsDNA por PCR. O DNA fita dupla (dsDNA) gerado é então submetido a transcrição in vitro
pela RNA polimerase T7 que regenera o RNA original em grande quantidade (Figura 10)
(YOU et al, 2003).
Figura 10: Diagrama da metodologia SELEX.
44
4.4.2) Alvos para SELEX
No processo da SELEX podem ser utilizados diferentes tipos de alvos como moléculas
orgânicas e inorgânicas, peptídeos, proteínas, carboidratos, antibióticos, alvos complexos
como mistura de alvos, células inteiras e organismos (STOLTENBURG et al, 2007).
Em uma revisão da literatura STOLTENBURG et al (2007) relata os alvos já descritos para a
obtenção de aptâmeros. Dentre os alvos já utilizados têm-se como exemplo, compostos
inorgânicos como Zn+2
e Ni+2
(CIESIOLKA et al, 1995 ; HOFMANN et al, 1997), pequenas
moléculas orgânicas como corantes orgânicos e dopamina (ELLINGTON & SZOSTAK,
1990; MANNIRONI et al, 1997), nucleotídeos e derivados como adenina, ATP e cAMP
(MELI et al, 2002; SASSANFAR & SZOSTAK, 1993; SAZANI et al 2004; KOIZUMI &
BREAKER, 2000), cofatores como cianocolabamina, riboflavina, coenzima A, FAD, NAD
(LORSCH & SZOSTAK, 1994; LAUHON & SZOSTAK, 1995; SARAN et al, 2003;
BURGSTALLER & FAMULOK, 1994; LAUHON & SZOSTAK, 1995), ácidos nucléicos
como elemento de RNA de TAR de HIV-1, RNA 5S de E. coli (BOIZIAU et al, 1999; KO et
al, 2001), aminoácidos como L-arginina, L- citrulina, L-valina (GEIGER et al, 1996;
FAMULOK, 1994; MAJERFELD & YARUS, 1994), carboidratos como a celobiose (YANG
et al, 1998), antibióticos como canamicina A, estreptomicina, neomicina, tetraciclina,
cloranfenicol (LATO et al, 1995; WALLACE & SCHROEDER, 1998; WALLIS et al, 1995;
BERENS et al 2001; BURKE et al, 1997), peptídeos e proteínas como a T4 DNA polimerase,
α-trombina, interferon-γ, VEGF, HIV-1 RT, vasopressina, marcador tumoral MUC-1, L-
selectina (TUERK & GOLD, 1990; BOCK et al, 1992; KUBIK et al, 1997; JELLINEK et al,
1994; TUERK et al, 1992; WILLIAMS et al, 1997; FERREIRA et al, 2006; HICKE et al,
1996), estruturas complexas como esporos de anthrax (BRUNO & KIEL, 1999).
A variedade de diferentes alvos usados nos experimentos com SELEX implica que a seleção
de aptâmeros é possível, virtualmente, para qualquer alvo. No entanto, há alguns pré-
requisitos para que o alvo em potencial selecione aptâmeros com alta especificidade e
afinidade. As moléculas do alvo devem estar presentes em quantidade suficiente e com alta
pureza. Isto ajuda a minimizar o enriquecimento de oligonucleotídeos com ligações
inespecíficas e aumenta a especificidade da seleção (STOLTENBURG et al, 2007).
A seleção de aptâmeros é facilitada por alvos que apresentam grupos carregados
positivamente (ex: grupo amino), presença de grupos doadores e aceptores de ligação de
hidrogênio e grupos planares (ex: compostos aromáticos). A seleção de aptâmeros é mais
45
difícil para alvos com caráter hidrofóbico e com grupos carregados negativamente (ex: grupo
fosfato) (STOLTENBURG et al, 2007).
Os aptâmeros ligam aos seus alvos por uma combinação de complementariedade na forma,
interações de emparelhamento entre compostos aromáticos e as nucleobases de aptâmeros,
interações eletrostáticas entre grupos carregados ou ligações de hidrogênio. Na presença do
alvo e na formação do complexo, os aptâmeros sofrem mudanças conformacionais
adaptativas. O enovelamento desses em estruturas tridimensionais permite aos aptâmeros
encapsular completamente pequenas moléculas-alvo com a geração de uma bolsa de ligação
específica. Em alvos com alto peso molecular como proteínas, diferentes subestruturas na
superfície molecular estão envolvidas na ligação do aptâmero como, por exemplo, as cadeias
laterais de aminoácidos que são responsáveis pelas ligações de hidrogênio (RANDOM et al,
2013).
4.4.3) A técnica SELEX para células (CELL SELEX)
Os aptâmeros selecionados pela técnica SELEX in vitro descrita anteriormente são obtidos
contra um alvo purificado. A utilização de alvos purificados apresenta a vantagem de alcançar
facilmente enriquecimento durante o processo de seleção se o alvo assume uma conformação
estável. No entanto, se os alvos estão presentes em estado modificado, em conformação não
nativa, ou se o alvo é mascarado em um contexto fisiológico como uma modificação pós-
traducional, os aptâmeros podem não reconhecer estes alvos (YE et al, 2012). Um exemplo
dessa situação é um aptâmero que foi selecionado contra o ectodomínio não glicosilado
EGFRvIII de Escherichia coli. Esse aptâmero mostrou alta afinidade e especificidade em
condições in vitro, mas não foi capaz de se ligar em EGFRvIII expresso na superfície de
células eucarióticas, possivelmente devido a modificações pós-traducionais (LIU et al, 2009).
A SELEX para células (CELL SELEX) foi desenvolvida para evitar essa desvantagem de
selecionar aptâmeros contra alvos em conformação não nativa. Assim, os aptâmeros
selecionados usando células inteiras serão capazes de se ligarem em alvos com conformação
nativa, mostrando, portanto um grande potencial em diagnóstico de células específicas e
terapia (KONG & BYUN, 2013).
Para gerar aptâmeros contra células inteiras, devem-se utilizar células alvo (seleção positiva) e
células não alvo (seleção negativa) no processo. Antes da incubação com o alvo, as células
são lavadas para a remoção do meio de cultura. Após a lavagem, as células são incubadas com
46
o pool de oligonucleotídeos em um shaker por um tempo e temperatura específicos. Os
aptâmeros que não se ligaram são descartados e os que se ligaram são eluídos por
desnaturação por calor por 15 minutos à 95°C e amplificados por PCR. As células não alvo,
que são utilizadas como controle negativo, são incubadas com esse pool amplificado e as
sequências que não se ligaram são separadas por centrifugação e amplificadas por PCR (YE et
al, 2012). Novos ciclos são realizados até que se obtenham aptâmeros com alta afinidade e
especificidade (Figura11).
Diferentes alvos já foram descritos em CELL-SELEX para a obtenção de aptâmeros. YE et al,
(2012), em uma revisão da literatura menciona alguns desses alvos, como células de
glioblastoma da linhagem U251 (DANIELS et al, 2003), células endoteliais da linhagem
YPEN-1 (BLANK et al, 2001)), células de linfoma Burkitt da linhagem Ramos
(MALLIKARATCHY et al, 2007), células T de leucemia linfoblástica CCRF-CEM
(SHANGGUAN et al, 2008). SHOJI OHUCHI (2012), em uma revisão de literatura,
menciona outros alvos como Trypanosoma brucei (HOMANN & GORINGER, 1999),
Trypanosoma cruzi (ULRICH et al, 2002), células hepáticas tumorais (MI et al, 2010),
células B humanas de leucemia (WU et al, 2003), células tronco de camundongo (GUO et al,
2007).
Figura 11: Esquema da metodologia CELL-SELEX com o passo de seleção negativa.
(Fonte: Modificado de SHOJI OHUCHI, 2012).
47
4.4.4) Propriedades dos aptâmeros
Os aptâmeros apresentam pequeno tamanho (aproximadamente 1-2 nm), usualmente com
menos de 100 nucleotídeos de extensão e com uma média de peso molecular de 10 KDa,
podendo variar de 7.5-32 KDa, enquanto que os anticorpos apresentam um tamanho bem
maior, de aproximadamente 10 nm e 155 KDa (JAMES W., 2000; LEE J. et al, 2010). Os
aptâmeros são estáveis à temperatura ambiente, podendo ser estocados e transportados a essa
temperatura (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007).
Os aptâmeros apresentam alta afinidade para os seus alvos (RAY et al, 2013). A afinidade de
ligação entre um ligante e um receptor pode ser expressa pela constante de dissociação (Kd)
para um receptor. A constante de dissociação é definida como a concentração necessária de
mensageiro para que a metade dos receptores da superfície da célula esteja ocupada pelo
ligante. Assim, receptores com alta afinidade tem uma constante de dissociação baixa e
receptores com baixa afinidade tem constante de dissociação alta (MOYES C. & SCULTE,
2010). A constante de dissociação no equilíbrio (kd) dos aptâmeros varia entre poucos
picomoles por litro até no máximo poucos nanomoles por litro. A afinidade destas moléculas
por alvos específicos chega a ser maior do que as apresentadas pelos anticorpos monoclonais
(MISSAILIDIS & PERKINS, 2007).
Aptâmeros para aminoácidos como citrulina e arginina apresentam afinidade de 0.3 a 65 µM,
aptâmeros para ATP e xantina são de 6 e 3,3 µM respectivamente, para dopamina e vitamina
B12 são de 2.8 µM e 90 nM respectivamente. Aptâmeros para ácidos nucléicos tem afinidades
na faixa de nanomolar como, por exemplo, o aptâmero para a integrase retroviral que
apresenta afinidade na faixa de 10-800 nM e o aptâmero para a transcriptase reversa que
apresenta afinidade na faixa de 0,3-20 nM. Afinidades na faixa nanomolar e subnanomolar
são encontradas em aptâmeros para proteínas como, por exemplo, o aptâmero para trombina
com afinidade de 25 nM, VEGF com afinidade de aproximadamente 100 pM, fator de
crescimento de queratinócito com afinidade de aproximadamente 1 pM (JAMES, 2000).
Os aptâmeros apresentam alta especificidade para os seus alvos. Diferentes enzimas com
atividades semelhantes podem ser distinguidas como, por exemplo, a α-trombina pode ser
diferenciada da γ-trombina (PABORSKY et al, 1993) e duas isozimas de proteína quinase C
diferenciadas em apenas 23 resíduos podem ser distinguidas (CONRAD et al, 1994). Além
disso, os aptâmeros podem identificar pequenas modificações estruturais em moléculas alvos,
tais como, grupos metil (BRIDONNEAU et al, 1999), hidroxil (MANNIRONI et al, 1997),
48
D- ou L-enantiomeros (GEIGER et al, 1996). Moléculas pequenas, como dopamina
(MANNIRONI et al, 1997), aminoácidos (GEIGER et al, 1996), antibióticos (WALLACE &
SCHOEDER, 1998 ), nucleotídeos (HALLER & SARNOW, 1997), peptídeos (WILLIANS et
al, 1997), cofatores (WILSON & SZOSTAK, 1998) e mesmo íons metálicos (HOFMANN et
al, 1997) podem ser reconhecidos por aptâmeros. Estas propriedades capacitam os aptâmeros
como um potencial substituto para os anticorpos monoclonais, pois apresentam baixo custo de
produção quando comparados aos anticorpos monoclonais, por serem facilmente produzidos
em condições in vitro, enquanto que a produção dos anticorpos é laboriosa requerendo
condições in vivo. (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007). Além disso, os aptâmeros não são
imunogênicos, apresentam rápida depuração por via renal, são bem menores que os anticorpos
e não são sensíveis a temperatura como os anticorpos. A síntese dos aptâmeros é feita com
extrema precisão e reprodutibilidade não havendo variações entre os lotes, enquanto que a
síntese dos anticorpos pode haver variações (YOU et al, 2003).
