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REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES MICROBIOLÓGICOS
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REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA
EXAMES MICROBIOLÓGICOS
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SÚMARIO
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I. REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAME MICROBIOLÓGICOS..................3
1.0 OBJETIVOS E ALCANCE......................................................................................................3
2.0 INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 3
3.0 PREMISSAS.......................................................................................................................... 4
4.0 PESSOAL............................................................................................................................. 11
5.0 APARELHOS E INSTRUMENTOS.......................................................................................13
6.0 PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE VIDRARIA DE LABORATÓRIO E OUTROS..............56
7.0 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA..........................................61
8.0 AMOSTRAS DE LABORATÓRIO........................................................................................61
9.0 EXAME................................................................................................................................. 65
10.0 ENUMERAÇÃO.................................................................................................................. 69
11.0 MÉTODO DE DETECÇÃO (MÉTODO QUALITATIVO)...................................................100
12.0 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO......................................................................................101
13.0 RELATÓRIO DE ENSAIO................................................................................................108
14.0 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS.........................................................108
15.0 GARANTIA DE QUALIDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE QUALIDADE DE DESEMPENHO........................................................................................................................ 109
16.0 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.......................................................................................110
II. HISTÓRICO DAS REVISÕES..............................................................................................111
Anexo A.................................................................................................................................... 112
Anexo B.................................................................................................................................... 113
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I. REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAME MICROBIOLÓGICOS
1.0 OBJETIVOS E ALCANCE
Abrange exame para bactérias, bolores e leveduras e pode ser usado se
suplementadas com orientação específica para príons, parasitas e vírus. Não
abrange o exame para toxinas ou outros metabólitos (aminas, por exemplo)
produzidos por microorganismos.
Esta Norma aplica-se a microbiologia de alimentos, alimentos para animais,
indústria de produção de alimentos, e ambiente de produção primária.
O objetivo desta Norma é contribuir para garantir a validade dos exames de
microbiologia de alimentos, e ajudar a garantir que as técnicas gerais usadas
para a realização desses exames são as mesmas em todos os laboratórios,
ajudar a alcançar resultados homogêneos em laboratórios diferentes, e
contribuir para a segurança do pessoal de laboratório, evitando riscos de
infecção.
2.0 INTRODUÇÃO
Ao conduzir exames microbiológicos é especialmente importante que
- apenas os microorganismos que estão presentes nas amostras sejam
isolados e contabilizados;
- os microorganismos não contaminem o meio ambiente
Para conseguir realizar isso é necessário também ter atenção à higiene
pessoal e realizar as técnicas de trabalho com certeza de eliminação de
contaminações externas, sempre que possível.
Uma vez que, nesta Norma Internacional, é possível dar apenas alguns
exemplos de precauções que devem ser tomadas durante uma análise
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microbiológica, um conhecimento profundo das técnicas microbiológicas e dos
microorganismos envolvidos é essencial. É importante que as análises sejam
realizadas com a maior precisão possível, incluindo monitoramento e registro
de aspectos que podem afetar os resultados e os cálculos do número de
microorganismos e o cálculo de incerteza de resultados.
Em ultima instância, é de responsabilidade do coordenador do laboratório de
julgar se as manipulações são seguras e se podem ser consideradas boas
práticas laboratoriais.
Um grande número de manipulações podem, por exemplo, sem intenção levar
a uma contaminação cruzada e o analista deve sempre verificar a precisão dos
resultados dados por sua técnica.
A fim de realizar as análises corretamente é necessário tomar certas
precauções ao construir e equipar o laboratório.
Certas precauções devem ser tomadas, não apenas por motivos de higiene,
mas também para garantir boa reprodutibilidade dos resultados. Não é possível
especificar todas as precauções que devem ser tomadas em todas as
circunstâncias, mas essa Norma Internacional pelo menos fornece as medidas
a serem tomadas ao preparar, esterilizar, armazenar os meios e utilizar os
equipamentos.
Se a orientação dada nessa Norma Internacional for seguida, será uma
contribuição para manter a saúde e segurança de todos. A fim de distinguir as
orientações nessa Norma Internacional, elas estão impressas em um tipo de
letra diferente (Times New Roman).
3.0 PREMISSAS
3.1 Geral
Esta cláusula dá requisitos gerais, para os princípios da concepção e
organização de um layout de laboratório de microbiologia.
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Exame das amostras estágio primário de produção (especialmente para
recepção de amostras e preparação de amostras) devem ser separadas da
análise de outras amostras para reduzir os riscos de contaminação cruzada.
3.2 Considerações sobre segurança
O projeto de laboratório deverá cumprir os requisitos de segurança que vai
depender do tipo de micro-organismo. Para este efeito, os micro-organismos
são classificados em quatro categorias de risco:
Categoria de risco 1 (nenhum risco ou muito baixo para o indivíduo e para a
comunidade).
Um micro-organismo que é improvável que causam a doença humana ou
animal.
Categoria de risco 2 (risco moderado para o risco individual e baixo para a
comunidade).
Um agente patogênico que pode causar doenças no homem ou animal, mas é
improvável que seja um perigo grave para os trabalhadores de laboratório, a
comunidade ou o ambiente. Exposições laboratoriais podem causar infecção
humana grave, mas o tratamento eficaz e medidas preventivas estão
disponíveis e o risco de propagação da infecção é limitada.
Categoria de risco 3 (alto risco para o risco individual e baixo para a
comunidade).
Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave, mas
normalmente não se espalham de um indivíduo infectado para outro.
Tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis.
Categoria de risco 4 (alto risco para o indivíduo e para a comunidade).
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Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave e que
pode ser facilmente transmitido de um indivíduo para outro, direta ou
indiretamente. Tratamento eficaz e medidas preventivas não são geralmente
disponíveis.
AVISO - Consulte a regulamentação nacional, que define a categoria de risco
de micro-organismos encontrados particularmente dentro das fronteiras do país
em questão.
3.3 Design de Laboratório
As diretrizes para a disposição de laboratório descrito abaixo cobrem exames
para a detecção de micro-organismos pertencentes à categoria de risco 1, 2 e
3 para microbiologia alimentar.
Note-se que as medidas de segurança adicionais podem ser necessárias,
dependendo da legislação local.
3.4 Áreas do Laboratório
3.4.1 Geral
O laboratório compreende áreas associadas com amostras e testes (ver 3.4.2)
e áreas em geral (Ver 3.4.3). Estas devem ser separadas.
3.4.2 Áreas associadas com amostras e testes
É considerada boa prática ter locais separados ou áreas claramente
designadas, para o seguinte:
- recebimento e armazenamento das amostras;
- preparação de amostras, em particular no caso de matérias-primas (por
exemplo, produtos em pó contendo um número elevado de micro-organismos);
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- exame das amostras (a partir da suspensão inicial), incluindo a incubação de
micro-organismos;
- manipulação de patógenos presuntivo;
- armazenamento de cepas de referência e outras cepas;
- preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;
- armazenamento de meios de cultura e reagentes;
- exame de alimentos para a esterilidade;
- descontaminação;
- limpeza de vidro e outros equipamentos;
- armazenamento de produtos químicos perigosos, de preferência mantidos em
armários especialmente designados, salas ou prédios.
3.4.3 Áreas gerais
As seguintes áreas são consideradas separadas:
- entradas, corredores, escadas, elevadores;
- áreas administrativas (por exemplo, escritórios, salas de documentação, etc);
- vestiários e banheiros;
- salas de arquivo;
- lojas;
- salas de repouso.
3.5 Layout e acessórios das instalações
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3.5.1 Objetivos
O objetivo é garantir que o ambiente dentro do qual os exames microbiológicos
são realizados não afetem a confiabilidade dos resultados do teste.
Providenciar instalações de forma a evitar o risco de contaminação cruzada.
Maneiras de atingir este objetivo são, por exemplo:
a) para a construção do laboratório de acordo com o princípio do layout "não
volta";
b) a realização de procedimentos de forma sequencial utilizando as devidas
precauções para garantir o teste e integridade da amostra (por exemplo, uso de
recipientes fechados);
c) separar as atividades por tempo ou espaço.
Evitar condições extremas, tais como temperatura excessiva, poeira, umidade,
vapor, ruído, vibração, etc.
Espaço deve ser suficiente para permitir que as áreas de trabalho sejam
mantidas limpas e arrumadas. O espaço necessário deve ser proporcional ao
volume de análises e a organização interna global do laboratório. O espaço
deve ser regulado pela legislação nacional, quando existir.
3.5.2 Instalações
As instalações devem ser construídas e equipadas a fim de reduzir o risco de
contaminação por poeira e, portanto, por microorganismos (para micro-
organismos da categoria de risco 3 verificar a legislação nacional).
a) As paredes, tetos e pavimentos devem ser lisos, fácil de limpar e resistente a
detergentes e desinfetantes usados em laboratórios.
b) O piso deve ser antiderrapante.
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c) tubos suspensos de transporte de líquidos não devem cruzar as instalações
a menos que sejam hermeticamente fechados. Qualquer outra estrutura aérea
deve ser coberta ou facilmente acessível para limpeza regular.
d) Janelas e portas devem ser capazes de ser fechado quando realização dos
ensaios, a fim de minimizar correntes de ar. Além disso, devem ser construídos
de modo a evitar a formação de poeira, e assim, facilitar a sua limpeza. A
temperatura ambiente (18 ° C a 27 ° C) e qualidade do ar (conteúdo micro-
organismo, a taxa de poeira se espalhando, etc) deve ser compatível com a
realização dos testes. Um sistema de ventilação de filtro de ar de entrada e
saída de ar é recomendado para esta finalidade.
e) Um sistema de extração adequada deve ser instalado para evitar a
exposição às poeiras provenientes do manuseio de meios de cultura
desidratados, e as amostras em pó.
f) Testes que devem ser realizados em uma atmosfera de baixa contaminação,
a sala deve ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou
cabine de segurança biológica.
g) Se necessário, o ambiente de laboratório devem ser protegidos contra os
efeitos nocivos da radiação solar através da utilização de venezianas ou
painéis de vidro tratados adequadamente. Persianas instaladas internamente
não são adequadas, pois são de difícil limpeza e podem se tornar uma fonte de
poeira.
3.5.3 Outros pontos
Os seguintes pontos devem ser considerados:
- disponibilidade de abastecimento de água de qualidade apropriada para o uso
pretendido;
- disponibilidade de energia elétrica;
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- disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);
- luz adequada em cada seção do laboratório;
- superfície de bancada e móveis de laboratório fabricados em material liso,
impermeável, de fácil limpeza e desinfecção;
- mobiliário de laboratório concebido de modo a facilitar a limpeza dos pisos
(por exemplo, mobiliário móvel);
- nenhuma mobília, documentos ou outros itens que não sejam os estritamente
necessários para as atividades de teste, devem ser mantidos na área de testes;
- disponibilidade de instalações de armazenamento para armazenar
documentos usados ao manipular as amostras, meios de cultura, reagentes, e
etc;
- fornecimento de lavatórios de mão em cada sala de testes e, se necessário,
em áreas gerais, de preferência perto da porta;
- disponibilidade de uma autoclave para destruição de resíduos contaminados e
meios de cultura, a menos que um adequado sistema para a remoção de
resíduos contaminados para incineração esteja em vigor;
- fornecimento de sistemas de segurança para cobrir incêndio, emergência
elétrica e chuveiro de emergência e instalações para lavagem dos olhos;
- fornecimento de instalações de primeiros socorros.
3.6 Limpeza e desinfecção
Os seguintes pontos devem ser verificados.
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a) Os pisos, paredes, tetos, bancadas de laboratório, mobiliário e junções entre
estes devem ser submetidos a manutenção e reparação regular, a fim de evitar
rachaduras que podem atuar como uma fonte de contaminação.
b) A limpeza regular e desinfecção devem ser realizadas a fim de manter as
instalações em condições adequadas para a realização de testes. Superfícies
contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser descontaminadas
utilizando desinfetante conhecido por ser bactericida e fungicida.
NOTA 1 Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumigação
com vapor de formaldeído, se permitido pela legislação nacional.
c) Os sistemas de ventilação e seus filtros devem receber manutenção
regularmente e os filtros mudados quando necessário.
d) A qualidade microbiológica de superfícies de trabalho laboratorial,
superfícies de contato pessoal, e ar devem ser monitorados regularmente (a
frequência depende dos resultados de testes anteriores).
e) a contaminação de superfície pode ser estimado através da aplicação direta
à superfície de uma placa de contato contendo neutralizantes contra agentes
sanitizantes (por exemplo, lecitina, tiossulfato de sódio). A qualidade do ar
pode ser examinada por exposição de 15 min uma placa de Petri abertas
contendo meio de ágar não seletivo (ágar contagem por exemplo placa - PCA)
ou um Ágar seletivo adequado para o microrganismo alvo procurado (por
exemplo, ágar batata).
4.0 PESSOAL
4.1 Generalidades
Requisitos gerais sobre a competência do pessoal pode ser encontrada em
ISO / IEC 17025.
4.2 Competência
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Para cada método ou técnica, os critérios objetivos devem ser definidos para a
avaliação das competências adequadas, ambos inicialmente e em uma base
contínua.
A competência pode ser estabelecida dentro do laboratório de controle de
qualidade interno (ver 15.1.2).
4.3 Verificação de competência em curso do pessoal
Verificação de competência em curso do pessoal deve ser avaliada
regularmente com parâmetros objetivos. Isso inclui participação em programas
internos de garantia da qualidade, testes de proficiência (ver ISO / IEC Guia 43-
1), o uso de materiais de referência ou por avaliação através de testes para
enumeração de microorganismos como descrito na ISO 14461-2.
4.4 Higiene
As seguintes precauções de higiene pessoal devem ser tomadas a fim de evitar
a contaminação das amostras, meios de cultura e para evitar o risco de
infecção do pessoal. Para maiores informações ver POP MET MIC 007.
a) Usar vestuário de laboratório devidamente preso, limpo e em bom estado,
fabricados a partir de um tecido que limita os riscos de inflamabilidade. Esta
roupa não deve ser usada fora das áreas de trabalho e, possivelmente,
vestiários.
b) Usar proteção para os cabelos e barba, se necessário, para a integridade da
amostra.
c) Manter unhas limpas e de preferência curtas.
d) Lave bem as mãos em água morna, de preferência por uma torneira não-
operada manualmente, antes e depois de exames microbiológicos e
imediatamente depois de ir ao banheiro banho. Use sabão líquido ou em pó ou,
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possivelmente, um desinfetante, entregue preferencialmente por um
dispensador mantido em boas condições de limpeza. Para a secagem das
mãos, usar papel ou toalhas de pano descartáveis. Estas precauções são
aplicáveis tanto aos funcionários do laboratório quanto aos visitantes.
e) Ao trabalhar com amostras expostas, meios de cultura, e ao inocular, evitar
falar, tossir, e etc.
f) As pessoas que tenham infecções de pele ou doenças devem tomar
precauções, onde os micro-organismos podem contaminar as amostras e
invalidar os resultados.
g) Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos para consumo
pessoal em refrigeradores ou freezers do laboratório.
h) Pipetagem com a boca é proibida.
5.0 APARELHOS E INSTRUMENTOS
5.1 Geral
De acordo com boas práticas de laboratório, todos os aparelhos e
equipamentos devem ser mantidos limpos e em condição de bom estado de
funcionamento. Antes do uso, o equipamento deve ser verificado como apto
para o efeito pretendido e seu desempenho monitorado durante o uso, sempre
que necessário.
Os aparelhos e dispositivos de monitorização devem ser calibrados por órgãos
de calibração rastreáveis e os controles necessários intermediários realizados,
e os procedimentos e os resultados documentados.
Equipamentos devem ser regularmente checados e mantidos para garantir a
segurança e adequação ao uso. O equipamento deve ser controlado de acordo
com as condições de trabalho e a precisão exigida para os resultados.
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A frequência de calibração e verificações de cada item do equipamento são, na
maioria dos casos, não especificadas nesta Norma, uma vez que será
determinada por cada laboratório, dependendo do tipo de equipamentos e ao
nível de atividade do laboratório, e de acordo com as instruções do fabricante.
Em um número limitado de casos, uma frequência foi especificada desde que
foi considerada essencial.
Aparelhos e equipamentos devem ser construídos e instalados para facilitar a
operação e para permitir a facilidade de manutenção, limpeza,
descontaminação e de calibração.
Quaisquer incertezas de medição indicados nesta cláusula referem-se a
aparelhos e equipamentos em causa e não para todo o método de análise.
Ao longo desta cláusula, os requisitos para a precisão de medição de
equipamentos de medição são dadas. Estes são baseados na tolerância
práticas necessárias para demonstrar o controle adequado dos equipamentos
em uso rotineiro. A precisão declarada está relacionada com a incerteza
metrológica do aparelho.
Para equipamentos de controle de temperatura, verificar a estabilidade e
homogeneidade da temperatura antes do uso inicial e depois de qualquer
reparação ou modificação que possa ter um efeito sobre o controle de
temperatura.
5.2 Cabines de segurança
5.2.1 Descrição
Uma cabine de segurança é uma estação de trabalho com o fluxo de ar laminar
horizontal ou vertical para remover poeira e outras partículas, como os
micróbios, a partir do ar.
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O número máximo tolerável de partículas por metro cúbico com um tamanho
maior ou igual a 0,5 μm representa a classe de espalhamento de poeira de
uma cabine de segurança. Para cabines usadas em microbiologia alimentar, o
número de partículas não deve exceder 4 000 por metro cúbico.
Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro
tipos.
a) Cabines de segurança de Classe I possuem abertura frontal e se destinam a
proteger o operador e o meio ambiente, mas não irá proteger o produto de
contaminação externa. Aerossóis potencialmente infectados serão contidos
dentro do gabinete e preso por impactação no filtro. O ar filtrado é normalmente
descarregada para a atmosfera, se isso não for feito, o ar deve passar por dois
filtros HEPA montados em série. Eles não são recomendados para trabalhar
com patógenos de categoria de risco 3 por causa das dificuldades em manter e
garantir a proteção do operador apropriado.
b) Cabines de segurança de Classe II protegem o produto, o operador e o meio
ambiente. Eles recircular parte do ar filtrado, outra parte vai para a atmosfera e
retornam no ar de reposição através da abertura de trabalho, proporcionando
assim a proteção do operador. Eles são adequados para trabalhar com
patógenos de categoria de risco 3.
c) Fluxos laminares de saída horizontal protegem o trabalho de contaminação,
mas joga qualquer golpe de aerossol gerado para o rosto do operador.
Portanto, eles não são adequados para lidar com culturas inoculadas ou
preparação de cultura de tecidos.
d) fluxo de ar laminar vertical protege o produto através do uso de fluxo laminar
vertical de HEPA-ar filtrado. Eles também protegem o operador através do uso
de ar internamente recirculado. Eles são particularmente adequados para
proporcionar um ambiente asséptico para a manipulação de produtos estéreis e
para proteger o operador quando o manuseio de pós.
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Usar cabines de proteção para todo o trabalho que envolva a manipulação de
agentes patogênicos e pós contaminados, se necessário por regulamentação
nacional.
O uso de um queimador de gás ou incinerador fio não é recomendado em
armários de proteção. Se for necessário, o queimador de gás deve ter uma
pequena chama de modo que o fluxo de ar não seja perturbado. O uso de
material descartável (alças, pipetas, etc) é uma alternativa adequada.
5.2.2 Uso
Cabines devem ser mantidas livres de todos os equipamentos possíveis.
Colocar todo material necessário dentro da cabine antes de começar a
trabalhar para minimizar o número de movimentos do braço para dentro e fora
da abertura de trabalho. Posicionar equipamentos e materiais de forma a
minimizar a perturbação do fluxo de ar na abertura de trabalho.
Operadores devem ser adequadamente treinados para o uso correto de cabine
para garantir a sua segurança e a integridade do produto ou cultura.
5.2.3 Limpeza e desinfecção
Limpar e desinfetar a área de trabalho após o uso com desinfetante apropriado
e não corrosivo, de acordo com as instruções do fabricante. Examinar
regularmente grades, arame, pré-filtros de proteção e limpar com um pano
encharcado de desinfetante.
Para cabines de fluxo laminar, a superfície do filtro deve ser limpa regularmente
com vácuo, tomando cuidado para não danificar o meio do filtro.
Cabines de segurança devem ser fumigadas antes de trocar de filtro ou
manutenção.
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Após a limpeza dos armários, lâmpadas UV podem ser utilizadas para a
desinfecção. As lâmpadas UV devem ser regularmente limpas e substituídas
em conformidade com as instruções do fabricante.
5.2.4 Manutenção e inspeção
Usar cabine de proteção que são apropriadas para a aplicação pretendida e as
condições ambientais no laboratório.
A eficiência de uma cabine de proteção deve ser verificada por uma pessoa
qualificada, no recebimento e, posteriormente, em intervalos regulares,
conforme recomendado pelo fabricante, bem como após qualquer reparo ou
modificação.
Verificação periódica de livre de qualquer contaminação microbiana deve ser
realizada por uma verificação da superfície e das paredes da cabine.
A verificação periódica do número de presentes micro-organismos no ar deve
ser realizada durante o funcionamento dos filtros usando o equipamento usual.
Por exemplo, expor várias placas de Petri abertas contendo um meio de cultura
de ágar não-seletivo (por exemplo, PCA) em cada gabinete por 30 min. Outros
métodos podem ser usados.
5.3 Balanças e diluidores gravimétricos
5.3.1 Uso e incerteza de medição
Balanças são usadas principalmente para a pesagem da porção da amostra a
ser analisada, os componentes do ensaio, os meios de cultura e reagentes.
Além disso, eles podem ser usados para a realização de medições de líquido
de diluição por volumes em massa.
Diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos constituídos de uma
balança e distribuidor de líquido programável e são utilizados durante a
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preparação de suspensões de amostra inicial; eles funcionam através da
adição de diluente a uma subamostra em uma proporção definida. A
subamostra é, então, pesada para a tolerância especificada no set do aparelho,
e o diluidor dispensa diluente suficiente para a relação necessária (por
exemplo, 9 pra 1 para diluições decimais).
Um laboratório de microbiologia de alimentos deve estar equipado com
balanças com o intervalo de incerteza necessário para pesar os diferentes
produtos.
Salvo disposição em contrário, os erros máximos admissíveis devem ser 1% ou
melhor, ao pesar as amostras de teste.
Colocar o equipamento sobre uma superfície estável e horizontal, ajustado
conforme necessário e protegido contra vibrações e vento.
5.3.2 Limpeza e desinfecção
Os equipamentos devem ser limpos e desinfetados após o uso ou derrame
durante a pesagem com um adequado e não corrosivo desinfetante.
5.3.3 Verificação de desempenho e calibração
O desempenho do sistema de equilíbrio deve ser regularmente verificado
durante o uso e após a limpeza com pesos de checagem e por uma pessoa
treinada. Calibração deve ser verificada em toda a gama por uma pessoa
qualificada, dependente da frequência de uso.
Pesos de checagem também podem ser verificados imediatamente após a
calibração da balança.
5,4 Homogeneizadores, liquidificadores e mixers
5.4.1 Descrição
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Este equipamento é usado para preparar a suspensão inicial da amostra de
produtos não-líquidos.
Os seguintes aparelhos podem ser utilizados:
Stomacher com sacos estéreis, possivelmente com um dispositivo de
regulação de velocidade e tempo; ou um homogeneizador rotativo
(liquidificador), a velocidade nominal de que é entre 8 000 rpm e 45 000 rpm,
com vidro esterilizável ou tigelas de metais equipados com tampas, ou um
misturador de vibração (pulsifier) com sacos estéreis, ou outro sistema de
homogeneização com eficiência equivalente.
Em certos casos, mistura manual pode ser feita usando pérolas de vidro
estéreis com diâmetro adequado (Cerca de 6 mm; ver POP MET MIC 002).
5.4.2 Uso
O tempo de funcionamento normal de um homogeneizador peristáltico é de 1
min para 3 min (ver POP MET MIC 002 para determinados alimentos).
Não use este tipo de aparelhos para determinados gêneros alimentícios, tais
como:
produtos que correm o risco de punção da bolsa (presença de nítidas, as
partículas duras ou secas);
produtos que são difíceis de homogeneizar por causa de sua textura (por
exemplo, salame).
O homogeneizador rotativo deverá funcionar por um período tal que o número
total de rotações é entre 15000 rpm e 20000 rpm. Mesmo com o mais lento
homogeneizador, este tempo não deve exceder 2,5 min.
O misturador de vibração pode ser usado para a maioria dos gêneros
alimentícios, incluindo produtos duros ou secos. O tempo de operação usual é
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0,5 min a 1 min. Se os micro-organismos são susceptíveis de serem
encontradas no fundo de estruturas coesas, a amostra deve ser cortada em
pedaços pequenos antes do processamento.
Contas de vidro podem ser usadas para a preparação, por agitação, de
suspensões iniciais de certos produtos viscosos ou espessos, em especial
determinados produtos lácteos (ver normas específicas).
5.4.3 Limpeza e desinfecção
Limpar e desinfetar homogeneizadores peristáltico e misturadores vibracionais
regularmente e após qualquer derrame do saco.
Para homogeneizadores rotativo, limpar e esterilizar o vidro ou tigela de metal
após cada utilização.
5.4.4 Manutenção
Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do
fabricante.
5.5 pHmetro
5.5.1 Descrição
Um medidor de pH é usado para medir a diferença de potencial, a uma
temperatura determinada, entre uma medição do eletrodo e uma referência, os
dois eletrodos sendo introduzidos no produto. Devem ser capazes de medir
com uma precisão de 0,05 unidades de pH e sua resolução será de 0,01
unidades de pH. O medidor de pH deve ser equipado com manual ou
compensação automática de temperatura.
NOTA: O eletrodo de medição e o eletrodo de referência normalmente são
agrupados em um sistema de eletrodos combinados.
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5.5.2 Uso
Um medidor de pH é usado para medir o valor de pH do meio de cultura e
reagentes, para verificar se o ajuste é necessário durante sua preparação e
como um controle de qualidade depois da esterilização.
Também pode ser usado para medir o valor de pH de amostras e suspensões
de amostras. O uso de um medidor de pH é discutido na área específica para
o produto a ser analisado, e em que as condições para a determinação do valor
de pH e para ajuste do valor do pH são especificados.
Ajustar o medidor de pH, conforme indicado no manual do fabricante para
medir o valor de pH em uma temperatura padronizada, por exemplo, 25 ° C.
Ler o valor de pH após a estabilização ser atingida. Registrar o valor para duas
casas decimais.
NOTA: A leitura pode ser considerada estável quando o valor de pH medido
durante um período de 5 s varia de acordo com pH não superior a 0,02
unidades. Usando eletrodos em boas condições, o equilíbrio é normalmente
alcançado dentro de 30 s.
5.5.3 Verificação e aferição
Verificar o medidor de pH de acordo com as instruções do fabricante, usando
pelo menos dois, e de preferência três padrões de soluções tampão, pelo
menos, diariamente antes do uso. Definir erros máximos admissíveis para esta
verificação, dependendo da utilização.
As soluções padrão devem ter valores de pH especificado para duas casas
decimais na temperatura de medição (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e / ou pH
9,00 a 25 ° C, de acordo com as instruções do fabricante).
Os padrões utilizados devem englobar o valor de pH a ser medido.
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Após a verificação do medidor de pH com as duas soluções tampão padrão
rastreáveis, o pH deve ser verificado pela uso de um terceiro tampão controle,
de, por exemplo, pH 5 ou 8.
Avaliar o medidor de pH quando as verificações derem um resultado que não
se enquadram nos erros máximos admissíveis e em acordo com as instruções
do fabricante.
Esta aferição pode ser seguida por uma calibração que permita estimativa da
incerteza de medição do medidor de pH.
5.5.4 Manutenção
Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante. É
necessário, em particular,
- o acompanhamento regular da condição dos eletrodos com relação ao
envelhecimento e sujidade, e
- o tempo de resposta e estabilidade.
Enxaguar os eletrodos com água destilada ou deionizada após cada utilização.
A fim de combater a sujidade e envelhecimento dos eletrodos, limpe-os
regularmente mais completamente de acordo com as instruções do fabricante.
Armazenar os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante.
5.6 Autoclave
5.6.1 Descrição
Uma autoclave permite que uma temperatura de vapor saturado seja atingida
na câmara, e é usado para a destruição de micro-organismos.
A autoclave deve ser equipada com
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- pelo menos uma válvula de segurança,
- uma torneira de drenagem,
- um dispositivo de regulagem permitindo que a temperatura na câmara para
ser mantida a + 3°C da meta de temperatura (para levar em conta a incerteza
de medição associada ao termopar de medição), e
- uma sonda de temperatura ou um termopar de gravação.
Também deve ser equipado com um temporizador e registrador de
temperatura.
5.6.2 Uso
Com a esterilização a vapor, todo o ar é expulso antes do acúmulo de pressão.
Se a autoclave não estiver equipada com um dispositivo de evacuação
automática, é necessário remover o ar até que um jato de vapor contínuo seja
emitido.
Para a destruição de micro-organismos, o vapor saturado na câmara deve
estar a uma temperatura de pelo menos 121°C.
Durante o mesmo ciclo de esterilização, não use o autoclave para esterilizar o
equipamento limpo (e/ou meio cultura) e, descontaminar equipamentos usados
(e/ou meios de cultura utilizados).
É preferível usar autoclaves separadas para estes dois processos. Após
autoclavagem, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro
da autoclave antes da remoção.
Por razões de segurança, não remova o conteúdo até que a temperatura caia
abaixo de aproximadamente 80°C.
5.6.3 Manutenção
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Limpe a câmara, as vedações de drenagem do filtro e porta regularmente.
Verificar a vedação da porta de integridade. Realizar operações de drenagem e
descalcificação, se necessário, em intervalos regulares. Siga as
recomendações do fabricante.
5.6.4 Verificação e calibração
A autoclave deve ser mantida em boas condições de funcionamento e deve ser
regularmente inspecionada pelas autoridades competentes, pessoal
qualificado, e em conformidade com as instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de
funcionamento e verificá-los regularmente.
Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de
operação e cada configuração de carga usada em prática. Este processo deve
ser repetido após o reparo ou modificação significativa. Suficientes sensores de
temperatura devem ser posicionados dentro da carga para demonstrar a
penetração de calor adequado em todos os locais. Validação e revalidação
devem considerar a adequação dos tempos de aquecimento e resfriamento,
bem como a temperatura de esterilização.
Para cada carga, no mínimo, um indicador de processo deve ser incluído no
centro da carga para verificar o processo de aquecimento onde um registro
rastreável da eficiência do processo não está disponível.
5.7 Preparador de Meio
5.7.1 Descrição
Um preparador de meio é desenvolvido principalmente para a esterilização de
grandes volumes de meio (>1L). É constituído por uma caldeira, compartimento
de água e um dispositivo de agitação contínua. O equipamento deve também
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ser equipado com um medidor de temperatura, medidor de pressão, timer, e
válvula de segurança.
Além disso, a unidade deve ter uma trava de segurança para impedir abertura
até que uma temperatura de <80 ° C seja alcançada.
5.7.2 Uso
Siga as instruções do fabricante em todos os momentos.
Todo o processo produtivo ocorre dentro do aparelho. Após a adição de todos
os ingredientes, eles são dissolvidos por agitação e aquecimento. Isto é
seguido pela esterilização.
5.7.3 Manutenção
Lavar o preparador e enxaguar abundantemente com água purificada entre
cada lote de meio.
5.7.4 Verificação
O preparador deve ser mantido em boas condições de funcionamento e
inspecionado regularmente por profissionais competentes, de acordo com as
instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de
funcionamento e verificar regularmente o seu desempenho.
Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de
operação e cada tamanho de carga utilizada na prática. Este processo deve ser
repetido após o reparo ou modificação significativa. Duas sondas de
temperatura, uma ao lado da sonda controle e outra adjacente a ele, devem ser
usadas para demonstrar aquecimento uniforme.
A temperatura e a duração de cada ciclo devem ser verificadas.
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5.8 Estufa
5.8.1 Descrição
Uma estufa consiste de uma câmara de isolamento que permite que a
temperatura seja mantida estável e distribuída de forma uniforme, dentro do
erro máximo admissível de temperatura especificado no método de ensaio.
5.8.2 Uso
Estufas devem estar equipadas com um sistema de regulação que permite que
a temperatura ou outros parâmetros sejam mantidos estáveis ao longo do
volume inteiro de trabalho. Definir o volume de trabalho para garantir que este
é seja alcançado.
Se a temperatura ambiente é próxima ou maior do que o da incubadora, é
necessário colocar um sistema de resfriamento para a câmara.
As paredes de estufas devem ser protegidas da luz solar.
Se possível, as estufas não devem ser completamente preenchidas em uma
única operação, porque os meios de cultura terão um longo tempo para entrar
em equilíbrio da temperatura, independentemente do tipo de estufa utilizada
(por convecção forçada de ar ou de outra forma). Evitar deixar a porta aberta
por longos períodos.
Ao carregar as estufas, deve ser dada atenção à circulação de ar (ver 10.2.4).
5.8.3 Limpeza e sanitização
Limpar e higienizar regularmente as paredes internas e externas da estufa e,
se for o caso, remover o pó do sistema de ventilação.
5.8.4 Verificação
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Verificar a estabilidade da temperatura e da homogeneidade da distribuição de
temperatura durante todo o volume de trabalho da estufa através do uso
simultâneo de termômetros ou termopares com conhecida precisão e faixa de
temperatura adequada.
Use as informações para definir a faixa de operação aceitável da incubadora e
a posição ideal do termômetro usado para monitorar a temperatura de trabalho.
Por exemplo, para atingir uma temperatura alvo de 37 ° C ± 1 ° C quando os
dados de um lado mostrarem um intervalo de 36,8 ° C para 37,3 ° C do outro
lado da estufa, em seguida, a faixa de operação deve ser reduzida para 36,2 °
C para 37,7 ° C, a fim de garantir que a todas as partes da estufa atinjam a
temperatura alvo de 37 ° C.
Este processo deve ser repetido após cada reparo ou modificação significativa.
A temperatura de operação deve ser verificada com um ou mais termômetros
de máxima e mínima ou termopares gravação, por exemplo.
O termopar ou termômetro de gravação utilizado para o monitoramento de
rotina da estufa deve ser fixado em uma posição definida a partir dos dados de
perfil como atingir a temperatura alvo.
Verifique a temperatura da estufa, pelo menos, a cada dia de trabalho. Para
este efeito, cada estufa deve incorporar pelo menos um dispositivo de medição
de trabalho, cuja sonda pode ser imersa em glicerol (ou outro dissipador de
calor apropriado) contida em um frasco lacrado.
Outros sistemas de verificação de desempenho equivalentes podem ser
utilizados.
5.9 Geladeira, câmaras frigoríficas
5.9.1 Descrição
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Estes são câmaras que permitem o armazenamento refrigerado. Para a
conservação de amostras de alimentos para análise, a temperatura será de
3°C +2°C (erro máximo admissível), exceto para aplicações específicas.
Para outros usos, a temperatura, salvo indicação em contrário, deve ser de 5°C
+3°C.
5.9.2 Uso
A fim de evitar a contaminação cruzada, use câmaras diferentes, ou pelo
menos diferentes recipientes, para alcançar separação física, para o
armazenamento de
- meios de cultura e reagentes não inoculadas,
- amostras de teste, e
- culturas de microorganismos e meios de cultura incubados.
Carregar geladeiras, chillers e câmaras frigoríficas de tal forma que a
circulação de ar adequada seja mantida e o potencial de contaminação cruzada
minimizado.
5.9.3 Verificação
Verifique a temperatura de cada câmara a cada dia de trabalho usando um
termômetro ou uma sonda instalada permanentemente. A precisão exigida do
dispositivo de monitoramento de temperatura é dependente do propósito para o
qual a unidade é utilizada.
