UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS E SEMENTES
ENCONTRADOS NA FLORA CATARINENSE
PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI
Itajaí, 2013
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI
PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS E SEMENTES
ENCONTRADOS NA FLORA CATARINENSE
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr Rivaldo Niero Co-orientador: Profa Dra Vânia Floriani Noldin
Itajaí, julho de 2013
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PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS
ENCONTRADOS NA FLORA CATARINENSE
Pâmella Cristine Duarte Bagattoli ‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Rivaldo Niero, Prof°Dr.
Orientador
__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Profa Dra.
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Prof° Dr Rivaldo Niero (UNIVALI)
Presidente
______________________________________ Profa Dra Vânia Floriani Noldin (UNIVALI)
Co-orientador
______________________________________ Profa Dra Fátima de Campo Buzzi (UNIVALI)
Membro
______________________________________ Profa Dra Angela Malheiros (UNIVALI)
Membro
____________________________________ Profa Dra Claudriana Locatelli (UNOESC)
Membro externo
Itajaí (SC), 12, julho de 2013
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Dedicatória
Dedico este trabalho, a minha família pelo amor e compreensão.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelos dons que me deste e pelos relacionamentos que possibilitam que eu cresça a cada dia. Aos meus pais e meu irmão, cujo amor e dedicação sempre me incentivaram a continuar, sem eles nada disso seria possível. Ao meu marido, Elton Bagattoli, meu agradecimento especial e todo meu carinho, admiração e amor. Aos meus mestres, Dr. Rivaldo Niero e Dra. Vânia Floriani Noldin, pela amizade e colaboração para a elaboração desse trabalho. A minha grande amiga Ana Flávia Fischer, pela amizade e aprendizado. “Pois cada pessoa que passa em nossa vida é única e sempre deixa um pouco de sim e leva um pouco de nós.” Aos meus amigos e técnicos de laboratórios, em especial Luisa, Juliana, Gislaine, Mateus, Daniela e demais colegas, pelo convívio e aprendizado. Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho e Dr. Theodoro Marcel Wagner pela ajuda para a realização desse trabalho.
Muito Obrigada!!!
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PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS
ENCONTRADOS NA FLORA CATARINENSE
PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI
julho/2013 Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero. Co-Orientador: Profa. Dra Vânia Floriani Noldin. Titulação: Área de concentração em produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de Páginas: 119 Substâncias químicas derivadas de produtos naturais, oriundas de animais, micro-organismos, minerais e/ou plantas, são utilizadas para o tratamento de doenças desde os primórdios da civilização humana. Atualmente cresce o interesse da comunidade científica em validar as plantas utilizadas na medicina popular, a fim de desenvolver novos fitoterápicos e fitofármacos, que possam beneficiar a população com novas opções terapêuticas, fortalecendo assim as indústrias brasileiras. Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil fitoquímico e a ação antioxidante e citotóxica in vitro dos extratos metanólicos obtidos dos frutos e sementes de: Solanum sessiliflorun, Diospyros inconstans, Solanum quitoense, Plinia glomerata, Rubus imperialis, Rubus rosaefolius e Garcinia achachairu oriundas da flora catarinense. Foram preparados os extratos metanólicos, os quais foram caracterizados fitoquimicamente por cromatografia em camada delgada usando reativos específicos. As substâncias fenólicas foram quantificadas pelo método de Folin-Ciocalteau. O potencial antioxidante dos extratos metanólicos, frações e subfrações foram avaliados espectrofotometricamente pelo método de sequestro dos radicais DPPH•, ABTS•, ORAC e quelante de metais. Também foi avaliada a atividade citotóxica dos extratos dos frutos e sementes em cultura celular utilizando a linhagem celular de melanoma murino (B16F10). Os resultados fitoquímicos mostraram que todos os frutos estudados possuem grande quantidade de carboidratos, principalmente frutose, glicose e sacarose além de compostos fenólicos ainda não identificados. No extrato metanólico das sementes de G. achachairu foi detectada a presença da substância gutiferona A, além de ésteres derivados de ácidos graxos e os fitoesterois, β-sitosterol e γ-sitosterol. Em todos os testes de avalição da atividade antioxidante (DPPH, ABTS, ORAC e quelante de metais) o extrato metanólico das sementes de G. achachairu apresentou os melhores resultados. No teste de citotoxicidade, tanto as sementes de Garcinia quanto suas frações e a gutiferona A, inibiram o crescimento das células tumorais B16F10 (melanona murino). Os resultados sugerem que dentre as sete espécies estudadas, as sementes de Garcinia achachairu foram as mais ativas e por isso, sugere-se a continuidade do estudo fitoquímico, objetivando a identificação dos compotos bioativos e o mecanismo de ação destes, a fim comprovar a atividade biológica do extrato das sementes de Garcinia achachairu para uso medicinal Palavras-chave: Perfil fitoquímico. Atividade antioxidante. Citotoxicidade
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PHYTOCHEMICAL PROFILE AND EVALUATION OF ANTIOXIDANT AND CYTOTOXICITY ACTIVITY OF FRUITS FROM THE FLORA OF
THE STATE OF SANTA CATARINA (SC), BRAZIL
PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI July, 2013
Supervisor: Professor PhD Rivaldo Niero. Co-Supervisor: Professor PhD Vânia Floriani Noldin. Area of Concentration: Natural products and synthetic and bioactive substances. Number of pages: 119 Chemical substances derived from natural products of animal, microorganism, mineral and/or plant originhave been used to treat diseases since the dawn of human civilization. Currently, the interest of the scientific community in legitimizing the plants used in popular medicine is increasing, with the aim of developing new phytotherapic and phytopharmaceutical drugs that can benefit the populationwith new therapeutic options, and strengthen Brazilian industries. This study assesses the phytochemical profile and in vitro antioxidant and cytotoxic activity of methanolic extracts obtained from fruits and seeds of Solanum sessiliflorun, Diospyros inconstans, Solanum quitoense, Plinia glomerata, Rubus imperialis, Rubus rosaefolius and Garcinia achachairu, which are native flora of the state of Santa Catarina, Brazil. The methanolic extracts were prepared and phytochemically characterized by thin layer chromatography using specific reaction agents.The phenolic substances were quantified according to the Folin-Ciocalteau method. The antioxidant potential of the methanolic extracts, fractions