iUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUMICA
DISSERTAO DE MESTRADO
ESTUDO DA COMPOSIO QUMICA DE LEOS ESSENCIAIS DE
PLANTAS AROMTICAS DA AMAZNIA
ALUNA: FERNANDA AVILA LUPE ORIENTADOR: PROF. DR. LAURO E. S. BARATA
CAMPINAS
2007
ii
vAos meus pais Maria de Ftima e Luprcio Aos meus irmos Tania e Ricardo
Ao meu sobrinho Arthur Ao Nelson e Emerval
Dedico
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus por me dar fora para concluir mais uma etapa.
Ao Instituto de Qumica da UNICAMP pela oportunidade de
aperfeioamento dos meus conhecimentos em Qumica.
Secretaria de Educao do Estado de So Paulo pelo apoio
financeiro.
Ao professor Dr. Lauro E. S. Barata pelo apoio e orientao.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e
Agrcolas (CPQBA), Sra. Maria Emlia Andrade, ao Sr. Raul Alencar e ao
Dr. Nilson Maia pela doao das amostras deste trabalho.
Aos professores Dr. Fbio Augusto e Dr Anglica Zaninelli Schreiber
pelas anlises feitas em colaborao.
Rita pela ajuda tcnica, dedicao e amizade.
Aos amigos do laboratrio de Qumica de Produtos Naturais, em
especial Adriana, pelo aprendizado e descontrao.
Aos amigos Ilton e Antonio por serem to prestativos.
Ana Cladia e ao Mrcio por ensinar a tcnica de SPME.
s minhas queridas amigas Mnica e Carla pelo incentivo e
pacincia.
Aos meus alunos pelo carinho.
A todos que de alguma forma contriburam para o desenvolvimento
desse trabalho.
ix
CURRICULUM VITAE
FORMAO ACADMICAUniversidade de So Paulo USP Ribeiro Preto.
Bacharelado em Qumica, concludo em dezembro de 2000. Licenciatura em Qumica, concludo em dezembro de 2000. Atribuies Tecnolgicas em Qumica, concludo em julho de 2001.
Escola Tcnica Estadual Conselheiro Antnio Prado ETECAP Curso tcnico em Qumica, concludo em dezembro de 1996.
EXPERINCIASENAI Paulnia
Professora do curso Tcnico em Qumica das disciplinas: Anlise Qualitativa, Anlise Instrumental, Corroso e Tecnologia Ambiental. Desde novembro de 2005 at os dias atuais.
Escolas Estaduais de Ensino Mdio. Professora Efetiva de Qumica do Ensino Mdio. Desde maro de 2001 at os dias atuais.
Oficina Pedaggica - Diretoria de Ensino Regio de Sumar. Bolsista do Programa Bolsa Mestrado. Incio em novembro de 2004 at fevereiro de 2007.
Colgio Alternativa Sumar Professora de Qumica do curso pr-vestibular e pr-vestibulinho. Incio em maro de 2005 at os dias atuais.
Curso Pr-Col. Tec Campinas. Professora Plantonista de Qumica. Incio em fevereiro de 2004 at dezembro de 2004.
Colgio Nova Veneza Unidade II Hortolndia. Professora de Qumica do Ensino Mdio. Incio em fevereiro de 2004 at julho de 2004.
xAPRESENTAES
Reviso de estudos fitoqumico e farmacolgico de Aniba canelilla e anlise do leo da madeira e folhas pster. VI Jornada Paulista de Plantas Medicinais. 26 a 29 de outubro de 2003.
Massoia lactona constituinte principal do resduo de Aeollanthussuaveolens por HS-SPME pster. III Simpsio Brasileiro de leos Essenciais. 8 a 10 de novembro de 2005.
PUBLICAES
LUPE, F. A.; LEMES, A. C.; AUGUSTO, F.; BARATA, L. E. S. Fragrant Lactones in the steam distillation residue of Aeollanthus suaveolensMart. ex Spreng and analysis by HS-SPME. Journal of Essential Oil Research, v 19 (3), 201-202, 2007
LUPE, F. A.; SOUZA, R. C. Z; BARATA, L. E. S. Linalool enantiomers from Aniba rosaeodora (rosewood), Lippia alba (erva cidreira nacional) and Ocimum basilicum (basil) oils. (Perfumer Flavorist,submetido).
xi
RESUMOESTUDO DA COMPOSIO QUMICA DE LEOS
ESSENCIAIS DE PLANTAS AROMTICAS DA AMAZNIA
O presente trabalho envolveu o estudo da composio qumica dos
leos essenciais de cinco plantas aromticas Aeollanthus suaveolens, Aniba
canelilla, Aniba rosaeodora, Lippia alba e Ocimum basilicum por
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM).
Amostras destas plantas - leo essencial, planta fresca, seca e resduo da
extrao do leo essencial - foram extradas por Microextrao em Fase
Slida em Espao confinado (HS-SPME) e analisadas por CG-EM. Os leos
foram extrados por arraste a vapor. Os leos essenciais ricos em linalol de
A. rosaeodora (madeira e folhas), L. alba e O. basilicum foram avaliados
por CG-EM com coluna HP-5 e a composio dos enantimeros de linalol
determinada usando coluna quiral. Com o resultado dessa comparao, foi
avaliada a substituio do leo essencial da madeira de A. rosaeodora pelos
leos essenciais estudados. Um estudo sazonal de L. alba para definir as
concentraes e quiralidade do linalol encontrado foi feito com seis coletas.
As principais molculas dos leos essenciais e/ou extratos de A. canelilla (1-
nitro-2-feniletano e metileugenol) e A. suaveolens (massoia lactona) foram
isoladas utilizando tcnicas de fracionamento como: destilao,
hidrodestilao, extrao cido-base, cromatografia em coluna e
cromatografia em camada delgada preparativa, e identificadas por RMN de 1H e 13C. A semi-sntese da massoia lactona foi feita a partir de uma
molcula comercial (-decalactona). Ensaios biolgicos - antifngico e anti
bacteriano foram realizados pela tcnica de difuso com discos com
amostras de A. canelilla e A. suaveolens.
xiii
ABSTRACTCHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL
OILS FROM AMAZONIAN AROMATIC PLANTS
This work involved the chemical composition study of the following
five aromatics plants Aeollanthus suaveolens, Aniba canelilla, Aniba
rosaeodora, Lippia alba and Ocimum basilicum using Gas Chromatography
/ Mass Spectrometry (GC-MS). Samples of these plants essential oils,
fresh and dried plants as well as extraction residues were extracted using
Headspace Solid Phase Microextraction (HS-SPME) and analyzed with GC-
MS. The oils were extracted by steam distillation. The essential oils of A.
rosaeodora (wood and leaves), L. alba and O. basilicum rich in linalool
were evaluated by GC-MS using HP-5 column, while the linalool
enantiomer composition using a chiral column. From the results of this
comparison the replacement of A. rosaeodora essential oil from its wood by
the plants listed above was evaluated. A seasonal study of L. alba to define
linalool concentrations and chirality was made using six different samples.
The main molecules of the essential oils and/or extracts of A. canelilla (1-
nitro-2-phenyethane and methyl eugenol) and A. suaveolens (massoia
lactone) were isolated using separation techniques as distillation, hydro-
distillation, acid-base extraction, column chromatography and preparative
thin layer chromatography, and identified by NMR 1H and 13C. The semi-
synthesis of the massoia lactone was obtained from a commercial molecule
(-decalactone). Biological assays anti-fungal and antibacterial with
samples of A. canelilla and A. suaveolens were conducted using the
diffusion technique in discs.
xv
LISTA DE ABREVIAES
CCD: Cromatografia em camada delgada
CCDP: Cromatografia em camada delgada preparativa
CG-EM: Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
d: Dubleto
dd: Duplo dubleto
dt: Duplo tripleto
HS SPME: Microextrao em fase slida no headspace da amostra
M: Multipleto
o.e.: leo essencial
PDMS: Polidimetilsiloxano
RMN de 13C: Ressonncia magntica nuclear de carbono 13
RMN de 1H: Ressonncia magntica nuclear de hidrognio
SPME: Microextrao em fase slida (Solid phase micro-extraction)
t: Tripleto
xvii
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Evoluo do faturamento lquido do setor de higiene
pessoal, perfumaria e cosmticos no Brasil........................................... 3
Figura 2. Origem dos terpenides e fenilpropanides............................ 6
Figura 3. Ciclo biossinttico geral dos metablitos secundrios3........... 7
Figura 4. Foto de A. suaveolens............................................................. 12
Figura 5. Foto de A. canelilla................................................................. 14
Figura 6. Foto de A. rosaeodora............................................................ 16
Figura 7. Foto de L. alba........................................................................ 19
Figura 8. Foto de O. basilicum............................................................... 22
Figura 9. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona isolada de A.
suaveolens............................................................................................... 34
Figura 10. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona isolada A.
suaveolens............................................................................................... 35
Figura 11. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona sintetizada....... 37
Figura 12. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona sintetizada...... 38
Figura 13. Espectro de RMN de 1H da -decalactona............................ 39
Figura 14. Espectro de RMN de 13C da -decalactona........................... 39
Figura 15. Fluxograma de extrao cido-base do leo essencial bruto
da madeira de A. canelilla...................................................................... 41
Figura 16. Espectro de RMN de 1H do 1-nitro-2-feniletano................... 44
Figura 17. Espectro de RMN de 13C do 1-nitro-2-feniletano.................. 44
Figura 18. Espectro de RMN de 1H do metileugenol............................. 45
Figura 19. Espectro de RMN de 13C do metileugenol............................ 46
Figura 20. Cromatograma do o.e. de A. suaveolens................................ 56
Figura 21. Principais constituintes do o.e. essencial de A. suaveolens. 57
xviii
Figura 22. Obteno da massoia lactona................................................ 62
Figura 23.Cromatograma do o.e. bruto da madeira de A. canelilla (A) 64
Figura 24. Cromatograma da frao obtida por destilao fracionada
do o.e. bruto da madeira de A. canelilla (B).......................................... 64
Figura 25. Cromatograma da alquota obtida por destilao fracionada
da frao B da madeira de A. canelilla (C)............................................. 65
Figura 26. Cromatograma da frao obtida por hidrodestilao do o.e.