5.9.4 Manutenção e limpeza
Realizar as seguintes operações de manutenção em intervalos regulares para
garantir a operação adequada:
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- remoção da poeira das pás do motor ou do exterior de troca de calor placas;
- descongelação;
- limpeza e higienização do interior das câmaras.
5.10 Freezer e congelador
5.10.1 Descrição
Um freezer é uma câmara que permite o armazenamento de produtos
congelados. A temperatura, a menos que especificada de outra forma, deve ser
inferior a -15 ° C, de preferência abaixo de -18 ° C para as amostras de
alimentos.
Um ultra-freezer é uma câmara que permite armazenamento de produtos
ultracongelados. A temperatura, a menos que necessite contrário, deve ser
abaixo de -70 ° C.
5.10.2 Uso
5.10.2.1 Freezer
Câmaras diferentes, ou pelo menos diferentes recipientes, devem estar
disponíveis para conseguir a separação física para o armazenamento de:
- reagentes não inoculados,
- amostras para análise, e
-culturas de micro-organismos.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, em
particular quando produtos descongelados são introduzidos.
5.10.2.2 Ultra-freezer
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É usado no armazenamento de micro-organismos de cultura referência, e / ou
de trabalho, e reagente.
Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, e evite a
contaminação cruzada entre micro-organismos e reagentes.
5.10.3 Verificação
Verificar a temperatura de cada câmara regularmente, usando um dispositivo
de monitorização de temperatura adequado.
5.10.4 Manutenção
Realizar regularmente as seguintes operações de manutenção:
- remoção da poeira das pás do motor e do externo de troca de calor placas (se
acessível);
- descongelação;
- limpeza e higienização do interior das câmaras.
5,11 Banho controlado termostaticamente (banho-maria)
5.11.1 Descrição
Um banho controlado termostaticamente, cheio de um líquido (água,
etilenoglicol, etc), com ou sem tampa ou equipado com outro dispositivo para
limitar a evaporação, é necessária para manter uma temperatura especificada.
Controle de temperatura é muitas vezes mais preciso do que em uma estufa
incubadora, permitindo erros máximos admissíveis de 0,5°C ou menores.
As temperaturas necessárias de trabalho e os erros máximos admissíveis são
estipulados em cada aplicação ou método. Um sistema de resfriamento é
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Revisão: 00
necessário para manter uma temperatura próxima ou abaixo da temperatura
ambiente.
5.11.2 Uso
Os principais usos são os seguintes:
- incubação a uma temperatura constante de meios de cultura inoculados;
- manutenção de ágar estéril fundido durante a preparação dos meios;
- manutenção de temperatura de ágar estéril fundido para uso em métodos
específicos;
- preparação de suspensões ou soluções de amostra inicial a uma temperatura
controlada;
- tratamento térmico de suspensões de amostra inicial a uma temperatura
controlada (pasteurização, por exemplo).
Onde o controle preciso da temperatura é necessário, o banho deve ser
equipado com uma bomba de circulação de água e um sistema de regulação
de temperatura automático. Qualquer agitação do líquido não deve causar
dispersão de gotículas.
Banhos com tampa são preferíveis para o uso preciso ou altas temperaturas.
Tampas inclinadas que permitem a drenagem de condensado devem ser
usadas.
Para a incubação dos caldos inoculados, manter o nível do líquido de modo
que a parte superior do caldo fique pelo menos 2 centímetros abaixo do nível
do líquido no banho durante todo o período de incubação.
Outros recipientes devem ser colocados dentro do banho de forma que o nível
do seu conteúdo seja inferior ao do líquido.
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A profundidade de imersão deve impedir a entrada de água através do
fechamento.
Dispositivos para manter a estabilidade dos recipientes podem ser necessários,
por exemplo, estantes.
Todos os recipientes devem ser secados após a remoção do banho e antes de
nova utilização.
5.11.3 Verificação
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura em todo o banho
antes do uso inicial e depois de qualquer reparo ou modificação que tenha um
efeito sobre o controle de temperatura.
Monitorar cada banho com um dispositivo termopar, termômetro, ou gravador
de temperatura com o mínimo adequado grau de incerteza de medição (ver
5.28.2), e independente do sistema de regulação de temperatura automático.
Um display digital também pode ser usado, desde que a sua precisão e
resolução sejam verificadas.
Monitorar a temperatura do banho durante cada uso ou pelo menos
diariamente, por períodos prolongados de incubação.
5.11.4 Manutenção
Banhos devem ser preenchidos com líquido, tal como recomendado pelo
fabricante. Para a incubação das culturas, água destilada ou deionizada deve
ser preferencialmente utilizada.
Verifique regularmente o nível do líquido para garantir o correto funcionamento
do banho e imersão satisfatória de itens na banheira. O nível do líquido deve
cobrir sempre os elementos de aquecimento.
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Banhos devem ser esvaziados, limpos, higienizados e reabastecidos
regularmente e com uma frequência dependendo do uso, ou depois da
ocorrência de um derrame.
5.12 Vaporizadores, incluindo banhos de água fervente
5.12.1 Descrição
Vapor de água fervente e banhos consistem de um elemento de aquecimento
cercado por água em um recipiente com uma tampa aderente. Um banho de
água fervente aquece a água a uma temperatura igual ou próxima ao ponto de
ebulição, com ou sem a produção de vapor.
5.12.2 Uso
Os principais usos são os seguintes:
-derretimento de ágar;
- preparação de meio termo lábil;
- redução da contaminação de pequenos itens de equipamentos entre o uso.
O nível seguro e adequado de água deve estar presente no recipiente para
garantir que os elementos de aquecimento estão cobertos em todos os
momentos.
Autoclave com um compartimento para liberar vapor também pode ser usado.
5.12.3 Manutenção
Mantenha vaporizadores e banhos de água fervente com água limpa.
Se necessário, descalcificação regular deve ser feita a uma frequência
dependente da dureza da água local.
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5.13 Forno de esterilização
5.13.1 Descrição
Um forno de esterilização é uma câmara que é capaz de manter uma
temperatura de 160°C a 180°C para a destruição de micro-organismos pelo
calor seco.
5.13.2 Uso
Apenas os equipamentos robustos, como vidro e metal para devem ser
esterilizados no forno de esterilização, não usá-lo para artigos de plástico e
borracha.
Antes da esterilização, limpe todos os vidros e metais para serem esterilizados
no forno.
Se vidro volumétrico for esterilizado no forno de esterilização, deve-se verificar
regularmente a precisão dos volumes marcados.
A temperatura deve ser uniforme em toda a câmara. O forno deve estar
equipado com um termostato e um dispositivo de termômetro ou de gravação
de temperatura com precisão adequada.
Deve ser equipado com um indicador de tempo, ou temporizador.
Uma vez que a temperatura de funcionamento é atingida, o processo de
esterilização deve durar pelo menos 1 hora a 170°C ou uma equivalente
combinação de tempo/temperatura.
Após a esterilização, para evitar rachaduras, vidros devem ser mantidos no
forno até seu resfriamento antes da remoção.
5.13.3 Verificação
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Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura durante todo o forno
antes do uso inicial e depois de qualquer reparação ou modificação que possa
ter um efeito sobre o controle de temperatura.
O forno deve estar equipado com um dispositivo termopar termômetro, ou
temperatura de gravação-calibrada de precisão adequada, que é independente
do sistema de regulação de temperatura automático. O monitoramento do
dispositivo deve ter uma resolução de 1°C, ou melhor, na temperatura do forno
utilizado.
A temperatura do forno deve ser monitorada e gravada durante cada uso.
5.13.4 Manutenção
Limpar as superfícies internas quando necessário.
5.14 Microondas
5.14.1 Descrição
Um forno de micro-ondas é um dispositivo que permite o aquecimento de itens
por energia de micro-ondas em pressão atmosférica.
5.14.2 Uso
o uso disponível do equipamento atualmente é apenas para aquecer líquidos
ou derreter meios de cultura com ágar.
ATENÇÃO - Não aqueça meios contendo componentes sensíveis ao calor
no microondas a menos que tenha sido verificado que esta forma de
aquecimento não tem nenhum efeito sobre o desempenho do meio.
Nenhuma avaliação ainda foi feita da eficiência do micro-ondas para
esterilizar meios de cultura e fornos de micro-ondas não devem ser usado
para esta finalidade.
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Emissão: 02/07/12 Página:36 de 119
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O forno deve ser capaz de aquecer líquidos e meios de cultura de forma
controlada através de um ciclo de emissão de micro-ondas. A distribuição das
micro-ondas deve ser homogênea para evitar zonas de superaquecimento.
Fornos equipados com disco girador ou um agitador para o micro-ondas
possuem uma melhor distribuição de calor.
Não utilize o equipamento de metal, incluindo os fechos de metal. Solte tampas
de garrafas ou tampas antes do aquecimento.
Aquecimento por períodos mais longos em avaliações de baixa potência pode
dar uma melhor distribuição de calor.
ATENÇÃO - Manuseie itens aquecidos com cuidado. Conteúdo podem se
tornar superaquecidos e podem ferver para fora das garrafas ou as
garrafas podem explodir.
O ágar deve derreter em uma configuração de baixa potência (por exemplo,
ciclo de degelo), e um dissipador de calor da água (por exemplo, 50 ml a 100
ml de água em um copo de micro-ondas) são recomendados para auxiliar o
controle do processo de aquecimento.
Um tempo de espera de pelo menos 5 min é recomendada após o processo de
aquecimento antes da remoção do frasco, do forno de micro-ondas.
5.14.3 Verificação
Tempos de aquecimento adequado e ajustes de potência devem ser
estabelecidos primeiro para os diferentes volumes de líquidos e meios de
cultura rotineiramente manuseados, para garantir um ótimo desempenho e
evitar superaquecimento de produtos sensíveis.
5.14.4 Manutenção
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Emissão: 02/07/12 Página:37 de 119
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Limpar o forno imediatamente caso ocorra qualquer derrame, bem como em
intervalos regulares, dependendo do uso.
Selos de porta dos fornos devem ser inspecionados para verificação da
integridade e o forno checado para vazamento de radiação em intervalos
regulares.
5,15 Lavador de vidro
5.15.1 Descrição
Lavadores de vidro de laboratório são máquinas controladas eletronicamente
para lavagem geral de vidraria de laboratório, que podem ser programadas
para diferentes ciclos de lavagem e enxágue (por exemplo, água destilada ou
deionizada ou ácido).
Dispositivos para lavagem de pipetas de vidro são lavadores de vidro
projetados especialmente para limpar os orifícios estreitos de pipetas.
5.15.2 Uso
Muitos tipos de máquina de lavar vidro estão disponíveis, e estes são,
geralmente, instalados e utilizados de acordo com instruções do fabricante.
5.15.3 Verificação
Verificar a eficácia da limpeza por inspeção visual e, em aplicações críticas,
realizar testes para assegurar que o vidro esta isento de substâncias inibidoras.
Resíduos alcalinos ou ácidos podem ser verificados por meio de uma solução
deindicador de pH, um pH dentro da faixa de 6,5 a 7,3 deve ser alcançado.
5.15.4 Manutenção
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Programar manutenção regular, conforme especificado pelo fabricante, com
uma frequência adequada.
Manutenção mais frequente pode ser necessária para equipamentos muito
usados ou em áreas de águas duras.
5.16 Microscópio óptico
5.16.1 Descrição
Existem diferentes tipos de microscópio: binocular, monocular, com um sistema
de visualização por monitor, equipados com uma câmera de fluorescência, com
uma fonte de luz interna ou externa. Para exames bacteriológicos, objetivas de
10X (lente seco) a 100X (imersão em óleo e com mola turret) são usados para
obter uma ampliação total de 100 a 1000X. Microscopia de contraste de fase
também é de valor inestimável para o exame de "Preparações liquidas".
5.16.2 Uso
Configure o sistema ótico do microscópio de acordo com as instruções do
fabricante. O eixo óptico da luz da lâmpada de alta intensidade deve passar
pelo centro do condensador de sub-estágio, o deslizador e a lente objetiva pela
ocular para que aberrações esféricas e cromáticas não ocorram.
5.16.3 Manutenção
Siga as instruções do fabricante para o armazenamento, a limpeza e
manutenção. Evitar a condensação que ocorre quando a umidade é alta, pois
isso pode levar à deterioração da qualidade da lente.
Cada dia ou após o uso, remover o óleo das lentes de imersão e peças
relacionadas com o tecido da lente. Use um solvente recomendado pelo
fabricante. Regularmente remover da lente ocular a gordura causada por cílios.
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O sistema óptico pode ser facilmente danificado, é desejável que a
manutenção seja feita de preferência pelo fabricante.
5.17 Bico de Bunsen ou incinerador de fio
5.17.1 Descrição
Bico de Bunsen produz uma chama nua estreita a partir de rede de gás ou
bujão. Variando a quantidade de ar misturado com o gás para controlar o grau
de calor produzido.
Incineradores de fio usam gás ou eletricidade para alcançar calor vermelho
sem uma chama para esterilizar alças ou agulhas usados para a manipulação
de culturas.
5.17.2 Uso
Um bico de bunsen é usado principalmente para a esterilização de alças de
metal e agulhas, trazendo-os ao calor vermelho e para outros pequenos itens
de equipamentos duráveis a chama - esterilizante.
O incinerador de fio é usado para esterilizar alças de metal e agulhas, e é
preferido ao manusear bactérias patogênicas, uma vez que evita respingos e
evita riscos de contaminação cruzada.
Queimadores a gás podem produzir muito calor e turbulência do ar no
laboratório.
Técnica de assepsia pode ser alcançada sem um queimador de gás, utilizando
materiais descartáveis. Em cabines de segurança biológica, o uso de
queimadores a gás deve ser evitado, pois podem interferir inaceitavelmente
com o fluxo laminar de ar. Neste caso, o uso de material descartável estéril é
recomendado.
5.17.3 Manutenção
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Limpar e desinfetar regularmente bicos de bunsen e capas dos incineradores
de fio, especialmente se qualquer cultura microbiana tiver sido derramada
sobre os dispositivos.
5.18 Dispenser para meios de cultura e reagentes
5.18.1 Descrição
Um dispensador é um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios
de cultura e reagentes em tubos, frascos ou Placas de Petri. Tais dispositivos
variam de cilindros de medição simples, pipetas ou seringas manuais, até
seringas automáticas e bombas peristálticas programáveis por dispositivos
controlados eletronicamente, com uma entrega variável automática.
5.18.2 Uso
Equipamento limpo usado para distribuição de meios de cultura e reagentes
deve estar livre de substâncias inibidoras. Usar tubulação separada para meios
seletivos para minimizar o carreamento de tais substâncias.
Se a distribuição asséptica de meios de cultura estéreis e reagentes é
necessária, todas as partes do equipamento de dispensação em contato com o
produto devem ser estéreis.
5.18.3 Verificação
A incerteza de medição do instrumento ou aparelho deve ser adequada para o
máximo de erro admissível no volume a ser dispensado, que não deve exceder
5% rotineiramente. O máximo de erro admissível em medição de volumes de
líquido de diluição usado para preparar diluições decimais é 2%.
Verifique volumes dispensados antes do uso inicial, depois, regularmente, de
acordo com um cronograma documentado, e sempre após os ajustes que
afetam o volume dispensado.
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5.18.4 Limpeza e manutenção
Limpar a superfície externa do dispenser após cada utilização. Lavar e
enxáguar bem todas as partes do dispenser que entrarem em contato com o
produto e esterilizá-los se necessário para o uso em líquido estéril. Não utilizar
desinfetantes em superfícies que entrem em contato com o produto para ser
dispensado, pois podem transmitir propriedades inibidoras.
Todos os dispensadores automáticos deverão ser mantidos em boas condições
de manutenção, de acordo com as instruções do fabricante.
5.19 Vórtex
5.19.1 Descrição
Este instrumento facilita a mistura homogênea de meios líquidos (por exemplo,
diluições decimais e amostras de líquido para teste) ou suspensões de células
bacterianas em um líquido.
A mistura é alcançada por um movimento de rotação excêntrica do conteúdo
do tubo ou recipiente (produzindo um vórtex).
5.19.2 Uso
Pressione a base do tubo ou recipiente contendo o líquido a ser misturado
contra a cabeça do mixer. A velocidade de mistura é controlada pela variação
da velocidade do motor ou o ângulo de contato com a cabeça do mixer.
O operador deve assegurar que o derramamento não ocorra durante a mistura,
ajustando a velocidade quando necessário e segurando o tubo
aproximadamente um terço de seu comprimento abaixo do topo, a fim de ser
capaz de controlar melhor o tubo e, evitar que o líquido suba muito alto no tubo.
Precauções apropriadas devem ser tomadas para minimizar a libertação de
aerossóis ao abrir recipientes em agitação.
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5.19.3 Verificação
Mistura adequada é evidenciada pelo aparecimento de um vórtice em toda a
profundidade do líquido durante a operação de mistura.
5.19.4 Manutenção
Manter o equipamento limpo. Se ocorrer o derramamento, descontaminar o
equipamento usando um desinfetante de laboratório adequado.
5.20 Contador de Colônias
5.20.1 Descrição
Contador de colônias manual utiliza dispositivo de contagem acionadas por
pressão e, geralmente, dão uma indicação audível de cada contar e possuem
um visor digital da contagem geral. Elas podem ser simples dispositivos pen-
like ou podem consistir de um suporte iluminado com uma grade calibrada para
a placa e uma lente de aumento para ajudar na detecção de colônia.
Contadores de colônia eletrônicos automatizados, analisadores de
incorporadores de imagem, operam por uma combinação de sistemas de
hardware e software, incorporando o uso de uma câmera e um monitor.
5.20.2 Uso
Seguir as instruções do fabricante. Ajustar a sensibilidade de um contador
automático para garantir que todas as colônias serão contadas. Contadores
eletrônicos automatizados de colônia também exigem programação separada,
quando utilizado com diferentes tipos de agar e matrizes, e para a contagem
em spread plate e pour plate, para assegurar adequada discriminação de
colônias alvo.