Os aptâmeros podem ser modificados quimicamente para se tornar mais resistentes a ação de
nucleases, normalmente encontradas nos fluídos biológicos. Uma modificação comumente
usada é a utilização de pirimidinas com substituição de amina (NH2) ou flúor (F) na posição
2’ da ribose ou desoxirribose. Estes nucleotídeos modificados são substratos das DNA
polimerases usadas em PCR e, portanto não comprometem o processo da SELEX. Foi
demonstrado também que modificações nas extremidades 3´ou 5´ aumentam a resistência dos
aptâmeros à degradação por nucleases, aumentando sua meia vida no plasma sanguíneo de
minutos para horas (FERREIRA & MISSAILIDIS, 2007). Têm-se como exemplos de
modificações das extremidades 3´e 5´ a adição de bases invertidas ou ainda a adição de grupo
amino, flúor ou grupo metil (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007). Normalmente, aptâmeros de
DNA são mais resistentes que de RNA. Os aptâmeros permitem ainda, a conjugação de
moléculas como o PEG que tem a propriedade de aumentar o tempo de circulação sanguínea
ou podem também ser conjugados a nanopartículas como nanopartículas de ouro, quantum-
dots, nanotubos de carbono (PIEVE et al, 2012; LEE et al, 2010).
Os aptâmeros podem ser marcados usando grupos reativos fluorescentes, como a fluoresceína
ou biotina. Além disso, os aptâmeros podem ser marcados com diferentes tipos de
radioisótopos como 99m
Tc, 18
F, 125
I e 32
P entre outros. Eles estão surgindo como ferramentas
promissoras no desenvolvimento de novos radiofármacos. Os aptâmeros apresentam a
propriedade de circularem livremente pelo sangue, apresentando rápida depuração plasmática,
49
sendo características importantes para o desenvolvimento de radiofármacos (MISSAILIDIS &
PERKINS, 2007).
As propriedades dos aptâmeros os capacitam para aplicação direta na detecção e quantificação
de moléculas. Estes são requisitos importantes para o desenvolvimento de radiofármacos para
cintilografia. A rápida farmacocinética dos aptâmeros desperta também o interesse para sua
utilização na Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET).
4.4.5) Aplicações dos aptâmeros
Os aptâmeros apresentam ampla aplicação incluindo pesquisa básica na área médica e
farmacêutica e no desenvolvimento de drogas em diagnóstico e terapia. Os aptâmeros são
moléculas promissoras no desenvolvimento de novos agentes em terapia e diagnóstico devido
as suas propriedades de alta afinidade e especificidade, facilidade para modificação química e
produção in vitro, além das vantagens sobre os anticorpos.
4.4.5.1) Aplicações em terapia
A maioria dos aptâmeros aplicados em terapia age como inibidores de seus alvos, mas alguns
agem como agonistas de receptores (RANDOM et al, 2013). Têm-se como exemplos de
aptâmeros inibidores de seus alvos os aptâmeros contra a nucleolina (BATES et al, 2009),
fator IXa (RUSCONI et al, 2002), ligante 12 de quimiocina (SAYYED et al, 2009), PDGF
(GREEN et al, 1996) e trombina (WATERS et al, 2011).
4.4.5.1.1) Aplicações em angiogênese
Em 1971, FOLKMAN sugeriu que o controle da angiogênese poderia ser útil no controle do
crescimento tumoral. Esse conceito de antiangiogênese foi aplicado a outras doenças e vem
sendo estudado extensivamente nos últimos anos. A angiogênese é um fenômeno complexo
no qual participam inúmeras moléculas que estimulam e inibem a formação dos neovasos
(DAMICO, 2007).
O aptâmero Macugen (pegaptanib da Eyetech) (GRAGOUDAS et al, 2004) , para o
tratamento de doença macular degenerativa, foi o primeiro aptâmero a chegar ao mercado e é
o único aprovado pelo FDA. O aptâmero inibe o receptor VEGF que é um regulador positivo
de angiogênese. Assim, o medicamento tem o papel de reduzir o crescimento do tumor e sua
vascularização (JANJIC et al, 2000; ADAMIS et al, 2006).
50
Em adição ao VEGF, outro fator de crescimento com papel na proliferação celular e
angiogênese é o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Aptâmeros de DNA
contra PDGF e PDGF-B foram desenvolvidos (JANJIC & GOLD, 1997; PIETRAS et al,
2004). Com a inibição de PDGF ocorre uma sinalização para o estroma de células tumorais
que levam a diminuição da pressão do fluido intersticial, que pode consequentemente
estimular o transporte de drogas quimioterápicas para o tumor.
O aptâmero NOX-A12, contra quimiocina angiogênica, implicada na vascularização
patológica está em desenvolvimento para o tratamento de retinopatia diabética (SAYYED et
al, 2009).
O aptâmero ARC1905 se liga ao componente 5 do sistema de complemento (C5), que
apresenta papel importante em doença macular degenerativa relacionada a idade. O C5 é um
agente pró-inflamatório e é encontrado na retina de pacientes com essa doença (BIESECKER
et al, 1999).
4.4.5.1.2) Aplicações em oncologia
A oncologia é um grande campo de desenvolvimento em termos de terapêutica e apesar disto
apenas alguns aptâmeros têm sido desenvolvidos nessa área. O aptâmero chamado de AS1411
se liga a nucleolina que é uma proteína localizada no nucléolo, mas que pode ser translocada
para a superfície de certas células cancerígenas (BATES et al, 2009). AS1411 não afeta
diretamente a nucleolina, mas apresenta efeito de internalização do complexo nucleolina-
AS1411, desestabilização de mRNA da proteína anti-apoptótica Bcl-2 e inibição do fator de
transcrição NFκB. Incialmente, ensaios em camundongos nude com xenotransplantes de
tumor de próstata com células da linhagem DU145, foram realizados, havendo uma redução
significativa no crescimento tumoral, mostrando assim um efeito citostático ao invés de
citotóxico. Posteriormente, o aptâmero AS141 entrou em fase I de ensaio clínico, incluindo
17 pacientes, sendo confirmada a ausência de toxicidade em doses maiores que 10mg/kg/dia.
Atualmente, esse aptâmero está em fase II de ensaios clínicos (CIBIEL et al, 2012).
Outro aptâmero aplicado como agente anti-tumoral é o aptâmero de RNA inibidor de CTLA-4
usado com a finalidade de aumentar a imunidade, modulando o sistema imune. CTLA-4 é um
receptor de membrana expresso em células antigênicas responsável por uma regulação
negativa atenuando a ativação de células T. O aptâmero então se liga ao receptor CTLA-4,
inibindo assim a inativação de células T. A injeção desse aptâmeros em camundongos em
51
combinação com a irradiação das células levou a inibição do crescimento tumoral, mas pode
aumentar o risco do desenvolvimento de uma doença autoimune (SANTULLI et al, 2003).
Outros dois aptâmeros contra os receptores 4-1BB e OX40, expressos em células T, também
permitem a inibição do crescimento do tumor in vivo estimulando a resposta imune
(MCNAMARA et al, 2008; DOLLINS et al, 2008). Ao invés de inibir o alvo, esses
aptâmeros agem como agonistas ativando os receptores e aumentando a resposta imune de
células T.
Outro exemplo é o aptâmero anti-4-1BB conjugado com outro aptâmero que se liga ao
antígeno de membrana prostático específico (PMSA), expresso na superfície de alguns
cânceres de próstata, levaram a diminuição do crescimento tumoral (PASTOR et al, 2011).
4.4.5.1.3) Aplicações como agentes anticoagulantes
O aptâmero RB006 conjugado com PEG, que se liga ao fator de coagulação IXa, foi
desenvolvido juntamente com seu antídoto RB007. Ao se ligar ao fator de coagulação IXa o
aptâmero inibe a cascata de coagulação atuando assim como um agente anticoagulante. O
RB007 rompe a estrutura de RB006 e inibe a função anticoagulante. REG-1 é a combinação
de RB006 e RB007, desenvolvido por Regado Biosciences, que está em fase II de ensaios
clínicos e mostrou função anticoagulante em estudos in vivo. (CHAN et al, 2008).
O aptâmero ARC1779 se liga ao domínio A1 do fator von Willebrand e inibe a capacidade
deste domínio se ligar ao receptor de membrana de plaquetas (glicoproteína Ib), induzindo
assim efeitos antitrombóticos (DIENER et al, 2009). Esse aptâmero está em fase II de ensaios
clínicos e é aplicado em pacientes com microangiopatias trombóticas e em pacientes com
doenças na artéria carótida submetidos a endarterectomia carotídea.
O aptâmero NU172 se liga a trombina inibindo assim a sua função na cascata de coagulação.
Esse aptâmero está em fase II de ensaios clínicos e é aplicado pacientes durante
procedimentos cirúrgicos cardiovasculares para evitar a formação de coágulos sanguíneos
(WATERS et al, 2009).
4.4.5.1.4) Aplicações em tratamento de inflamação
A L-selectina apresenta um importante papel na inflamação, estando expressa na superfície de
leucócitos, mediando a adesão às células endoteliais. Um aptâmero de DNA que se liga a L-
selectina foi desenvolvido pela NeXstar Pharmaceuticals. Esse aptâmero apresentava
52
modificações na extremidade 3´ e a conjugação de PEG na ponta 5´ (HICKE et al, 1996). No
entanto, a dose requerida para desencadear o efeito foi considerada muito alta para continuar a
ser desenvolvido. O mesmo grupo desenvolveu assim, outro aptâmero de RNA que se liga ao
mesmo alvo com uma modificação 2´-flúor-ribose-pirimidina (2´-F-Py). Esse aptâmero inibiu
50% do tráfego de linfócitos. Uma dose de 5.4 nmol/Kg mostrou efeito de duração de 11 h
(WATSON et al, 2000).
Outro aptâmero contra P-selectina chamado de ARC5690 também demonstrou atividade
inibitória prevenindo a adesão de leucócitos e a passagem para os tecidos. A P-selectina é
expressa em resposta a um estímulo extracelular como a hipóxia e está presente em altos
níveis em pacientes com anemia falciforme (GUTSAEVA et al, 2010).
O aptâmero RA10-6 selecionado para o receptor A de interleucina 17 (IL-17RA) foi capaz de
reduzir a inflamação sinovial em modelo murinho de osteoartrite experimental. Esse aptâmero
de DNA é capaz de bloquear a ligação da interleucina 17 no receptor IL-17R, diminuindo
assim a expressão de citocinas inflamatórias (CHEN et al, 2011).
4.4.5.1.5) Aplicação no tratamento de doenças infecciosas
O aptâmero de DNA chamado PO RO10-60 selecionado para o receptor 9 do tipo toll
(TLR9), apresenta o efeito de estimular a resposta imune. O receptor TLR9 apresenta a
função de reconhecimento de patógenos e estimulação da resposta imunológica contra esses
agentes. Esse aptâmero administrado por via intranasal (25µg) em camundongos um dia antes
de uma infecção por anthrax retardou a morte do animal. O aptâmero PO RO10-60 pode
assim, ser utilizado em tratamento profilático em caso de ataque bioterrorista, retardando as
consequências letais, permitindo assim o tratamento por antibióticos (WU et al, 2008).