bruto da madeira de A. canelilla (D)...................................................... 65
Figura 27. Cromatograma do o.e. das folhas de A. canelilla (E)........... 65
Figura 28. Principais constituintes do o.e. da madeira de A. canelilla... 66
Figura 29. Variao percentual dos principais componentes do leo
essencial de A. canelilla em fraes hidrodestiladas............................. 70
Figura 30. Cromatograma do o. e. das folhas de A. rosaeodora............ 74
Figura 31. Cromatograma do o. e. da madeira de A. rosaeodora.......... 75
Figura 32. Principais constituintes do leo essencial de A. rosaeodora 76
Figura 33. Cromatograma do o. e. de L. alba........................................ 78
Figura 34. Principais constituintes do leo essencial de L. alba........... 79
Figura 35. Cromatograma do o. e. de O. basilicum................................ 81
Figura 36. Principais constituintes do leo essencial de O. basilicum... 82
Figura 37. Enantimeros do linalol 88
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna
cromatogrfica para isolamento da massoia lactona............................. 33
Tabela 2. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna
cromatogrfica para isolamento de 1-nitro-2-feniletano e
metileugenol.......................................................................................... 42
Tabela 3. Fraes da hidrodestilao do o.e. de A. canelilla................. 48
Tabela 4. Datas, observaes das coletas e rendimentos das extraes
de L. alba................................................................................................ 53
Tabela 5 Constituintes do o.e. de A. suaveolens e rea percentual
relativa dos picos no cromatograma....................................................... 57
Tabela 6. Constituintes volteis de A. suaveolens fresca (1), seca (2),
leo essencial (3) e resduo da extrao do o.e. (4) extrados por HS-
SPME e rea percentual relativa dos picos no cromatograma............... 60
Tabela 7. Amostras de A. canelilla analisada por CG-EM..................... 64
Tabela 8. Constituintes do leo essencial de A. canelilla da madeira
bruto (A) e fraes B, C, D e das folhas (E), e rea percentual
relativa dos picos nos cromatogramas (Figura 22, 23, 24, 25, 26)........ 66
Tabela 9. Concentrao (%) de 1-nitro-2-feniletano (m/m) nos leos
essenciais de A. canelilla....................................................................... 68
Tabela 10. Constituintes do leo essencial hidrodestilado da madeira
de A. canelilla e rea percentual relativa dos picos no cromatograma . 69
Tabela 11. leo essencial e extratos testados no ensaio biolgico........ 72
Tabela 12. Teste preliminar de atividade do o.e. e dos extratos
realizado pela tcnica de difuso com discos........................................ 73
Tabela 13. Constituintes do leo essencial da madeira e folhas de A.
xx
rosaeodora e rea percentual relativa dos picos no cromatograma....... 75
Tabela 14. Constituintes do leo essencial da madeira e folhas de A.
rosaeodora e rea percentual relativa dos picos no cromatograma33.... 76
Tabela 15. Constituintes do leo essencial de L. alba e rea percentual
relativa dos picos no cromatograma....................................................... 78
Tabela 16. Anlise comparativa de linalol em diferentes amostras de
L. alba....................................................................................................
80
Tabela 17. Constituintes do leo essencial de O. basilicum e rea
percentual relativa dos picos no cromatograma..................................... 82
Tabela 18. Constituintes volteis de amostras de A. rosaeodora, L.
alba e O. basilicum analisados por HS-SPME-CG-EM e rea
percentual relativa dos picos no cromatograma...................................... 85
Tabela. 19. Comparao dos constituintes do o.e. de O. basilicum por
injeo do o.e. e por HS-SPME.............................................................. 86
Tabela 20. Enantimeros do linalol nos o.e. de A. rosaeodora, L. alba
e O. basilicum...................................................................................... 87
xxi
SUMRIO
1. INTRODUO................................................................................. 1
1.1. leo essencial.......................................................................... 4
1.2. Mercado de leos essenciais..................................................... 9
2. REVISO BIBLIOGRFICA.......................................................... 12
2.1 Aeollanthus suaveolens Mart. ex-Spreng................................. 12
2.2 Aniba canelilla (H.B.K.) Mez.................................................. 14
2.3. Aniba rosaeodora Ducke......................................................... 16
2.4. Lippia alba Mill. N. E. Br....................................................... 19
2.5. Ocimum basilicum L. .............................................................. 22
3. OBJETIVOS...................................................................................... 27
3.1. Objetivo Geral......................................................................... 27
3.2. Objetivos Especficos.............................................................. 27
4. EXPERIMENTAL............................................................................. 29
4.1. Material botnico..................................................................... 30
4.2. Extrao do leo essencial de Aeollanthus suaveolens........... 31
4.3. Extrao a frio do resduo de A. suaveolens............................ 31
4.4. Extrao das partes areas de A. suaveolens com solvente..... 32
4.5. Isolamento da massoia lactona do extrato hexnico de A.
suaveolens....................................................................................... 32
4.5.1. Eliminao de clorofila.................................................... 32
4.5.2. Coluna cromatogrfica.................................................... 33
4.5.3. Cromatografia em camada delgada preparativa.............. 34
xxii
4.6. Constituintes volteis de Aeollanthus suaveolens extrados
por Micro-extrao em fase slida (SPME)................................... 35
4.7. Obteno da massoia lactona................................................... 36
4.8. Fracionamento do leo essencial da madeira de A. canelilla
por extrao cido-base, cromatografia em coluna e
cromatografia em camada delgada preparativa.............................. 40
4.9. Destilao do leo essencial bruto da madeira de A. canelilla 46
4.10. Redestilao do leo essencial da madeira de A. canelilla.... 47
4.11. Hidrodestilao do leo essencial bruto da madeira de A.
canelilla.......................................................................................... 47
4.12. Extrao e anlise do leo essencial das folhas de A.
canelilla.......................................................................................... 48
4.13. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial da
madeira e folhas de A. canelilla e fraes...................................... 48
4.14. Extrao das folhas de A. canelilla com diclorometano........ 49
4.15. Ensaios biolgicos................................................................. 49
4.15.1. Amostras e microorganismos avaliados........................ 49
4.15.2. Preparao do inculo................................................... 50
4.15.3. Preparao dos discos.................................................... 50
4.15.4. Meio de cultura.............................................................. 51
4.15.5. Inoculao das placas de teste....................................... 51
4.15.6. Aplicao de discos a placas de gar inoculadas........... 52
4.15.7. Leitura das placas e interpretao dos resultados.......... 52
4.16. Extrao do leo essencial de Lippia alba............................ 53
xxiii
4.17. Microextrao em Fase Slida de A. rosaeodora, L. alba e
O basilicum......................................................................................
54
4.18. Avaliao dos enantimeros de linalol nos leos essenciais
de A. rosaeodora, L. alba e O. basilicum....................................... 54
5. RESULTADOS E DISCUSSO....................................................... 56
5.1. Constituintes volteis do leo essencial de A. suaveolens....... 56
5.1.1. Isolamento da massoia lactona........................................ 58
5.1.2. Constituintes de A. suaveolens extrados por HS-SPME 59
5.1.3. Obteno da massoia lactona........................................... 61
5.2. Constituintes volteis do leo essencial de Aniba canelilla.... 63
5.2.1. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial
de A. canelilla............................................................................ 68
5.2.2. Variao dos constituintes volteis do leo essencial da
madeira de A. canelilla no processo de hidrodestilao............ 69
5.2.3. Isolamento de 1-nitro-2-feniletano e de metileugenol..... 70
5.3. Ensaios biolgicos com amostras de Aeollanthus suaveolens
e Aniba canelilla............................................................................. 72
5.4. Constituintes volteis do leo essencial de Aniba rosaeodora
das folhas e da madeira................................................................... 74
5.5. Constituintes volteis do leo essencial de Lippia alba.......... 77
5.5.1. Variao sazonal de linalol no leo essencial de Lippia
alba............................................................................................. 80
5.6. Constituintes volteis do leo essencial de Ocimum basilicum 81
5.7. Anlise comparativa de A. rosaeodora, L. alba e O.
xxiv
basilicum......................................................................................... 83
5.7.1 Constituintes volteis de A. rosaeodora, L. alba e O.
basilicum extrados por Microextrao em Fase Slida............ 83
5.7.2. Avaliao dos enantimeros de linalol nos leos
essenciais de A. rosaeodora, L. alba e O. basilicum................. 87
5.7.3. Anlise dos leos essenciais de L. alba, O. basilicum e
das folhas de A. rosaeodora comparando com o leo essencial
da madeira de A. rosaeodora...................................................... 89
6. CONCLUSES................................................................................. 91
7. REFERNCIAS................................................................................ 93
8. ANEXOS............................................................................................ 101
INTRODUO
1
1. INTRODUO
Estima-se que o Brasil possua 50.000 espcies de plantas superiores,
produtoras de madeiras, celulose, fibras, alimentos, leos vegetais e leos
essenciais entre outros produtos naturais. A floresta Amaznica com 4
milhes km2, teria 30.000 espcies de plantas, cerca de um tero medicinais
e/ou aromticas e talvez 70 % destas usadas como medicamentos pela
populao local, alm de outros usos. Porm, acredita-se que apenas 8 %
das espcies vegetais da flora brasileira foram estudadas em busca de
compostos bioativos e apenas 1.100 espcies vegetais da flora brasileira
foram avaliadas em suas propriedades medicinais.1
Plantas tm sido tradicionalmente usadas por populaes de todos os
continentes no controle de diversas doenas e pragas, alm de representar
uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos
dos quais se constituem modelos para sntese de um grande nmero de
frmacos. O fato que gera interesse nos produtos encontrados na natureza
que esses apresentam enorme diversidade em termos de estrutura e de
propriedades fsico-qumicas e biolgicas. A diversidade molecular dos
produtos naturais muito superior quela derivada dos processos de sntese,
que, apesar dos avanos considerveis, ainda limitada. Alm disso, como
produtos de organismos que possuem muitas similaridades com o
metabolismo dos mamferos, os produtos naturais muitas vezes exibem
propriedades adicionais s antimicrobianas a eles associados.2
Estudos apontam que a maior parte da populao nacional usa a
medicina alternativa como fonte de recursos teraputicos.
Com o aumento da demanda pela utilizao de plantas medicinais na
cura ou preveno de doenas, o cultivo e/ou o extrativismo dessas plantas
INTRODUO
2
torna-se uma alternativa cada vez mais importante na agricultura nacional.
No entanto, o intenso extrativismo coloca em risco de extino inmeras
espcies nativas, causando distrbios ecolgicos. Considerando-se o valor
das plantas medicinais no apenas como recurso teraputico, mas tambm
como fonte de recurso econmico, torna-se importante estabelecer linhas de
ao voltadas para o desenvolvimento de tcnicas de manejo ou cultivo,
tendo em vista a utilizao dessas espcies vegetais pelo homem aliada
manuteno do equilbrio dos ecossistemas tropicais.3
O mercado de produtos farmacuticos derivados de plantas um
segmento promissor, j que o crescimento do mercado de medicamentos
fitoterpicos da ordem de 15 % ao ano, enquanto o crescimento anual do
mercado de medicamentos sintticos gira em torno de 3 a 4 %, alm de
constituir-se em uma opo teraputica eficaz e culturalmente apropriada.3
O ltimo diagnstico do mercado de cosmticos feito pela ABIHPEC
(Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e
Cosmticos), disponvel para consulta, mostra que o Brasil conta com 1.367
empresas atuando no setor, sendo que as 16 de grande porte so
responsveis por 72,4 % de faturamento total. As vendas de cosmticos em
2005 atingiram o valor de R$ 15,4 bilhes e o crescimento do setor de
cosmticos, higiene pessoal e perfumaria em 2005 foi de 14,5 %,
apresentando nos ltimos 10 anos um crescimento mdio de 10,7 %.