5.20.3 Verificação
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Verificações devem ser feitas manualmente em uma base regular para
assegurar que as contagens precisas são obtidas utilizando um contador de
colônia.
Além disso, contadores de colônias automatizados devem ser verificados a
cada dia de utilização com uma placa de calibração contendo um conhecido
número de partículas contável ou colônias.
5.20.4 Manutenção
Manter o equipamento limpo e livre de poeira, evitar arranhar as superfícies
que são um elemento essencial do processo de contagem. Programar a
manutenção periódica de contadores eletrônicos que incorporam analisadores
de imagem como especificado pelo fabricante, em uma freqüência adequada.
5.21 Equipamento para cultura em atmosfera modificada
5.21.1 Descrição
Este pode ser um frasco que possa ser hermeticamente fechado ou qualquer
outro equipamento apropriado que permita condições de atmosfera modificada
(por exemplo, para anaerobiose) para ser mantido durante o tempo total de
incubação do meio de cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente
tais como cabines de anaerobiose, podem ser usados.
Siga as instruções do fabricante para a instalação e manutenção.
5.21.2 Uso
A composição da atmosfera necessária pode ser obtida por meio da adição de
uma mistura de gases (por exemplo, de um cilindro de gás) após a saída do ar
do frasco, pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por qualquer
outro meio apropriado (como pacotes de gás disponível no mercado).
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Em geral, incubação anaeróbica requer uma atmosfera de menos de 1% de
oxigênio, 9% a 13% de dióxido de carbono; incubação microaeróbica
(capnaeróbica) requer uma atmosfera de 5% a 7% de oxigênio e cerca de 10%
de dióxido de carbono.
Condições talvez precisem ser modificadas dependendo das exigências do
micro-organismo específico.
5.21.3 Verificação
Coloque um indicador biológico ou químico para monitorar a natureza da
atmosfera em cada câmara durante cada uso. Crescimento da estirpe controle
ou uma mudança de cor do indicador químico verifica se as condições de
incubação apropriada foram alcançadas.
5.21.4 Manutenção
Se um catalisador é montado, deve-se regenerá-lo regularmente, em
conformidade com as instruções do fabricante. Se as válvulas estão instaladas,
limpar e lubrificar-las para garantir o funcionamento correto e substituir se
necessário.
Regularmente limpar e higienizar o equipamento.
5.22 Centrífuga
5.22.1 Descrição
Centrífugas são dispositivos operados mecânica ou eletronicamente que usam
a força centrífuga para separar partículas suspensas, incluindo micro-
organismos, a partir de fluidos.
5.22.2 Uso
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Em algumas aplicações, a concentração de micro-organismos alvo é atingida
por centrifugação de amostras de líquido para promover a formação de um
deposito que pode ser ressuspendido em líquido e submetido a um exame
mais aprofundado.
Tomar as precauções necessárias para impedir a geração de aerossóis e
contaminação cruzada, pelo uso correto do equipamento e o uso de tubos de
centrifugação fechados e estéreis ou potes.
5.22.3 Verificação
Onde a velocidade de centrifugação é crítica ou especificada no ensaio, utilizar
regularmente um indicador de velocidade e tacômetro calibrado independente,
e sempre após reparos ou modificações significativas.
5.22.4 Manutenção
Limpar e desinfetar centrífugas regularmente e após qualquer derrame
envolvendo culturas microbianas ou amostras potencialmente contaminadas.
Centrífugas devem ser sofrer manutenção regularmente.
5.23 Placa de aquecimento
5.23.1 Descrição
Placas de aquecimento são dispositivos de aquecimento controlados
termostáticamente. Alguns equipamentos incorporam sistemas de agitação
magnética.
5.23.2 Uso
Placas de aquecimento equipados com sistemas de agitação magnética são
utilizados para aquecimento de grande volumes líquidos, tais como meios.
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Não use placas de aquecimento sem sistemas de agitação para a preparação
dos meios de cultura.
5.23.3 Manutenção
Limpar qualquer derrame logo que a unidade for resfriada.
5.24 Plaqueador espiral automático
5.24.1 Descrição
O plaqueador espiral automático é um equipamento que distribui um volume
predeterminado de líquido sobre a superfície de uma placa de ágar em rotação.
O braço de distribuição se move do centro do placa para a borda de fora,
formando uma Espiral de Arquimedes. O volume dispensado diminuí assim que
o dispensador de distribuição se move do centro para a borda da placa, de
modo que se forme uma relação inversa entre o volume depositado e o raio da
espiral. O volume da amostra dispensado em qualquer segmento específico é
conhecido e é constante. Uma fonte de vácuo é necessária para o
carregamento e distribuição de líquidos.
5.24.2 Uso
O equipamento é utilizado para dispensar uma amostra de líquido, uma
amostra homogeneizada ou uma diluição em uma placa de ágar adequada, a
fim de determinar a contagem de colônias. Após a incubação, as colônias se
desenvolvem ao longo das linhas onde o líquido foi depositado. O número de
colônias em uma área conhecida é contada usando uma grade de contagem
fornecido com o equipamento e a contagem calculada.
A superfície da placa de ágar usada como base deve ser reta e livre de bolhas
de ar.
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As placas devem ser pré-secadas antes do uso para garantir que estão livres
do excesso de umidade.
O sistema de distribuição deve ser higienizado e lavado com água estéril antes
de cada amostra e após o uso.
5.24.3 Verificação
Verificar o ângulo de ponta da caneta diariamente usando um vácuo para
segurar uma lamínula sobre a face da caneta. A tampa de deslizamento deve
ser paralela e a 1 mm da superfície do ágar.
O padrão de distribuição deve ser verificado por meio da supressão de tinta
lavável. O padrão espiral deve ser mais denso próximo ao centro do placa onde
a deposição começa e tornar-se cada vez menos denso, no ponto de saída da
caneta. A porção clara da placa deve ser central e com cerca de 2,0 cm de
diâmetro.
Uma verificação diária deve ser realizada para garantir que a ponta da caneta
esteja no ângulo correto para a superfície do ágar usando a tampa de
deslizamento e indicador de nível fornecido com o instrumento.
A esterilidade da placa espiral deve ser verificada por plaqueamento de água
estéril para cada série de amostras examinadas.
Uma verificação gravimétrica do volume de dispensados deve ser realizada
regularmente com água destilada. A massa obtida deve estar dentro de um
erro máximo admissível de +5% da massa esperada para o volume
dispensado.
5.24.4 Manutenção
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Desinfecção da tubulação de distribuição e da caneta pode ser conseguida
através de lavagem com uma solução contendo 0,5% a 1% de cloro livre. Isto
deve ser seguido por enxágue com água destilada ou deionizada estéril.
Bloqueios podem ser evitados utilizando suspensões ou uma parcela do líquido
sobrenadante, para que todas as partículas sejam removidas antes da
colocação da suspensão da amostra.
Eventuais derrames devem ser removidos imediatamente e os equipamentos
limpos em uma base regular.
O equipamento deve ser reparado e verificado de acordo com o uso.
5.25 Destiladores, deionizadores e aparelhos de osmose reversa
5.25.1 Descrição
Estes dispositivos são usados para produzir água destilada ou deionizada/
desmineralizada com a qualidade exigida para a preparação de meios de
cultura microbiológicos ou reagentes de laboratório e para outras aplicações.
5.25.2 Uso
Instalar, autorizar e usar equipamentos em conformidade com as instruções do
fabricante, tendo em conta a localização da água de laboratório, resíduos e
serviços elétricos.
5.25.3 Verificação
Água deve ser controlada regularmente, ou quando usada após o
armazenamento para condutividade satisfatória, e não será mais de 25 μS/cm
(equivalente a uma resistividade > 40 000Ω cm) para o preparo de meios e
reagentes.
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Se a água é armazenada antes do uso ou produzida através de um trocador de
íons, controles adequados de contaminação microbiana devem ser realizados
em conformidade com o POP MET MC 001.
5.25.4 Manutenção
Destiladores devem ser limpos e descalcificados com uma freqüência
dependente da dureza da água de entrada. Deionizadores e aparelhos de
osmose reversa devem ser mantidos de acordo com as instruções do
fabricante.
5.26 Temporizadores e dispositivos de temporização (timer)
5.26.1 Descrição
Dispositivos de temporização e temporizadores integrais são instrumentos que
permitem que o período de tempo correto seja usado para muitas aplicações
no laboratório, onde a duração é especificada e crítica.
5.26.2 Uso
Timer analógico ou digital, portátil ou de bancada são usados para monitorar a
duração das operações de laboratório (Por exemplo, aplicação de manchas de
filmes microbianos, homogeneização das amostras) devem estar em boas
condições de funcionamento e capazes de alcançar a precisão exigida.
Operar timer integrado sobre equipamentos de laboratório (por exemplo,
autoclaves, centrífugas, homogeneizadores), em conformidade com as
instruções do fabricante. Estes temporizadores devem ser capazes de alcançar
a precisão exigida.
5.26.3 Verificação
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Verifique todos os temporizadores utilizados nas operações de laboratório,
onde a duração é fundamental para o resultado, com outro marcador de tempo
regularmente, e após reparos significativos.
5.26.4 Manutenção
Limpar e verificar regularmente o timer para o funcionamento correto.
Dispositivos de tempo integral devem ser verificados como parte do
procedimento de manutenção para o instrumento.
5.27 Pipetas e pipetadores
5.27.1 Descrição
Pipetas são dispositivos de vidro ou de plástico descartáveis usados para
fornecer volumes de materiais líquidos ou viscosos; pipetas graduadas
entregam volumes medidos com uma precisão que depende da especificação.
Pipetadores automáticos (mecânicos) equipados com pontas de plástico são
dispositivos que dispensam volumes fixos ou ajustáveis de líquidos,
manualmente ou por ação de pistão operado eletronicamente.
5.27.2 Uso
Descartar pipetas que estão danificadas ou quebradas.
Pipetas Pasteur estéreis ou pipetas graduadas e ponteiras devem ser
equipadas com uma ficha de lã de algodão não-absorvente para evitar
contaminação quando usado para manipular culturas microbianas.
Não executar pipetagem com a boca em instalações microbiológicas, exceto
para líquidos não-contaminados.
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Emissão: 02/07/12 Página:51 de 119
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Bulbos usados em pipetas Pasteur ou pipetas graduadas e em ponteiras para
pipetadores automáticos devem ser do tamanho correto para evitar saída de
liquido e garantir um funcionamento eficiente.
5.27.3 Verificação
Verificar se as pipetas graduadas entregam o volume correto, se o fabricante
não certificar a sua exatidão (veracidade e precisão).
Testar os pipetadores novos antes de entrar em uso, e em intervalos regulares,
dependendo da freqüência e natureza de uso, para confirmar que estão em
acordo com os erros máximos admissíveis definidos em norma específica.
Executar checagem gravimétrica intermediária usando água destilada ou
deionizada para garantir que os volumes dispensados permanecem dentro dos
erros máximos admissíveis.
Confira novos lotes de pipetas graduadas.
5.27.4 Manutenção
Descontaminar e limpar/ esterilizar apropriadamente pipetas não-descartáveis
e pipetadores automáticos, após cada uso.
Se os barris ou pistões de pipetadores automáticos se contaminarem em uso,
desmontá-los para descontaminação e limpeza. Após a montagem, recalibrá-
los. Quando não for possível que isso seja feito em laboratório, retornar o
pipetadores ao fabricante para a montagem e recalibração.
5.28 Termômetros e dispositivos de monitorização da temperatura,
incluindo aparelhos de registro automático
5.28.1 Descrição
Termômetros são dispositivos de mercúrio ou álcool em vidro que são usados
para monitorar temperaturas em toda a gama de atividades de laboratório.
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Emissão: 02/07/12 Página:52 de 119
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Outros dispositivos de monitorização da temperatura incluem termômetros de
resistência de platina e os instrumentos que usam termopares para medir
temperatura e fornecer um registro visual, impresso ou eletrônico de
temperatura com variação do tempo.
Termômetros de referência e outros dispositivos de monitorização da
temperatura devem ser calibrados para padrões nacionais ou internacionais e
certificada como tal. Eles devem ser utilizados apenas como referência e não
deve ser utilizado para o monitoramento de rotina.
Termômetros de trabalho e outros dispositivos de gravação de temperatura
devem ser calibrados de forma que permita rastreabilidade a padrões nacionais
ou internacionais.
Dispositivos de precisão adequados, que estejam em conformidade com uma
especificação internacional ou nacional podem também ser usados como
termômetros de trabalho após verificação da sua performance.
5.28.2 Uso
Termômetros e outros dispositivos de monitorização da temperatura devem ser
capazes de medir a temperatura requerida por um aplicativo dentro de
determinados erros máximos admissíveis.
A incerteza de medição do dispositivo de monitoramento de temperatura deve
ser quatro vezes menor do que o alcance do erro máximo admissível solicitado.
Por exemplo, para um erro máximo permissível de +1°C, a incerteza de
medição deve ser de +0,25°C, para um erro máximo permissível de +0,5°C, a
incerteza de medição deve ser de ± 0,125°C. A incerteza de medição da
calibração do termômetro de referência também deve levar em conta a
determinação da temperatura de funcionamento.
Termômetros ou termopares colocados em incubadoras de ar devem ser
protegidos em recipientes adequados cheio de glicerol, parafina líquida ou
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Emissão: 02/07/12 Página:53 de 119
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polipropilenoglicol para proteger contra a perda de calor quando a porta é
aberta e fornecer uma leitura estável.
Usar termômetros de imersão total com apenas o bulbo imerso.
Termômetros colocados em banhos-maria devem ser imersos na água, em
conformidade com as especificações individuais, por exemplo, imersão parcial
termômetros devem ser imersos na profundidade especificada para esse
termômetro, por exemplo, 76 mm ou 100 mm.
Não usar termômetros se a coluna de mercúrio ou álcool estiver quebrada.
Termômetros de mercúrio em vidro são frágeis e, se houver um risco de
quebra, eles devem ser colocados dentro de dispositivos de proteção que não
interferem com as medições de temperatura.
AVISO - O mercúrio é perigoso para a saúde. Remover derrames, em
conformidade com regulamentos da legislação nacional.
5.28.3 Verificação
Termômetros de referência devem ser calibrados em todos os pontos com
padrões rastreáveis nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial
e pelo menos a cada 5 anos. Verificação intermediária de um único ponto de
calibração (por exemplo, ponto de gelo) deve ser realizada para verificar o
desempenho.
Termopar de referência deve ser totalmente calibrado com padrões rastreáveis
nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial e de acordo com
instruções do fabricante. Verificações intermediárias são efetuadas com um
termômetro de referência para verificar o desempenho.
Outros dispositivos de monitorização da temperatura (como receptores de
ondas de rádio) devem ser calibrados com padrões rastreáveis de acordo com
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Emissão: 02/07/12 Página:54 de 119
Revisão: 00
normas nacionais ou internacionais, em conformidade com as instruções do
fabricante.
Termômetros de trabalho e termopares devem ser verificados no ponto de gelo
e / ou com um termômetro de referência na faixa de temperatura de trabalho.
5.28.4 Manutenção
Manter termômetros e termopares em bom estado de limpeza.
Manter outros dispositivos de monitorização da temperatura de acordo com as
instruções do fabricante.
5.29 Separador imunomagnético
5.29.1 Descrição
Este equipamento é usado para separar e concentrar micro-organismos alvo
em culturas líquidas por meio de esferas paramagnéticas revestidas com um
anticorpo apropriado.
Separador manual consiste de um misturador rotativo capaz de ir de 12 RPM a
20 RPM, e um concentrador de partículas com uma barra magnética removível.
Separadores automáticos usam matrizes de barras magnéticas e suportes de
tubos. As partículas magnéticas mudam de tubo para tubo e permitem que o
processo inteiro de separação, incluindo as etapas de lavagem, possa ser
executado automaticamente em um ambiente fechado.
5.29.2 Uso e verificação
Siga as instruções do fabricante para uso e aquelas dadas em normas
específicas (por exemplo, E. coli O157).
Para o sistema manual, verificar a velocidade de rotação do misturador.
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Emissão: 02/07/12 Página:55 de 119
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Para sistemas manuais e automatizados, verifique se o sistema é capaz de
isolar em baixos níveis o micro-organismo alvo antes de colocá-lo em uso
rotineiro.
É importante valorizar o potencial de contaminação cruzada durante os
procedimentos de separação manual e tomar as medidas adequadas para
evitar que isso aconteça.
5.29.3 Manutenção
Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do
fabricante.
5.30 Sistema de filtragem
O sistema de filtração utilizado deve ser como descrito no POP MET MIC 003
ITEM XII.
5.31 Outros equipamentos e software
Outro equipamento e seu software associado deverão ser capazes de alcançar
a precisão necessária e deve estar em conformidade com as especificações
relevantes para os testes em questão. Programas de calibração devem ser
estabelecidos para quantidades ou valores fundamentais em que essas
propriedades têm um efeito significativo sobre o resultado. Antes de uso
rotineiro, calibrar ou verificar o equipamento para comprovar que ele atende
aos requisitos do laboratório e está em conformidade com as especificações
padrão. Quaisquer reconfigurações ou modificações feitas pelo laboratório para
o software devem ser verificadas para garantir que o software modificado de o
resultado correto.
6.0 PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE VIDRARIA DE LABORATÓRIO E OUTROS
6.1 Preparação
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Emissão: 02/07/12 Página:56 de 119
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Vidro e materiais de laboratório utilizadas em microbiologia devem ser de
projetos adequados, utilizados de forma adequada e preparados de modo a
garantir a sua limpeza e/ ou esterilidade até o momento do uso.
Deve ser projetado para evitar ou limitar o contato entre o operador e o material
infectante.