and subfractions was spectrophotometrically evaluated by the DPPH•, ABTS•, ORACradical scavenging method and metal chelates. The cytotoxic activity of the fruit and seed extracts was also evaluated in murine melanoma (B16F10) cell culture. The phytochemical results revealed that all the fruits studied contain large amounts of carbohydrates, particularly fructose, glucose and sucrose, as well as phenolic compounds not yet identified. In the methanolic extract of the seeds of G. achachairu,the presence of the substance guttiferone A was detected, as well as fatty acid derivatives, and the phytosterolsβ-sitosterol andγ-sitosterol. In all the tests to evaluate antioxidant activity (DPPH, ABTS, ORAC and metal chelates) the methanolic extract of the seeds of G. achachairu presented the best results. In the cytotoxicity test, both the seeds of Garciniaand its fractions and guttiferone Ainhibited the growth of the B16F10 tumor cells (murine melanoma). The results suggest that of the seven species studied, the seeds ofGarciniaachachairuwere the most active, therefore further phytochemical studies are suggested, seeking to identify the bioactive compounds and their mechanism of action, in order to demonstrate the biological activity of the seed extract of Garcinia achachairu for medicinal use. Keywords: Phytochemical profile. Antioxidant activity. Cytotoxicity.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Frutos maduros e partes aéreas de P. glomerata......................................34 Figura 2 – Frutos maduros e partes aéreas de G. achachairu..................................36 Figura 3 - Frutos maduros e partes aéreas da R. imperialis.....................................38 Figura 4 - Frutos maduros e partes aéreas da R. rosaefolius...................................40 Figura 5 – Frutos maduros e partes aéreas da S. sessiliflorum................................41 Figura 6 – Frutos maduros e partes aéreas de S. quitoense Lam............................42 Figura 7 – Frutos maduros e partes aéreas de Diospyros inconstans......................43 Figura 8: Reação do Fenton ou Haber-Weiss...........................................................45 Figura 9: Fluxograma das operações realizadas para purificação da fração de acetato de etila de Garcinia achachairu.....................................................................60 Figura 10 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes partes dos frutos de garcinia (G. achachairu) comparados com diferentes padrões comumente encontrados em plantas e isolados em outras partes de G. achachairu..................................................................................................................69 Figura 11 – Estrutura química da Gutiferona A isolada do extrato metanólico das sementes de G. achachairu........................................................................................70 Figura 12 – Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes frutos com dois sistemas distintos de eluentes. A: Sistema apolar. B: Sistema polar..............................................................................................................70 Figura 13 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos das cascas e da polpa + sementes da cabeludinha (P. glomerata) (A) e dos extratos metanólicos dos frutos de amora vermelha (R. rosafolius) e amora-branca (R. imperialis) (B) com diferentes padrões de açúcares.................................................................................71 Figura 14 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da polpa e casca do fruto maná cubiú (S. sessiliflorum) (A) e do extrato da polpa e casca da naranjila (S. quitoense) (B) com diferentes padrões de açúcares.............................72 Figura 15 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da semente da jacu, polpa da jacu e casca da jacu (D. inconstans) (A) e dos extratos metanólicos das diferentes partes da garcinia (G. achachairu) (B) com diferentes padrões de açúcares..................................................................................................73 Figura 16 - Perfil cromatográfico da sobreposição da análise dos diferentes extratos
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clorofórmicos das sementes (a) e das cascas dos frutos (d) de G. achachairu; polpa + semente (b) e casca dos frutos (c) de P. glomerata...............................................75 Figura 17 - Perfil cromatográfico do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (2 µg/ml) comparados com a biblioteca de referência.........................76 Figura 18 – Estruturas químicas dos compostos presentes extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu.......................................................................................77 Figura 19 - Identificação dos esteróis do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (temperatura inicial da coluna 180°C)......................................................78 Figura 20 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico (0,31 mg/ml) das cascas dos frutos (B) e polpa + semente de P. glomerata (C) comparados com padrão interno quercitrina (A)................... .........................................................................................81 Figura 21 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das sementes de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml)....................................82
Figura 22 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das cascas dos frutos de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml)....................................82
Figura 23 - Curva para polifenóis totais de ácido gálico (µg/ml)...............................83 Figura 24 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes da garcinia – G. achachairu), RI (frutos da amora-branca – R. imperialis), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata) e dos controles positivos trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre DPPH•......................87 Figura 25 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: CG (cascas dos frutos da garcinia – G. achachairu), CN (cascas dos frutos da naranjila - S. quitoense), RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), SJ (sementes da jacu – D. inconstans), CM (cascas da maná cubiú- S. sessiliflorun) pelo método do sequestro do radical livre DPPH•......................................................88 Figura 26 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes da garcinia (G. achachairu) e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre DPPH•..............................90