Adicionalmente, o setor de cosmticos tem alta demanda por novos
produtos. Essa dissertao visa a inovao em novos produtos para
perfumaria e cosmticos. A Figura 1 apresenta a evoluo do faturamento
desse setor.4
INTRODUO
3
Fig. 1. Evoluo do faturamento lquido do setor de higiene pessoal,
perfumaria e cosmticos no Brasil
A Amaznia tem papel de grande importncia, nacional e
internacional. Sua flora e fauna so extremamente ricas, e centenas de
espcies de animais e plantas so encontradas exclusivamente na regio.
urgente a necessidade de preservar sua biodiversidade, pois a floresta
Amaznica sofre grande devastao, tanto pela explorao madeireira como
pela prtica agrcola. Estima-se que o desmatamento j destruiu cerca de
625.000 km2 de floresta, no poupando nem mesmo plantas teis para a
rea Farmacutica ou Cosmtica. O custo ecolgico destas derrubadas
altssimo, e o ambiente afetado de forma irreparvel.
Apesar da indstria de Perfumaria e Cosmticos exigir produtos
novos com freqncia, e esta ser uma boa rea de investimento por
consumir baixos volumes de materiais a altos preos, apenas trs espcies
aromticas oriundas da Biodiversidade fazem parte da pauta de exportao
e comrcio na Amaznia: as favas de cumar (Coumarona odorata), o leo
3,6 3,3 3,84,6
6,48,3
9,711,5
13,515,4
2001 2002 2003 2004 2005
Bilhes - US$ Bilhes - R$
INTRODUO
4
de copaba (Copaifera spp.) e o leo de pau-rosa (Aniba rosaeodora). 5
Recentemente, o Estado do Acre iniciou a extrao do leo essencial de
pimenta longa (Piper hispidinervium) originado de cultivos, como produtor
de safrol, e o Par extrao do leo essencial de priprioca (Cyperus
articulatus) para perfumes finos. No Sul do Brasil a espcie Ocotea
sassafraz est em perigo de extino e a erva baleeira (Cordia verbenaceae)
a nica que se tornou comercial, em bases sustentveis como medicamento
Acheflan desenvolvido pela Ach em colaborao com o CPQBA -
UNICAMP.
1.1. LEO ESSENCIAL
As substncias odorferas em plantas possuem funes ecolgicas,
especialmente como inibidores da germinao, na proteo contra
predadores, na atrao de polinizadores, na proteo contra a perda de gua
e aumento da temperatura, entre outras.6,7
leos essenciais tambm chamados de leos volteis so produtos
obtidos de partes de plantas atravs, sobretudo, de destilao por arraste
com vapor dgua, bem como os produtos obtidos por expresso dos
pericarpos de frutos ctricos. De forma geral, so misturas complexas de
substncias volteis lipoflicas geralmente odorferas e lquidas. Sua
principal caracterstica a volatilidade, diferindo-se, assim, dos leos fixos,
mistura de substncias lipdicas, obtidos geralmente de sementes.
Apresentando tambm outras caractersticas:
x aparncia oleosa temperatura ambiente;
x aroma agradvel e intenso da maioria dos leos;
INTRODUO
5
x solubilidade em solventes orgnicos apolares. Em gua apresentam
solubilidade limitada, mas suficiente para aromatizar as solues
aquosas, que so denominadas hidrolatos;
x sabor: geralmente acre (cido) e picante;
x cor: quando recentemente extrados so geralmente incolores ou
ligeiramente amarelados; so poucos os leos que apresentam cor,
como o leo voltil de camomila de colorao azulada pelo seu alto
teor de azuleno;
x estabilidade: em geral no so muito estveis, principalmente na
presena de ar, calor, luz, umidade e metais;
x a maioria possui ndice de refrao e so opticamente ativos;
x seus constituintes variam desde hidrocarbonetos terpnicos, lcoois
simples e terpnicos, aldedos, cetonas, fenis, steres, teres, xidos,
perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas, cumarinas, e at
compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se
em diferentes concentraes, normalmente, um deles o composto
majoritrio, existindo outros em menores teores e alguns em
baixssimas quantidades ou traos.3
A grande maioria dos leos essenciais constituda de derivados de
terpenides ou de fenilpropanides, sendo que os primeiros preponderam.
Os terpenides so derivados de unidades do isopreno e os fenilpropanides
se formam a partir do cido chiqumico, que forma as unidades bsicas dos
cidos cinmico e p-cumrico. A Figura 2 mostra a origem dos terpenides
e fenilpropanides.
INTRODUO
6
isopreno terpenide
OHO
OHHO OH
cido chiqumico fenilpropanide
Fig. 2. Origem dos terpenides e fenilpropanides
Tais compostos so metablitos secundrios que tm a sua origem
explicada a partir do metabolismo da glicose. Esse ciclo biossinttico pode
ser observado na Figura 3.
INTRODUO
7
alcalideindlicos
quinolnico
protoalcalidealcalide
isoquinolnicos benzilisoquinolnicos
polissacardeos heterosdeos
cido chiquimco
GLICOSEE
acetil-CoA
triptofano fenilalanintirosina
cido glico
Ciclo do cido ctrico
via mevalonato
condensao
taninoshidrolisveis
antraquinonaflavonide
taninos
ornitinalisina
isoprenide
cidos graxosacetogeninas
terpenides esteris
alcalidepirrolidnicos
tropnicos,pirrolizidnicopiperidnicos
quinolizidnico
cido cinmico
fenilpropanide
lignanas e cumarinas
Fig. 3. Ciclo biossinttico geral dos metablitos secundrios 3
Os leos essenciais podem estar estocados em certos rgos, tais
como nas flores, folhas ou ainda nas cascas dos caules, madeira, razes,
rizomas, frutos ou sementes. Embora todos os rgos de uma planta possam
INTRODUO
8
acumular leos essenciais, sua composio pode variar segundo a
localizao.3
A composio qumica dos leos essenciais pode ser afetada pelas
condies ambientais. Por exemplo: um indivduo cultivado numa regio
chuvosa pode apresentar composio qumica diferente de outro indivduo
da mesma espcie cultivado em uma regio seca.
Os mtodos de extrao variam conforme a localizao do leo
essencial na planta e com a proposta de utilizao do mesmo, os mais
comuns so:
1. enfleurage: empregado para extrair leo essencial de ptalas de
flores,. As ptalas so depositadas, a temperatura ambiente, sobre
uma camada de gordura, durante certo perodo de tempo. Em seguida
essas ptalas esgotadas so substitudas por novas at a saturao
total, quando a gordura tratada com lcool. Para se obter o leo
essencial, o lcool destilado a baixa temperatura, o produto assim
possui alto valor comercial.
2. arraste por vapor dgua: os constituintes do material vegetal
possuem presso de vapor mais elevada que a da gua, sendo por
isso, arrastados pelo vapor dgua. Em pequena escala, emprega-se o
aparelho de Clevenger. O leo essencial obtido, aps separar-se da
gua, deve ser seco com Na2SO4 anidro. Esse procedimento, embora
clssico, pode levar formao de artefatos em funo da alta
temperatura empregada. Preferencialmente, esse mtodo utilizado
para extrair leos de plantas frescas.
3. extrao com solventes orgnicos: os leos essenciais so extrados,
preferencialmente, com solventes apolares que, entretanto, extraem
INTRODUO
9
outros compostos lipoflicos, alm dos leos essenciais. Por isso, os
produtos assim obtidos raramente possuem valor comercial.
4. prensagem (ou expresso): empregado para extrao de leos
essenciais de frutos ctricos. Os pericarpos desses frutos so
prensados e a camada que contm o leo essencial , ento, separada.
Posteriormente, o leo separado da emulso formada com gua
atravs de decantao, centrifugao ou destilao fracionada.
5. extrao por CO2 super crtico: esse mtodo permite recuperar os
aromas naturais de vrios tipos e no somente leo essencial, de um
modo bastante eficiente. o mtodo ideal para extrao industrial de
leos essenciais. Nenhum trao de solvente permanece no produto
obtido, tornando-o mais puro do que aqueles obtidos por outros
mtodos. Para tal extrao, o CO2 primeiramente liquefeito atravs
de compresso e, em seguida, aquecido a uma temperatura superior a
31 C. Nessa temperatura, o CO2 atinge um quarto estado, no qual
sua viscosidade anloga de um gs, mas sua capacidade de
dissoluo elevada como a de um lquido. Uma vez efetuada a
extrao, faz-se o CO2 retornar ao estado gasoso, resultando na sua
total eliminao.
1.2. MERCADO DE LEOS ESSENCIAIS
O uso de extratos e leos essenciais na indstria de cosmticos e, em
particular, no ramo de perfumes remonta Antigidade. Na China, na ndia
e no Oriente Mdio, as plantas aromticas, os leos, as guas perfumadas e
preparaes cosmticas eram utilizadas na cozinha, em cosmticos, na
medicina e nas prticas religiosas. A indstria de cosmticos moderna foi
INTRODUO
10
buscar na sabedoria milenar da fitoterapia as receitas para hidratao e
relaxamento da pele e do cabelo.8
Alm dos leos essenciais obtidos de plantas, produtos sintticos so
encontrados no mercado. Esses leos sintticos podem ser imitaes dos
naturais ou composies de fantasia. Para o uso farmacutico, somente os
naturais so permitidos pelas farmacopias. Excees so aqueles leos que
contm somente uma substncia, como o leo de baunilha, que contm
vanilina. Nesses casos, algumas farmacopias permitem tambm os
equivalentes sintticos.3
No mercado internacional o Brasil o dcimo maior importador de
leos essenciais e o quarto maior exportador somando US$ 98 bilhes em
2004. Existem hoje aproximadamente 3.000 leos conhecidos e 300
comercializados, sendo os seis principais produzidos e exportados os leos
de laranja, limo taiti, eucalipto, pau-rosa, lima e capim-limo.5
Empresas multinacionais, sobretudo comeam a instalar-se na
Amaznia a partir do ano 2001. Assim a Crodamazon, a Cognis alm da
Beraca (Brazmazon) produzem diferentes leos e extratos para importantes
indstrias de cosmticos.
O mercado mundial de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmtico
chegou a US$ 240 bilhes em 2004,9 sendo provavelmente 10 % desde
valor o consumo de matrias primas. O valor deste mercado mostra
claramente que os produtos naturais da Amaznia tm uma oportunidade
nica neste contexto, visto que a demanda de novos leos essenciais para o
mercado de perfumaria crescente, principalmente aqueles oriundos da
Amaznia e da Mata Atlntica. Infelizmente, a baixa qualidade das matrias
primas originadas na regio aliada a fatores como suprimento inadequado,
INTRODUO
11
prazos, e falta de controle de qualidade, liquidam a competitividade da
regio na busca de novos mercados.