O aptâmero chamado de A22 selecionado contra hemaglutinina (HA) de vírus influenza tem o
papel de bloquear a ligação de HA em receptores de células hospedeiras e, consequentemente
inibir a entrada do vírus na célula. Estudos com camundongos em modelo de infecção viral
demonstraram a redução do título viral no pulmão dos animais tratados com injeção intranasal
de A22 (125 pmol) no mesmo dia, após um dia e após dois dias da inoculação viral (JEON et
al, 2004). Outro aptâmero chamado de NK2 selecionado contra Mycobacterium tuberculosis
teve efeitos semelhantes, aumentando as taxas de sobrevivências em camundongos (CHEN et
al, 2007).
53
Estudos com aptâmeros para componentes do vírus HIV estão sendo realizados. Aptâmeros
para a transcriptase reversa de HIV (GOLD & TUERK, 1996; SCHNEIDER et al, 1996),
proteína GAG HIV-1 (Lochrie & Gold, 1998), proteína nucleocapsídea (ALLEN & GOLD,
1997), integrase (ALLEN & GOLD, 1996), gp 120 (WILSON et al, 2004), proteína TAT
(GOLD & TUERK, 1996) estão em várias fases de desenvolvimento.
Aptâmeros para glicoproteínas (E1 e E2) do vírus de hepatite C, chamados de ZE2, foram
selecionados. Esse aptâmeros se ligam a proteína E2 impedindo em 80% a ligação destas em
células de mamíferos (CHEN et al 2009).
4.4.5.1.6) Aplicações em diabetes
O aptâmero chamado de NOX-E36 se liga a quimiciona-2 (motivo C-C), que é uma proteína
responsável por recrutar monócitos e células T do compartimento vascular para o espaço
extracelular nos locais de inflamação. NOX-E36 é um aptâmero de RNA desenvolvido para o
tratamento de complicações de diabetes tipo II. Esse aptâmero mostrou uma eficiência
significativa em reduzir glomeruloesclerose de diabetes tipo II em modelos murinos
(NINICHUK et al, 2008; MAASCH et al, 2008 ).
4.4.5.2) Aplicações em diagnóstico
Um agente diagnóstico ideal deve apresentar as características de alta especificidade,
sensibilidade, reprodutibilidade, rapidez e facilidade na análise dos resultados. Os aptâmeros
preenchem todos esses requisitos, apresentando um grande potencial como agentes
diagnósticos. Devido as suas propriedades, a detecção de toxinas, drogas, metabólitos,
patógenos pode ser possível em baixas concentrações. Diferentes métodos de diagnóstico têm
sido estudados como “beacons” competitivos, sensores eletroquímicos, conjugados de
aptâmeros a nanopartículas e radiodiagnóstico (RANDOM et al, 2013).
4.4.5.2.1) “Beacons” competitivos
Esse tipo de sensor detecta a energia de ligação dos aptâmeros nos respectivos alvos por sinais
fluorescentes. Um ácido nucléico com um fluoróforo é chamado de “beacon molecular” e se o
ácido nucléico é um aptâmero o termo utilizado é “apta-beacon”. O aptâmero é desenvolvido
com uma estrutura em hairpin e as extremidades do aptâmero são marcadas com um
fluoróforo e um “quencher”. A ligação do aptâmero com o alvo rompe a estrutura em hairpin,
separando o fluoróforo do “quencher”, permitindo que o fluoróforo esteja livre para emitir um
54
sinal fluorescente (RANDOM et al, 2013). Um exemplo da aplicação desse tipo de sensor foi
desenvolvido para avaliar a concentração de elastase de neutrófilos humanos, sendo que esse
sensor foi capaz de detectar concentrações baixas como 0,34 nM de elastase de neutrófilos
humanos (HE et al, 2010).
4.4.5.2.2) Sensores eletroquímicos
Os sensores eletroquímicos quando comparados com apta-beacons oferecem maior
sensibilidade de detecção e baixo custo. Nesse tipo de sensor o aptâmero é imobilizado em
um suporte condutor. Quando o aptâmero se liga ao alvo, ocorre uma mudança
conformacional em sua estrutura que leva a alteração no fluxo de corrente do sistema. Um
exemplo da aplicação desse tipo de sensor é o sensor desenvolvido por SWENSEN et al
(2009), chamado de MECAS (Microfluidic Electrochemical Aptamer-based sensor), que
mede a concentração de cocaína em soro fetal bovino em tempo real. Nesse sistema o
aptâmero é marcado com azul de metileno (grupo redox) e é imobilizado na superfície de um
eletrodo de ouro. Quando o aptâmero se liga a cocaína ocorre uma mudança conformacional
que diminui a distância do grupo redox do eletrodo, promovendo a transferência de elétrons e
consequentemente o aumento da corrente elétrica com mudança da coloração do indicador
(azul de metileno).
4.4.5.2.3) Diagnóstico com conjugados de aptâmeros a nanopartículas
Desenvolvimentos recentes em nanoestruturas têm gerado um grande impacto em vários
campos como nanoeletrônica, fotônica, biologia e medicina. Diferentes tipos de nanomateriais
têm sido aplicados como nanopartículas metálicas (NPs), quantum dots (QDs), nanotubos de
carbono (CNTs) e partículas nanomagnéticas.
Os quantum dots são mais estáveis que os corantes fluorescentes e o comprimento de onda
emitido pode ser controlado modificando o tamanho e a composição da nanopartícula. O
primeiro quantum dot conjugado com aptâmero foi descrito para a detecção de trombina.
Nesse trabalho o aptâmero para trombina conjugado com um quantum dot foi hibridizado com
uma fita complementar de DNA marcada com um quencher na extremidade. Na presença de
trombina, o aptâmero interage com a trombina modificando sua estrutura e libera a fita
complementar contendo o quencher, induzindo assim a emissão de fluorescência (LEVY et
al, 2005).
55
Outro grupo utilizou a detecção múltipla com quantum dots e nanopartículas de ouro
conjugados com aptâmeros para a detecção de adenosina e cocaína. Nesse trabalho agregados
de quantum dots com pico de emissão de 525 nm e nanopartículas (AuNPs) foram formados
com aptâmeros específicos para adenosina. Em paralelo, agregados de quantum dots com pico
de emissão de 585 nm e nanopartículas (AuNPs) foram formados com aptâmeros específicos
para cocaína. A introdução de adenosina e/ou cocaína aumenta a emissão de fluorescência de
QD1 (pico de emissão 525 nm) e QD2 (pico de emissão 585nm). A introdução de analitos
controle (citidina e uridina) não aumentaram a fluorescência dos QDs (LIU et al, 2007).
Quantum dots conjugados com aptâmeros para MUC1 foram desenvolvidos. Estudos in vitro
e in vivo mostraram que o complexo acumula predominantemente no tumor (SAVLA et al,
2011).
Partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (TCL-SPION) foram conjugadas com o
aptâmero A10 específico para câncer de próstata. O aptâmero A10 é um aptâmero de RNA
que se liga ao domínio extracelular do antígeno de membrana próstata específico (PMSA), um
marcador tumoral, que apresenta expressão elevada em células tumorais. Estudos mostraram
que o bioconjugado foi capaz de detectar células expressando PMSA com alta sensibilidade
(WANG et al, 2008).
4.4.5.2.4) Diagnóstico por cintilografia utilizando aptâmeros
O primeiro aptâmero descrito para diagnóstico por imagem usando SPECT foi o aptâmero
NX2109 para elastase de neutrófilos. Em resposta a inflamação, os neutrófilos são recrutados
aos locais de inflamação onde secretam grandes quantidades de elastase que se ligam a
superfície de neutrófilos ativados. Inicialmente, com o uso de citometria de fluxo foi
demonstrado que o aptâmero NX2109 podia interagir com a elastase na superfície de
macrófagos ativados. Posteriormente, o aptâmero NX2109 foi marcado com 99m
Tc para
estudos in vivo de imagem em modelo experimental de ratos com indução artificial de
inflamação no membro anterior. O aptâmero foi comparado com um oligonucleotídeo
controle (NX303) e com IgG de rato como controle positivo. O aptâmero NX2109 mostrou
maior intensidade na imagem do que o oligonucleotídeo controle e uma relação alvo/não alvo
de 4.3 ± 0.6 foi obtida 2 h após a administração do aptâmero. O anticorpo IgG específico
levou 3 h para atingir a melhor relação alvo/não alvo de 3.1 ± 0.1 (CHARLTON et al, 1997).
56
Outro aptâmero aplicado em cintilografia é o aptâmero TTA1 marcado com 99m
Tc para
diagnóstico de tumor. O aptâmero TTA1 se liga a proteína da matriz extracelular tenascina-C
que é uma proteína hexamérica. A tenascina está expressa em processos de angiogênese,
crescimento tumoral, cicatrização de feridas, embriogênese. A proteína é continuamente
expressa na neovasculatura e no estroma do tumor. Os tumores conhecidos por apresentarem
superexpressão de tenascina-C são: carcinomas de pulmão, mama, prostata, colon, linfomas,
sarcomas, glioblastomas e melanomas. HICKE et al (2006), fizeram estudos de imagem
tumoral utilizando o aptâmero TTA1 marcado com 99m
Tc e estudos de biodistribuição em
modelo experimental de camundongos com xenotransplantes de células humanas U251 de
glioblastoma. Após injeção intravenosa (5 noml/camungongo – 200 nmol/Kg) foi obtida uma
captação máxima no tumor de 6% da dose injetada (ID/g) observada rapidamente, dentro de
10 minutos, seguido de um lento decréscimo, sendo observado 1.9 % ID/g ainda presentes
após 3 h da injeção. O aptâmero controle mostrou captação inicial de 3% ID/g em 10 min,
mas foi eliminado do tumor rapidamente (0.04 %ID/g em 3 h). A depuração sanguínea foi
extremamente rápida com uma relação tumor/sangue de 50 em 3 h. A rápida depuração se
deve a excreção renal e a degradação por nucleases. No entanto, 60% dos aptâmeros intactos
foram medidos no tumor 3 h após a injeção, sugerindo que a interação do aptâmeros com o
alvo de alguma forma protege os aptâmeros contra nucleases. Foi utilizado no estudo três
diferentes quelantes, mostrando que cada agente altera dramaticamente o padrão de
biodistribuição dos aptâmeros (HICKE et al, 2006).
Dois outros aptâmeros, AptA e AptB, selecionados contra a proteína MUC1 foram marcados
com 99m
Tc e testados em imagem tumoral. MUC1 é uma glicoproteína grande, de superfície,
expressa na matriz extracelular de células epiteliais glandulares e ductos e em algumas
linhagens de células hematopoéticas. MUC1 está superexpressa na maioria dos
adenocarcinomas humanos, sendo então, um marcador tumoral. AptA foi selecionado contra a
proteína não glicosilada de MUC1 enquanto que AptB foi selecionado contra a forma maligna
e glicosilada da proteína. Ambos os aptâmeros foram modificados com a inserção de uma
timina invertida na ponta 3´ para conferir resistência a nucleases. Após marcação com 99m
Tc,
foram injetados intravenosamente em camundongos nude com xenotransplante de células de
câncer de mama da linhagem MCF-7. Diferentes quelantes foram utilizados para sintetizar
formas monoméricas e tetraméricas de AptA. Como descrito anteriormente, o padrão de
biodistribuição variou dependendo do quelante, mas as formas tetraméricas mostraram maior
captação tumoral comparadas com as formas monoméricas. Em outro experimento, AptA e
57
AptB foram marcadas usando o mesmo quelante MAG2. Os aptâmeros foram eliminados pelo
trato urinário e sistema hepatobiliar. AptB mostrou maior captação tumoral que AptA em 5 h
e 22 h após a injeção (0.14% ID/g x 0.12% ID/g e 0.013% ID/g, x 0.008% ID/g
respectivamente) (FERREIRA et al, 2006; PIEVE et al, 2009).