Tubos e garrafas devem ser fechados pelos meios adequados. Se necessário
vidros a serem esterilizados (pipetas, por exemplo) devem ser colocados em
recipientes especiais ou envolto em um material apropriado (papel especial,
papel alumínio, etc.) Vidraria para ser autoclavada vazia deve permitir o acesso
livre de vapor, caso contrário, a esterilização não será alcançada.
6.2 Esterilização / descontaminação
6.2.1 Geral
A temperatura e a duração da esterilização / descontaminação devem ser
registradas. Indicadores de esterilização podem ser usados para distinguir
entre materiais esterilizados e não esterilizados.
6.2.2 Esterilização por calor seco
Aquecer vidros, etc, em um forno de esterilização por pelo menos 1 hora a
170°C ou equivalente.
6.2.3 Esterilização por calor úmido (vapor)
Vapor úmido sob pressão é o método mais eficaz de esterilização de vidraria
de laboratório e materiais.
A temperatura da câmara de autoclave deve ser mantida em 121°C por pelo
menos 15 min (ver 5.6).
6.2.4 Descontaminação com compostos químicos
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Emissão: 02/07/12 Página:57 de 119
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Use compostos químicos (por exemplo, produtos à base de cloro, álcoois,
compostos quaternários de amônio) em concentrações adequadas e por um
tempo de contato adequado.
Assegurar que os resíduos químicos não afetará a recuperação de micro-
organismos.
6.3 Equipamentos e materiais descartáveis
Equipamentos e materiais descartáveis podem ser usados em vez de
equipamentos e materiais reutilizáveis (vidro, placas de Petri, pipetas, frascos,
tubos, alças, espalhadores, etc), se as especificações forem semelhantes.
É aconselhável verificar se tal equipamento é adequado para uso em
microbiologia (em especial no que diz respeito à sua esterilidade) e que o
material não contém substâncias que inibem o crescimento de micro-
organismos.
6.4 Armazenamento de objetos de vidro limpo e materiais
Proteger os vidros limpos e materiais contra a poeira durante o
armazenamento, em condições que irá manter a sua limpeza.
6.5 Gerenciamento de objetos de vidro esterilizado e materiais
Armazenar vidro e materiais em condições que garantam que eles
permaneçam estéreis. Armazenar equipamento de uso único, de acordo com
as instruções do fabricante, sem qualquer deterioração da embalagem.
Armazenar equipamentos de preparo de laboratório em condições limpas.
Quando o equipamento esterilizado é destinado para microbiologia, coloque
uma data de validade (ou data de fabricação) em cada pacote.
6.6 Uso de descontaminação e desinfecção
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Emissão: 02/07/12 Página:58 de 119
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6.6.1 Descontaminação de equipamentos descartáveis
Descontaminar material descartável antes da sua eliminação.
Além dos métodos descritos nesta cláusula, a incineração pode ser usada. Se
houver um incinerador no local, descontaminação e descarte podem ser
realizados em uma única operação.
6.6.2 Descontaminação de artigos de vidro e materiais antes da sua
utilização
Em geral, a esterilização dos equipamentos deve ser feito por calor úmido (ver
6.2.3) ou calor seco (ver 6.2.2).
Em certas situações (por exemplo, amostragem de campo), descontaminação
química pode ser apropriada. Após o tratamento, os equipamentos devem estar
livres de substâncias inibidoras.
6.6.3 Descontaminação de artigos de vidro e materiais após o uso
Materiais para descontaminação e eliminação devem ser colocados em
recipientes, por exemplo, sacos de plástico autoclavável. Autoclavagem é o
método preferido para todos os processos de descontaminação (pelo menos 30
min a 121°C). A autoclave deve ser carregada de uma maneira que favoreça a
penetração do calor para a carga (por exemplo, sem excesso de embalagem) e
tendo o cuidado de soltar tampas / abrir sacos.
Método alternativo, que não a autoclave, pode ser usado se for permitido pelos
regulamentos nacionais.
Autoclave todos os equipamentos que tenham estado em contato com culturas
microbiológicas (meios de cultura sólidos ou líquidos), incluindo frascos
reutilizáveis antes de serem lavados.
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Durante o exame, descontaminação por imersão em desinfetante preparada
recentemente use a diluição para equipamentos pequenos e equipamentos
resistentes à corrosão (pipetas, por exemplo).
Use pipetas Pasteur apenas uma vez.
A maioria dos desinfetantes (ver Anexo A) possuem alguns efeitos tóxicos. Use
luvas e óculos de proteção quando manusear desinfetante concentrado.
6.7 Gestão de resíduos
O descarte correto de material contaminado não afeta diretamente a qualidade
da análise da amostra, mas é uma questão de gestão de laboratório.
Deve estar de acordo com normas nacionais ambientais, de saúde e de
segurança.
Um sistema para a identificação e separação de materiais contaminados e
suas embalagens devem ser estabelecidos
- para lixo não contaminado (por exemplo, amostras de alimentos não
inoculadas) que pode ser descartado no lixo em geral,
- bisturis, agulhas, facas, vidro quebrado,
-material contaminado para autoclavagem e reciclagem, e
- material contaminado para autoclave e eliminação, ou para eliminação
somente se o material for ser incinerado (ver, No entanto, os requisitos
especiais para o risco de categoria 3 micro-organismos abaixo).
Incineração de materiais contaminados e seus recipientes devem ser
realizados em conformidade com a legislação nacional ambiental, de saúde e
de segurança.
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Materiais contaminados com micro-organismos de categoria risco de 3 e seus
recipientes devem ser autoclavados antes de serem incinerados.
6.8 Lavagem
Lavar equipamentos reutilizáveis somente depois de ter sido
descontaminados. Após a lavagem, enxágüe todo o equipamento com água
deionizada.
Equipamentos especializados podem ser usados para facilitar as operações de
limpeza (por exemplo, uma máquina de lavar pipeta, máquina de lavar louça,
através de ultra-som).
Após a lavagem, equipamentos reutilizáveis devem estar livres de resíduos que
possam afetar o crescimento subseqüente de micro-organismos.
7.0 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
Preparar e esterilizar meios de cultura, de acordo com as instruções do POP
MET MC 001.
8.0 AMOSTRAS DE LABORATÓRIO
8.1 Amostragem
8.1.1 Geral
Embora extremamente importante para a interpretação dos resultados,
amostragem e planos de amostragem não são uma parte desta Norma. É
importante que o laboratório receba uma amostra representativa do lote do
produto que não tenha sido danificada ou alterada durante o transporte e
armazenamento.
A amostra deve ser protegida contra a contaminação pelo ar esterno, o
recipiente da amostra, os dispositivos de amostragem usados e o manuseio
inadequado. Um recipiente da amostra não deve ter mais de três quartos do
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produto, a fim de evitar vazamentos e para permitir uma boa mistura da
amostra no laboratório.
Identificar amostras de forma clara e completa, e gravar a informação da
amostra.
Freqüentemente, a temperatura no momento da coleta e após o recebimento é
útil para o laboratório para a interpretação de resultados.
A amostra deverá ser apresentada na embalagem original, sem abrir.
Se o produto é volumoso ou em um recipiente grande demais para o envio para
o laboratório, transferir uma parcela da amostra assepticamente para um
recipiente estéril.
O recipiente da amostra estéril deve ser aberto apenas no tempo suficiente
para permitir que a amostra seja transferida e fechada imediatamente depois.
8.1.2 Plano de amostragem
O laboratório não realiza a amostragem dos produtos.
8.2 Transporte
O modo de transporte das amostras para o laboratório deve assegurar que eles
são mantidos em condições que irá minimizar qualquer alteração no número de
microorganismos presentes.
Entregar amostras para o laboratório imediatamente com as condições de
armazenamento original mantida tanto quanto possível.
A amostra deve ser acondicionada de modo a que a ruptura ou derrame seja
evitado.
O rótulo do produto deve indicar se a refrigeração é necessária.
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Amostras que não exigem refrigeração ou congelamento podem ser
acondicionadas em um recipiente que use material de embalagem adequado
para evitar a quebra.
Não use gelo solto, pois isso pode causar contaminação do produto, se houver
quebra de recipiente ou vazamentos.
Salvo disposição em contrário ao POP MET MIC 002 as seguintes
temperaturas durante transporte são recomendadas:
- produtos estáveis: temperatura ambiente (abaixo de 40°C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15°C, de preferência
abaixo de -18°C;
- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente: 1°C a 8°C;
- amostras de swab: ver ISO 17604.
Quando não há condições especificadas, é recomendável que as partes
envolvidas concordem com a duração e a temperatura de transporte.
8.3 Recebimento
Verificar as condições das amostras no recebimento.
Se sua condição não é satisfatória ou se as amostras são insuficientes, o
laboratório deve recusar amostras.
Em circunstâncias especiais, podem ser testados, após discussão e acordo
com o cliente.
No entanto, o relatório de ensaio deve incluir reservas sobre a validade dos
resultados.
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Documentar as amostras admitidas no laboratório de tal maneira que o seu
progresso até o momento da elaboração do relatório de ensaio possa ser
monitorado. A identidade e codificação das amostras e os registros devem
assegurar rastreabilidade em todas as fases no laboratório.
Se necessário, as superfícies externas das embalagens podem ser
desinfetadas com um desinfetante apropriado.
Verifique os recipientes de amostra para defeitos físicos evidentes.
Observe as seguintes informações:
- data (e hora, se for o caso) de recepção;
- detalhes da amostragem (data de amostragem e do tempo, se a condição de
amostra relevante e conhecida);
- nome do cliente e endereço.
Após a recepção de amostras perecíveis, registrar a temperatura de transporte
ou a temperatura de uma amostra simulada incluída para este fim.
Examine as amostras o mais rapidamente possível após a recepção, de
preferência no prazo de 24 h, ou conforme acordado entre as partes.
Para produtos altamente perecíveis (como crustáceos), os testes devem
começar no prazo de 24 h de amostragem. Para produtos perecíveis (tais como
peixes, leite cru), o teste deve começar dentro de 36 h.
Se os prazos dos testes mencionados acima não puderem ser respeitados, as
amostras podem ser congeladas a abaixo de -15 ° C, de preferência -18 ° C,
desde que tenha sido demonstrado que a recuperação do micro-organismo
alvo(s) não é significativamente prejudicada.
8.4 Armazenamento
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Armazene as amostras à espera do ensaio em condições que irá minimizar
qualquer alteração no número de micro-organismos presentes.
As temperaturas de armazenamento seguintes são recomendadas:
- produtos estáveis: temperatura ambiente (18 °C a 27 °C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15 °C, de preferência
abaixo de -18 °C;
- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente, incluindo alimentos
estragados: 3 °C 2 °C (ver POP MET MIC 002);
- amostras de swab: ver ISO 17604.
8.5 Porção de teste
8.5.1 Regras específicas para a tomada de porções para ensaio
Referem-se ao POP MET MIC 002 responsável pelas regras específicas da
retirada da porção de ensaio e preparação da suspensão e homogeneização
inicial.
8.5.2 Conservação e destruição de amostras de laboratório
Exceto em casos especiais, manter as amostras de laboratório até que todos
os resultados tenham sido obtidos, ou por mais tempo, se necessário, embalá-
las em um recipiente estéril (por exemplo, um saco plástico) e armazená-los
em sua temperatura de armazenamento original.
Produtos perecíveis devem ser congelados.
NOTA: Não é normalmente aceita a prática de retestar as amostras, devido a
possíveis mudanças no status microbiano.
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9.0 EXAME
9.1 Precauções de higiene durante a análise
Para evitar a contaminação do meio ambiente e das porções de teste,
manipular produtos em pó (desidratados) em uma sala ou área separada, ou
em uma cabine de segurança biológica.
Antes de abrir amostras comuns, passe álcool 70% (em volume) (ou outro
produto equivalente) ao redor do ponto de abertura previsto e deixe evaporar.
Antes de abrir embalagens esterilizadas, mergulhe a área a ser aberta em uma
solução contendo de 100 ppm a 200 ppm de cloro livre (ou outro esterilizante
adequado) por menos 10 min para destruir micro-organismos que possam
contaminar a amostra.
Qualquer instrumento utilizado para abrir a embalagem e retirar a totalidade ou
parte da amostra (abridor de latas, tesoura, colher, pinças, pipetas, etc) devem
ser esterilizados.
A área de trabalho adjacente deve ser limpa com um desinfetante apropriado
antes do início dos testes.
As mãos devem ser lavadas imediatamente antes de começar os testes e
novamente durante os testes se forem contaminadas.
Todos os instrumentos utilizados devem ser esterilizados e protegidos da
exposição à contaminação antes e durante o uso.
Todos os instrumentos e ferramentas utilizadas devem ser colocados em um
recipiente adequado para posterior eliminação ou esterilização.
Tomar precauções para que o trabalho seja realizado, na medida do possível,
sob condições assépticas. Por exemplo:
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a) certificar-se que a área de trabalho seja limpa, que todas as possíveis fontes
de contaminação sejam removidas ou reduzidas ao mínimo e que não haja
correntes de ar (ou seja, que as portas e janelas estejam fechadas), e evitar a
movimentação desnecessária de pessoal durante o exame;
b) antes e depois do trabalho, descontaminar a superfície de trabalho com um
desinfetante apropriado;
c) antes de começar, certifique-se que tudo que é necessário para a realização
do trabalho (e apenas isso) esteja disponível;
d) realizar o trabalho sem demora;
e) separar as atividades por tempo ou local em "limpa" e "suja" (isto é
particularmente importante com alto risco amostras, como carne crua e ovos
crus);
f) usar equipamentos descartáveis;
g) se todo o conteúdo de um maço de pipetas descartáveis, placas de Petri,
etc, não for utilizado durante o curso de um exame, certificar-se que a
embalagem está bem fechada após remoção do número apropriado de
unidades;
h) limpar imediatamente qualquer derramamento, por meio de almofadas de
algodão ou qualquer outro material apropriado impregnado com 70% (em
volume) de álcool ou qualquer outro desinfetante apropriado1), em seguida,
limpar e desinfetar a superfície de trabalho antes de continuar;
i) usar cabine de segurança para o manuseio de produtos susceptíveis de
conter bactérias patogênicas, se recomendado por regulamentação nacional;
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j) ao remover uma pipeta estéril de uma embalagem, não permita que a ponta
toque a superfície externa das pipetas restantes, pois tais superfícies estão
sujeitas à contaminação;
k) não permitir a pipeta tocar as bordas ou gargalos de garrafas de diluição.
1) Quando outros desinfetantes alem do álcool 70% (em volume) são usados,
os tempos de contato apropriado, de acordo com a instruções do fabricante,
são necessários para a desinfecção eficaz.
Os aerossóis são uma das principais causas de contaminação ambiental e de
infecção. Aerossóis podem ser formados por exemplo:
- ao abrir placas de Petri, tubos e frascos;
- quando se utilizar shakers, seringas, centrífugas, etc;
- ao esvaziar pipetas;
- ao esterilizar alças de inoculação ou agulhas;
- quando abrir ampolas contendo culturas liofilizadas.
Sua formação deve, portanto, minimizada.
9.2 Preparação da suspensão inicial e diluições
9.2.1 Geral
Prepare a suspensão inicial e diluições, de acordo com a parte relacionada no
POP MET MIC 002. O tempo que decorre entre o final da preparação da
suspensão inicial e o momento em que o inóculo entra em contato com o meio
de cultura não deve exceder 45 minutos, a não ser especificamente
mencionado em normas internacionais pertinentes.
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Emissão: 02/07/12 Página:68 de 119
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A suspensão inicial e as etapas de diluições podem ser seguidas por uma
etapa de enriquecimento, conforme descrito em normas específicas.
9.2.2 Concentração
9.2.2.1 Centrifugação ou filtração por membranas
Se for necessária a contagem de números baixos de micro-organismos, a
enumeração pode ser melhorada, tanto em termos de sensibilidade e precisão,
através da introdução de um teste de concentração de porção. Esta
concentração pode ser obtida por centrifugação ou filtração por membranas.
Se estiver usando a centrifugação, ressuspender o depósito centrifugado em
um volume conhecido de diluente e continuar a análise.
Para cada combinação (alimentos mais micro-organismo) considerar, realizar
um estudo prévio para demonstrar quando se deve fazer teste de concentração
de porção.
A filtrabilidade de suspensões de alimentos deve ser avaliada.
O desempenho do método global, em termos de sensibilidade, seletividade,
linearidade e repetibilidade, devem ser verificados.
Se o nível de contaminação é desconhecido, o método padrão (sem filtração)
deve ser conduzido em paralelo.
9.2.2.2 Imunosseparação
Se os números baixos de micro-organismos alvo estão presentes na amostra,
separação e concentração de micro-organismos podem ser alcançadas com
esferas imunomagnéticas revestidas com anticorpos específicos.
Espalhe as esferas, juntamente com os micro-organismos alvo capturado,
diretamente no meio sólido específico em acordo com as normas específicas.
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Emissão: 02/07/12 Página:69 de 119
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No entanto, verifique se as esferas imunomagnéticas revestidas com os
anticorpos específicos utilizados para esta etapa de concentração são
adequadas, como mostrado por estudos de avaliação publicado na literatura
científica internacional, de preferência relacionados com microbiologia
alimentar.
10.0 ENUMERAÇÃO
10.1 Geral
Ao avaliar a qualidade microbiológica e/ou segurança de alimentos e alimentos
para animais, muitas vezes saber se os micro-organismos estão presentes não
é suficiente para. Na maioria dos casos, o aspecto quantitativo é igualmente
importante, o que traz a necessidade de enumerar micro-organismos. Isto pode
ser conseguido de várias maneiras: através de exame direto (microscopia),
através da inoculação em meio sólido ou líquido, por citometria de fluxo, por
reação em cadeia da polimerase em tempo real, etc. No entanto, esta Norma
só cobre enumeração em meios sólidos e líquidos.
Enumeração em meios sólidos se baseia na capacidade de muitos micro-
organismos para produzir colônias no interior ou na superfície de ágar, que
pode ser reconhecido como tal a olho nu ou com o auxílio de uma lupa simples.