Baseado na importncia do estudo de novas fontes sustentveis, leos
essenciais de cinco plantas aromticas (Aeollanthuns suaveolens, Aniba
canelilla, Aniba rosaeodora, Lippia alba e Ocimum basilicum) foram
escolhidos para esse trabalho. Aeollanthuns suaveolens pelo seu aroma
marcante de cco, tornando seu leo uma possvel fragrncia para
perfumaria, Aniba canelilla por seu aroma de canela, podendo ser usado nas
indstrias alimentcia e de cosmticos, Aniba rosaeodora dado ao
esgotamento de suas fontes naturais e por sua importncia no mercado
internacional de leos essenciais, Lippia alba e Ocimum basilicum por
serem citados na literatura como possveis fontes de linalol para substituir o
leo essencial de A. rosaeodora . A reviso bibliogrfica de cada planta est
a seguir.
REVISO BIBLIOGRFICA
12
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1. Aeollanthus suaveolens Mart. ex- Spreng
Fig. 4. Foto de A. suaveolens
Aeollanthus suaveolens, conhecida popularmente como catinga de
mulata, pertence famlia Lamiaceae e uma erva anual nativa da
Amaznia. O leo essencial dessa planta foi recentemente apresentado, pelo
nosso grupo de pesquisa, no Congress on Perfumery and Natural raw
material 5, na Frana, e na empresa Quest, em Paris, onde recebeu grande
ateno.
A planta usada pela populao em banhos de cheiro feito pela
infuso de plantas aromticas, em motivos religiosos ou folclricos, e em
perfumes caseiros. No folclore usado para quebranto. Na etnomedicina
usado no combate febre, dor de cabea, incio de derrame, sendo a folha a
parte mais utilizada como ch e sumo.10 Devido a importncia desta planta
como medicinal e como fragrncia, vrios autores a estudaram.
Edua
rdo
Mat
toso
REVISO BIBLIOGRFICA
13
Estudos anteriores mostraram que os leos essenciais das folhas e
flores obtidos por hidrodestilao apresentaram como principais
componentes o (-) linalol, farneseno e (-) massoia lactona.10 Por esses
autores, o maior rendimento de linalol ocorre na folha (31,50 %), para o
farneseno observa-se maior concentrao na flor (55,32 %), seguida do
caule (42,17 %) e folha (21,90 %).10 Com relao a massoia lactona, o
percentual de maior significado ocorreu na folha (25,15 %), nas demais
partes do vegetal, as porcentagens foram insignificantes.10 Um outro estudo
mostra que o rendimento da destilao do leo essencial maior no perodo
de florescncia (0,11 %) do que no perodo sem flores (0,07 %).11 No caso
da hidrodestilao, amostras frescas apresentam menor rendimento (0,1 %)
que amostras secas (0,5 %).12
A atividade antimicrobiana do leo essencial foi comprovada, sendo a
massoia lactona fortemente ativa contra os microorganismos S. setubal e
Bacillus subtilis.13 A CIM (Concentrao Inibitria Mnima) do leo voltil
mostra atividade mais acentuada contra a bactria Escherichia coli e o
fungo Cryptococcus neoformans.13
Estudos fitoqumicos monitorados farmacologicamente evidenciaram
que o leo essencial o responsvel pelo bloqueio de convulses induzidas
por Metrazol (PTZ) em camundongos.14 A atividade anticonvulsivante das
lactonas detectadas nesta planta, (G - decalactona, G - decen-2-lactona e J -
decalactona) foram avaliadas em camundongos, sendo que as duas
primeiras no apresentaram resultados significativos, mas a J - decalactona
apresentou atividade sedativa.15 O extrato hidroalcoolico de A. suaveolens
mostrou forte atividade analgsica e antiinflamatria em camundongos.16
REVISO BIBLIOGRFICA
14
Dado a importncia etnomdica, farmacolgica e a possibilidade de
ser utilizada em perfumaria, decidimos estudar mais profundamente essa
planta.
2.2. Aniba canelilla (H. B. K.) Mez
Fig. 5. Foto de A. canelilla
A Aniba canelilla pertence famlia Lauraceae e nativa da regio
Amaznica, distribuindo-se amplamente nas matas pluviais do interior da
Guiana Francesa no leste, ao longo do escudo das Guianas, atravessando
Suriname, Venezuela e Colmbia at Amaznia peruana. No Brasil,
ocorre nos estados do Par e Amazonas. Apresenta os nomes vulgares de
preciosa17, folha-preciosa, pau-precioso18, casca-preciosa17, casca-do-
maranho17, falsa-canela18, amapaiama18, pereior18. Esta rvore fornece
madeira de tima qualidade, apropriada para mobilirio e construo civil.
A planta enormemente utilizada na medicina popular. O ch das
cascas e folhas empregada contra o artritismo, esgotamento nervoso como
redutora da albumina do sangue19, para hidropsia, catarro crnico, sfilis,
leucorria, aerofagia, males do corao e para amenizar a dor aps a
extrao de dentes17, sendo ainda considerado anti-anmico, anti-
desentrico, anti-espasmdico, digestivo, eupptico, peitoral e
ww
w.tr
eem
ail.n
l
REVISO BIBLIOGRFICA
15
estimulante18. Tambm usado para resfriados, tosses, dor-de-cabea e
nuseas.20 Possveis aplicaes em cosmticos so sugeridas pelo seu uso
etnobotnico. O leo essencial usado contra acnes, dermatites, febre,
infeces diversas e ferimentos.20
Devido ao aroma de canela usado como condimento.21 O odor do leo
essencial da preciosa, semelhante ao da canela, fez com expedies
portuguesas e espanholas, aps o descobrimento do Brasil, penetrassem na
regio amaznica em busca dessa especiaria.22
Os tecidos indicam a composio: eugenol, linalol, metileugenol,
anabasina, anibina e tanino.23 O principal componente do leo essencial,
tanto do tronco quanto das folhas de A. canelilla, o 1-nitro-2-feniletano,
uma molcula rara em produtos naturais, derivada da fenilalanina. O leo
da madeira apresenta rendimento de 0,7-1,0 % e consiste de eugenol (1 %),
metil eugenol (15 %) e 1-nitro-2-feniletano (80 %).24 A anlise de CG-EM
do leo essencial das folhas apresentou a seguinte composio qumica: D-
pineno, E-pineno, E-felandreno, E-cariofileno, E-sesquifelandreno, p-
cimeno, linalol, 1-nitro-2-feniletano, D-copaeno e espatulenol.18 Em outro
estudo22 foram identificados sesquiterpenos no leo essencial das folhas,
bem como a presena de molculas precursoras da biossntese de 1-nitro-2-
feniletano como benzonitrila, benzoacetaldedo e benzoacetonitrila. O leo
essencial das cascas apresentou os alcalides benziltetrahidroisoquinolina23,
tetrahidroprotoberberina25, (R)(+)noranicanina26, anicanina26, canelila27,
norcanelilena27, (-) norcanelilina28, (+) canelilina28, canelilinixina.28
A atividade anti-espasmdica do leo das cascas de A. canelilla foi
comprovada in vivo.29
REVISO BIBLIOGRFICA
16
O componente majoritrio do leo essencial 1-nitro-2-feniletano,
possui alta toxicidade contra Candida albicans. A DL50 do extrato de ter de
petrleo da planta maior que 800 mg/Kg por rato BALB/c.30
Nosso interesse nessa planta deriva do seu aroma especial, do uso
etnobotnico e da sua ao sobre a pele como mostrado por Maia e col.18
Adicionalmente, nosso estudo voltado para as folhas dessa planta, que
mostram os trabalhos de Maia e col.18,22 possui enorme concentrao de 1-
nitro-2-feniletano.
2.3. Aniba rosaeodora Ducke
Fig. 6. Foto de A. rosaeodora
A Aniba rosaeodora uma rvore da famlia Lauraceae, conhecida
como pau-rosa, que no Brasil ocorre desde o Amap at a fronteira com o
Peru ao longo de ambas as margens do rio Amazonas.
A planta usada em cosmticos, perfumes caseiros e sprays para
aromatizar ambientes e em loes com leo de Andiroba (Carapa
guianensis) para reumatismo. O leo essencial puro usado na odontologia
Edua
rdo
Mat
toso
REVISO BIBLIOGRFICA
17
e alergias. O hidrolato (gua aromtica subproduto da destilao) usado
para a desinfeco de banheiros e ralos com grande eficincia. As folhas de
A. rosaeodora so utilizadas pelas lavadeiras beira dos rios da Amaznia,
para a ltima gua de enxge das roupas, o que lhe confere um aroma
especial de limpeza.
No folclore amaznico os homens passam gotas do leo atrs dos
lbulos da orelha, acreditando que isto lhes confere atrativo sexual. So os
perfumes atrativos encontrados na feira Ver-o-Pso preparados com lcool
desodorizado 70 %, casca e folhas do pau-rosa e outras plantas aromticas.
Defumaes de limpeza do ambiente so feitas com raspas de casca e
folhas de A. rosaeodora aspergidas sobre braseiros toda 1a sexta-feira do
ms, e no folclore isto afasta os maus espritos.
Na Aromaterapia, o leo essencial de A. rosaeodora aconselhado
como estimulante celular, regenerador de tecidos, antidepressivo, tnico
dos nervos, calmante e utilizado para dores de cabea e nuseas.
Na Cosmetologia indicado para os cuidados com a pele sensvel,
pele envelhecida, rugas e cuidados em geral e tambm para cicatrizes e
leses, acne e dermatite. indicado para qualquer tipo de preparado para o
corpo ou para a pele (leos de banho, loes, mscaras e massagens
faciais).
A. rosaeodora, espcie cujo aroma da madeira lembra a rosa, produz
leo essencial constitudo na maior parte por linalol (70-90 %). Linalol e
seus steres, como o acetato de linalila, so matrias odorferas de cheiro
intenso e agradvel. Esse lcool um importante intermedirio na produo
de vitamina E, e embora de origem sinttica seja bastante usado em
perfumaria para produtos de fragrncias florais, pode ser aplicado em
detergentes e sabes. Desde o incio do sculo a indstria de Perfumaria e
REVISO BIBLIOGRFICA
18
Cosmticos vem utilizando este leo, que hoje vendido por US$80/kg
(FOB Manaus). O preo tem aumentado com a escassez do produto, j que
as ltimas fontes naturais esto esgotando-se. Os principais compradores do
leo so os Estados Unidos e Europa, podemos citar empresas sofisticadas
como a francesa Chanel, que utiliza o leo na produo dos seus perfumes.
Para produzir anualmente cerca de 40 toneladas de leo essencial da
madeira de A. rosaeodora, necessrio que sejam derrubadas cerca de 4 mil
rvores. De acordo com o Ibama, para cada tambor de 180 litros de leo
produzido, 80 mudas de A. rosaeodora deveriam ser plantadas. Existe,
entretanto, a escassez de mudas, o que as torna caras. O principal problema
que para a extrao do leo essencial de A. rosaeodora ocorre a destruio
da rvore, pois, para obteno desse leo, o tronco cortado transformado
em serragem, outros problemas so a falta de tcnicas de plantio e o longo
perodo de maturao dessas plantas na floresta para corte da madeira -
mais de 25 anos.