58
5) MATERIAL E MÉTODOS
5.1) Aptâmeros
Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 (Figura 12) previamente desenvolvidos para S. aureus
(CAO et al, 2009) foram sintetizados pela empresa Prodimol Biotecnologia em duas
variações: sem modificações e com a adição de um grupo amino (-NH2) com um espaçador de
seis carbonos na extremidade 5´.
Figura 12: Aptâmeros SA20, SA23 e SA34. A) Sequências dos aptâmeros. B) Estruturas
secundárias dos aptâmeros com menor estado de energia desenhados pelo software RNA
STRUCTURE 4.5. Fonte: CAO et al, 2009.
59
5.2) Microrganismos e condições de cultura
Staphylococcus aureus da linhagem ATCC 25923 e Candida albicans da linhagem ATCC
18804 foram cultivados em meio BHI sólido (Himedia Laboratories Pvt. Ltda) em placas de
petri a 37°C e repicados a cada sete dias.
5.3) Animais
Camundongos Swiss foram adquiridos do biotério da Faculdade de Farmácia da UFMG. Os
camundongos foram mantidos em gaiolas com maravalha, água e ração comum (sem
restrição), em estantes comuns. Os camundongos Swiss utilizados para infecção com C.
albicans foram imunossuprimidos por irradiação em fonte uniforme de 60
Co, com a dose de
2,5 Gray e taxa de dose de 75 Gray/hora, no Laboratório de Irradiação Gama do CDTN e
mantidos em gaiolas autoclavadas com maravalha, água e ração (sem restrição). Todos os
experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação animal
da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG), protocolo nº. 143 / 2013
(ANEXO A).
5.4) Marcação dos aptâmeros com 32
P
Os aptâmeros foram inicialmente colocados a 95°C por 5 min, em seguida no gelo por 1 min e
depois por 15min a 8°C. Em seguida, foram deixados em repouso a temperatura ambiente por
no mínimo 1 hora para atingirem o enovelamento correto. Para a reação de marcação foram
adicionados na respectiva ordem, 15,5 µL de água DNase free, 5 µL de tampão (250 mM
Imidazole-HCl (pH 6.4), 60 mM MgCl, 5 mM 2-mercaptoetanol, 350 M ADP ), 0,5 µL (5
unidades) da enzima T4 polinucleotideo kinase, 1 µL da solução do aptâmero (10 pmol), 3 µL
de [γ-32
P]ATP. Após a adição dos reagentes o tubo foi agitado e incubado em banho-maria a
37°C por 10 min. Em seguida, a solução foi deixada a 65°C por 10 minutos para paralização
da reação. Após essa etapa, foram adicionados 7,5 µL de água DNase free no tubo contendo o
produto da reação. Uma biblioteca de oligonucleotídeos degenerados com sequências
aleatórias também foi marcada para utilização como controle.
5.5) Ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32
P a células de S. aureus
Para o ensaio de ligação de cada um dos aptâmeros marcados a células de S. aureus da
linhagem ATCC 25923 foram realizadas 4 diluições em PBS dos aptâmeros marcados nas
concentrações de 5 pmol, 2,5 pmol, 1,5 pmol e 0,75 pmol. Foram adicionados 100 µL de cada
60
diluição em microtubos contendo 107 células de S. aureus. A incubação foi realizada em
banho-maria a 37°C por 45 min para a ocorrência da ligação dos aptâmeros radiomarcados
com as células bacterianas. Após esse tempo o material foi centrifugado a 13000 rpm por 5
min e o sobrenadante descartado. Em seguida o pellet foi resuspendido em 200 µL de PBS e
novamente centrifugado nas mesmas condições. O procedimento foi repedido mais duas vezes
até que não foi verificada a presença de radiação no sobrenadante. Ao final, o pellet foi
armazenado a 20°C até ser utilizado.
5.6) Detecção da Radioatividade por Cintilação Líquida
O pellet obtido após o ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32
P a células de
S. aureus foi ressuspendido em 200 µL de PBS e transferido para um tubo contendo 1,3 mL
do cintilador líquido Ultima GoldTM
LLT (PerkinElmer). A radioatividade foi determinada em
cpm (contagem por minuto) pelo método de espectrometria em cintilador líquido no
equipamento Quantulus com tempo de contagem de 10 minutos.
5.7) Marcação dos aptâmeros com 99m
Tc
Em um frasco foi adicionado 20 mg de tricina e 5 mg de EDDA solubilizando-os em 300 µL
de salina 0,9%. Em seguida, foi adicionado 10 µL de uma mistura dos aptâmeros SA20, SA23
e SA34 na concentração de 200 pmol/µL cada e 100 µL de uma solução de cloreto estanoso
(SnCl2) a 2 µg/mL, solubilizada em HCl 0,25N. O pH foi ajustado para 7 com solução de
NaOH 1,0 N. O recipiente foi lacrado e vácuo foi aplicado com auxílio de uma seringa. A
atividade de 200 µCi de 99m
Tc foi adicionada para a marcação para utilização em ensaios in
vitro. Para os ensaios in vivo e obtenção de imagens cintilográficas a atividade adicionada foi
de 3 mCi. Em seguida, a solução foi deixada em banho-maria a 100°C por 15 min para a
ocorrência da ligação. Após a ligação, o produto da marcação foi resfriado em água corrente.
O rendimento da marcação foi determinado por cromatografia em camada delgada (CCD)
(Figura 13) utilizando como fase móvel acetona, para a determinação do percentual de TcO4-,
e solução de NaCl 0,9% com 5% de hidróxido de amônio para avaliar a quantidade de TcO2
(Tabela 2) . As placas cromatográficas de sílica gel de fase normal (cromatofolha de alumínio
com sílica gel) foram cortadas em tiras de 1x10 cm. Com o auxílio de uma seringa de 1 mL
uma gota do aptâmero marcado com 99m
Tc foi aplicada no ponto de origem. Após a secagem a
temperatura ambiente a corrida foi realizada em tubos contendo os eluentes citados na Tabela
2. A corrida foi paralisada quando a fase móvel atingiu a marca superior da placa (0,5 cm da
61
extremidade superior). Após a corrida, as placas foram deixadas a temperatura ambiente para
secagem e cortadas ao meio. As atividades das porções inferiores e superiores da placa foram
medidas utilizando contador gama (Wizard-Perkin Elmer).
Tabela 2: Eluentes utilizados na CCD
Suporte Solvente Rf∆
TcO4- Rf TcO2 Rf TcAptâmero
ITLC SG* NaCl 0,9%,
5% de NH4OH
1,0 0,0 1,0
ITLC SG Acetona 1,0 0,0 0,0
*ITLC SG: Instataneous Thin Layer Cromatography Media Silica Gel. ∆Rf: índice de retenção: razão
entre a distância percorrida pelo composto e pelo eluente.
O rendimento da marcação foi obtido seguindo a fórmula abaixo:
Porcentagem de marcação= 100 – (% TcO4- + % TcO2)
5.8) Testes de estabilidade dos aptâmeros marcados
O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foi marcado com 99m
Tc conforme metodologia
descrita no item 5.7. Foi utilizado 10 µL de cada aptâmero (200 pmol/µL) para a marcação
conjunta com 500 µCi de 99m
Tc. O pool de aptâmeros radiomarcados foi em seguida,
incubado separadamente com solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiss e em
excesso de cisteína para análise da estabilidade da marcação.
Figura 13: Diagrama esquemático da cromatografia em camada delgada.
62
Os coligantes tricina e EDDA utilizados na metodologia de marcação do presente projeto
foram marcados com 99m
Tc sem a adição dos aptâmeros, sendo utilizados como controle da
marcação. A estabilidade dos coligantes foi avaliada em solução salina 0,9%.
5.8.1) Teste de estabilidade em solução salina
Foram adicionados 100 µL do pool de aptâmeros radiomarcados com 99m
Tc em um tubo
contendo 1,1 mL de solução salina 0,9%. A solução resultante foi estocada a temperatura
ambiente e analisada por CCD em triplicata nos tempos de 1, 2, 4 e 24 h.
5.8.2) Teste de estabilidade em excesso de cisteína
A cisteína é um aminoácido competidor pelo 99m
Tc e assim é utilizada para avaliar a
estabilidade da marcação dos aptâmeros. Foram adicionados 50, 500 e 5000 vezes de excesso
de cisteína a solução contendo os aptâmeros radiomarcados. Foi utilizado 1,1 mL de cada
solução de cisteína para cada 100 µL do produto da marcação de aptâmeros. As soluções
foram mantidas à temperatura ambiente e analisadas por CCD também em triplicata nos
tempos de 1, 2, 4 e 24 h.
5.8.3) Teste de estabilidade no plasma
Foi obtido 3 mL de sangue de camundongos Swiss e adicionado 25 µL de anticoagulante
EDTA. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e a fração do plasma foi
separada. Foi obtido um tubo contendo 1,1 mL de plasma no qual foram adicionados 100 µL
dos aptâmeros marcados e a mistura foi incubada a 37°C. A atividade na fração do plasma foi
analisada por CCD, em triplicata, nos tempos de 1, 2, 4 e 24 h.
5.9) Ensaio in vitro de afinidade dos aptâmeros marcados com 99m
Tc
O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m
Tc foi filtrado em filtros 3K para
a eliminação de impurezas. O filtro de 3K foi escolhido considerando o valor do peso
molecular estimado dos aptâmeros (SA20 = 27,5 KDa; SA23 = 27,6 KDa e SA34 = 27,4
KDa). Após a filtração, o produto foi diluído em 160 µL de PBS e 50 µL foram incubados
separadamente com 1 x 107 células de S. aureus em 1,0 mL de PBS. A incubação foi
realizada em banho-maria a 37°C por 45 min para a ocorrência da ligação do aptâmero
marcado com as células. Após a ligação, o material foi centrifugado a 13000 rcf por 5 min e o
sobrenadante descartado. Em seguida, o pellet foi lavado em PBS por 3 vezes até que não se
63
obteve radiação no sobrenadante. A radioatividade incorporada ao pellet foi determinada em
contador gama. A biblioteca marcada foi utilizada como controle.
5.10) Estudos de Biodistribuição e Cintilografia
Para os estudos de biodistribuição e cintilografia, três grupos de camundongos Swiss (peso
20-25 g) contendo 6 animais em cada (n=6) foram utilizados. Os animais foram anestesiados
com uma mistura de xilasina (15 mg/Kg) e quetamina (80 mg/Kg).
O grupo 1 foi infectado com 1 x 107 células de S. aureus da linhagem ATCC25923,
suspensas em 100 µL de solução salina, por via intramuscular na coxa direita. Após 24 h,
tempo necessário para o desenvolvimento da infecção intramuscular, foram injetados 100 µL
do pool de aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m
Tc, por via intravenosa, para a
realização das imagens cintilográficas e estudos de biodistribuição. Foi utilizada uma dose de
3 mCi de 99m
Tc na marcação para os ensaios in vivo.
O grupo 2 foi infectado com 1 x 107 células de C. albicans da linhagem ATCC18804,
suspensos em 100 µL de solução salina, por via intramuscular na coxa direita. Os
camundongos do segundo grupo foram previamente imunossuprimidos para que fosse
possível o desenvolvimento da infecção fúngica, segundo descrito no item 5.3. Após 24 h da
inoculação do microrganismo, foram injetados 100 µL dos aptâmeros anti S. aureus marcados
com 99m
Tc, por via intravenosa, para a realização das imagens cintilográficas e estudos de
biodistribuição.