Figura 27- Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes de G. achachairu), CG (cascas de G. achachairu), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata), RI (frutos de R. imperialis) trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre ABTS•..............................................................91 Figura 28 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), CN (cascas dos frutos da naranjila- S. quitoense), SJ (sementes da jacu – D. inconstans) pelo método do sequestro do radical livre ABTS•..............................................................92
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Figura 29 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes de G. achachairu e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre ABTS•......................................................94 Figura 30 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações de trolox........................................................95 Figura 31 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu..............................96 Figura 32 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 3 das sementes de G. achachairu........97 Figura 33 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 3 das sementes da garcinia (G. achachairu).............................................98 Figura 34 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).................................................................................................................98 Figura 35 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).............................................99 Figura 36 - Curva de decaimento da intensidade da fluorescência da fluoresceína na presença da Gutiferona A em diferentes concentrações (µM)..............................................................................................................100 Figura 37 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das cascas de cabeludinha (P. glomerata)................................101 Figura 38 - Gráfico do percentual da atividade de quelação de metais em função das diferentes concentrações do extrato metanólico das sementes de G. achachairu..102 Figura 39 - Atividade citotóxica do extrato metanólico das sementes de G. achachairu e do composto isolado gutiferona A em células de melanoma murino (B16F10).................................................................................................................103 Figura 40 - Atividade citotóxica das frações das sementes de G.achachairu em células de melanoma murino (B16F10)................................................................................................................104
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Identificação das plantas em relação ao nome científico, nome popular, extrato metanólico das suas diferentes partes e suas siglas....................................57 Quadro 2: Rendimento dos extratos metanólicos brutos expresso em gramas e em percentual em relação a massa de frutos utilizados para preparação dos extratos..........................................................................................................58 Quadro 3: Teor de polifenóis totais equivalentes ao ácido gálico por grama de extrato metanólico dos frutos..................................................................................84
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAPH Dicloreto de 2,2'-azobis(2-amidinopropano)
ABTS+. 2,2`-azino-bis (3-etibenzotiazolin) 6-ácido sulfônico
ANOVA Análise de variância
CAT Catalase
CC Cascas da cabeludinha (Plinia glomerata)
CG Cascas da garcinia (Garcinia achachairu)
CJ Cascas da jacu (Diospyros inconstans)
CM Cascas da maná cubiú (Solanum sessiliflorum)
CN Cascas da naranjila (Solanum quitoense)
CSG Casca das sementes da garcinia (Garcinia achachairu)
DMSO Dimetilsufóxido
DPPH 2,2-difenil-1– picrilhidrazil
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
ET Transferência de elétrons
GAE Equivalente ácido gálico
Gpx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
HAT Transferência de átomo de hidrogênio
MEM Meio Mínimo Essencial
MTT [3-(4,5 – dimetiltiazol-2-il) 2,5 – brometo de difeniltetrazólio
ORAC Capacidade de absorção do radical oxigênio
PBS Salina tamponada com fosfato
PG Polpa da garcinia (Garcinia achachairu)
PJ Polpa da jacu (Diospyros inconstans)
PM Polpa da maná cubiíú (Solanum sessiliflorum)
PN Polpa da naranjila (Solanum quitoense)
PSC Polpa mais semente da cabeludinha (Plinia glomerata)
RL Radical livre
RR Rubus rosafolius
RI Rubus imperialis
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SFB Soro fetal bovino
SG Sementes da garcinia (Garcinia achachairu)
SOD Superóxido Dismutase
TEAC Capacidade antioxidante equivalente ao trolox
SJ Sementes da jacu (Diospyros inconstans)
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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 24
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28
2.1 Objetivo geral ............................................................................................. 28
2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 28
3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 30
3.1 Importância das plantas medicinais .......................................................... 30
3.2 Frutos estudados ................................................................................................. 33
3.2.1 Plinia glomerata ................................................................................................ 33
3.2.2 Garcinia ........................................................................................................... 35
3.2.3 Gênero Rubus .................................................................................................. 38
3.2.3.1 Rubus imperialis ............................................................................................ 38
3.2.3.2 Rubus rosaefolius .......................................................................................... 39
3.2.4 Solanum sessiliflorum....................................................................................... 40
3.2.5 Solanum quitoense Lam. .................................................................................. 42
3.2.6 Diospyros inconstans ....................................................................................... 43
3.3 Radicais livres e estresse oxidativo ........................................................... 44
3.3.1 Metodologias para análise do estresse oxidativo ............................................. 47
3.4 Defesas antioxidantes ......................................................................................... 49
3.5 Atividade citotóxica .............................................................................................. 52
4 METODOLOGIA ..................................................................................................... 56
4.1 Material vegetal ................................................................................................... 56
4.2 Preparação de extratos ............................................................................. 57