Nos ltimos tempos, a indstria de Perfumaria tem reduzido o
consumo do leo de A. rosaeodora, tanto pelo preo quanto pela questo
ambiental, tendo em vista que a espcie corre perigo de extino, as grandes
empresas, em geral, preferem no correr o risco de ter seu nome associado
devastao do meio ambiente.
Cientistas brasileiros preocupados com o esgotamento das reservas
naturais de A. rosaeodora tm pesquisado fontes alternativas de leos
essenciais ricos em linalol. Alguns estudos mostram que o leo de O.
basilicum por apresentar considervel concentrao de linalol (31 %) e
grande facilidade de cultivo seria uma possvel alternativa ao uso do leo de
A. rosaeodora.31 Outros estudos apontam o leo da L. alba como
REVISO BIBLIOGRFICA
19
alternativa, devido a sua alta concentrao de linalol (60 %) nas partes
areas.32
Anlises do leo essencial das folhas de A. rosaeodora feitas pelo
nosso grupo de pesquisa mostraram que este a melhor alternativa de fonte
sustentvel do leo da sua madeira, por possuir perfil cromatogrfico e
qualidade olfativa aps destilao, similar ao linalol da madeira. O linalol
apresenta-se em alta concentrao no leo essencial da madeira (85 %) e
nas folhas (81 %).33
O estudo dos leos essenciais da madeira e das folhas de A.
rosaeodora foi introduzido nessa dissertao para comparar a quiralidade
dos compostos desses leos com as dos leos essenciais de Lippia alba e
Ocimum basilicum.
2.4. Lippia alba Mill. N. E. Br.
Fig. 7. Foto de L. alba
Tambm conhecida como erva cidreira nacional, erva cidreira de
arbusto, erva cidreira do campo, alecrim do campo, alecrim selvagem,
carmelitana, cidreira brava, falsa melissa, lpia (Brasil); white ou bush
Adr
iana
Lope
sSch
ioze
r
REVISO BIBLIOGRFICA
20
Lippia, wild sage (ingls); pampa organo (Amaznia peruana); toronjil
mulato, organo de burrro, cidrona (Venezuela); paralisado, salvia
(Argentina); salvia betonica (Mxico).34 Ocorre nas Amricas Central e do
Sul, habitando praticamente todas as regies do Brasil, onde empregada
como medicinal, pelas suas propriedades sedativa, carminativa, analgsica,
espasmoltica e emengoga.
L. alba um arbusto perene de at 3 m de altura, muito ramificado e
de galhos finos. As folhas so curto-pecioladas, opostas, ovadas, ovado-
oblongas ou oblongas, agudas ou obtusas no pice, estreitas na base. As
flores so pequenas, normalmente rseo-violceas, mas s vezes vermelhas
ou brancas, em espigas densas. Planta de fcil propagao, no tolerando
excesso de temperatura. Cresce em vrios tipos de solo, preferindo os
levemente arenosos.34
A composio do leo essencial apresenta variao qualitativa e
quantitativa, levando a separao em quimiotipos denominados Lippia alba
1, 2, 3, os quais produzem como componente majoritrio no leo essencial
o citral, a carvona e o linalol, respectivamente,35 mesmo que cultivadas em
condies semelhantes. O leo essencial do quimiotipo 3 obtido por
hidrodestilao das folhas das plantas foi analisado por CG, sendo
identificados oito compostos (aproximadamente 93,6 % do leo): linalol
(69,3 %), 1,8 cineol + limoneno (4,6 %), germacreno D (4,2 %), SS-
cariofileno (3,6 %) e germacreno D-4-ol (2,7 %).36 Em outra anlise, o leo
essencial das folhas apresentou a composio: linalol (78,9 %), 1,8 cineol
(6,5 %), germacreno D (3,5 %), E- cariofileno (2,7 %) e D- terpineol (2
%).37 A anlise do linalol com coluna quiral mostrou que a L. alba apresenta
exclusivamente o ismero S-linalol.38 Humberto, Lage e Leito39 afirmam
que L. alba uma fonte em potencial de linalol 3S-(+)-linalol, que requer
REVISO BIBLIOGRFICA
21
pequenas reas para o cultivo a apresenta crescimento rpido, alm disso
uma fonte sustentvel porque o melhor leo obtido dessa planta o da sua
folha. Kleber, Bem e Jannuzzi40, agrnomos da Universidade de Braslia
(UNB), estudaram diferentes quimiotipos de L. alba determinando a
composio de linalol com at 60 % nas partes areas. Os autores sugerem
que o leo essencial dessa planta poderia vir a substituir o leo essencial da
madeira de A. rosaeodora.
O leo essencial de L. alba mostra efeito fungisttico contra
Colletotrichum falcatum and C. pallescens a 700 ppm ou menos e efeito
fungicida em concentraes maiores para Fusarium moniliforme,
Ceratocystis paradoxa, Rhizoctonia solani, Curvularia lunata, Periconia
atropurpuria e Epicoccum nigrum.41 Tambm apresenta atividade
antibacteriana, sendo maior, sobre os germes grampositivos.42 e mostra um
promissor potencial txico contra insetos de gros.43
Avaliando a atividade inseticida de compostos de origem vegetal para
obter inseticidas com baixa toxicidade para mamferos, testou-se extrato de
Lippia alba contra a praga Tribolium castaneum e como se observou um
efeito letal sobre T. castaneum concluiu-se que esse extrato poderia servir
como base para a obteno de novos agroqumicos.44 O extrato tambm
apresentou efeito aleloptico e citotxico sobre sementes de alface45 e
atividade anti-candida.46
O extrato de acetato de etila de L. alba mostra atividades anti-
poliovrus.43 Administrao oral de infuso de L. alba previne leses
gstricas induzidas por indometacina (anti-inflamatrio).48 Uma frao no-
voltil de L. alba extrada em etanol 80 % (v/v) apresentou efeitos sedativo
e miorelaxante em camundongos.49
REVISO BIBLIOGRFICA
22
O leo essencial anti-oxidante natural apropriado para produtos
farmacuticos e alimentcios, por exemplo: loes, cremes, xampus e
doces.50
O uso etnomdico de L. alba e suas propriedades bactericidas,
fungicidas e anti-oxidante conduziram nosso interesse para o estudo dessa
planta. Adicionalmente, a sugesto de autores (Maia e col.32, Humberto,
Lage, Leito39 e Kleber, Bem e Jannuzzi40) de que o leo essencial de L.
alba poderia substituir o leo da madeira de A. rosaeodora, provocou a
anlise comparativa desses leos.
2.5. Ocimum basilicum L.
Fig. 8. Foto de O. basilicum
Entre as ervas aromticas, O. basilicum, conhecido popularmente
como manjerico, possui importncia econmica no Brasil, podendo ser
utilizado in natura ou como leo essencial.51 Este leo produzido em larga
escala mundialmente: ndia, Bulgria, Egito, Paquisto, Israel, Iugoslvia,
Estados Unidos, Madagascar, Albnia e Hungria. O Brasil exporta esse leo
por 50 US$/Kg, a ndia e o Egito por 12 15 US$/Kg.52 O tipo europeu
Nils
onM
aia
Bor
lina
REVISO BIBLIOGRFICA
23
considerado de altssima qualidade, produzindo um delicado aroma devido
mistura de linalol e estragol em sua composio qumica, sendo
extensivamente utilizado como aromatizante de licores e perfumes finos.53
Na Etnomedicina essa planta utilizada contra vrias doenas como:
estimulante, estomacal, bronquite, reumatismo e antiespasmdico. Na
Aromaterapia cabocla da Amaznia a planta usada em banhos de cheiro,
mas cuidados devem ser tomados quando se utiliza o leo essencial de O.
basilicum em banhos, pois ele pode causar irritaes na pele de pessoas
sensveis.54,55,56
So identificados sete quimiotipos de Ocimum basilicum: (1) linalol,
(2) metil cinamato, (3) metil cinamato/ linalol, (4) metil eugenol, (5) citral,
(6) metil chavicol, e (7) metil chavicol/ citral.57
A anlise qumica do O. basilicum mostra a presena de taninos,
flavonides, saponinas, cnfora e no leo essencial: timol, metil-chavicol,
linalol, eugenol, cineol e pineno.51
Diversos autores avaliaram a produtividade de O. basilicum em
ambiente protegido: 1) hidroponia (floating); 2) substrato preparado e 3)
substrato comercial. O sistema hidropnico apresentou a maior
produtividade de massa verde, aproximadamente 44 % superior aos outros
dois tipos de cultivo. No houve diferena significativa entre as formas de
cultivo quanto ao rendimento e composio qumica dos leos essenciais.51
Um estudo sobre o efeito da temperatura na composio do leo
essencial foi realizado, sendo que na temperatura de 25 C houve aumento
de eugenol e cis-ocimeno, enquanto em 15 C o acrscimo se deu nos
compostos cnfora e trans farneseno. Os compostos linalol e 1,8
cineol no sofreram efeito da temperatura.58
REVISO BIBLIOGRFICA
24
A anlise do leo essencial de O. basilicum leva a resultados
diferentes dependendo do mtodo de extrao. Enquanto a composio dos
leos obtidos com arraste convencional, usando-se microondas como fonte
de aquecimento e com CO2 pressurizado forneceu estragol como principal
constituinte, o leo extrado com solvente a partir da gua codestilada
apresenta linalol em maior teor.59
Um estudo do armazenamento e conservao do O. basilicum, em
diferentes pocas e horrios de colheita, mostrou o decrscimo linear dos
teores de leo essencial, de clorofila e do nmero de colnias de fungos e
bactrias ao longo do armazenamento. No houve efeito da poca ou do
horrio de colheita sobre a composio do leo essencial, mas os teores de
eugenol e linalol aumentaram durante o armazenamento.60 O nmero de
coliformes ficou abaixo de 0,3 NMPg-1 e o nmero de Staphylococcus
aureus, abaixo de 1,0x 102 UFC g1-.60
O leo essencial das folhas extrado tanto por hidrodestilao quanto
por arraste vapor ou de toda planta usado em aroma alimentcio,
produtos de higiene bucal, em fragrncias, em rituais, aromaterapia e como
medicinal.