Nos animais do grupo 3 foi injetado 100 µL de zimosan 5% por via intramuscular para a
indução de uma inflamação no músculo da coxa direita. Após 24 h foram injetados 100 µL
dos aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m
Tc, por via intravenosa, para a realização das
imagens cintilográficas e estudos de biodistribuição. Em todos os grupos foi observado um
inchaço visível nas coxas infectadas ou inflamadas, quando comparadas com as coxas sem
intervenção.
Foram adquiridas imagens cintilográficas nos tempos de 1 e 4 h após a administração do
radiomarcado para todos os grupos. Para tal, os camundongos foram anestesiados com uma
mistura de xilasina (15 mg/Kg) e quetamina (80 mg/Kg). Em seguida, foram colocados em
posição de decúbito ventral sob uma câmara de cintilação à raios gama para a obtenção da
imagem cintilográfica. Uma janela de 20% de simetria foi utilizada para um pico de energia
de 140 keV e um colimador de baixa energia do tipo LEHR foi utilizado para direcionar os
64
raios. As imagens foram obtidas durante 5 minutos e armazenadas em uma matriz de 256x256
pixels.
Os estudos de biodistribuição foram realizados no tempo de 4 h após a administração dos
aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m
Tc. Após o tempo de 4 h, os camundongos foram
eutanasiados por deslocamento cervical e amostras de tecido (sangue, fígado, baço, estômago,
coração, pulmão, rim, músculo da coxa direita infectada e músculo da coxa esquerda) foram
dissecadas, pesadas e suas atividades medidas em contador gama. Foi obtida a relação
alvo/não alvo a partir da análise da radiação medida no músculo da coxa direita infectada com
a radiação medida no músculo da coxa esquerda. Utilizou-se padrões de dose para corrigir o
decaimento físico do 99m
Tc para calcular o percentual da dose injetada por grama de tecido
(%ID/g) para cada órgão. Os padrões continham a mesma dose injetada nos camundongos. O
%ID/g para cada órgão foi calculado pela fórmula:
ó ã ó ã
5.11) Histologia
Após os estudos de biodistribuição, os fragmentos de tecido do músculo da coxa direita
infectada ou com a indução de inflamação foram encaminhados para a análise histopatológica
no laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica do setor de Patologia do departamento
de Clínica e Cirurgia Veterinária da UFMG. Os tecidos de músculo da coxa foram dissecados
do osso e os fragmentos de tecido foram fixados em formol 10% por 72 h. Em seguida, os
tecidos foram submetidos a um processo de desidratação, sendo utilizada uma série crescente
de concentrações de álcool etílico: 70% (1 h); 80% (1 h); 90% (1 h); 95% (1 h); 100% (4 h).
Após este processo os fragmentos foram submetidos a um processo de clarificação com a
imersão no solvente xilol por 2 h e por último foram submetidos a um processo de
impregnação com parafina por 3 h. O material resultante foi incluído em moldes de parafina
para a realização de cortes. Secções histológicas de 4 µm foram coradas por hematoxilina-
Eosina (HE), PAS e Good-pastore para avaliação histopatológica. As imagens dos cortes
histológicos foram capturadas por uma câmera digital adaptada a um microscópio óptico
Olympus IX70.
65
5.12) Análise Estatística
O tratamento estatístico dos dados obtidos foi realizado com o auxílio do programa GraphPad
Prism versão 5.01, utilizando-se a Análise da variância (ANOVA) com intervalo de confiança
de 95% e teste de comparação múltipla de Tukey. Também foi utilizada a apresentação dos
dados em gráficos contendo os respectivos desvios-padrão e análise da média dos dados.
66
6-RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1) Ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32
P para células de S. aureus
Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foram avaliados individualmente quanto a capacidade de
ligação ao alvo, no caso células de S. aureus. Os aptâmeros foram marcados na extremidade
5´com 32
P e incubados com 1x 107 células de S. aureus. A biblioteca de oligonucleotídeos
também foi marcada e utilizada como controle. Pode-se observar que os aptâmeros marcados
apresentaram alta capacidade de ligação a células de S. aureus, pois a contagem em cpm
relativa a biblioteca, que apresenta diversas sequências aleatórias, apresentou-se desprezível
em comparação aos três aptâmeros analisados. A leitura da radioatividade em cpm relativa ao
aptâmero SA20 (5 pmol) foi 8751 vezes maior quando comparado com a biblioteca na mesma
concentração (Gráfico 1). A radioatividade devida ao aptâmero SA23 foi 11928 vezes maior
(Gráfico 2) e do aptâmero SA34 foi 9574 vezes maior (Gráfico 3) que a da biblioteca na
mesma concentração.
Bib
l-5
Bib
l-2,5
Bib
l-1,5
-32P
]ATP li
vre
[
SA20
- 5
SA20
- 2,5
SA20
- 1,5
0
10000
20000
30000
40000
cp
m
Gráfico 1: Ensaio de ligação do aptâmero SA20 marcado com 32
P a células de S. aureus.
Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O asterisco (*) indica
diferenças estatisticamente significativas em relação a biblioteca (p<0,005). Bibl-5:
Biblioteca (5pmol); Bibl-2,5: Biblioteca (2,5 pmol); Bibl-1,5: Biblioteca (1,5 pmol); [γ-32
P]ATP livre; nucleotídeo marcado com 32
P livre; SA20-5: Aptâmero SA20 (5 pmol);
SA20-2,5: Aptâmero SA20 (2,5 pmol); SA20-1,5: Aptâmero SA20 (1,5 pmol).
*
*
*
67
Bib
l-5
Bib
l-2,5
Bib
l-1,5
-32P
]ATP
livr
e
[
SA23
- 5
SA23
- 2,5
SA23
- 1,5
0
10000
20000
30000
40000cp
m
Bib
l-5
Bib
l-2,5
Bib
l-1,5
-32P
]ATP
livr
e
[
SA34
- 5
SA34
- 2,5
SA34
- 1,5
0
10000
20000
30000
40000
cp
m
Gráfico 2: Ensaio de ligação do aptâmero SA23 marcado com 32
P a células de S. aureus.
Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O asterisco (*) indica
diferenças estatisticamente significativas em relação a biblioteca (p<0,005). Bibl-5:
Biblioteca (5pmol); Bibl-2,5: Biblioteca (2,5 pmol); Bibl-1,5: Biblioteca (1,5 pmol); [γ-32
P]ATP livre: nucleotídeo marcado com 32
P livre ; SA23-5: Aptâmero SA23 (5 pmol);
SA23-2,5: Aptâmero SA23 (2,5 pmol); SA23-1,5: Aptâmero SA23 (1,5 pmol).
*
*
*
Gráfico 3: Ensaio de ligação do aptâmero SA34 marcado com 32
P a células de S. aureus.
Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O asterisco (*) indica
diferenças estatisticamente significativas em relação a biblioteca (p<0,005). Bibl-5:
Biblioteca (5pmol); Bibl-2,5: Biblioteca (2,5 pmol); Bibl-1,5: Biblioteca (1,5 pmol); [γ-32
P]ATP livre: nucleotídeo marcado com 32
P livre; SA34-5: Aptâmero SA34 (5 pmol);
SA34-2,5: Aptâmero SA34 (2,5 pmol); SA34-1,5: Aptâmero SA34 (1,5 pmol).
*
*
*
68
CAO et al. (2009), obtiveram resultados semelhantes utilizando ensaio por citometria de fluxo
que avaliou a capacidade de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 a células de
S. aureus. Os autores utilizaram diferentes linhagens de S. aureus (ATCC 8325-4; ATCC 196
e ATCC 04018) enquanto que neste estudo foi utilizada a linhagem ATCC 25923. O
aptâmero SA23 foi o que apresentou maior capacidade de ligação, de acordo com os dados de
EC50 (tabela 3) obtidos por Cao et al. (2009), para a linhagem ATCC 8325-4 e com os
resultados observados no ensaio de ligação com aptâmeros marcados com 32
P obtidos no
presente trabalho (tabela 4). O EC50 indica a concentração da substância em estudo que induz
metade do efeito máximo e quanto menor o EC50 maior a afinidade. Portanto, os resultados
do ensaio de ligação comprovaram a afinidade dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 para
células de S. aureus.
Tabela 3: EC50 para células de S. aureus da linhagem ATCC 8325-4.
Aptâmero EC50 (nM)
SA20 70.86 ± 39.22
SA23 61.50 ± 22.43
SA34 72.42 ± 35.23
Tabela 4: Determinação da radioatividade incorporada aos pellets de S. aureus
da linhagem ATCC 25923*
Aptâmero Cintilações por minuto (cpm)
SA20 25902,49 ± 3793,16
SA23 36497,47 ± 2123,51
SA34 25742,51 ± 787,39
FONTE: modificado de Cao et al. (2009).
* Resultados para os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 32
P na concentração de
5 pmol. Os valores estão representados como média ± desvio padrão.
69
6.2) Marcação com 99m
Tc e avaliação da estabilidade dos aptâmeros marcados
O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foi marcado com 99m
Tc pela metodologia de
marcação direta descrita no item 5.7 da secção de Material e Métodos. Para a marcação com
99mTc foram utilizados aptâmeros modificados na extremidade 5´ pela adição de um espaçador
de seis carbonos ligado a um grupamento NH2. A estabilidade da marcação foi avaliada em
solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiss e em excesso de cisteína (50, 500, 5000
vezes) nos tempos de 1, 2, 4, e 24 h. Os resultados obtidos estão representados como média ±
desvio padrão. Os coligantes EDDA e tricina utilizados no processo de marcação também
foram marcados na ausência dos aptâmeros e avaliados quanto a estabilidade em solução
salina 0,9%.
Como observado, os aptâmeros marcados foram estáveis em solução salina 0,9% (Tabela 5),
plasma de camundongos Swiss (Tabela 6) e em excesso de cisteína (50, 500 e 5000 vezes)
(Tabela 7), nos tempos de 1, 2, 4, e 24 h. A estabilidade da marcação na presença de excesso
de cisteína, aminoácido que possui um grupamento SH doador de elétrons pelo qual o 99m
Tc
apresenta grande afinidade e que compete com as moléculas vizinhas pelo 99m
Tc, demonstrou
a firmeza do complexo 99m
Tc-aptâmero e a eficiência do processo de marcação direta.
Os coligantes marcados isoladamente não apresentaram estabilidade em solução salina
(Tabela 8). Estes resultados atestam a estabilidade da marcação direta com 99m
Tc e excluem a
presença de quantidades significativas de coligantes marcados na preparação do aptâmero
marcado, uma vez que a porcentagem de marcação dos aptâmeros em solução salina se
manteve praticamente constante por 24 h.
Tabela 5: Estabilidade em solução salina 0,9%
Tempo (h) Marcação (%)*
1 87,72% ± 1,46
2 86,17% ± 1,11
4 85,36% ± 3,29
24 85,75% ± 0,63
*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão.
70
Tabela 6: Estabilidade no plasma
Tempos (h) Marcação (%)*
1 93,97% ± 0,30
2 97,58% ± 0,52
4 97,54% ± 0,33
24 97,00% ± 0,66
*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão.