4.2.1 Purificação da fraçao de acetato de etila G. achachairu .................................. 59
4.2.2 Caracterização fitoquímica ............................................................................... 60
4.2.3 Doseamento de polifenóis totais ...................................................................... 61
4.2.4 Análise fitoquimica por cromatografia gasosa acoplada em massa ................. 61
4.2.5 Análise fitoquimica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE ........ 62
4.3 Análise da atividade antioxidante .............................................................. 63
4.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH• ...................................................... 63
4.3.2 Atividade sequestradora do radical ABTS• ....................................................... 64
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4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante pelo método ORAC ................................. 64
4.3.4 Avaliação da atividade antioxidante pelo método de quelação de metais. ....... 65
4.4 Cultura celular ..................................................................................................... 66
4.4.1 Tratamento Celular ........................................................................................... 66
4.4.2 Ensaio de Viabilidade Celular ........................................................................... 67
4.5 Análise estatística ............................................................................................... 67
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 68
5.1 Análise fitoquímica...............................................................................................68
5.1.1 Análise fitoquímica preliminar por cromatografia em camada delgada ............ 68
5.1.2 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada ao massa. ................. 74
5.1.3 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE ........ 80
5.1.4 Doseamento de polifenóis totais ...................................................................... 82
5.2 Avaliação da Atividades Biológica........................................................................86
5.2.1Atividade sequestradora do radical DPPH• ....................................................... 86
5.2.2 Atividade sequestradora do radical ABTS• ...................................................... 91
5.2.3 Avaliação da atividade antioxidante pela capacidade de absorção do radical
oxigênio (ORAC). ...................................................................................................... 95
5.2.4 Avaliação antioxidante pelo método de quelação de metais. ......................... 102
5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica. ................................................................... 102
6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 106
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 108
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1 INTRODUÇÃO
Substâncias químicas derivadas de produtos naturais, oriundas de animais,
micro-organismos, minerais e ou plantas, são utilizadas para o tratamento de
doenças desde os primórdios da civilização humana. Desde então, o homem
adquiriu conhecimentos empíricos sobre plantas medicinais, repassando-os às
demais gerações e, por isso, estes exerceram importante papel na descoberta de
muitos medicamentos e constituíram a base da medicina moderna, a qual está
estritamente ligada às plantas medicinais (CECHINEL-FILHO; YUNES, 2001;
BUTLER, 2005; KOEHN; CARTER, 2005; VEIGA-JUNIOR et al., 2005).
As plantas medicinais são utilizadas por diversos motivos, mas
predominantemente pelo baixo poder aquisitivo da população que não consegue
adquirir o medicamento, bem como a busca de terapias alternativas para doenças
crônicas e/ou sem tratamento específico (MALHEIROS et al., 2010). Além destas
razões, as plantas também são importantes para a indústria farmacêutica, visto que
a partir destas pode-se desenvolver medicamentos, tais como os fitoterápicos,
fitofármacos ou protótipos para a síntese de novos fármacos (BARREIRO; BOLZANI,
2009).
Sabe-se que muitos fármacos com ação anti-infecciosa, antitumoral,
cardiovascular, neurológica, imunológica, anti-inflamatória, entre outros, disponíveis
no mercado, ou que ainda estão sendo estudados, são oriundos de fontes naturais,
especialmente de plantas medicinais (CHIN et al., 2006; BUTLER, 2005)
Há alguns anos, o Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR)
do Centro de Ciências da Saúde da UNIVALI - SC pesquisa e avalia várias plantas
utilizadas na medicina popular. Os resultados obtidos são bastante promissores sob
o ponto de vista tanto químico como medicinal (CECHINEL-FILHO, 2000).
Além das partes aéreas, comumente utilizadas em estudos com plantas
medicinais, os frutos de muitas espécies também estão sendo alvos de pesquisas,
visto que estes são ricos em fibras, substâncias antioxidantes, e muitos outros
nutrientes importantes relacionados com a redução do risco de desenvolvimento de
doenças crônicas (ARUOMA et al., 2012).
Estudos mostram que o alto consumo de frutas e hortaliças e a baixa ingestão
de gordura auxiliam na manutenção ou na perda de peso e podem levar a uma
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diminuição de risco no desenvolvimento de doenças crônicas, como a síndrome
metabólica, doenças cardiovascular e diabetes tipo 2 (FISK et al., 2011). Os
antioxidantes dietéticos presentes nas frutas são cada vez mais estudados com
intuito de reduzir tais doenças (ARUOMA et al., 2012).
Ainda, o consumo de frutas e vegetais pode reduzir o risco de câncer, uma
das principais causas de morte nos países ocidentais. Soerjomataram e
colaboradores (2010) relatam que alguns casos de câncer poderiam ser prevenidos
se a ingestão de frutas e vegetais fosse de 500 g por dia.
As espécies da flora catarinense selecionadas para este estudo já vem sendo
avaliadas pelo NIQFAR. São plantas utilizadas popularmente por possuírem
diferentes propriedades terapêuticas, porém, poucos estudos científicos em relação
aos efeitos citotóxicos e antioxidantes dos frutos foram encontrados na literatura.
A Rubus imperialis mais conhecida como amora-branca ou “amora-do-mato” é
encontrada por toda a região Sul do Brasil. Na medicina popular é utilizada para
diabetes, processos inflamatórios e dolorosos (CECHINEL-FILHO, 2000; NIERO;
CECHINEL-FILHO, 2008).
A amora-vermelha ou “amora-do-mato”, cujo nome científico é Rubus
rosaefolius, apresenta-se como um arbusto de flores brancas. É utilizada para aliviar
cólicas menstruais, inflamação na garganta e diarreia (SILVA; SIQUEIRA, 2000).
Industrialmente seus frutos são utilizados como fonte de flavorizante e corante, já na
culinária, é utilizada na elaboração de doces e geleias (JORGE; MARKMANN,
1993).