O leo essencial apresenta propriedades inseticidas, nematicida,
fungisttico, antimicrobiano61 e antifngico.62 Diferentes mtodos utilizados
para testar a atividade antibacteriana mostraram que o leo essencial obtido
de partes areas de O. basilicum possui forte efeito inibitrio sobre
Staphylococcus, Enterococcus e Pseudomonas.63
O crescimento micelial do fungo patognico (Botrytis fabae) de
planta foi reduzido significativamente nos quimiotipos metil chavicol e
linalol. Todos os componentes individuais de maior concentrao nos leos
REVISO BIBLIOGRFICA
25
metil chavicol, linalol, eugenol e eucaliptol - diminuem o crescimento do
fungo.64
O leo essencial a uma dose de 1,5 mL/L inibe completamente o
crescimento micelial de 22 espcies de fungos e tambm repelente ao
inseto Allacophora foveicollis. A dose txica muito menor que de alguns
fungicidas comerciais.65
Nos testes antifngicos, os melhores resultados foram obtidos com o
extrato das folhas frescas a 20 %, que ocasionou inibio de 100 %, 91 % e
84 % sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides, L. theobromae e
M. phaseolina respectivamente e com o leo essencial a 0,2 % que
promoveu uma inibio de 91 %, 100 % e 43 % frente a C. gloeosporioides,
L. theobromae e M. phaseolina respectivamente. Os extratos das folhas
secas foram completamente inativos nas mesmas condies.59
O eugenol encontrado no leo essencial mostra atividade
antioxidante,66 alm dos 2 compostos fenlicos cido rosmarnico (RA) e
cido cafeico (CA) - que apresentam essa propriedade fortemente
pronunciada.67
As substncias apigenina, linalol e cido ursolico foram isoladas dos
extratos aquoso e etanlico e apresentaram amplo espectro de atividade
antiviral, como atividade contra vrus da Herpes e hepatite B.68
O extrato aquoso, metanlico e hidro-metanlico e os flavonides
glicosilados de O. basilicum diminuem o ndice de lcera, inibe o cido
gstrico e secrees da pepsina e aumenta hexosaminas em ratos em
tratamento com aspirina.69
A atividade antimicrobiana do leo essencial de O. basilicum contra
microorganismos tem sido amplamente relatada. Prasad et al. (1986) e
Farag et al. (1989) ressaltam ainda que o leo essencial obtido de O.
REVISO BIBLIOGRFICA
26
basilicum e outras espcies de Ocimum so mais eficientes contra bactrias
Gram-positivas (Bacilus sp., Staphylococcus sp., Micrococcus sp.,
Lactobacillus sp.) que contra bactrias Gram-negativas (Enterobacter sp.,
Pseudomonas sp., Salmonela sp.).70
O. basilicum tolerante a cobre e zinco em altas concentraes e
sensvel a Co e Ni. Estudos da distribuio subcelular das folhas e raiz
revelam a seletiva diviso de altas concentraes de Cu e Zn nas paredes da
clula, e Co e Ni na frao do citoplasma.71
O leo essencial de O. basilicum um aromatizante utilizado em
indstrias Alimentcia e de Perfumaria, possui atividades antimicrobiana e
antifngica. Somando-se a isso citado na literatura31 como uma possvel
fonte sustentvel de linalol, pois sua concentrao de 31 % e apresenta
grande facilidade de cultivo, por isso sugerido como um substituinte do
leo essencial da madeira de A. rosaeodora. Tornando-se assim, um objeto
interessante para nosso estudo.
OBJETIVOS
27
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Estudar a composio qumica de leos essenciais de plantas
aromticas de valor comercial por CG-EM.
3.2. Objetivos Especficos
1. Extrair o leo essencial das folhas de Aniba canelilla e Lippia alba e
partes areas de Aeollanthus suaveolens.
2. Caracterizar quimicamente por CG-EM os leos essenciais das
espcies Aeollanthus suaveolens, Aniba canelilla, Aniba rosaeodora,
Lippia alba e Ocimum basilicum.
3. Extrair por Microextrao em Fase Slida e analisar por CG-EM os
compostos volteis de amostras de A. suaveolens, A. rosaeodora, L.
alba e O. basilicum.
4. Comparar por CG-EM em coluna quiral a composio dos
enantimeros de linalol nos leos essenciais de A. rosaeodora, L.
alba e O. basilicum e avaliar a substituio do leo essencial da
madeira de A. rosaeodora pelos leos essenciais das folhas de A.
rosaeodora, de L. alba e/ou de O. basilicum.
5. Isolar e identificar fitoquimicamente as principais molculas dos
leos essenciais e/ou extratos de A. canelilla e A. suaveolens.
6. Transformar a -decalactona comercial na lactona majoritria de A.
suaveolens: massoia lactona, por uma rota deferente da literatura.
OBJETIVOS
28
7. Concentrar a massoia lactona no resduo da extrao do leo
essencial por arraste a vapor.
8. Realizar (em colaborao) ensaios biolgicos preliminares
antifngico e antibacteriano - pela tcnica de difuso com discos com
amostras de Aniba canelilla e Aeollanthus suaveolens.
9. Estudo sazonal de L. alba por CG-EM para definir as variaes de
rendimento do leo essencial e concentrao de linalol.
EXPERIMENTAL
29
4. EXPERIMENTAL
Para anlises de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de
Massas (CG-EM) foi utilizado um cromatgrafo a gs HP 5890 com
detector seletivo de massas HP 5870 B, com exceo da quantificao de
1-nitro-2-feniletano no leo essencial da madeira e das folhas de A.
canelilla e em suas fraes, realizada no cromatgrafo a gs com detector
de ionizao de chama modelo HP 5890, integrador 3396. A coluna usada
foi HP-5 (5 % fenil 95 % metilpolisiloxano) com comprimento de 30 m,
dimetro interno de 0,25 mm e filme com espessura de 0,25 m. As
condies foram:
Temperatura inicial: 60 C
Temperatura final: 240 C
Rampa: 3 C/ min.
Injetor: 240 C
Detector: 260 C
Gs de arraste: Hlio, fluxo: 1,0 mL/min
Nas anlises usando HS-SPME (do ingls Head Space - Solid Phase
Micro Extraction), o equipamento utilizado foi o primeiro citado. Foi usado
o modo de injeo splitless com fibra PDMS-100 (polidimetilsiloxano).
As anlises de Ressonncia Magntica Nuclear foram feitas no
espectrmetro Varian INOVA500 operando a 499,88 MHz para 1H e 75,45
MHz para 13C e no espectrmetro Gemini operando a 75 MHz para a
anlise de 13C da amostra de 1-nitro-2-feniletano. As amostras foram
solubilizadas em CDCl3.
EXPERIMENTAL
30
As extraes por arraste a vapor foram realizadas num extrator
Marconi 20 L ao inox 306.
As placas para cromatografia em camada delgada preparativa
(CCDP) foram preparadas no prprio laboratrio com espessura de 1 mm de
slica de placa da marca Merck sobre lmina de vidro.
A slica gel usada nas colunas cromatogrficas da marca Merck e
possuem tamanho de partcula 0,063 0,200 mm e 70 230 mesh ASTM.
As placas para cromatografia em camada delgada (CCD) utilizadas
foram da marca Merck, com refletncia para luz ultravioleta 254 nm com
diferentes combinaes dos solventes: acetato de etila, clorofrmio,
diclorometano, hexano, metanol e tolueno. A visualizao dos compostos
foi verificada pela irradiao da luz ultravioleta no comprimento onda 254
nm, seguida da pulverizao com vanilina e cido sulfrico 5 % em etanol
(revelador de terpenides, fenis, etc.)72 seguida de aquecimento em placa
eltrica.
A avaliao dos cromatogramas foi feita atravs da comparao dos
espectros de massas apresentados pela biblioteca Wiley do equipamento e
dos ndices de reteno calculados com os dados da literatura73. Para a
determinao do ndice de reteno de cada substncia foi usada uma srie
homloga de hidrocarbonetos (C9- C20).
4.1. Material botnico
O leo essencial bruto da madeira da A. canelilla e o leo essencial
da madeira de A. rosaeodora foram doados pelo produtor Sr. Raul Alencar
de Manaus, Amazonas.
EXPERIMENTAL
31
O leo essencial das folhas de A. rosaeodora foi obtido num
experimento piloto realizado na regio de Presidente Figueiredo,
Amazonas, pela Sra. Maria Emlia Andrade, tambm produtora de leo
essencial.
As amostras de A. suaveolens e as folhas A. canelilla foram obtidas
no mercado municipal Ver-o-Pso em Belm, Par.
As folhas de L. alba foram colhidas no campo do Centro
Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas (CPQBA) e
no jardim da residncia do Professor Lauro E. S. Barata em Campinas, So
Paulo.
O leo essencial de Ocimun basilicum foi doado pelo Dr. Nilson
Maia do Instituto Agronmico de Campinas (IAC), So Paulo e representa
uma amostra da empresa Linax.
4.2. Extrao do leo essencial de Aeollanthus suaveolens
O leo essencial de A. suaveolens obtido por arraste a vapor de
1386,5 g de partes areas frescas, durante 2 h e 30 min, apresentou a massa
de 0,306 g, que corresponde a 0,022 % de rendimento e foi analisado por
CG-EM.
4.3. Extrao do resduo de A. suaveolens
16,3 g do resduo seco da extrao de A. suaveolens por arraste a
vapor foi submetido extrao temperatura ambiente com diclorometano
por 24 h, resultando em 0,74 g de extrato (4,5 % da massa inicial).
EXPERIMENTAL
32
4.4. Extrao das partes areas de A. suaveolens com solvente
Para extrao das partes areas de A. suaveolens utilizou-se um
equipamento de Soxhlet, que utiliza refluxo de solvente o que torna a
tcnica econmica e ambientalmente correta.
33,6 g de partes areas secas ao ar foram extradas com
diclorometano por 24 h, num equipamento de Soxhlet. Aps esse perodo o
solvente foi evaporado em evaporador rotatrio e o extrato foi obtido com
7,6 % de rendimento (2,55 g).
Esse procedimento foi repetido para outra amostra (78,3 g) mudando
o solvente para hexano, apresentando agora o rendimento de 2,8 % (2,17 g).
4.5. Isolamento da massoia lactona do extrato hexnico de A.
suaveolens
Para o isolamento da massoia lactona, o extrato hexnico seco (sem
solvente 4.4) passou por trs processos:
4.5.1. Eliminao de clorofila
1 g do extrato hexnico seco de cor verde, obtido no item 4.4 foi
adicionado 30 mL de metanol. Depois de agitada, essa mistura, filtrada em
papel de filtro. O resduo da filtrao foi abandonado e ao filtrado foi
adicionado gua destilada at turvar (a relao metanol:gua ficou prxima
de 7:3), posteriormente foi realizada uma filtrao em celite de
granulometria 0,01 0,04 mm da marca Merck. Novamente o resduo foi
EXPERIMENTAL
33
descartado e o filtrado extrado com diclorometano (3 x 30 mL). O solvente
foi evaporado em rota-evaporador, o extrato hexnico sem clorofila, de
colorao amarelada, foi pesado, apresentando a massa de 0,23 g que
corresponde a 23 % da massa inicial e analisado em CG-EM.
4.5.2. Coluna cromatogrfica
O extrato obtido no item 4.5.1 foi submetido coluna de filtrao,
utilizando 10 g slica gel, 0,20 g de amostra e os eluentes hexano e acetato
de etila. Foram retiradas alquotas de 20 mL e seis novas fraes foram
agrupadas de acordo com as semelhanas de RF observadas por CCD
(Tabela 1).