Tabela 7: Estabilidade em excesso de cisteína
Cisteína 1:50 Cisteína 1:500 Cisteína 1:5000
Tempo (h) Marcação (%)* Marcação (%)* Marcação (%)*
1 84,59% ± 3,97 89,29% ± 0,78 90,55% ± 0,22
2 86,77% ± 1,79 83,44% ± 2,67 91,28% ± 1,72
4 84,05% ± 0,41 86,12% ± 1,13 90,23% ± 6,36
24 83,61% ± 0,13 83,79% ± 0,14 99,08% ± 0,08
*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão.
Tabela 8: Estabilidade dos coligantes tricina e EDDA em solução salina 0,9%
Tempo (h) Marcação (%)*
1 70,06% ± 1,94
2 60,07% ± 0,63
4 53,41% ± 0,06
24 37,13% ± 0,73
*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão.
71
6.3) Ensaio in vitro de afinidade dos aptâmeros marcados com 99m
Tc
Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34, individualmente, e a biblioteca foram marcados com
99mTc. O rendimento da marcação foi determinado por CCD (Tabela 9). Após a incubação dos
aptâmeros e da biblioteca com 1 x 107 células de S. aureus foi observado que os aptâmeros
SA20, SA23 e SA34 apresentaram ligação a células de S. aureus (Gráfico 4). Porém, a
biblioteca não apresentou contagem desprezível como no ensaio de marcação com 32
P,
possivelmente devido à permanência de impurezas como 99m
TcO4- e
99mTcO2 (como
demostrado na Tabela 9 através da porcentagem de marcação), e mesmo quantidades residuais
dos coligantes marcados que podem ser responsáveis por ligações inespecíficas. Embora para
todos os aptâmeros a ligação tenha sido superior a da biblioteca, apenas para o aptâmero
SA34 esta diferença foi estatisticamente significativa. Temos que levar em consideração que a
marcação com 99m
Tc pode alterar a afinidade dos aptâmeros pelo alvo. O ensaio in vitro com
aptâmeros marcados com 99m
Tc, entretanto, devido a alta leitura obtida com a biblioteca, não
permitiu elucidar uma possível alteração nas afinidades dos aptâmeros.
Bib
liote
ca
SA20
SA23
SA34
0
20000
40000
60000
cp
m
Gráfico 4: Ensaio de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m
Tc a
células de S. aureus. Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O
asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa em relação a biblioteca
(p<0,005).
*
72
Tabela 9: Rendimento da marcação dos aptâmeros SA20, SA23, SA34
e da biblioteca com 99m
Tc.
Amostras Marcação (%)*
Biblioteca 83,60% ± 2,80
SA20 82,93% ± 0,99
SA23 82,13% ± 2,77
SA34 82,37% ± 2,44
6.4) Biodistribuição
Para os estudos de biodistribuição foram utilizados três grupos de camundongos Swiss
contendo 6 animais em cada (n=6). A biodistribuição foi realizada no tempo de 4 h após a
administração do pool de aptâmeros (SA20, SA23 e SA34) anti S. aureus marcados com
99mTc.
A utilização de vários aptâmeros combinados apresenta um efeito somatório no
reconhecimento de S. aureus em relação a utilização de somente um aptâmero, visto que cada
um dos aptâmeros utilizados apresenta alvos diferenciados na superfície da bactéria em
relação aos demais (CAO et al, 2009). Para o diagnóstico de uma célula bacteriana inteira, um
único aptâmero pode vir a fornecer um resultado falso-negativo. Uma bactéria em diferentes
estados de crescimento pode expressar diferentes conjuntos de moléculas e, além disso, a
bactéria pode apresentar variações antigênicas para escapar da vigilância dos hospedeiros.
Portanto, a detecção baseada em uma única molécula pode excluir bactérias que não estejam
expressando esta molécula específica em um dado momento ou que podem estar expressando
a molécula mutada. Assim, explorar diferentes alvos na célula bacteriana pode aumentar a
sensibilidade da detecção. CAO et al (2009), utilizando citometria de fluxo e microscopia
confocal, demostraram que a utilização de um pool de aptâmeros combinados apresentou
efeito superior no reconhecimento de diferentes linhagens de S. aureus ou de células em
diferentes estados de crescimento, quando comparados com um aptâmero individual. Esse
efeito foi visualizado através de um aumento na intensidade da fluorescência quando o pool
de aptâmeros foi utilizado em relação a utilização de um aptâmero isoladamente. Nos estudos
in vivo no presente projeto foram utilizados os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 modificados
na extremidade 5´ com a adição de um grupo amino (-NH2) para conferir maior resistência a
ação de nucleases presentes no sangue.
*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão
73
Os camundongos do grupo 1 e do grupo 2 foram infectados com células de S. aureus e com
células de C. albicans, respectivamente, por via intramuscular na coxa direita. Nos animais do
grupo 3 foi induzida inflamação no músculo da coxa direita com a administração de zimosan
5%, conforme metodologia descrita no item 5.10. Após 24 h foi injetado o pool de aptâmeros
anti S. aureus marcados com 99m
Tc, por via intravenosa (100 µl), e a biodistribuição foi
determinada. A Tabela 10 apresenta os resultados para o grupo 1, a Tabela 11 para o grupo 2
e a Tabela 12 para o grupo 3 com inflamação induzida.
74
Tabela 10: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e SA34, marcados com 99m
Tc no grupo infectado por S. aureus (n=6) obtidos no tempo de 4 h.
CA1 CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 MÉDIA
TECIDO cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g
Sangue NA* NA* 52496,10 0,11 72604,74 0,12 77041,21 0,11 90721,23 0,13 74497,77 0,11 73472,21 ± 13711,93 0,12 ± 0,01
Fígado 126319,60 0,24 104886,20 0,21 66218,91 0,11 125979,00 0,18 253330,50 0,37 132829,30 0,19 134927,25 ± 62930,43 0,22 ± 0,09
Baço 8481,69 0,02 31588,33 0,06 52206,58 0,08 32745,81 0,05 67748,88 0,10 56268,53 0,08 41506,63 ± 21386,12 0,07 ± 0,03
Estômago 135991,70 0,26 33365,90 0,07 37368,45 0,06 556313,10 0,82 61817,57 0,09 71542,49 0,10 149399,86 ± 202734,10 0,23 ± 0,30
Rim 527387,70 0,99 694425,30 1,42 807354,80 1,30 498142,70 0,73 424831,40 0,62 650644,90 0,95 600464,46 ± 141991,00 1,00 ± 0,31
Coração NA* NA* NA* NA* NA* NA* 37568,20 0,06 54840,20 0,08 52891,08 0,08 48433,16 ± 9459,66 0,07 ± 0,01
Pulmão NA* NA* NA* NA* NA* NA* 71465,89 0,10 62950,09 0,09 63125,64 0,09 48433,16 ± 4866,71 0,09 ± 0,01
Coxa com infecção 45003,24 0,08 246713,00 0,51 160581,10 0,26 81827,21 0,12 112167,90 0,16 89848,17 0,13 122690,10 ± 71710,17 0,21 ± 0,16
Coxa sem infecção 12118,43 0,02 55075,34 0,11 37321,30 0,06 23011,34 0,03 25435,65 0,04 29065,04 0,04 30337,85 ± 14642,33 0,05 ± 0,03
Relação alvo/não
alvo ** 4 4,63 4,33 4 4 3,25
4,035 ±0,460
*NA- Não avaliado.
** Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.
75
Tabela 11: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e SA34, marcados com 99m
Tc no grupo infectado por C. albicans (n=6) obtidos no tempo de 4 h.
CA1 CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 MÉDIA
TECIDO cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g
Sangue 73401,42 0,11 79099,76 0,12 659164,70 0,09 46463,94 0,07 46044,68 0,07 61139,42 0,09 160885,60 ± 244480,9 0,09 ± 0,02
Fígado 248047,50 0,36 257272,60 0,38 677033,20 0,38 152049,50 0,24 303096,20 0,47 293167,20 0,43 321777,70 ± 182087,2 0,38 ± 0,08
Baço 48939,30 0,07 38745,56 0,06 645759,30 0,07 40429,08 0,06 24604,38 0,04 41798,24 0,06 140046,00 ± 247875,4 0,06 ± 0,01
Estômago 73490,64 0,11 114678,60 0,17 674580,00 0,04 33102,00 0,05 71536,92 0,11 159300,80 0,23 187781,50 ± 247875,4 0,12 ± 0,07
Rim 1024386,00 1,50 601504,60 0,88 683528,00 0,70 991629,30 1,54 621518,50 0,97 606459,40 0,89 754837,60 ± 198551,2 1,08 ± 0,35
Coração 60751,81 0,09 29642,26 0,04 741056,50 0,05 33760,74 0,05 28649,30 0,04 50627,72 0,07 157414,70 ± 286210,3 0,06 ± 0,02
Pulmão 61084,22 0,09 34891,63 0,05 697832,60 0,05 44434,06 0,07 32992,77 0,05 62957,18 0,09 155698,70 ± 265892,1 0,07 ± 0,02
Coxa com infecção 77254,65 0,11 53723,08 0,08 51184,81 0,08 36873,28 0,06 35622,25 0,06 72760,34 0,11 54569,74 ± 17492,0 0,08 ± 0,02
Coxa sem infecção 31934,42 0,05 31620,10 0,05 36710,21 0,05 18215,49 0,03 16517,41 0,03 24897,24 0,04 26649,15 ± 8132,8 0,04 ± 0,01
Relação alvo/não
alvo*
2,2
1,6
1,6
2
2
2,75
2,025 ±0,429
* Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.
76
Tabela 12: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e SA34, marcados com 99m
Tc, no grupo com a indução de inflamação estéril por zimosan (n=6),
obtidos no tempo de 4 h.
CA1 CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 MÉDIA
TECIDO cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g
Sangue 37021,83 0,07 49110,38 0,10 NA* NA* 50609,51 0,08 41444,63 0,06 35837,64 0,06 42804,80 ± 6791,69 0,07 ± 0,02
Fígado 75795,52 0,14 141209,90 0,29 84496,56 0,17 105544,00 0,17 164829,80 0,26 135859,50 0,21 117955,88 ± 34955,77 0,21 ± 0,06
Baço 11371,48 0,02 37444,85 0,08 22840,89 0,05 42605,96 0,07 51122,41 0,08 32480,47 0,05 32977,67 ± 14224,77 0,06 ± 0,02
Estômago 71527,98 0,13 27856,61 0,06 137633,80 0,28 61106,73 0,10 139329,50 0,22 322096,70 0,50 126591,88 ± 105428,00 0,22 ± 0,16
Rim 623889,10 1,17 747407,30 1,53 543320,90 1,11 994744,50 1,60 1164624,00 1,81 860710,80 1,34 822449,43 ± 232896,20 1,43 ± 0,27
Coraçao NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* 35830,17 0,06 24050,00 0,04 29940,08 ± 8329,84 0,05 ± 0,01
Pulmão NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* 50526,12 0,08 33925,23 0,05 42225,67 ± 11738,60 0,07 ± 0,02
Coxa com infecção 16134,56 0,03 44153,55 0,09 77741,79 0,16 29066,93 0,05 39061,60 0,06 29659,55 0,05 39302,99 ± 21145,57 0,07 ± 0,05
Coxa sem infecção 12954,27 0,02 38536,68 0,08 62830,15 0,13 28202,67 0,05 31882,52 0,05 36532,79 0,06 35156,51 ± 16316,64 0,07 ± 0,04
Relação alvo/não
alvo** 1,5
1,12
1,23
1 1,2 0,83
1,146 ±0,226
*NA- Não avaliado.
** Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.
77
O perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc em camundongos
Swiss apresentado em %ID/g no grupo infectado com S. aureus (Gráfico 5), no grupo
infectado com C. albicans (Gráfico 6) e no grupo com o desenvolvimento de
inflamação por zimosan (Gráfico 7) mostrou captação acentuada pelos rins indicando
que a eliminação do radiofármaco ocorre por via renal, estando de acordo com a
natureza da molécula que é hidrofílica. Além disso, o radiofármaco mostrou rápida
depuração sanguínea indicada pela reduzida dose em %ID/g no sangue.
Atualmente, o 99m
Tc é o radioisótopo mais utilizado nos procedimentos diagnósticos em
medicina nuclear, devido as suas características físicas favoráveis como meia vida de
6,02 hs e emissão gama principal de 140,51 Kev (89%) (WELCH & REDVANLY,
2003). A marcação de aptâmeros com 99m
Tc tem sido realizada utilizando-se uma etapa
de síntese precedente. Nesta reação uma molécula quelante para o radioisótopo é ligada
ao aptâmero para em seguida o complexo aptâmero-quelante ser marcado. Alguns
quelantes como MAG2, MAG3, MetCyc, HYNIC, DTPA e DOTA tem sido utilizados
com sucesso (ZHANG et al, 2000; HICKE et al, 2006; FERREIRA et al, 2006;
BORBAS et al, 2007).
A utilização de quelantes para marcação com 99m
Tc pode alterar o perfil de
biodistribuição, como observado por HICKE et al (2006). Hicke e colaboradores
utilizaram o aptâmero TTA1 para a proteína extracelular tenascina-C, com a finalidade
de identificar glioblastomas. Ao conjugarem o aptâmero TTA1 ao quelante MAG2 foi
observado elevada captação intestinal, mas com a conjugação do aptâmero ao quelante
DTPA foi observada captação no fígado e rins. Por sua vez, a conjugação de
polietilenogligol (PEG), que é hidrofílico, aboliu a depuração hepatobiliar e levou a alta
captação pelos rins. BORBAS et al (2007), conjugou o aptâmero anti-MUC1,
desenvolvido para o diagnóstico de adenocarcinomas, com MAG3 e observou elevada
captação pelos rins e fígado, mostrando eliminação por via renal. VARMIRA et al
(2013), conjugou o aptâmero anti-HER2, selecionado para o diagnóstico de carcinoma
de óvario humano (linhagem SKOV-3) ao quelante HYNIC e observou elevada
captação pelos rins e rápida depuração no sangue.
No presente estudo não foram utilizados quelantes, pois foi utilizado um processo
inédito de marcação direta de aptâmeros e assim, o perfil de biodistribuição foi devido
apenas às propriedades da molécula do aptâmero que é hidrofílica e de pequeno
78
tamanho. A marcação direta possibilita ganho de tempo e rendimento na preparação dos
aptâmeros radiomarcados, reduzindo o número de etapas. Isto torna o processo mais
fácil e menos dispendioso. A redução da manipulação da preparação diminui ainda as
chances de degradação.
Sangue
Fígad
o
Baç
o
Estôm
ago
Rim
Cora
ção
Pulmão
Coxa
infe
ctad
a
Coxa
não
infe
ctad
a
0.0
0.5
1.0
1.5
%ID
/g
Sangue
Fígad
o
Baç
o
Estôm
ago
Rim
Cora
ção
Pulmão
Coxa
infe
ctad
a
Coxa
não
infe
ctad
a
0.0
0.5
1.0
1.5
%ID
/g
Gráfico 5: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc em camundongos
Swiss (n=6) no grupo infectado com S. aureus em %ID/g.
Gráfico 6: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc em camundongos
Swiss (n=6) no grupo infectado com C. albicans em %ID/g.
79
Sangue
Fígad
o
Baç
o
Estôm
ago
Rim
Cora
ção
Pulmão
Coxa
infla
mad
a
Coxa
não
infla
mad
a
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
%ID
/g
A contagem em %ID/g na coxa infectada por S. aureus foi estatisticamente superior em
relação aos outros grupos (C. albicans e zimosan), indicando assim a maior captação do
radiofármaco e maior afinidade e especificiadade do mesmo para as células bacterianas,
demostrando a eficácia do radiofármaco na identificação de S. aureus (Gráfico 8).
Ressalta-se que a biodistribuição foi realizada no tempo de 4 h, após a realização das
imagens cintilográficas mostradas na próxima seção. Devida a rápida eliminação do
radiofármaco do organismo pela via urinária e a provável ação de nucleases que
degradam os aptâmeros, pode se supor que valores mais elevados de %ID/g no foco de
infecção poderiam ser obtidos se a biodistribuição fosse realizada em tempos menores
como 1 ou 2 h, por exemplo.
Gráfico 7: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc em camundongos
Swiss (n=6) no grupo com o desenvolvimento de inflamação por zimosan em %ID/g.
80
S. a
ureus
C. a
lbic
ans
Zimosa
n
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4%
ID/g
A relação alvo/não alvo nos três grupos foi obtida a partir razão da %ID/g medida no
músculo da coxa direita infectada em relação a obtida no músculo da coxa esquerda
(Gráfico 9). O grupo 1, infectado por S. aureus, mostrou uma elevada relação alvo/não
alvo de 4,03 ± 0,46, enquanto que os outros grupos utilizados como controle
apresentaram relações inferiores. O grupo 2, infectado por C. albicans, apresentou
relação alvo/não alvo de 2,02 ± 0,42 e o grupo 3, com inflamação asséptica por
zimosan, apresentou relação alvo/não alvo de 1,14 ± 0,22. A relação alvo/não alvo deve
ser superior a 1,5 para finalidade de diagnóstico, pois esse valor indica uma captação
pelo menos 50% maior no tecido alvo em relação ao tecido não alvo (PHILLIPS, 1999).
Com base nesse critério os aptâmeros marcados com 99m
Tc mostraram-se altamente
promissores no diagnóstico de infecções causadas por S. aureus. A relação alvo/ não
alvo do grupo infectado por C. albicans mostrou-se ligeiramente superior ao controle
por zimosan, apresentando-se superior a 1,5, possivelmente devido a uma baixa
reatividade cruzada dos aptâmeros com C. albicans. CAO et al (2009), mostraram que
os aptâmeros são específicos para S. aureus com coeficientes de dissociação (Kd) na
faixa de nanomolar e que não apresentaram reatividade cruzada com Streptococcus
A5005, S. epidermidis 26069 e E. coli DH5α, mas o grupo não testou a reatividade
cruzada para C. albicans. Apesar da pequena captação observada em focos de
Gráfico 8: Comparação da %ID/g nas coxas infectadas (S. aureus e C. albicans) e
inflamada (zimosan). O asterisco (*) indica que S. aureus apresenta diferença
estatisticamente significativa em relação aos outros grupos (p<0,05).
*
81
infecciosos devidos a C. albicans, o pool de aptâmeros mostrou diferença significativa
na relação alvo/não alvo entre o grupo infectado por S. aureus e o grupo controle
infectado por C. albicans (Gráfico 9), apresentando a capacidade de diferenciar entre os
dois tipos de infecção. Além disso, a ID%/g (Gráfico 8) na coxa infectada por S. aureus
mostrou diferença estatisticamente significativa em relação aos outros grupos (C.
albicans e zimosan).
VARMIRA et al (2013), marcaram com 99m
Tc um aptâmero de RNA específico para o
receptor HER2, superexpresso em tumores de mama, cabeça e pescoço, próstata e
óvario. O aptâmero de RNA, com finalidade de diagnóstico de carcinoma de óvario
humano (linhagem SKOV-3), foi conjugado ao quelante HYNIC e os estudos de
biodistribuição mostraram elevada captação pelo fígado, não justificada pela natureza
da molécula do aptâmero e do quelante HYNIC (que possuem caráter hidrofílico), e
baixas relações alvo/não alvo (menores que 1). VARMIRA et al (2013), apresentaram
como hipótese para o resultado uma provável reatividade cruzada do aptâmero aos
tecidos do fígado. Assim, apesar dos aptâmeros serem específicos para seus alvos,
reatividade cruzada com outras moléculas pode ocorrer. No presente estudo, a relação
alvo/não alvo estatisticamente superior para S. aureus, demostrando o potencial do pool
de aptâmeros utilizados para o diagnóstico diferencial.
Outra hipótese para o ocorrido seria que um quadro infeccioso grave estimula uma
reação do sistema imune mais acentuada do que uma simples inflamação, com um
aumento da vascularização e presença de um maior número de células
polimorfonucleares. Assim, uma permeabilidade vascular aumentada no grupo de
C. albicans poderia explicar uma relação alvo/não alvo superior ao grupo controle por
zimosan.
Destaca-se que os resultados demonstraram também que os aptâmeros radiomarcados
diferenciaram com facilidade infecção causada por S. aureus de inflamação asséptica,
limitação que tem sido verificada em diferentes radiofármacos utilizados no diagnóstico
de infecção por cintilografia.
82
S. a
ureus
C. a
lbic
ans
Zimosa
n
0
1
2
3
4
5
Rela
ção
alv
o/n
ão
alv
o
KAUL et al (2013), que utilizaram o antibiótico ceftriaxone marcado com 99m
Tc para o
diagnóstico de infecções causadas por estafilococos e bacilos Gram-negativos,
obtiveram uma relação alvo/não alvo de 4.5, mas somente no tempo de 24 h.
CHATTOPADHYAY et al (2012), utilizaram o antibiótico cefuroxima marcado com
99mTc para o diagnóstico de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e obtiveram
relação alvo/não alvo de apenas 1,8 em imagem de 3 h. SIAENS et al (2004), avaliaram
os antibióticos 99m
Tc-enrofloxacina e 99m
Tc-ciprofloxacina que são antibióticos de
amplo espectro para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O estudo demonstrou
que ambos os antibióticos não foram capazes de discriminar entre infecção e inflamação
estéril de acordo com a análise da relação alvo/não alvo obtida por ROI das imagens e
dados de biodistribuição no tempo de 22 h. A relação alvo/não alvo para 99m
Tc-
enrofloxacina foi de 4.2 ± 0,6 e para 99m
Tc-ciprofloxacina foi de 3.8 ± 0,8, mas não
houve diferença significativa em relação ao grupo de inflamação estéril onde esta
relação foi de 4,2. Portanto, essa classe de radiofármacos apresentou dúvidas quanto a
especificidade. No presente estudo foi obtida a relação alvo/não alvo de 4,03 ± 0,46 no
tempo de 4 h, enquanto que relação semelhante só foi obtida no tempo de 22 h para
antibióticos marcados e principalmente esta relação foi estatisticamente superior a
obtida em sítios inflamação asséptica. Com base nestes resultados concluímos que os
Gráfico 9: Relação alvo/não alvo (coxa infectada/coxa não infectada) nos grupos S. aureus,
C. albicans e Zimosan. O asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa entre
todos os grupos (p<0,05).
*
*
*
83
aptâmeros utilizados nesse estudo são moléculas promissoras para o diagnóstico de
infecções devido as suas características de especificidade e afinidade para o seu alvo.
Além disso, devido ao pequeno tamanho estes apresentam rápida depuração plasmática,
sendo que o pico da relação alvo/não alvo pode ser obtido em um tempo menor,
diminuindo assim a dose de exposição ao paciente.
84
6.5) Cintilografia
As imagens cintilográficas obtidas nos tempos de 1 e 4 h após a administração do pool
dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc por via intravenosa em
camundongos Swiss estão apresentadas na Figura 14 para os animais infectados com S.
aureus, na Figura 15 para os infectados com C. albicans e na Figura 16 para os animais
com indução de inflamação por zimosan.