Garcinia achachairu pertence à família Clusiaceae. É uma fruta muito
apreciada na Bolívia, seus frutos e folhas são utilizados popularmente para
cicatrização, problemas digestivos e como laxantes. Também é indicada para úlcera
gástrica, inflamações e tratamentos reumáticos (BARBOSA; ARTIOLI, 2007).
Plinia glomerata é conhecida como “cabeludinha”, originária dos estados: Rio
de Janeiro, São Paulo e do Sul de Minas Gerais. Em Santa Catarina ocorre apenas
em áreas de cultivo. Floresce de abril a junho e seus frutos são apreciados de
outubro a dezembro (SERAFIN et al., 2007).
Diospyros inconstans Jacq., espécie nativa do sul do Brasil, conhecida como
fruta-de-jacu-macho ou caqui-do-mato, apresenta hábito arbóreo, constitui fonte de
alimento para aves como jacus e aracuãs, recomendada como ornamental e
apropriada para arborização urbana (CALIL; LEONHARDT; OLIVEIRA, 2001).
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Solanum quitoense Lam. é conhecida como naranjila. É nativa dos Andes,
sendo muito cultivada no Equador, Colômbia e América Central. Seu fruto possui
características arredondadas e sua casca é coberta por pelos (ACOSTA; PÉREZ;
VAILLANT, 2009).
A Solanum sessiliflorun é também conhecida como maná,maná-cubiu, topiro
e tomate de índio, originária da Amazônia Ocidental. É um arbusto ereto e
ramificado, atinge de 1 a 2 m de altura e pode ser cultivada em diversos solos. Seus
frutos são comestíveis e é muito utilizado na culinária (LOPES; PEREIRA, 2005).
Mediante o exposto, este estudo tem a finalidade de verificar se os frutos de
R. imperialis, R. rosaefolius, G. achachairu, P. glomerata, D. inconstans, S.
sessiliflorum e S. quitoense têm realmente papel importante na prevenção e
tratamento de doenças crônicas não transmissivéis, verificando o perfil fitoquímico e
a ação antioxidante e citotóxica in vitro.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o perfil fitoquímico e a atividade antioxidante e citotóxica in vitro dos
extratos e frações obtidos dos frutos e sementes de G. achachairu, R. imperialis, R.
rosaefolius, P. glomerata, D. inconstans, S. sessiliflorum e S. quitoense oriundas da
flora catarinense.
2.2 Objetivos específicos
- Obter os extratos dos frutos e sementes por meio da maceração a frio em metanol
e clorofórmio;
- Obter frações semipurificadas por meio de partição líquido-líquido a partir dos
extratos das sementes de G. achachairu;
- Identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes nos extratos
metanólicos dos frutos e sementes por meio de cromatografia em camada delgada
usando reativos específicos e padrões autênticos;
- Identificar as classes de metabólitos secundários presentes nos extratos
clorofórmicos e metanólicos dos frutos e sementes de G. achachairu e P. glomerata
por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectometro de massa (CG/EM) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
- Verificar a ação antioxidante in vitro dos extratos metanólicos pelo método do
sequestro dos radicais DPPH• e ABTS•, quelante de metais e ORAC;
- Avaliar a citotoxicidade in vitro dos extratos metanólicos pelo método MTT na
linhagem celular de melanoma murino (B16F10).
29
30
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Importância das plantas medicinais
No planeta existem aproximadamente 500 mil espécies de plantas, no
entanto, há pouca pesquisa sobre o potencial destas em relação ao
desenvolvimento de novos medicamentos. Apenas uma pequena percentagem foi
estudada quanto às características fitoquímicas e biológicas (KOEHN; CARTER,
2005).
No Brasil, há grande diversidade de plantas, que está relacionada às boas
condições climáticas, edáficas (fatores inerentes ao solo) e potencial hídrico. Estes
fatores contribuem para a síntese de inúmeros metabólitos secundários com
potencial atividade biológica (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).
A utilização de plantas medicinais no Brasil se iniciou em virtude da cultura
dos índios que habitavam o país. Posteriormente, sofreu influências dos
colonizadores e de outros povos que aqui vieram habitar (KOEHN; CARTER, 2005;
BALUNAS; KINGHORN, 2005). Embora haja tradição de seu uso em vários biomas,
entre eles Amazônia, Cerrado e a Mata Atlântica, são poucas as pesquisas
etnofarmacológicas e não há estatística sobre o mercado e consumo de plantas
medicinais, apenas há vários relatos sobre o uso de plantas exóticas, em relação às
plantas nativas (VEIGA-JÚNIOR, 2008).
No Brasil o consumo de frutas e vegetais é muito baixo, um dos fatores que
contribuem para mortalidade de acordo com o Relatório Mundial de Saúde. A
Organização Mundial da Saúde (OMS) mostra que 2,7 milhões de vidas poderiam
ser salvas por ano com o consumo necessário de frutas e verduras, pois a ingestão
destes alimentos contribui para a prevenção de doenças crônicas não-transmissíveis
além de assegurar um consumo adequado de micronutrientes e fibras dietéticas
(MOURA et al., 2011).
É estimado que o baixo consumo de frutas e verduras é responsável por
cerca de 19% dos casos de câncer gastrintestinal no mundo, bem como 31% das
doenças cardíacas e 11% de acidente vascular encefálico. A ingestão mínima
recomendável é de 400 g de frutas e vegetais por dia, a fim de prevenir doenças
31
crônicas, como doenças cardíacas, neoplasias, diabetes e obesidade (WAXMAN;
KELLER; PORTER, 2003).