Tab. 1. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna cromatogrfica para
isolamento da massoia lactona
Eluentes (proporo) Volume
(mL)
Fraes
ReunidasMassa (mg) Massa %
Hexano 80 1 7,8 3,9
20 2 5,8 2,9
20 3 130,2 65,1 Hexano: AcOEt (7:3)
40 4 29,8 14,9
40 5 16,5 8,3 Hexano: AcOEt(4:6)
40
AcOE 90 6 8,8 4,4
As seis fraes foram analisadas por CG-EM.
EXPERIMENTAL
34
4.5.3. Cromatografia em camada delgada preparativa
A frao 3 (Tab. 1) que continha a massoia lactona foi submetida a
cromatografia em camada delgada preparativa com 5 % de nitrato de prata,
mantida no escuro, com eluente hexano:acetato de etila 8:2. A frao
apresentou quatro faixas, que foram coletadas da placa e extradas com
clorofrmio: metanol 95:5. Essa mistura foi filtrada, o solvente evaporado
em rota-evaporador A anlise de CG-EM indicou que na segunda frao, a
massoia lactona foi isolada. A anlise por RMN de 1H e 13C (Figuras 8 e 9)
confirmou que se trata da massoia lactona.
ppm1234567
Fernanda lactona-1 cdcl3/tri-res mar31falHPulse Sequence: s2pul
Fig. 9. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona isolada de A. suaveolens
RMN de 1H (500 MHz): G 0,92 (3H, t, 3J= 6,6Hz, H-10); 1,24 1,83
(8H, m, H-6, 7, 8, 9); 2,27 2,37 (2H, m, H-4); 4,39 4,45 (1H, m, H-5);
6,01 (1H, dt, 3J=9,9Hz, 4J=1,5Hz, H-2); 6,86 6,90 (1H, m, H-3).
OO1
2
34
56
7
8
9
10
EXPERIMENTAL
35
ppm20406080100120140160
Fernanda lactona-1 cdcl3/tri-res mar31falCPulse Sequence: s2pul
Fig. 10. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona isolada de A.
suaveolens
RMN de 13C (125 MHz): G 13,9 (CH3, C-10); 22,4 (CH2, C-9); 24,4
(CH2, C-7); 29,3 (CH2, C-8); 31,5 (CH2, C-6); 34,8 (CH2, C-4); 80,0 (CH,
C-5); 121,3 (CH, C-2); 145,0 (CH, C-3); 164,5 (C0, C-3).
4.6. Constituintes volteis de Aeollanthus suaveolens extrados
por Microextrao em Fase Slida (SPME)
As anlises dos constituintes volteis extrados por Microextrao em
Fase Slida foram feitas no modo headspace (HS-SPME) para quatro
amostras de A. suaveolens: partes areas frescas, secas, leo essencial e
resduo da extrao do leo essencial. 200 mg de cada amostra e 15 mL de
soluo aquosa saturada de cloreto de sdio foram acondicionadas em
frascos de 25 mL lacrados com septo de teflon/silicone e magneticamente
EXPERIMENTAL
36
agitados a 1.200 rpm por 15 minutos a 55 C para o pr-equilbrio
amostra/headspace. Aps esse perodo, a fibra foi exposta por 20 minutos,
os analitos extrados foram imediatamente dessorvidos e analisados por CG-
EM. Estas foram realizadas em colaborao com o laboratrio do Prof. Dr.
Fbio Augusto do Instituto de Qumica UNICAMP.
4.7. Obteno da massoia lactona
A massoia lactona, alm de ter sido isolada do extrato hexnico da
planta (descrito em 4.5) tambm foi obtida por uma reao de eliminao
, a carbonila da G-decalactona comercial. uma soluo de
diisopropilamina (0,36 mL, 2,36 mmol) em THF anidro (10,0 mL) foi
adicionado a - 78 C e sob uma atmosfera de argnio, 1,20 mL (2,36 mmol)
de uma soluo de n-butil-ltio (2,35 M em n-hexano). esta soluo de
LDA formada (2,36 mmol), foi adicionada uma soluo da G-decalactona
(0,200 g, 1,18 mmol) em THF anidro (1,2 mL). A mistura foi mantida sob
agitao por 0,5h a -78 C, quando ento adicionou-se uma soluo de
PhSeCl (0,452 g, 2,36 mmol) em THF (1,2 mL). A reao foi mantida sob
agitao a -78 C por 4 h (a cada 1 h a reao foi monitorada por CG-EM).
Aps este perodo, adicionou-se 10 mL de uma soluo aquosa saturada de
NH4Cl. A fase aquosa foi extrada com acetato de etila (3 x 10 mL) e as
fases orgnicas combinadas foram secas com MgSO4 anidro, filtradas e
concentradas em evaporador rotatrio. O resduo obtido foi dissolvido em
diclorometano (30 mL) e esta soluo adicionou-se, 0 C, piridina (2
mL) e H2O2 (soluo 30 % aquosa, 8mL). Esta mistura bifsica foi agitada
por 1,5 h a 0 C quando ento adicionou-se uma soluo aquosa de Na2CO3
EXPERIMENTAL
37
(10 %, 20 mL). As fases orgnicas combinadas foram lavadas com gua (10
mL) e soluo aquosa saturada de NaCl (10 mL), seca com MgSO4 anidro,
filtradas, concentradas em evaporador rotatrio e avaliadas por CG-EM.
O leo resultante foi purificado por coluna cromatogrfica com slica
gel, usando o eluente hexano:acetato de etila 8:2. Foram retiradas trs
alquotas de 50 mL que foram analisadas por CG-EM, sendo que apenas a
primeira frao continha a massoia lactona e para seu isolamento, essa
frao foi submetida a CCDP em placa preparada como descrito no item
4.5.3. As subfraes foram analisadas por CG-EM. Anlises de RMN 1H e 13C foram realizadas com a subfrao que apresentava a massoia lactona
isolada e com a G-decalactona, material de partida, (Figuras 11 e 12; 13 e
14, respectivamente), para confirmao do isolamento da massoia lactona e
da reao.
ppm1234567
Fernanda F3.2P44-2 cdcl3 ago24falHPulse Sequence: s2pul
0.040.04
0.050.12
0.550.19
Fig. 11. Espectro de RMN de 1H da massoia lactona sintetizada
OO1
2
34
56
7
8
9
10
EXPERIMENTAL
38
RMN de 1H (500 MHz): G 0,92 (3H, t, 3J= 6,6Hz, H-10); 1,22 1,96
(9H, m, H-6, 7, 8, 9); 2,25 2,39 (2H, m, H-4); 4,37 4,44 (1H, m H-5);
6,01 (1H, d, 3J= 9,9Hz, H-2), 6,85 6,89 (1H, m, H-3).
ppm20406080100120140160
Fernanda "F3.2P44-2" cdcl3/bb5old ago29falCPulse Sequence: s2pul
Fig. 12. Espectro de RMN de 13C da massoia lactona sintetizada
RMN de 13C (500 MHz): G 13,9 (CH3, C-10), 22,4 (CH2, C-9), 24,4
(CH2, C-7), 29,3 (CH2, C-8), 31,5 (CH2, C-6), 34,8 (CH2, C-4), 77,9 (CH,
C-5), 121,4 (CH, C-2), 145,0 (CH, C-3), 164,5 (C0, C-1).
EXPERIMENTAL
39
ppm1234567
Fernanda d-decalactona cdcl3/tri-res abr26falHPulse Sequence: s2pul
0.040.12
0.380.30
0.16
Fig. 13. Espectro de RMN de 1H da -decalactona
RMN de 1H (500 MHz): G 0,87 (3H, t, 3J= 7,0Hz, H-10); 1,24 1,84
(8H, m H-6, 7, 8, 9); 1,86 -1,92 (2H, m, H-4); 2,38 2,45 (2H, m, H-3);
2,53 -2,59 (2H, m, H-2); 4,23 4,29 (1H, m, H-5).
ppm20406080100120140160180
Fernanda d-decalactona cdcl3/tri-res abr26falCPulse Sequence: s2pul
Fig. 14. Espectro de RMN de 13C da -decalactona
OO1
2
34
56
7
8
9
10
EXPERIMENTAL
40
RMN de 13C (500 MHz): G 13,9 (CH2, C-10); 18,4 (CH2, C-3); 22,4
(CH2, C-9); 24,5 (CH2, C-7); 27,7 (CH2, C-4); 29,4 (CH2, C-8); 31,5 (CH2,
C-6); 35,7 (CH2, C-2); 80,6 (CH, C-5); 172,0 (C0, C-1).
4.8. Fracionamento do leo essencial da madeira de A.
canelilla por extrao cido-base, cromatografia em coluna e
cromatografia em camada delgada preparativa
As condies utilizadas para o fracionamento do leo por extrao
cido-base esto na Figura 15.
EXPERIMENTAL
41
Fig. 15. Fluxograma de extrao cido-base do leo essencial bruto da
madeira de A. canelilla.
A secagem de cada frao foi feita com MgSO4 anidro, a filtrao
com papel de filtro e a evaporao do solvente em rota-evaporador. As trs
fraes (cidos, bases e neutros) foram submetidas CG-EM.
xtrao com HCl 1 % (3x30 mL)
cidosm = 46 mg
Adio de NaOH 1N at pH >7 Extrao com CH2Cl2(3x30 mL)
Secagem FiltraoEvaporao do solvente
Secagem FiltraoEvaporao do solvente
Fase Aquosa
Adio de HClconc. at pH < 7 Extrao com CH2Cl2 (3x30 mL)
Massa do leo = 1,1210 g
Fase Orgnica
Fase Orgnica
Fase Orgnica
Fase Aquosa
Adio de 50mL de CH2Cl2Extrao com KOH 1 % (3x 30mL)
Fase Aquosa Fase Aquosa Fase Orgnica
Abandonada
Abandonada
Secagem FiltraoEvaporao do solvente
Basesm = 3,9mg
Neutrosm = 986,7 mg
EXPERIMENTAL
42
Para purificao de 1-nitro-2-feniletano, uma coluna cromatogrfica
foi feita com 30 g slica gel e 0,98 g dos compostos neutros (relao slica:
amostra = aproximadamente 30:1). Foram usados os eluentes: hexano,
acetato de etila e metanol em gradiente de polaridade. Retiraram-se
alquotas de 10 mL e com o auxlio de CCD, de acordo com a semelhana
de RF, foram agrupadas em seis fraes (Tabela 2)
Tab. 2. Eluentes, volumes usados e fraes da coluna cromatogrfica para
isolamento de 1-nitro-2-feniletano e metileugenol.