No entanto, se a matriz contém muitas partículas que podem interferir com a
detecção de colônias, ou se o nível de bactérias é muito baixo, este princípio
não pode ser utilizado sem antes se separar os micro-organismos alvos da
matriz (por exemplo, por filtração ou imunosseparação). Nesses casos,
enumeração com meios líquidos é muitas vezes uma alternativa mais
adequada.
10.2 Enumeração usando um meio sólido
10.2.1 Geral
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REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES MICROBIOLÓGICOS
Emissão: 02/07/12 Página:70 de 119
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Placa de Petri deve ser rotulada com o número da amostra, diluição, data e
qualquer outra informação desejada.
Diluições devem ser selecionadas para garantir que as placas obtenham o
número apropriado de colônias (ver 10.3.1) e elimine qualquer possibilidade de
propriedades inibidoras.
Usar uma pipeta estéril para transferências de cada diluição, salvo se trabalhar
a partir da maior diluição para a menor diluição.
10.2.2 Número de placas de Petri por diluição
Para as técnicas de enumeração em microbiologia alimentar, duas placas
devem ser utilizadas de acordo com o POP MET MIC 003 ITEM XII.
10.2.3 Técnica de pour plate
10.2.3.1 Geral
Retirar os volumes definidos da diluição a ser examinada, tocando a ponta da
pipeta contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido que aderirem
ao exterior. Levante a tampa da placa de Petri estéril apenas alto o suficiente
para inserir a pipeta, em seguida, dispensar o conteúdo. Despeje agar fundido
a 44°C a 47°C em cada placa de Petri 2). Evite derramar o meio fundido
diretamente sobre o inóculo. Imediatamente misture o meio derretida e o
inóculo cuidadosamente de modo a obter uma distribuição homogênea dos
micro-organismos dentro do meio. Permitia o esfriamento e solidificação,
colocando a placa de Petri sobre uma superfície fria horizontal (o tempo de
solidificação do Agar não pode exceder 10 minutos).
Depois de retirar agar temperado do banho-maria, seque a garrafa com uma
toalha limpa para evitar a água de contaminar as placas. Evite derramar o meio
do lado de fora da embalagem ou no interior da tampa da placa quando vazar.
Procedimento Operacional Padrão de Metodologias de Análises POP MET MIC 001
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Emissão: 02/07/12 Página:71 de 119
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Isto pode exigir que se segure a garrafa em uma posição quase horizontal, ou
evitando o ajuste da garrafa entre os passos derramamento.
Se existir a possibilidade da presença de colônias invasoras que façam
espalhamento (por exemplo, Proteus spp.). Está previsto que a placa a ser
examinada, possa ser coberta com ágar não nutritivo estéril ou Ágar idêntico ao
meio de cultura utilizado no teste 3), para evitar ou minimizar o espalhamento.
2) Geralmente 18 a 20 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri, para obter
pelo menos 3 mm de espessura.
3) Geralmente 5 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri.
10.2.4 Inoculação em superfície
10.2.4.1 Geral
Métodos de plaqueamento projetado para produzir apenas colônias de
superfície em placas de Agar têm certas vantagens sobre o método de placa
derramar. A morfologia de colônias de superfície é facilmente observada,
melhorando a habilidade do analista para distinguir entre diferentes tipos de
colônia.
Micro-organismos não são expostos ao calor do meio Ágar derretido, de modo
contagens mais altas podem ser obtidas.
Usar placas com pelo menos 3 mm de espessura do meio de Ágar, com
superfície lisa, e livres de bolhas de ar e umidade na superfície.
Para facilitar a disseminação uniforme, a superfície do Ágar solidificado deve
ser seca em conformidade com o POP MET MC 001 de forma que o inóculo
seja absorvido dentro de 15 min.
10.2.4.2 Método Spread-plate com alça de Drigalski
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Emissão: 02/07/12 Página:72 de 119
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Usando uma pipeta estéril, transferir o inóculo (geralmente 0,1ml ou 0,5ml) da
amostra teste líquida ou da suspensão inicial, no caso de outras amostras para
a placa de ágar (90 mm ou 140 mm de diâmetro, respectivamente). Repetir
este passo para a diluição decimal seguinte (as colônias para serem contadas,
deverão, estar presente em uma etapa de diluição de 10-1, no caso de material
da amostra de líquida e 10-2, no caso de amostra de outro material) e, se
necessário, repetir o procedimento para outras diluições decimais.
Se for necessário para detectar baixas contagens microbianas no caso de
certos produtos, o limite de detecção pode ser aumentado em um fator de 10,
analisando 1,0 ml da amostra no caso de produtos líquidos e 1,0 ml da
suspensão inicial no caso de outros produtos. Para esse fim, 1,0 ml do inóculo
é espalhado ou sobre a superfície de uma placa de Petri grande (140 mm de
diâmetro) ou sobre as superfícies de três pequenos placas de Petri (90 mm de
diâmetro).
Usando uma alça de Drigalski feita de vidro, plástico ou aço (por exemplo feito
de um bastão de vidro e em forma um taco de hóquei sobre 3,5 mm de
diâmetro e 20 cm de comprimento, dobrados em ângulo reto em cerca de 3 cm
de um lado e achatado nas extremidades por aquecimento), espalhar o inóculo
o mais rápido possível uniformemente sobre a superfície do ágar sem tocar as
paredes laterais da placa de Petri. Permitir que o inóculo seja absorvido na
placa com as tampas no lugar por cerca de 15 min à temperatura ambiente.
Em certos casos (como indicado em normas internacionais pertinentes), o
inóculo pode ser depositado em uma membrana, e espalhada em seguida,
como descrito anteriormente.
10.2.4.3 Método do plaqueamento em Spiral
10.2.4.3.1 Geral
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Emissão: 02/07/12 Página:73 de 119
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O método do plaqueamento em espiral para determinar o nível de micro-
organismos foi testado em ensaios interlaboratoriais com leite, produtos lácteos
e outros tipos de alimentos.
O equipamento utilizado – o plaqueador espiral automático - é descrito em
5.24.
10.2.4.3.2 Preparação da placa de ágar
Um dispensador automático com um sistema de entrega estéril é recomendado
para a preparação de placas de ágar, para garantir que as placas estão
niveladas.
Despeje a mesma quantidade de Ágar em todas as placas para que a mesma
altura do ágar seja dispensada a fim de manter o ângulo de contato correto.
Alternativamente, preparados de placas de ágar pronto para uso podem ser
usadas.
10.2.4.3.3 Processo de plaqueamento e contagem
Descontaminar a ponta da caneta e tubos puxando primeiro uma solução de
hipoclorito de sódio (ver 5.24.4) e depois água esterilizada através do sistema,
antes de tirar a amostra líquida para a caneta.
Colocar uma placa previamente derramada com ágar, na plataforma giratória
inferior a caneta. A amostra é diferencialmente dispersada conforme a ponta da
caneta passa na superfície da placa de ágar rotativo. Remover a placa
inoculada e devolver a caneta para sua posição inicial. Descontaminar a caneta
e carregar para a inoculação de uma outra placa.
Após a incubação, colocar a grade de contagem da placa espiral central no
lugar. Use a regra de 20 contagens para determinar a contagem. Escolher
qualquer fatia e começar a contar as colônias a partir da borda externa do
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Emissão: 02/07/12 Página:74 de 119
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primeiro segmento em direção ao centro, até que 20 colônias sejam contadas.
Completar através da contagem de colônias remanescentes na segmento a
partir da vigésima colônia. Contar uma área correspondente no lado oposto da
placa e dividir o número de colônias contadas em ambos os lados pelo volume
de amostra depositada nestas duas áreas. O volume de amostra associado a
cada parte da grade de contagem é dado no manual operacional que
acompanha cada plater espiral.
10.2.5 Incubação
Salvo recomendação contrária em normas específicas, inverter imediatamente
as placas após a inoculação, e colocá-las rapidamente na estufa incubadora à
temperatura adequada. Se a desidratação excessiva ocorrer (por exemplo, em
55 ° C ou em caso de forte circulação de ar), enrole os placas vagamente em
sacos plásticos antes da incubação ou usar qualquer sistema similar de
eficiência equivalente.
Durante o período de incubação, pequenas variações na temperatura de
incubação podem ser inevitáveis e é aceitável, por exemplo, durante as
operações usuais de carga ou descarga da estufa incubadora, mas é
importante que esses períodos sejam mantidos a um mínimo possível. A
duração destas variações deve ser monitorada para garantir que elas não
tenham um efeito significativo sobre o resultado.
NOTA: Em certos casos, pode ser útil para armazenar placas inoculadas em
3°C ± 2°C para usar em comparação com placas inoculadas e incubadas na
contagem, a fim de evitar confundir as partículas do produto a ser examinado
com colônias. A lupa binocular também pode ser usada para distinguir
partículas do produto das colônias.
Em determinadas circunstâncias, pode ser desejável para a organização do
trabalho no laboratório refrigerar as placas inoculadas por um período máximo
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de 24 horas antes da incubação. Se isso for feito, o laboratório deve assegurar
que essa prática não afete a contagem resultante.
Geralmente, placas de Petri não devem ser empilhadas em mais de seis placas
para incubação aeróbica e devem ser separadas umas das outras e das
paredes da incubadora pelo menos 25 mm. No entanto, pilhas maiores com
menos espaçamento pode ser aceitável em incubadoras equipadas com
sistemas de circulação de ar, neste caso, a distribuição de temperatura deve
ser verificada.
Após a incubação, as placas normalmente devem ser examinadas
imediatamente. Podem, no entanto, ser armazenadas, salvo descrito em
normas específicas, por até 48 h na geladeira. Armazenamento refrigerado por
períodos mais longos só é aceitável se tiver sido demonstrado que não têm
efeito sobre os números, à aparência ou a confirmação posterior das colônias.
Com certos meios contendo corantes indicadores, placas podem ser
refrigeradas para equilibrar a temperatura ambiente antes de se examinar, para
garantir que a cor correta tenha sido recuperada.
10.3 Cálculo e expressão dos resultados obtidos com meios sólidos
10.3.1 Contagem de colônias
Após o período de incubação indicado na norma específica, a contagem de
colônias (colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas) para cada
placa contendo menos de 300 colônias (ou qualquer outro número indicado na
norma específica).
Ao contar colônias típicas ou presuntivas, a descrição das colônias é a indicada
no padrão específico.
Em certos casos, pode ser difícil contar as colônias (por exemplo, quando os
micro-organismos espalhados estão presentes). Considerar colônias
espalhadas como colônias individuais. Se menos de um quarto da placa estiver
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coberto por espalhamento, contar as colônias na parte não afetada do placa e
calcular o número dele para toda a placa. Deduzir por extrapolação o número
teórico que deve corresponder à placa inteira. Se mais de um quarto estiver
coberto, descarte a contagem. Considerar colônias espalhadas como uma
colônia.
Nas diferentes modalidades de cálculo dado em 10.3.2, contagens tiradas das
placas que não contenham colônias, deverão ser feitas onde essas placas
foram mantidas.
Quando um plaqueador espiral automático tiver sendo usado, a contagem de
colônias é como descrito em 10.2.4.3.3.
10.3.2 Expressão dos resultados
10.3.2.1 Geral
10.3.2.1.1 Os casos de que trata este subitem são casos gerais:
- inoculação de uma placa de Petri 90 mm de diâmetro por diluição;
- número máximo de contagem para as colônias totais presentes: 300 por
placa;
- número máximo total de colônias (típicas e atípicas) em uma placa, em uma
contagem de colônias típicas ou presuntivas: de preferencialmente 300 por
placa;
- número máximo de contagem de colônias típicas ou presuntivas: 150 por
placa;
- número de colônias inoculadas presuntivas para identificação ou confirmação
(ver 10.3.2.3): em geral 5 em cada placa.
Estes números são definidos nas normas específicas.
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Quando as placas com um diâmetro diferente de 90 milímetros são usadas, o
número máximo de colônias deve ser aumentado ou diminuído em proporção à
área da superfície dos placas (ou membranas).
10.3.2.1.2 Os métodos de cálculo apresentados a seguir são para os casos que
ocorrem mais freqüentemente quando os testes são realizadas de acordo com
boas práticas de laboratório. Casos especiais podem acontecer
ocasionalmente (por exemplo, a relação dos fatores de diluição usada para
duas diluições sucessivas pode ser muito diferente), e é, portanto, necessário
que os resultados de contagem obtidos sejam analisados e interpretados por
um qualificado microbiologista e, se necessário, rejeitado.
10.3.2.2 Método de cálculo: caso geral (contagem de colônias total ou
colônias típicas)
Para um resultado ser considerado válido, é geralmente necessário contar as
colônias em pelo menos uma placa contendo pelo menos 10 colônias [colônias
total, colônias típicas ou colônias em conformidade com critérios de
identificação (Ver 10.3.2.3)].
Calcular o número N de micro-organismos presentes na amostra de teste como
uma média ponderada de duas diluições sucessivas através da Equação (1):
Onde,
é a soma das colônias contadas com duas placas retidas a partir de duas
diluições sucessivas, sendo que pelo menos uma das quais contenham um
mínimo de 10 colônias;
V é o volume de inóculo colocado em cada placa, em mililitros;
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d é a diluição correspondente à diluição primeiro retido [d= 1 é quando o
produto retido for um líquido não diluído (Amostra)].
Arredondar o resultado calculado para dois algarismos significativos. Ao fazer
isso, se a terceira figura for inferior a 5, não modificar a figura anterior, se a
terceira figura for maior ou igual a 5, aumente uma unidade do número anterior.
Expressar o resultado de preferência com um número entre 1,0 e 9,9
multiplicado pela potência de 10 adequada, ou um número inteiro com dois
algarismos significativos.
Exprimir o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro
(produtos líquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
a primeira diluição reteve (10-2): 168 colônias;
a segunda diluição reteve (10-3): 14 colônias.
Arredondando o resultado especificado acima, o número de micro-organismos
é 17000 ou 1,7 x 104 por mililitro ou por grama de produto.
10.3.2.3 Método de cálculo: após a identificação
Quando o método utilizado requer a identificação, um determinado número A
(geralmente 5) de colônias presuntivas devem ser identificadas a partir de cada
um das placas retidas para a contagem de colônias. Após a identificação,
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calcular, para cada uma das placas, o número α de colônias em conformidade
com os critérios de identificação, através da Equação (2):
onde
b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre
as colônias identificadas A;
C é o número total de colônias presuntivo contou com o placa.
Arredondar o resultado calculado para o número inteiro mais próximo. Ao fazer
isso, se a primeira figura após o ponto decimal for inferior a 5, não modificar a
figura anterior, se a primeira figura depois do ponto decimal for maior ou igual a
5, aumentar a figura anterior em uma unidade.
Calcular o número N de micro-organismos identificados presentes na amostra
de teste, substituindo por na equação dada em 10.3.2.2.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado, conforme especificado no 10.3.2.2.
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
a primeira diluição reteve (10-3): 66 colônias;
a segunda diluição reteve (10-4): 4 colônias.
Teste das colônias selecionadas foi realizado:
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- das 66 colônias, 8 colônias foram testadas, 6 dos quais cumpriu com os
critérios, α= 50;
- das 4 colônias, todas as 4 cumpriram os critérios, α= 4.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número de
micro-organismos é 49000 ou 4,9 x 104 por mililitro ou por grama do produto.
10.3.2.4 Método de cálculo: baixas contagens
10.3.2.4.1 caso quando uma placa (amostra ou suspensão inicial ou
primeira diluição) contém menos de 10 colônias
Contagens de 10, até o limite (prática) superior de cada método estão na faixa
de precisão ideal. Precisão diminui rapidamente à medida que o número de
colônias diminui abaixo de 10, no entanto. Dependendo da finalidade do teste,
um limite inferior de determinação pode ser definido como a seguir para
contagem inferior a 10.
A definição de limite de determinação é: concentração média mais baixa de
partículas x por porção analítica onde o padrão da incerteza relativa esperada,
é igual a um valor especificado (RSD)". RSD é o desvio-padrão relativo, que é
calculado dividindo-se a estimativa do desvio padrão s de uma população a
partir de uma amostra por dessa amostra. Em vez de RSD, símbolo o w será
usado para o desvio padrão relativo. Assim,
No caso de uma distribuição de Poisson, x é calculada pela equação:
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Se w é fixado em 50% para o limite de precisão relativa aceitável (o que parece
ser razoável em microbiologia), o limite inferior de determinação será o número
de colônias dadas por:
Assim, os resultados com base na contagem de menos de quatro deve ser
tratada como mera detecção da presença do micro-organismo.
Resumindo:
Se a placa tiver menos de 10 colônias, mas, pelo menos, 4, calcular o resultado
como dado, no caso geral (10.3.2.2), e relatá-lo como número x estimado de
micro-organismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros
produtos).
Se o total for de 3 a1, a precisão do resultado é muito baixa e o resultado
deverá ser reportado como:
"Os micro-organismos estão presentes, mas menos do que (4 x d) por grama
ou ml".
10.3.2.4.2 Caso onde a placa (amostra ou suspensão inicial ou primeira
diluição) não contém colônias
Se a placa que contém a amostra do teste (produtos líquidos) ou a suspensão
inicial (outros produtos) ou a primeira diluição inoculada ou retida não contém
quaisquer colônias, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:
"Inferior a 1/d micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos) ou "menos de
1/d micro-organismos por grama"(Outros produtos)
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onde d é o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição
inoculada ou retida (d= 100= 1 onde a amostra de teste inoculada diretamente
do produto líquido é retida).
10.3.2.4.3 Casos especiais
10.3.2.4.3.1 Geral
Estes casos dizem respeito à contagem de colônias típicas ou presuntivas.
10.3.2.4.3.2 Caso 1
Se o número de colônias típicas e atípicas para a placa tiver uma primeira
diluição d1 maior do que 300 (ou qualquer outro número indicado na norma
específica), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se, o placa
contendo o d2 diluição subsequente possuir menos de 300 colônias (ou
qualquer outro número indicado na norma específica), e nenhuma colônia típica
visível ou confirmada, relatar o resultado da seguinte forma:
"Menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por mililitro" (produtos
líquidos) ou "menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por grama
"(outros produtos), onde d1 e d2 são os fatores de diluição correspondente à
diluição d1 e d2.