A prevalência de doenças crônicas não transmissíveis cresce rapidamente, e
elementos nutricionais, como vitaminas e minerais são amplamente utilizados como
terapias preventivas a fim de evitar o desenvolvimento ou controlar essas doenças.
Estudos revelam que as frutas exóticas possuem potente capacidade para melhorar
distúrbios metabólicos e suas condições resultantes, porém essas frutas são
escassas em alguns lugares do mundo devido à sua presença limitada e regional
(DEVALARAJA; JAIN; YADAV, 2011).
Reiss e colaboradores (2012), mostraram estimativas de que 20.000 casos
novos de câncer por ano poderiam ter sido evitados com o alto consumo de frutas e
vegetais. Muitas doenças crônicas estão relacionadas com o estresse oxidativo e
muitos alimentos de origem vegetal tem sido capaz de controlar tais distúrbios por
possuirem propriedades antioxidantes. As diferentes classes alimentares possuem
diferentes compostos bioativos e quando consumidos juntos produzem um interação
sinérgica tendo efeitos fisiológicos positivos sobre a saúde (WANG et al., 2012).
Pesquisas aponta o interesse da comunidade científica em caracterizar físico-
quimicamente e quantificar os componentes bioativos de frutas exóticas ou não.
Dentre todos os componentes presentes nessas frutas, aquelas que possuem
atividade antioxidante têm melhor destaque em virtude de proteger o organismo
contra o estresse oxidativo com intuito de evitar doenças originadas por esse
processo (SOUZA et al., 2012).
Cresce o interesse dos pesquisadores em validar as plantas utilizadas na
medicina popular, a fim de desenvolver novos fitoterápicos e fitofármacos, que
possam beneficiar a população com novas opções terapêuticas, fortalecendo assim
as indústrias brasileiras (CECHINEL-FILHO, 1995; YUNES; PEDROSA; CECHINEL-
FILHO, 2001; CECHINEL-FILHO, 2012).
Os produtos naturais, incluindo as plantas medicinais, são utilizados como
forma de tratamento mais acessível para 80% da população de baixa renda, e
movimenta investimentos financeiros em todo o mundo, principalmente em países
em desenvolvimento. No entanto, há pouco conhecimento científico sobre
determinadas espécies vegetais e suas propriedades químicas, toxicológicas e
farmacológicas, que possibilitem segurança e eficácia completa do uso dessas
plantas (MOREIRA-SOUZA; SALGADO; PIETRO, 2010).
32
Para que essas plantas possam ser utilizadas terapeuticamente necessitam
estarem livres de contaminação, precisam ser identificadas, cultivadas e coletadas
de maneira correta, estando livre de material estranho e contaminações inorgânicas
e microbianas. Neste aspecto, um controle de qualidade deve ser realizado desde o
seu plantio até sua comercialização e uso (MOREIRA-SOUZA; SALGADO; PIETRO,
2010).
No Brasil, os registros de medicamentos fitoterápicos, a comercialização e
distribuição de plantas medicinais são regulamentados pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA). A implantação da Política Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicas (Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006) representou
uma das medidas fundamentais adotadas pelo governo capaz de promover
melhorias na qualidade de vida da população brasileira, mas, também serviu para a
regulamentação da produção e uso de drogas vegetais e fitoterápicos, visando
segurança e eficácia (BRASIL, 2004; 2006; 2010).
A RDC n° 10 de 9 março de 2010, que regulamenta o registro de plantas
medicinais junto à ANVISA, e a RDC nº 14 de 31 de março de 2010, que
regulamenta o registro de fitoterápicos, determinam os aspectos a serem
observados desde a produção, distribuição e uso de plantas medicinais in natura
e/ou utilizados para produção de fitoterápicos, a fim de garantir a qualidade e
eficácia desses produtos, com intuito de promover e reconhecer as práticas
populares e tradicionais do uso de plantas e remédios caseiros na atenção primária
à saúde (VEIGA-JUNIOR 2008; PINHO; PICHONELLI, 2009; BRASIL, 2010a;
2010b).
No contexto atual, 71 plantas fazem parte do RENISUS, Relação Nacional de
Plantas Medicinais de Interesse ao SUS, que tem por finalidade orientar novos
estudos para a elaboração com segurança de fitoterápicos eficazes na prevenção e
tratamento de doenças utilizadas pela população (PINHO; PICHONELLI, 2009;
BRASIL, 2010b).
A fitoterapia se expandiu graças à preferência do consumidor por tratamentos
terapêuticos naturais, surgindo o interesse por produtos naturais como fonte de
substâncias bioativas (SCHMIDT et al., 2008; RISHTON, 2008). Há grande interesse
por parte da indústria alimentícia, das indústrias cosmética e farmacêutica em
substituir os aditivos com ação antioxidante de origem sintética por antioxidantes
naturais, em função de polêmicas sobre possíveis efeitos adversos dos agentes
33
sintéticos e, também, pelo apelo comercial dos derivados naturais (OLIVEIRA et al.,
2009).
Um estudo recente dos autores Newman e Cragg (2012, 2013) mostra que
nos últimos anos as pesquisas na área de produtos naturais vêm crescendo de
forma significativa e, cada vez mais, há descobertas de substâncias bioativas em
diversas plantas, as quais por meio de muitos estudos se tornam medicamentos ao
longo dos anos, tanto para amenizar como para prevenir diversas doenças.