1 HORA
A1
4 HORAS
A2
B1
B2
Figura 14: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros SA20, SA23
e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss infectados na coxa direita com S. aureus. As
setas indicam o foco infeccioso. Imagem no tempo de 1h (A1) e 4h (A2) em gradiente de cores.
Imagem no tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e branco.
85
1 HORA
A1
4 HORAS
A2
B1
B2
Figura 15: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros
SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss infectados na coxa
direta com C. albicans. As setas indicam o foco infeccioso. Imagem no tempo de 1h
(A1) e 4h (A2) em gradiente de cores. Imagem no tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e
branco.
86
1 HORA
A1
4 HORAS
A2
B1
B2
Figura 16: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros
SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc em camundongos Swiss com uma inflamação
desenvolvida por administração de zimosan na coxa direita. As setas indicam o foco
inflamatório. Imagem no tempo de 1h (A1) e 4h (A2) em gradiente de cores. Imagem no
tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e branco.
87
Como pode ser observado, o perfil obtido pelas imagens cintilográficas após a
administração do pool de aptâmeros marcados com 99m
Tc apresentou uma elevada
captação do radiofármaco pelos rins e pela bexiga em todos os grupos. A bexiga foi
editada das imagens no grupo de C. albicans nos tempos de 1 e 4 h (Figura 14) e do
grupo de S. aureus no tempo de 4 h (Figura 13) para melhor vizualização do contorno
do animal, pois o percentual de radiação associado a bexiga foi muito elevado. Esse
perfil está de acordo com os dados obtidos na biodistribuição, indicando a via urinária
como via de eliminação do radiofármaco. Além disso, não foram observados acúmulos
de radioatividade na tireóide, no estômago, no fígado e no baço, indicando assim níveis
aceitáveis de impurezas radioquímicas como o tecnécio livre (99m
TcO4-) e tecnécio
hidrolisado (99m
TcO2).
O grupo infectado por S. aureus apresentou maior captação na coxa direita infectada
sendo visível a diferença entre a coxa direita e esquerda no tempo de 1 h (Figura 13). Os
outros grupos (C. albicans e zimosan) não apresentaram diferenças vísíveis entre a coxa
direita que sofreu a intervenção e a coxa esquerda, estando em consonância com os
resultados obtidos das relações alvo/não alvo nos estudos de biodistribuição.
De acordo com a análise das imagens cintilográficas, o tempo de 1 h foi suficiente para
a ação do radiofármaco como agente para imagem. No tempo de 4 h as imagens já
mostravam pequena captação provavelmente devida á rápida eliminação ou degradação
do radiofármaco, visto que os aptâmeros utilizados foram apenas parcialmente
protegidos contra a ação de nucleases pela adição de um grupo amino na extremidade
5’. CHARLTON et al. (1997), utilizaram aptâmero inibidor de elastase de neutrófilos
humanos para diagnóstico de inflamação e obtiveram uma relação alvo/não alvo de
aproximadamente 4, determinada por análise de ROI nas imagens no tempo de 2 h e
que depois começou a declinar.
Os resultados obtidos neste estudo demonstram que aptâmeros marcados diretamente
com 99m
Tc são promissores no diagnóstico de infecções causadas por S. aureus e abrem
a perspectiva de utilização desta abordagem para o diagnóstico pela cintilografia de
infecções provocadas por outros microrganimos e patógenos.
88
6.6) Histologia
Em todos os animais, foram analisados fragmentos dos tecidos do músculo da coxa
direita infectada (S. aureus e C. albicans) e com a indução de inflamação (zimosan).
Foram preparadas lâminas coradas com hematoxilina-eosina (HE) para os três grupos.
Para os grupos 1 e 2 foram realizadas adicionalmente colorações com good pastore e
PAS, respectivamente, para a identificação diferencial de batérias e fungos. Resultados
representativos para cada grupo estão representados a seguir.
6.6.1) Grupo 1: infectado com S. aureus
Foi observada uma reação mais grave e mais intensa com vários focos coalescentes de
reação inflamatória predominantemente neutrofílica com grande quantidade de
neutrófilos degenerados (piócitos). Foi observado também a presença de material
fibrilar amorfo e eosinofílico em moderada quantidade por entre as células
inflamatórias. Além disso, foi observada grande quantidade de fibras musculares sem
estriações e fragmentadas (necrose) (Figura 17). Foi detectada também a presença de
grumos bacterianos intralesionais com bactérias do tipo cocos que pode ser confirmada
em coloração good pastore (Figura 18).
Diagnóstico: miosite neutrofílica multifocal acoalescente intensa com grumos
bacterianos intralesionais e necrose muscular intensa e extensa agudos.
89
Figura 17: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em microscopia
óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de 200x. A seta indica o
infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Nota-se a presença de fibras
sem estriações (necrose). Barra de escala: 50 µm.
Aumento, coloração.
Figura 18: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em microscopia
óptica. Coloração good pastore em aumento de 200x. As setas indicam a presença
de grumos bacterianos do tipo cocos. Nota-se a presença de fibras fragmentadas e
sem estriações (necrose).
90
6.6.2) Grupo 2: Infectado com C. albicans
Foram observadas áreas focalmente extensas por entre as fibras musculares com grande
quantidade de neutrófilos, sendo que muitos deles apresentam-se degenerados (piócitos)
(Figura 19). Por entre esse infiltrado inflamatório e na periferia dele foi observada
discreta quantidade de um material amorfo e fibrilar e eosinofílico (fibrina). As fibras
musculares adjacentes a reação inflamatória apresentaram perda de estriações e
fragmentação (necrose muscular) (Figura 20). Foi observado ainda a presença de raros
mastócitos. Foi detectado a presença de leveduras em coloração PAS (Figura 21).
Diagnóstico: miosite focalmente extensa e intensa supurada aguda.
Figura 19: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de 200x.
A seta indica o infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Barra de
escala: 50 µm.
91
Figura 21: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica. Coloração PAS em aumento de 200x. As setas indicam a
presença de leveduras. Barra de escala: 50 µm.
Figura 20: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em
microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de
200x. A seta indica fibra muscular sem estriações (necrose) próxima ao
infiltrado. Nota-se que a fibra adjacente apresenta-se com estriações. Barra
de escala: 50 µm.
92
6.6.3) Grupo 3: Zymosan
Foi observada reação inflamatória moderada, com pequenos focos de inflamação por
entre as fibras musculares. Além disso, foi obervada discreta quantidade de neutrófilos,
linfócitos e raros plasmócitos. O processo degenerativo nas fibras musculares foi menos
presente que nos outros grupos (Figura 22).
Diagnóstico: miosite linfoplasmocitária e neutrofílica multifocal moderada e aguda.
Os resultados das análises histológicas demostraram que as infecções experimentais,
bem como a inflamação induzida, foram bem sucedidas para todos os animais utilizados
nos experimentos de biodistribuição e cintilografia.
Figura 22: Fotomicrografia de inflamação intramuscular induzida por zimosan
em microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de
200x. A seta indica o infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Nota-
se a presença de fibras fragmentadas e sem estriações (necrose). Barra de escala:
50 µm.
93
7- CONCLUSÕES
O ensaio de ligação com os aptâmeros marcados com 32
P comprovaram a afinidade dos
mesmos para células de S. aureus.
Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados diretamente com 99m
Tc foram estáveis em
solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiis e em excesso de cisteína.
O ensaios de ligação in vitro com os aptâmeros marcados com 9m
Tc apresentaram
interações inespecíficas provavelmente devidas a presença de impurezas como
99mTcO4
-,
99mTcO2 e quantidades residuais dos coligantes marcados.
Os estudos de biodistribuição dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m
Tc
mostraram perfil de excreção renal e rápida depuração sanguínea.
O grupo infectado por S. aureus mostrou elevada relação alvo não alvo (4,03 ± 0,46),
enquanto que os grupos utilizados como controle, C. albicans e zimosan, apresentaram
relaçõesalvo/não alvo de 2,02 ± 0,42; 1,14 ± 0,22, respectivamente.
Os estudos de biodistribuição demostraram o potencial de aptâmeros radiomarcados no
diagnóstico de infecções por S. aureus, sendo capazes de diferenciarem com facilidade,
infecção causada por S. aureus de inflamação asséptica, limitação que tem sido
verificada em diferentes radiofármacos utilizados no diagnóstico de infecção por
cintilografia.
Observou-se coerência entre as imagens cintilográficas e as relações alvo/não alvo
obtidas pela biodistribuiçao, sendo que já no tempo de uma hora foi possível obter o
diagnóstico com a maior captação na coxa direita infectada por S. aureus. Já os outros
grupos, C. albicans e zimosan, não apresentaram diferenças vísíveis entre a coxa direita
que sofreu a intervenção e a coxa esquerda.
As análises histológicas comprovaram o modelo experimental, mostrando a infecção
presente na coxa direita infectada por S. aureus ou C. albicans e a inflamação obtida por
zimosan.
O conjunto dos resultados aponta que aptâmeros, diretamente marcados com 99m
Tc, são
moléculas promissoras para utilização como radiofármacos no diagnóstico de infecção
bacteriana.
94
8- PERSPECTIVAS
- Desenvolver e avaliar aptâmeros mais resistentes a nucleases, com alterações nas
extremidades 5’ e 3’, para o diagnóstico de infecção bacteriana.
- Avaliar aptâmeros diretamente marcados com 99m
Tc para o diagnóstico de infecção
bacteriana em tecidos densos como o tecido ósseo.
- Avaliar o efeito da encapsulação de aptâmeros radiomarcados em lipossomas pH-
sensíveis no diagnóstico de infecção bacteriana.
- Marcar os aptâmeros com e emissores de pósitrons como 68
Ga e 18
F e avaliar sua
eficácia para o diagnóstico pela Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET).
- Utilizar aptâmeros radiomarcados para o diagnóstico de infecção por cintilografia de
outros microrganismos e patógenos.
95
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ANEXO A- CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DE MINAS GERAIS (CETEA/UFMG).
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
CEUA
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
CERTIFICADO
Certificamos que o Protocolo nº. 143 / 2013, relativo ao projeto intitulado “Avaliação in vivo de aptâmeros marcados com tecnécio-99m para
identificação de infecção em modelo experimental”, que tem como responsável VALBERT NASCIMENTO CARDOSO, está de acordo com os
Princípios Éticos da Experimentação Animal, adotados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMG), tendo sido aprovado na reunião
de 05/11/2013. Este certificado espira-se em 05/11/2018.
CERTIFICATE
We hereby certify that the Protocol nº. 143 / 2013, related to the Project entilted “Assessement of infecious foci using aptamers radiolabeled with
technetium-99m in experimental model”, under the supervision of VALBERT NASCIMENTO CARDOSO, is in agreement with the Ethical Principles
in Animal Experimentation, adopted by the Ethics Committee in Animal Experimentation (CEUA/UFMG), and was approved in 05/11/2013. This
certificates expires in 05/11/2018.
FRANCISNETE GRACIANE ARAUJO MARTINS
Coordenador(a) da CEUA/UFMG
Belo Horizonte, 05/11/2013.
Atenciosamente.
Sistema CEUA-UFMG
https://www.ufmg.br/bioetica/cetea/ceua/
Universidade Federal de Minas Gerais
Avenida Antônio Carlos, 6627 – Campus Pampulha
Unidade Administrativa II – 2º Andar, Sala 2005
31270-901 – Belo Horizonte, MG – Brasil
Telefone: (31) 3499-4516 – Fax: (31) 3499-4592
www.ufmg.br/bioetica/cetea - [email protected]
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