As seis fraes foram analisadas por CCD e por CG-EM, onde 70 %
dos componentes foram coletados nas fraes 3 e 4, que concentraram as
substncias 1-nitro-2-feniletano e metileugenol, por isso foram submetidas a
cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). O eluente usado foi
tolueno: acetato de etila 9:1. A visualizao foi feita atravs da irradiao da
Eluentes (proporo) Volume
(mL)
Fraes
reunidas
Massa
(mg)massa %
Hexano: AcOEt (99:1) 30
Hexano: AcOEt (98:2) 301 0,8 0,1
Hexano: AcOEt (95:5) 30 2 1,1 0,1
Hexano: AcOEt (85:15) 30
Hexano: AcOEt (7:3) 30 0 0
Hexano: AcOEt (3:7) 30 3 463,0 47
AcOEt 60 4 236,6 24
AcOEt: metanol (97:3) 30 5 4,8 0,5
AcOEt: metanol (95:5) 60 6 5,3 0,5
EXPERIMENTAL
43
luz ultravioleta no comprimento de onda 254 nm. As regies de slica
contendo as subfraes foram retiradas das placas e as amostras
solubilizadas com clorofrmio: metanol 95:5. Cada mistura foi filtrada, o
solvente evaporado em rota-evaporador.
Aps esta separao, as subfraes foram analisadas por CG-EM. Os
cromatogramas indicaram duas substncias isoladas: 1-nitro-2-feniletano
nas subfraes 1 das placas 1 e 2, metileugenol nas subfraes 2 das duas
placas. O isolamento das mesmas foi confirmado por RMN de 1H e 13C
(Figuras 16, 17, 18,19).
Para o isolamento do 1-nitro-2-feniletano das folhas de A. canelilla,
seu leo essencial foi submetido CCDP nas mesmas condies usadas
para o isolamento do 1-nitro-2-feniletano do o.e. da madeira, descritas a
cima. As fraes da CCDP foram avaliadas por CCD e para facilitar a
identificao do composto de interesses utilizou-se o padro isolado do o.e.
da madeira, que indicou que o 1-nitro-2-feniletano foi realmente isolado. A
frao correspondente ao composto isolado foi analisada por CG-EM, RMN
de 1H e 13C e IV (Anexo A).
EXPERIMENTAL
44
ppm12345678
Fernanda F2,1P4 cdcl3 out16lsbH2Pulse Sequence: s2pul
0.550.22
0.23
Fig. 16. Espectro de RMN de 1H do 1-nitro-2-feniletano
RMN de 1H (500 MHz): G 3,35 (2H, t, 3J=6,9 Hz, H-2); 4,63 (2H, t, 3J=6,9 Hz, H-1); 7,23 (2H, dd, 3J=7,4 Hz, 3J=2,7 Hz, H-5 e H-5); 7,30 (1H,
tt, 3J=7,4Hz, 3J =2,6 Hz, H-6); 7,35 (2H, t, J=7,4 Hz, H-4 e H-4).
Fig. 17. Espectro de 13C do 1-nitro-2-feniletano
ppm2030405060708090100110120130140
Fernanda f1,1p4 cdcl3 jan05falCPulse Sequence: s2pul
NO21
23
4
4'
5
5'
6
EXPERIMENTAL
45
RMN de 13C (75 MHz): G 32,5 (CH2, C-2); 75,2 (CH2, C-1); 126,3
(CH, C-6); 127,4 (CH, C-4, C-8); 127,8 (CH, C-5, C-7); 134,5 (C0, C-3).
ppm1234567
Fernanda F1,2P4 cdcl3 out16lsbH1Pulse Sequence: s2pul
0.210.07
0.140.43
0.15
Fig. 18. Espectro de RMN de 1H do metileugenol
RMN de 1H (500 MHz): G 3,34 (2H, d, 3J=6,1Hz, H-3); 3,85 (3H, s,
H-11); 3,87 (3H, s, H-10); 5,02 5,11 (2H, m, H-1); 5,95 6,02 (1H, m, H-
2); 6,68 6,71 (1H, m, H-9); 6,72 (1H, s, H-5); 6,80 (1H, d, 3J=6, 80Hz, H-
8).
1
2
349
8
7 65
10
11OCH3
CH3O
EXPERIMENTAL
46
ppm2030405060708090100110120130140150
Fernanda f1,2P4 cdcl3/bbsw out17lsbCPulse Sequence: s2pul
Fig. 19. Espectro de RMN de 13C do metileugenol
RMN de 13C (125 MHz): G 40,1 (CH2, C-3); 56,1 (CH3, C-10, C-11);
111,2 (CH, C-8); 111,8 (CH, C-9); 115,6 (CH2, C-1); 120,3 (CH, C-2);
132,6 (C0, C-4); 137,7 (CH, C-5); 147,3 (C0, C-7); 148,8 (C0, C-6).
4.9. Destilao do leo essencial bruto da madeira de A.
canelilla
A destilao de 31,0 g do leo essencial bruto foi realizada sob vcuo
de 3,3 mmHg com coluna de fracionamento de 13,5 cm. Foi usado um
banho de silicone e o intervalo da temperatura de destilao foi 110-112 C.
O leo foi fracionado em duas amostras e a frao no destilada foi
denominada resduo. A primeira chamada cabea de destilao com
massa de 0,43 g corresponde a 1,4 % da massa inicial do leo e a segunda,
EXPERIMENTAL
47
leo destilado com 29,3 g referentes a 94,6 %. O leo bruto e as duas
amostras foram analisados por CCD e por CG-EM.
4.10. Redestilao do leo essencial da madeira de A. canelilla
Para redestilao do leo destilado, descrito no item 4.9., utilizou-se
26,0 g do leo destilado, vcuo de 3 mmHg e coluna de fracionamento de
13,5 cm. O mesmo foi fracionado em duas alquotas e resduo. A primeira,
cabea de destilao, foi retirada na faixa de temperatura de 68 70 C,
massa = 1,27 g (4,9 %) e a segunda, leo redestilado foi retirada na faixa de
temperatura de 72 74 C, massa = 23,6 g (90,7 %). O leo redestilado foi
analisado por CCD e por CG-EM.
4.11. Hidrodestilao do leo essencial bruto da madeira de A.
canelilla
Foi realizado a hidrodestilao de 33 g de leo essencial bruto da
madeira por 19 h e 30 min. A primeira alquota foi retirada aps 6 h e as
demais, a cada 1 h e 30 min, totalizando 10 fraes hidrodestilada e um
resduo (frao no hidrodestilada). O leo foi extrado de cada poro com
diclorometano (3 x 30 mL), seco com MgSO4 anidro e o solvente evaporado
em rota-evaporador. As fraes foram pesadas (Tabela 3) e analisadas por
CCD, utilizando como eluente hexano: acetato de etila 8:2, e por CG-EM.
EXPERIMENTAL
48
Tab. 3. Fraes da hidrodestilao do o.e. de A. canelilla
N da frao Massa (g)
1 14,7928
2 4,6161
3 2,7768
4 3,8547
5 3,3783
6 1,7647
7 0,7153
8 0,1935
9 0,1722
10 0,042
Resduo 0,4121
4.12. Extrao e anlise do leo essencial das folhas de A.
canelilla
A extrao de 900 g de folhas de A. canelilla foi realizada por arraste
a vapor durante 2 h e 30 min, obtendo 1,35 g de leo (1,7 % de
rendimento). O leo essencial foi submetido CG-EM.
4.13. Quantificao de 1-nitro-2-feniletano no leo essencial da
madeira e folhas de A. canelilla e fraes
A quantificao de 1-nitro-2-feniletano foi feita em cinco amostras:
A- leo essencial bruto da madeira
EXPERIMENTAL
49
B- frao obtida por destilao fracionada do o. e. bruto da madeira
C- amostra obtido atravs redestilao: destilao fracionada de leo
destilado(B) - madeira
D- frao obtido por hidrodestilao do o. e. bruto da madeira
E- leo essencial obtido por arraste vapor folhas
4.14. Extrao das folhas de A. canelilla com diclorometano
56,1 g de folhas de A. canelilla foram submetidas extrao com
diclorometano num equipamento de Soxhlet por 18 h. Aps esse perodo, o
extrato foi obtido com 1,4 % de rendimento (0,77 g).
4.15. Ensaios biolgicos
Os ensaios foram realizados pela Prof Dr Anglica Zaninelli
Schreiber da Faculdade de Cincias Mdicas UNICAMP.
Foi utilizada a tcnica de difuso com discos utilizando como base a
norma do NCCLS (Performance Standards for Antimicrobial Disk
Susceptibility Tests; Approved StandardEighth Edition. NCCLS document
M2-A8 [ISBN 1-56238-485-6]) que permite a determinao do halo de
inibio de crescimento para as substncias em estudo.
4.15.1. Amostras e microorganismos avaliados
As amostras foram dissolvidas em DMSO e esto descrita abaixo :
O.e. hidrodestilado de A. canelilla madeira
Extrato CH2Cl2 de A. canelilla folhas
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50
Extrato CH2Cl2 de A. suaveolens partes areas
Extrato CH2Cl2 do resduo da extrao com arraste a vapor de A.
suaveolens
Os microorganismos avaliados foram:
Candida albicans
Candida krusei
Candida parapsilosis
Staphylococcus aureus (S)
Staphylococcus aureus (R)
Staphylococcus hominis
4.15.2. Preparao do inculo
Pelo menos de trs a cinco colnias, bem isoladas, do mesmo tipo
morfolgico foram selecionadas da placa de gar. A superfcie de cada
colnia foi tocada com uma ala, e os microorganismos foram transferidos
para um tubo contendo 4-5 mL de salina 0,8 %. Ajustou-se a turbidez da
cultura em crescimento com soluo salina estril ou caldo, de modo a obter
uma turbidez ptica comparvel da soluo padro de McFarland a 0,5.
Isso resulta numa suspenso contendo aproximadamente de 1 a 2 x 108
UFC/mL.
4.15.3. Preparao dos discos
Foram utilizados discos de papel de filtro estreis (CEFAR),
comercialmente disponveis com peso de 30 r 4 mg/cm2, com capacidade
EXPERIMENTAL
51
para absorver de 2 a 3 vezes o seu peso em gua e dimetro de 6,35mm. A
cada disco foram adicionados 20 Pl de extrato. Acondicionados em placas
de Petri estreis foram incubados em estufa at completa secagem, depois
mantidos entre 2-8 C at o momento do teste.
4.15.4. Meio de cultura
O gar Meller-Hinton foi preparado a partir de uma base desidratada
(Oxoid) conforme as instrues do fabricante. O meio recm preparado e
resfriado foi depositado em placas de Petri estreis descartveis de fundo
chato, numa superfcie horizontal, para garantir uma profundidade uniforme
de aproximadamente 4 mm. O que corresponde a 25-30 mL de meio para
placas com dimetro de 100 mm. O meio gar foi esfriar a temperatura
ambiente e armazenadas em geladeira (de 2 a 8 C), por at 7 dias.
4.15.5. Inoculao das placas de teste
Em condies ideais, mergulhou-se um swab de algodo estril na
suspenso ajustada, at 15 minutos aps ajuste da turbidez da suspenso de
inculo. O swab foi girado vrias vezes e apertado firmemente contra a
parede interna do tubo, cima do nvel do lquido para retirada de qualquer
excesso de inculo no swab. A superfcie seca da placa de gar Meller-
Hinton foi inoculada passando-se o swab em toda a superfcie estril do
gar. Repetiu-se o procedimento esfregan
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