As substâncias bioativas provêm da grande diversidade de espécies na
natureza e podem ser obtidas graças ao avanço nas técnicas de separação,
purificação e identificação de misturas complexas (SCHMIDT et al., 2008; RISHTON,
2008). Uma importante ferramenta para a seleção da matéria-prima tem sido os
testes in vitro, os quais auxiliam na busca por substâncias bioativas, principalmente,
em frutas e vegetais com potencial ação antioxidante (ALVES et al., 2010).
Pode-se citar como resultados dos avanços científicos a descoberta: a) da
hipericina, metabólito ativo da planta Hypericum perforatum, que apresenta atividade
antidepressiva, antiviral e antitumoral e é utilizada para tratar depressão leve a
moderada (SHEN; JI; ZHANG, 2006); b) do diterpeno paclitaxel (Taxol®), o qual foi
isolado da espécie Taxus brevifolia, sendo hoje sintetizado em escala industrial e
empregado no tratamento de neoplasias de ovário, mama e pulmão (BRANDÃO et
al., 2010).
3.2 Frutos estudados
3.2.1 Plinia glomerata
P. glomerata faz parte da família Myrtaceae considerada uma das mais
importantes da Mata Atlântica brasileira. Essa família é formada por grande número
de plantas que incluem matas rasteiras a grandes árvores, encontrada no Sul do
Brasil (OLIVEIRA et al., 2007). Também possui nome científico Myrciaria glomerata,
Eugenia cabelluda e Eugenia tomentosa (SERAFIN et al., 2007).
34
P. glomerata também conhecida como cabeludinha ou jabuticada-amarela é
um arbusto de folhagem densa, ramos pendentes e flexíveis. As folhas são
lanceoladas e aveludadas, com cerca de 11 cm de comprimento em média. Seus
frutos (Figura 1) comestíveis são sésseis com epicarpo espesso e piloso de cor
amarelada. O mesocarpo externo é denso e esbranquiçado, enquanto o interno é
gelatinoso (JORGE; FERRO; OLIVEIRA, 1996).
Figura 1- Frutos maduros e partes aéreas de P. glomerata
Fonte: Tropical Plant Catalog
Muitas espécies de Plinia têm sido estudadas com foco no seu potencial
medicinal, rendendo bons resultados em diferentes modelos experimentais, como a
atividade antidiabética, antimicrobiana, antirreumática, diurética e reguladora do
sistema digestivo (BEZERRA et al., 2006; AGRA et al., 2007; OLIVEIRA et al.,
2007).
Uma pesquisa, realizada sobre o uso popular da P. glomerata com os índios
Parezi (Sapezal - MG) relata que eles utilizavam as partes aéreas da planta para
queda de cabelo, em criança enfraquecida e pessoas debilitadas. Utilizavam na
forma de banhos de imersão em temperaturas frias, mornas ou quentes, variando de
acordo com a doença (MORAIS; MACEDO, 1996).
O extrato bruto metanólico de P. glomerata mostrou atividade antimicrobiana
contra Staphylococcus aureus; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e
Burkholderia cepacia e também potente ação analgésica a qual provavelmente está
relacionada com a presença de substâncias fenólicas (SERAFIN et al., 2007).
O extrato aquoso das folhas de Plinia edulis apresentou atividade antioxidante
in vitro, sendo que na concentração de 20 µg/ml apresentou perfil semelhante ao
35
ácido ascórbico testado nesta mesma concentração. Este mesmo extrato foi
citotóxico para células MCF-7 (linhagem tumoral de mama) (CARVALHO;
ISHIKAWA, GOUVÊA, 2012).
3.2.2 Garcinia
As plantas do gênero Garcinia pertencem à família Clusiaceae, podem ser
encontradas na África tropical, Ásia, Nova Caledônia, Polinésia e Brasil. Neste
gênero são encontrados em abundância substâncias das classes das xantonas,
benzofenonas e biflavonoides, e por isso são atribuídas diferentes atividades
biológicas, como: antioxidante, anti-inflamatória, antimicrobiana e citotóxica
(FOUOTSA et al., 2012; GONTIJO et al., 2012).
O gênero Garcinia, antigamente era conhecido como Rheedia, inclui cerca de
30 gêneros e 1000 espécies. No Brasil ocorrem 18 gêneros de Clusiaceae e cerca
de 150 espécies amplamente distribuídas em regiões tropicais do Brasil (SOUZA;
LORENZI, 2008).
A G. achachairu é originária da região de Santa Cruz – Bolívia, mas está bem
adaptada à Mata Atlântica. Popularmente, essa planta é utilizada como cicatrizante,
digestiva, laxante, antirreumática, antiulcerosa e anti-inflamatória (ALVES et al.,
2000; BARBOSA; ARTIOLE, 2007). Seus frutos são globoso-oblongos, muito
parecidos a uma nêspera, amarelos-alaranjados, com casca grossa, lisa, firme e
resistente e no seu interior a casca é creme-palha (Figura 2). A base peduncular do
fruto é estreita e a calicinal é mais larga. A polpa é branca, suculenta e de textura
mucilaginosa, não adere à casca e após a retirada do fruto a polpa se oxida
rapidamente (BARBOSA; ARTIOLE, 2007).
36
Figura 2 – Frutos maduros e partes aéreas de G. achachairu
Fonte: Informedfarmers
No Brasil, esse fruto é pouco conhecido, muitas vezes confundido pela
população com frutos de outras espécies, como por exemplo, o bacupari, bacuripari
e bacurizinho. Na Bolívia e no nordeste brasileiro seus frutos são comercializados,
porém são raras as pesquisas científicas que abordam esta espécie (BARBOSA;
ARTIOLE, 2007).