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, com colônias
típicas ou confirmadas presente;
- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou
confirmadas presente.
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O resultado, expresso em micro-organismos, é menor que 1000 e maior que
100 por mililitro ou por grama de produto.
10.3.2.4.3.3 Caso 2
Se o número de colônias típicas e atípicas na placa, tiver uma primeira diluição
d1 maior do que 300 (ou qualquer outro número acima do indicado na norma
específica), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa
d2 contendo a diluição subsequente tiver menos de 300 colônias (ou qualquer
outro número indicado na norma específica) ou nenhuma colônia típica visível
ou confirmada, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:
"Menor que 1/d2 micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos), ou menor
que 1/d2 micro-organismos por grama" (Outros produtos)
onde d2é o fator de diluição correspondente à diluição d2.
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, sem colônias
típicas ou confirmadas presente;
- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou
confirmadas presente;
O resultado, expresso em micro-organismos, é inferior a 1000 por mililitro ou
por grama de produto.
10.3.2.5 Método de cálculo: casos especiais
10.3.2.5.1 Quando o número de colônias contadas (colônias total, colônias
típicas ou colônias presuntivas) é superior a 300 (ou qualquer outro número
indicado em norma específica) para a placa contendo uma primeira diluição d1,
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com um número de colônias (colônias totais, colônias típicas ou colônias em
conformidade com critérios de identificação) menor que 10 para a placa
contendo a diluição d2 subsequente:
- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 dentro do
intervalo de 334 a 300 (a parte superior do intervalo de confiança para uma
média ponderada igual a 300), use o método de cálculo para casos em geral
(ver 10.3.2.2);
- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 maior do que
334 (o limite superior do intervalo de confiança para uma média ponderada
igual a 300), apenas levar em conta o resultado da contagem de diluição d2 e
calcular uma contagem estimada (ver 10.3.2.4), exceto, quando um máximo de
300 for definido para a contagem de colônias, se esta contagem estimada for
inferior a 8 (limite inferior do intervalo de confiança para uma média ponderada
igual a 10), uma vez que a diferença entre as duas diluições é então
inaceitável.
Os números correspondentes aos intervalos de confiança devem ser
adaptados para o número máximo indicado para a contagem de colônias.
EXEMPLO1
Contagem produziu os seguintes resultados:
a primeira diluição reteve (10-2): 310 colônias;
a segunda diluição reteve (10-3): 8 colônias.
Usar o método de cálculo para os casos em geral, usando as duas placas
retidas com diferentes diluições.
EXEMPLO 2
Contagem produziu os seguintes resultados:
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a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;
a segunda diluição reteve (10-3): 9 colônias.
Assinalar uma contagem estimada com base nas colônias contadas no placa
para a diluição 10-3.
EXEMPLO 2
Contagem (quando um número máximo de 300 foi fixado para a contagem de
colônias) produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;
- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.
O resultado desta contagem é inaceitável.
EXEMPLO 4
Contagem (quando um número máximo de 150 foi fixado para a contagem de
colônias) produziu os seguintes resultados:
- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 167 colônias na placa (limite superior
do intervalo de confiança com uma média ponderada média igual a 150);
- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.
Assinalar uma contagem estimada com base em colônias contadas na placa
para a diluição 10-3.
10.3.2.5.2 Quando a contagem de colônias (colônias totais, colônias típicas ou
colônias presuntivas) para cada uma das placas, para todas as diluições
inoculadas produz um número superior a 300 (ou qualquer outro número
indicado na norma específica), o relatório do resultado é dado seguinte forma:
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"Maior que 300/d" (no caso das colônias total ou colônias típicas) ou "maior que
" (no caso de colônias confirmadas), expressa em micro-organismos por
mililitro (produtos líquidos) ou micro-organismos por grama (outros produtos)
onde
d é a diluição da última diluição inoculada;
b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre
as colônias presuntivas A.
10.3.2.5.3 Quando o placa que contém a última diluição inoculada tiver mais de
10 colônias e menos de 300 (ou qualquer outro número indicado na norma
específica) colônias (colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas),
calcular o N número de micro-organismos presentes usando a Equação (4):
onde
c é o número de colônias contadas na placa;
V é o volume do inóculo utilizado em cada placa, em mililitros;
d é a diluição correspondente à diluição retida.
Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.
Expressar o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro
(produtos líquidos) ou por grama (outros produtos).
EXEMPLO
Contagem produziu os seguintes resultados:
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- na última diluição inoculada (10-4): 120 colônias.
Assim
Arredondando o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número N 'de
micro-organismos é 1200000, ou 1,2x 106 por mililitro ou por grama do produto.
10.3.2.6 Incerteza de medição
Ver ISO/TS 19036 para determinações quantitativas.
10.4 Enumeração de bolores e leveduras
10.4.1 Geral
Bolores e leveduras geralmente devem ser enumerados seja por uma técnica
de pour-plate, que facilita a enumeração ou por uma técnica spread-plate que
fornece a máxima exposição das células ao oxigênio atmosférico e evita o
estresse de calor do agar derretido. Placas de ágar vertidas devem ser secas
antes de serem inoculadas conforme POP MET MC 001.
Alguns bolores e leveduras podem ser infecciosos ou podem provocar reações
alérgicas, às vezes até mesmo em indivíduos saudáveis. Assim, é importante
estar razoavelmente cauteloso ao trabalhar com eles. Idealmente, as placas
devem ser mantidas em incubadoras, não em uma sala aberta. Tampas das
placas devem ser removidas o mais raramente possível, normalmente apenas
para fins essenciais, tais como a preparação de uma lamina para exame
microscópico. Agulhas esterilizadas pelo calor devem ser resfriadas antes de
fazer transferências, para evitar dispersão de conídios e outras células.
Bancadas de trabalho e as incubadoras devem ser desinfetadas
rotineiramente.
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Emissão: 02/07/12 Página:88 de 119
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Placas de Petri devem ser incubadas em posição vertical e não devem ser
manipuladas até que as placas estejam prontas para serem contadas, o
movimento pode resultar na liberação de conídios ou esporos e subseqüente
desenvolvimento de colônias de satélite, dando uma superestimativa da
população.
10.4.2 Contagem de colónias de bolores e leveduras
Placas com 10 a150 colônias são geralmente contadas. Se a micoflora consiste
principalmente de fungos, selecione placas contendo as contagens na faixa de
menor população; se a micoflora consiste principalmente de leveduras, placas
que contenham até o limite superior podem ser selecionadas para a contagem.
Se a identidade das colônias estiver duvidosa, examinar em microscópio pelo
menos cinco colônias por amostra para confirmar que bactérias não estão
presentes.
10.5 Enumeração usando um meio líquido
10.5.1 Princípio
Porções de teste são inoculadas em um meio líquido que é projetado para
suportar o crescimento de um determinado micro-organismo ou um grupo de
micro-organismos, e muitas vezes inibem a proliferação de micro-organismos
não-alvo.
Para determinar se o crescimento dos micro-organismos-alvo tenha ocorrido,
vários critérios podem ser usados, por exemplo, detecção visual de turbidez,
produção de gás, mudanças de cor, posterior isolamento dos micro-organismos
em um ágar seletivo. A composição do meio de crescimento e os critérios para
distinguir entre um resultado positivo e um negativo são definidos nas normas
correspondentes.
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Usando essa abordagem, apenas um valor qualitativo pode ser atribuído a
cada porção de teste, ou seja, o resultado é ou positivo ou negativo. Para obter
uma estimativa da quantidade de micro-organismos que está presente, é
necessário examinar várias porções de ensaio e os procedimentos estatísticos
para determinar o número mais provável (NMP).
10.5.2 Inoculação
10.5.2.1 Geral
Se um meio de crescimento seletivo é usado, a adição da amostra de ensaio
não deve reduzir as suas propriedades seletivas (permitindo assim o
crescimento de micro-organismos não-alvo). Na maioria das normas padrões
informações sobre a compatibilidade de uma determinada matriz e do meio
líquido é descrita no âmbito, mas cuidados devem ser tomados com matrizes
como especiarias, cacau, caldo de carne, etc, pois podem conter substâncias
inibidoras de crescimento, que exigem a adição de compostos neutralizantes, o
uso de uma quantidade maior de fatores de diluição, filtração, centrifugação ou
separação imunomagnética para separar o micro-organismo alvo a partir da
matriz, mesmo que isso nem sempre seja especificado nas normas
correspondentes. Incompatibilidade também pode ser devido à composição
biológica da matriz: amostras ambientais altamente contaminadas, produtos
fermentados ou produtos com bactérias probióticas, obviamente representam
um desafio maior para a análise do microbiologista do que as amostras que
contêm somente muito poucos micro-organismos. Para essas matrizes
problemáticas, experimentos com micro-organismos representativos devem ser
realizados para verificar se o método é realmente compatível com a matriz.
10.5.2.2 Procedimento
Salvo disposição em contrário das normas correspondentes, volumes inferior
ou igual a 1ml da porção teste são normalmente adicionados cinco a dez vezes
ao volume de um único meio com concentração simples. Volumes entre 1ml e
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100ml são normalmente adicionados a volumes iguais de meios com dupla
concentração.
Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados podem ser
usados. Para fins especiais, meios estéreis desidratados podem ser dissolvidos
a frio (ou pré-aquecidos a 30°C) da amostra a ser analisada.
Salvo disposição em contrário, o tempo entre preparar a primeira diluição de
uma amostra e inoculação do último tubo, placa de vários poços, ou frasco
devem ser inferior a 15 minutos.
Uma nova pipeta estéril deve ser utilizada para cada diluição.
10.5.3 Escolha do sistema de inoculação
A essência do método NMP é que a diluição de uma amostra a um grau tal que
inóculos, às vezes, mas nem sempre contêm micro-organismos viáveis. O
"resultado", isto é, o número de inóculos produzindo crescimento em cada
diluição, dará uma estimativa da concentração inicial de bactérias na amostra.
A fim de obter estimativas sobre uma ampla gama de concentrações possíveis,
microbiologistas usam diluições em série, incubando vários tubos (ou placas,
etc) em cada diluição. O número mais provável (NMP) de micro-organismos
presentes na amostra original, e a precisão da estimativa, pode ser calculada
por procedimentos estatísticos sobre a base do número de tubos positivos e
negativos observados após a incubação.
Fazer a escolha das várias configurações disponíveis de NMP de acordo com
- o número esperado de micro-organismos na amostra em estudo,
- requisitos regulamentares,
- a precisão necessária, e
- quaisquer outras considerações práticas.
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A incerteza de medição depende do número de positivo nas porções teste
observadas, semelhante a incerteza de medição em contagem do número de
colônias, que depende do número de colônias em uma placa. A incerteza de
medição aumenta à medida que uma função da raiz quadrada do número de
tubos utilizados aumenta. O número de tubos tem que ser quadruplicado para
reduzir pela metade a incerteza de medição. Quando os sistemas usam apenas
alguns tubos de replicação, a incerteza de medição é baixa.
Dependendo do seu tamanho, porções de teste podem ser inoculadas em
tubos ou frascos contendo a quantidade necessária do meio líquido. Para
porções de teste pequenas, placas com vários poços também podem ser
usadas.
10.5.3.1 Sistema único de diluição
Quando a concentração de micro-organismos esperado é pequena ou varia
apenas moderadamente, o mais adequado é o sistema de inoculação em uma
série única de porções de ensaio igual. Onde a relação esperada entre o
número máximo e mínimo de micro-organismos é menor que 25, dez porções
de teste em paralelo é a menor número esperado de funcionar; com 50 tubos
paralelos, uma relação de 200 é o limite. Exemplos de sistema único de
diluição NMPs são indicados no anexo B, Tabelas B.1 a B.4.
10.5.3.2 Sistema Múltiplo de diluição
Quando a concentração de micro-organismos na amostra é desconhecida, ou
se suspeita de haver grande variação, pode ser necessário inocular tubos em
série de várias diluições. Inocular um número suficiente de diluições para
garantir um sistema com resultados positivos e negativos. O número de
diluições também depende do método de cálculo utilizado para estimar o valor
do NMP. Se tabelas forem usadas, então os resultados de três diluições devem
estar disponíveis, e as configurações dos sistemas são restritas aos
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disponíveis em tabelas. Com programas de computador, o número de diluições
e tubos paralelos é irrestrito.
10.5.3.3 Sistema de diluição simétrica
O sistema NMP simétrico mais comumente aplicado utiliza três ou cinco tubos
paralelos por diluição. A precisão obtida com este sistema diminui rapidamente
com o menor número de tubos por diluição. Os resultados de três tubos de
design são pouco mais do que indicações da ordem de grandeza da
concentração. Se maior precisão for necessária, recomenda-se que cinco ou
mais tubos paralelos sejam escolhidos. Exemplos de NMP de três tubos e um
NMP de cinco tubos são indicados no anexo B, Tabelas B.5 e B.7,
respectivamente.
10.5.3.4 Sistema de diluição não-simétrica
Em um sistema de diluição não-simétrica, os diferentes níveis de diluição não
têm o mesmo número de tubos. Usar esses sistemas apenas para calcular o
número de micro-organismos dentro de uma faixa bem definida. Para
exemplos, consulte o POP MET MIC 003 ITEM XII.
10.5.4 Incubação
Incubar os tubos, frascos ou garrafas inoculados em uma estufa incubadora ou
em banho-maria. Coloque placas de vários poços, em uma estufa incubadora.
Escolher a duração e a temperatura de incubação após a referência de um
método específico, pois dependem do microrganismo ou grupo de micro-
organismos procurado.
Para alguns micro-organismos, um processo de incubação de dois estágios
e/ou uma etapa de confirmação pode ser necessária.
Pesquisar em normas específicas para obter detalhes.
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10.5.5 Interpretação dos resultados
Os critérios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo
com cada micro-organismo ou grupo de micro-organismos e são definidos nas
normas correspondentes. Usando estes critérios, contar e registrar o número
de resultados positivos obtidos em todos os testes derivados de uma amostra.
10.5.6 Determinação dos valores NMP
Há três possibilidades diferentes para determinar o valor do NMP: cálculo com
fórmulas matemáticas, consulta das tabelas de NMP, ou utilização de
programas de computador específico. Desde que sejam baseados nas mesmas
considerações estatísticas, eles são igualmente válidos. Estes três métodos
são detalhados a seguir.
10.5.6.1 Fórmulas matemáticas
10.5.6.1.1 Fórmula aproximada para todos os casos
Os valores aproximados de NMP para qualquer número de diluições e tubos
paralelos são derivados da aplicação da seguinte equação (adaptado da
referência [36]):
onde
Zp é o número de tubos positivos;
mr é a massa de referência da amostra, em gramas;
ms é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com as reações
negativas;
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mt é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.
NMP é expresso por massa de referência da amostra em gramas (geralmente
1 g, por vezes 100 g).
10.5.6.1.2 Solução "exata" para uma série de tubos
O valor do NMP para uma única série de tubos é derivado da seguinte fórmula:
onde
mr é a massa de referência da amostra, em gramas;
mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural;
n é o número de tubos na série;
zp é o número de tubos com uma reação positiva.
10.5.6.1.3 Precisão estimada em ensaios de diluição simples
Os limites de confiança de 95% da estimativa NMP podem ser calculados
aproximadamente através da equação:
onde
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x é o limite de confiança superior ou inferior a 95%;
mr é a massa de referência da amostra, em gramas;
mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural;
n é o número de tubos na série;
zn é o número de tubos com uma reação negativa.
O sinal positivo é conectado com o limite inferior e o sinal de menos com o
limite superior. A aproximação não é muito bom quando a maioria dos tubos
são negativos (estéril), mas melhora quando a proporção de tubos positivos
aumenta.
10.5.6.1.4 Precisão estimada em ensaios de diluição múltipla simétrica
O padrão de incerteza log10 de um sistema de NMP de diluição múltipla
simétrica pode ser obtido pela equação aproximada de Cochran:
onde
SE é o erro padrão de log10NMP;
f é o fator de diluição entre diluições consecutivas (principalmente 10);
n é o número de tubos por diluição.
Os limites superior e inferior do grau confiança de 95% podem ser
conseguidos, respectivamente, multiplicando e dividindo a estimativa NMP pelo
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antilogaritmo de 2x SE. Esse procedimento tende a exagerar o limite de
confiança superior.
10.5.6.2 Tabelas de NMP
10.5.6.2.1 Tabelas para sistemas diluição simples
Tabelas B.1 a B.4 (Anexo B) fornecem os valores de NMP e os intervalos de
confiança de 95% por porção de teste para 10, 15, 20 e 25 tubos paralelos
[cada tubo é inoculado com a mesma diluição (simples)].
Para expressar o resultado por massa de amostra de referência (ou o volume
de amostras de líquido), multiplique o NMP e os 95%d os valores-limite pela
razão (massa de referência) / (massa toma de ensaio). Não multiplicar o
padrão logarítmico
Incerteza. A massa de referência em microbiologia alimentar é geralmente 1g.
A massa tomada no ensaio corresponde à quantidade de amostra (em gramas)
que está presente no volume usado para inocular os tubos, por exemplo, 0,1g
se 1ml do homogeneizado 10-1 foi utilizado.
EXEMPLO
Vinte tubos de caldo de dupla concentração foram inoculados com 5 ml
alíquotas de uma amostra de dez vezes diluída (0,1 g / ml). Após a incubação,
16 dos tubos apresentaram crescimento visível. Qual foi a densidade mais
provável de bactérias (organismos por grama) na amostra? Tabela B.3 dá 1,61
como o número mais provável de organismos por tubo, com um limite inferior
de 95% de 0,93 e um limite superior de 95% de 2,77.
Cada tubo recebeu uma porção teste de 5 ml, o que corresponde a 0,5 g de
amostra. Portanto, o número mais provável de micro-organismos em 1 grama
de amostra é dada por:
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NMP= /g = 3,2/g
com o intervalo de confiança de 95%, variando de
limite inferior de 95% = /g= 1,9/ g;
limite superior de 95% /g = 5,5/g
10.5.6.2.2 Tabelas para sistemas de diluição múltiplas: três diluições
sucessivas
Com sistemas simétricos, é comum a prática do uso de três diluições
sucessivas com três ou (Tabela B.5) ou cinco (Tabela B.7) repetições.
Registrar o número de resultados positivos para cada conjunto de tubos e, a
partir da tabela de NMP para o sistema de inoculação utilizada, leia o número
mais provável de micro-organismos presentes no volume de referência da
amostra.
Algumas combinações de tubos positivos são mais prováveis do que outras.
Por exemplo, uma combinação de resultados positivos 0, 0, 3 é muito menos
provável de ocorrer do que a combinação 3, 2, 1. Para quantificar esta
probabilidade, todas as combinações de resultados positivos têm sido
atribuídas a uma categoria, variando de 0 a 3. A categoria de resultado 1 é um
resultado com maior probabilidade, enquanto que uma categoria de resultado 3
é rara e não pode ser reproduzido facilmente. Os piores casos são de categoria
0 resultados, que devem ser considerados com grande suspeita. Supondo-se
que os resultados da análise estiverem corretos, seria de esperar que 95% das
combinações observadas cairiam na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na
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categoria 3 e apenas 0,1% na categoria 0. Categorias são mais bem explicadas
na Tabela B.6.
No caso em que mais de três diluições são feitas, a seleção da combinação
"direta" de três diluições consecutivas nem sempre é muito clara. No entanto,
isso pode ser feito facilmente pela gravação de todas as possíveis
combinações de tubos positivos e lendo a categoria correspondente na Tabela
B.5.
A partir daí, aplicar as seguintes regras:
1) Selecione a combinação de três diluições consecutivas com uma categoria 1
de perfil para obter o índice de NMP. Se mais de uma combinação de perfil de
categoria 1 tiver sido obtida, use a que apresentar o maior numero de tubos
positivos.
2) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 1 estiver disponível, usar
uma de perfil de categoria 2. Se mais de uma combinação de perfil de
categoria 2 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
3) ) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 2 estiver disponível, usar
uma de perfil de categoria 3. Se mais de uma combinação de perfil de
categoria 3 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.
Alguns exemplos são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 - Exemplos de seleção de resultados positivos para o cálculo do MPN
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10.5.6.3 Programas de computador
Os programas de computador mais versáteis não representam nenhuma
restrição sobre o número de diluições e tubos paralelos ou simetria do sistema
de NMP. MPN Assay Analyzer é um programa disponível gratuitamente com
base em um programa anterior.
10.5.7 Expressão dos resultados
Do índice NMP lido na tabela B.5 [de acordo com a combinação de três (ou
cinco) diluições consecutivas retida], determinar o numero de micro-organismos
mais prováveis no volume referido.
Resultados do relatório como o número mais provável de micro-organismos (ou
grupo específico de micro-organismos) por grama ou mililitro. A massa ou o
volume de referência pode ser diferente de g ou ml (por exemplo, 100 g ou 100
ml).
11 Método de detecção (método qualitativo)
11.1 Geral
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Um método de detecção é um método que determina a presença ou ausência
de micro-organismos em uma determinada quantidade de produto.
11.2 Princípio
Salvo disposição em contrário de norma internacional especifica, misturar
(produtos líquidos) ou homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P do
produto a ser examinado com 9 x P ml ou 9 x P g de um caldo eletivo e/ou
seletivo.
Para facilitar a recuperação de micro-organismos estressados em alimentos, as
amostras são geralmente pré-enriquecidas em um caldo não-seletivo seguido
de enriquecimento seletivo e isolamento em meios agar seletivos / diferenciais.
O uso de dois diferentes caldos de enriquecimento, bem como de dois ou mais
meios de ágar seletivo, aumentam a sensibilidade do método.
Após a incubação, espalhar com uma alçada obtida do caldo seletivo sobre a
superfície de um meio agar seletivo de tal forma a obter colônias isoladas.
Salvo disposição em contrário, os caldos de enriquecimento incubados só
podem ser refrigerados após a avaliação do impacto de sistemas de
refrigeração nos resultados e somente se claramente estipulado no resultado
do teste.
Um número (geralmente cinco por placa de ágar) das colônias obtidas após a
incubação são, então, identificadas com técnicas adequadas de confirmação.
A seleção de colônias para confirmação deverá abranger representativamente
colônias tipicamente suspeitas.
11.3 Incerteza de medição
A estimativa da incerteza de medição de determinações qualitativa está sendo
investigada pela ISO/TC 34/SC 9.
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12 Métodos de confirmação
12.1 Geral
Utilizar apenas culturas puras para confirmação bioquímica e sorológica.
Os testes de confirmação de referência são descritos nas normas específicas.
Como uma alternativa aos testes bioquímicos descritos nessas normas
específicas, os métodos de confirmação descritos nesta cláusula (bioquímicos,
sondas de DNA) podem ser utilizados nas condições descritas na cláusula,
salvo disposição em contrário as normas específicas.
12.2 Preparação de uma cultura pura
Começar a preparação de uma cultura pura pela seleção de uma única colônia
em um meio agar. Então inocular a colônia selecionada em meio de ágar não-
seletivo. Após a incubação, selecione uma colônia bem isolada para
posteriores testes de confirmação. Repita a operação se necessário.
Se possível, os testes de confirmação deverão ser feitos usando células de
uma única colônia. Se houver material insuficiente em uma colônia, ele deve
primeiro ser repicadas em um meio líquido ou em um meio inclinado ágar, após
o qual a subcultura pode ser utilizada para os testes a serem realizados.
12,3 Teste de Gram (técnica de Hucker modificada)
12.3.1 Geral
Esta forma de coloração de células bacterianas permite a descrição da
morfologia da bactéria e sua classificação em dois grupos em função de serem
ou não capazes de reter a coloração de cristal violeta (Gram +) nas condições
de ensaio. Esta divisão resulta principalmente de diferenças na estrutura da
parede da célula dos dois grupos e se correlaciona com outras diferenças
importantes entre os dois grupos.
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A alternativa satisfatória à coloração de Gram é o uso de solução de hidróxido
de potássio 3% (KOH). Uma alçada do crescimento bacteriano é agitada em 2
gotas de solução de KOH. Bactérias gram-negativas farão com que a solução
tornar-se muito viscosa e mucóide em 30 segundos, com formação de um filete
da seguinte mistura na alça, quando levantada.
Há uma série de maneiras de conduzir um teste de Gram, mas todos seguem
as sequências abaixo.
12.3.2 Soluções
12.3.2.1 Geral
Soluções disponíveis no mercado podem ser utilizados.
Neste caso, siga as recomendações do fabricante.
12.3.2.2 Solução de cristal de violeta
12.3.2.2.1 Composição
Cristal violeta 2,0 g
Etanol (95%) 20 ml
Oxalato de amônio (C2H8N2O4) 0,8 g
água 80 ml
12.3.2.2.2 Preparação
Dissolver o cristal violeta no etanol, e o oxalato de amônio na água destilada.
Misturar as duas soluções e manter a mistura em repouso por 24 h antes do
uso.
12.3.2.3 Solução de iodo
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12.3.2.3.1 Composição
1,0 g de iodo
Iodeto de potássio (KI) 2,0 g
água 100 ml
12.3.2.3.2 Preparação
Dissolver o iodeto de potássio em 10 ml de água e adicionar o iodo em frações.
Após dissolução, completar o 100 ml em um balão volumétrico.
12.3.2.4 Solução de safranina
12.3.2.4.1 Composição
Safranina 0,25 g
Etanol (95%) 10 ml
água 100 ml
12.3.2.4.2 Preparação
Dissolver o safranina no etanol, em seguida, misturar com a água destilada.
12.3.3 Técnica de Gram
Depois de fixar uma alçada de bactérias numa lâmina de microscópio com a
chama, preparada a partir de uma cultura 18 a 24 horas ou quando o caldo
estiver turvo, cobrir o filme com o cristal violeta. Deixar reagir por 1 min.
Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.
Cubrir a lâmina com a solução de iodo. Deixar reagir por 1 min.
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Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.
Despeje delicadamente e de forma contínua um filme de etanol (95%) sobre a
rampa inclinada durante um período não superior a 30 s até que nenhuma cor
violeta saia da lamina.
Delicadamente lavar com água a lamina inclinada para eliminar o etanol. Cubra
a lâmina com uma solução de safranina por 10 segundos. Delicadamente lavar
com água a lamina inclinada.
Secar a lamina.
12.3.4 Interpretação
Colocar uma gota de óleo de petróleo na lamina, e examinar na objetiva de alta
potência de um microscópio. As células bacterianas que aparecem em azul ou
violeta são denominadas Gram-positivas (+ Gram), aquelas que são cor de
rosa, ou cor vermelha escura são denominadas Gram-negaivas (- Gram).
Para uma cultura pura de certos tipos de bactérias, tanto as células Gram-
positivas e Gram-negativas podem ser obtidas no mesmo campo do
microscópio.
NOTA Quantidade muito densa de células pode dar uma resposta incomum.
12.4 Uso de galerias bioquímicas para identificação
Galerias bioquímicas disponíveis podem ser usadas para identificação de
colônias isoladas.
Verificar se as galerias são adequadas, através de estudos de avaliação
publicados em revistas de literatura científicas internacionais, de preferência
relacionados à microbiologia de alimentos4. Esta verificação é especialmente
importante se o fabricante não tem validação de dados sobre as galerias.
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O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com
indicação das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar também as cepas de controle que o laboratório
pode usar para verificar a preservação do desempenho das galerias.
As galerias devem incluir, no mínimo, os testes bioquímicos descritos nas
normas específicas ou ser complementadas por outros testes.
12.5 Uso de sondas nucléicas para a identificação
Sondas nucléicas podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas.
No entanto, deve-se verificar se as sondas nucléicas utilizadas para a
confirmação são adequadas, como mostradas por estudos de avaliação
publicados em literatura científica internacional, de preferência relativa à
microbiologia de alimentos. Esta verificação é especialmente importante se o
fabricante não tem dados de validação das sondas.
O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com
indicação das estirpes de ensaio.
O fabricante deve especificar também as cepas controle que o laboratório pode
usar para verificar a manutenção do desempenho da sonda.
4) Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de referência
nacional, regional ou internacional indicado para cada micro-organismo.
12.6 Métodos sorológicos
12.6.1 Geral
Quando confirmação sorológica é necessária, realizá-la após a identificação
bioquímica das colônias isoladas.
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12.6.2 Testes de aglutinação em laminas
Reações antígeno-anticorpo causam nas células bacterianas agregação e
formação massas floculantes ou densos grânulos. No caso das bactérias da
família Enterobacteriaceae, a reação entre o antígeno "H" (flagelar) e seu
antissoro homólogo resulta em um amontoado floculante, enquanto que a
reação envolvendo o antígeno "O" (somático) resulta em uma mais densa
aglomeração granular.
Antes de aglutinação com anti-soros, um teste deve ser realizado para
determinar se as células bacterianas aglutinam em solução de 3% de cloreto
de sódio. Se as células bacterianas aglutinarem, a cepa é autoaglutinante e
não deve ser aglutinada com anti-soros.
Anti-soros disponíveis comercialmente são de dois tipos: anti-soros polivalentes
que reagem com micro-organismos de um determinado gênero ou com grupos
de sorovares e que são adequados para triagem preliminar, e anticorpos
monoclonais específicos, cuja utilização permite a identificação de um sorovar
especifico.
O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote de anti-
soros, com indicação das cepas testes.
Verifique se os testes de aglutinação são adequados, como mostrado por
estudos de avaliação publicado em literatura científica internacional, de
preferência relacionados à microbiologia de alimentos5.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser
usados.
12.6.3 Teste de aglutinação de látex
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Um método mais rápido está disponível comercialmente, empregando
partículas de látex revestidas com grupos de anticorpos específicos. O
antígeno no extrato é testado contra uma série de látex reagentes.
Verifique se os testes de aglutinação em látex são adequados, como mostrado
por estudos de avaliação publicados em literatura científica internacional, de
preferência relacionados à microbiologia de alimentos. O laboratório deve obter
um certificado de controle para cada lote, com indicação das cepas testes.
Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser
usados. Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de
referência nacional, regional ou internacional indicado para cada
microorganismo.
13.0 RELATÓRIO DE ENSAIO
O relatório deve especificar o método utilizado, se necessário a temperatura de
incubação, e os resultados obtidos. Deve também mencionar todos os detalhes
operacionais não especificadas nesta Norma, bem como aqueles considerados
como opcional, juntamente com os detalhes de quaisquer incidentes que
possam ter influenciado os resultados.
Constar também no relatório de ensaio se mais testes devem ser realizados
por um laboratório de referência, ou, e se esses testes foram realizados, quais
foram os resultados.
O relatório de ensaio deve incluir todas as informações necessárias para a
identificação completa da amostra. Também é apropriado incluir todas as
informações necessárias para a interpretação dos resultados do teste.
Se necessário, a medida de incerteza, deve ser incluída no relatório de ensaio.
14.0 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
14.1 Validação de métodos de referência
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A validação de métodos de referência está sendo investigada pela ISO/TC
34/SC 9.
14.2 Validação de métodos alternativos
A ISO 16140 orienta para o protocolo técnico de validação de métodos
alternativos comparados com métodos de referência.
14.3 Validação de métodos internos
A validação de métodos internos está sendo investigada pela ISO/TC 34/SC 9.
15.0 GARANTIA DE QUALIDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE QUALIDADE DE DESEMPENHO
15.1 Controle de qualidade interno
15.1.1 Controle de qualidade interno é composto por todos os procedimentos
realizados por um laboratório para a contínua avaliação do seu trabalho. O
objetivo principal é garantir a consistência dos resultados no dia-a-dia e a sua
conformidade com critérios bem definidos.
15.1.2 Um programa de verificações periódicas é necessário para demonstrar
que a variabilidade (entre os analistas, entre equipamentos ou entre materiais)
está sob controle. Todos os testes incluídos no escopo de atividade do
laboratório precisam ser protegidos.
O programa deve envolver:
- o uso de amostras fortificadas, com níveis variáveis de contaminação,
incluindo a cepa alvo e flora contaminante;
- o uso de amostras naturalmente contaminadas a partir de uma gama de
matrizes;
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- o uso de materiais de referência (incluindo materiais para ensaios de
proficiência);
- testes de replicação;
- replicação de testes de avaliação.
O intervalo entre essas verificações é influenciado pela natureza dos ensaios
efetuados pelo laboratório e a freqüência na qual os testes são realizados.
Recomenda-se que, sempre que possível, os testes devem incorporar
controles para monitorização do desempenho.
15.1.3 Em casos especiais, um laboratório pode realizar um teste específico
raro. É reconhecido que, em tais casos, um programa de controle de qualidade
interno em curso pode ser inadequado e que pode ser mais adequado realizar
em paralelo com o teste um esquema para demonstrar desempenho
satisfatório.
15.2 Cepas de referência
Manutenção de cepas de referência de acordo com o POP MET MC 001.
15.3 Avaliação externa da qualidade (ensaios de proficiência)
Laboratórios devem participar regularmente em programas de ensaios de
proficiência que são relevantes para o seu âmbito de atividade.
Deve ser dada preferência aos programas de ensaios de proficiência que
utilizem matrizes adequadas.
Laboratórios devem usar avaliação externa da qualidade não só para avaliar
tendência de laboratório, mas também para verificar a validade do seu sistema
de qualidade como um todo.
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16.0 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General
requirements and guidance for microbiological examinations.
II. HISTÓRICO DAS REVISÕES
REVISÃO DESCRIÇÃO DATA00 Emissão inicial 02.07.2012
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Anexo A
Informativo
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Anexo B
(Normativo)
Determinação do número mais provável (NMP)
Tabela B.1 - valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 10 tubos.
Tabela B.2 – Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 15 tubos.
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Tabela B.3 - Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 20 tubos.
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Tabela B.4 - Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 25 tubos.
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Tabela B.5 - índices e limites de confiança (95%) de NMP, quando três porções de ensaio de 1g (ml), três de 0,1g (ml) e três de 0,01g (ml) são usados.
a fonte: Referência: De Man, J.C. MPN tables (corrected), Eur. J. Appl. Biotechnol. 1983, 17, pp. 301-5.b Veja a Tabela B.6.c os limites de confiança apresentados nesta tabela são destinados apenas para fornecer uma idéia da influência das variações estatísticas nos resultados.Haverá sempre também outras fontes de variação, que pode às vezes ser ainda mais importante.
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Tabela B.6 - Explicação de categorias de resultados
categoriaa Definição1 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o
resultado é aquele que têm a maior chance de ser obtido. Há no máximo apenas 5% de chance de se obter um resultado que menos provável do que mínimo provável nesta categoria.
2 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 1, mas não há, no máximo, 1% de chance de se obter um resultado que é menos provável do que mínimo provável nesta categoria.
3 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 2, mas não há, no máximo, 0,1% de chance de se obter um resultado que é menos provável do que mínimo provável nesta categoria.
0 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 3. Há apenas 0,1% de chance de obter um resultado, nesta categoria, sem que nada esteja errado.
a Antes de iniciar um teste, ele deve ser decidido qual a categoria será aceitável, ou seja, apenas 1, 1 e 2 ou mesmo 1, 2 e 3. Quando o decisão a ser tomada com base no resultado é de grande importância, apenas a categoria 1, ou no máximo 1 e 2, os resultados devem ser aceitos. Resultados da categoria 0 devem ser considerados com grande suspeita.
Tabela B.7 - Valores de NMP por grama de amostra com limites de confiança de 95% (Quando tomada cinco porções teste de 1 g, cinco de 0,1 g e cinco de 0,01g)
Procedimento Operacional Padrão de Metodologias de Análises POP MET MIC 001
REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES MICROBIOLÓGICOS
Emissão: 02/07/12 Página:118 de 119
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