Estudos recentes mostraram que o extrato metanólico das sementes e dos
galhos da G. achachairu tem atividade antinociceptiva. Outros resultados dessa
pesquisa mostraram significativa ação antiúlcera relacionada a uma substância
denominada de Gutiferona A (DAL MOLIN, 2009).
Mais recentemente foram avaliados os possíveis efeitos genotóxicos e
clastogênicos do extrato das sementes de G. achachairu em diferentes células de
camundongos. Os resultados mostraram que o extrato não induziu danos ao DNA
em células hepáticas de medula óssea e testiculares em diferentes doses de (500,
1000, 2000 mg/kg) nos tempos de 4h e 24h (MARQUES et al., 2012).
Dal Molin et al. (2012), avaliou a composição química e potencial
antinociceptivo do extrato metanólico e da gutiferona A obtida das sementes de G.
achachairu. Ambos apresentaram ação antinociceptiva nos modelos de dor
induzidos por formalina, capsaicina, glutamato e carragenina.
Muitos estudos vêm sendo realizados com diferentes espécies de Garcinia,
além de utilizarem diversas partes da planta, desde a raiz até seu fruto.
Recentemente Fouotsa et al. (2012), encontraram na casca do caule de G. nobilis
uma nova xantona (caroxantona) a qual foi isolada juntamente com outras seis já
conhecidas. Gartanina e a 8-hidroxicudraxantona G inibiram a enzima α-glicosidase
em concentrações inferiores a 100 µM.
37
A partir do extrato etanólico da casca dos caules de G. bracteata foram
isoladas cinco xantonas e vinte e seis compostos conhecidos. As xantonas 1,4,5,6-
tetrahidroxi-7,8-di(3-metilbut-2-enil)xantona, globuxantona e garcinia xantona E
foram citotóxicas nas concentrações de 2,8; 3,4 e 3,1 µM, respectivamente, contra
células de leucemia humana HL-60 (NIU et al., 2012).
Do extrato metanólico das sementes da G. kola foi isolado quatro
biflavonoides, denominados de GB1a, GB2a, garcinal e ácido garcinóico, os quais
apresentaram atividade antioxidante e inibiram a produção de óxido nítrico em
macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (OKOKO, 2009).
Fu et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante de diferentes extratos das
folhas, raizes e frutos de G. xanthochymus e detectaram que somente o extrato de
acetato de etila apresentou ação semelhante ao butilhidroxitolueno (BHT).
Kaur et al. (2012), isolaram uma benzofenona poli-isoprenilada (14-deoxi-
isogarcinol) e um novo derivado acilfloroglucinol e duas moléculas já conhecidas, o
garcinol e isogarcinol, a partir da fração hexânica dos frutos de G. indica. As
substâncias garcinol e isogarcinol também foram isoladas em grandes quantidades
nas frações mais polares, como a fração clorofórmica e de aceto de etila.
G. mangostana Linn é muito utilizada na medicina tradicional para o
tratamento de dor abdominal, diarreia, feridas infectadas e úlcera, e a parte utilizada
é o pericarpo, fonte de xantonas e outras substâncias bioativas. Alguns estudos têm
sido realizados com essa espécie mostrando sua atividade antioxidante, antitumoral,
antialérgica, anti-inflamatoria, antibacteriana e antiviral (PEDRAZA-CHAVERRI et al.,
2008).
As cascas dos frutos e folhas de G. indica Choisy, conhecida como kokum,
são usados para tratar doenças inflamatórias, dores reumáticas e dores intestinais,
no sistema tradicional indiano. Estudos químicos mostraram que suas cascas
contêm proteínas, taninos, pectina, açúcares, gorduras, ácidos orgânicos, como: (-)-
ácido hidroxicítrico, ácido hidroxicítrico lactona e ácido cítrico; antocianinas,
cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-sambubioside, e os compostos fenólicos
poliisoprenilada garcinol e isogarcinol (KAUR et al., 2012).
Alguns estudos pré-clínicos mostram que G. indica e substâncias isoladas
desta possuem atividade antibacteriana, antifúngica, antiulcerogênica,
cardioprotetora, anticancerígena, quimiopreventiva, efeitos antioxidantes e
antiobesidade (BALIGA et al., 2011).
38
3.2.3 Gênero Rubus
O gênero Rubus pertence à família Rosaceae, subfamília da Rosoideae e
dentro dessa há muitas espécies, sendo que 250 já foram identificadas. Elas são
usadas popularmente em diversas regiões para tratamento da diabetes mellitus,
queimaduras e feridas (PATEL; ROJAS-VERA; DACKE, 2004; NIERO; CECHINEL-
FILHO, 2008).
A família Rosaceae apresenta em torno de 100 gêneros com mais de 250
espécies, grande parte encontrada em climas temperados (JOLY, 1991). Na flora
Brasileira é representada por cinco gêneros, ela é encontrada principalmente no Sul
do país (JORGE; MARKMAN, 1993).
3.2.3.1 Rubus imperialis
R. imperialis é um arbusto encontrado no Sul do Brasil, conhecido
popularmente como amora-do-mato ou amora-branca (Figura 3). Na medicina
popular é usada no tratamento de diversas doenças, como diabetes, processos
inflamatórios e dolorosos (NIERO et al., 1999).
Figura 3 - Frutos maduros e partes aéreas da R. imperialis
Fonte: FloraSBS
39
O extrato metanólico das partes aéreas quando administrados em ratos
normoglicêmicos, na dose de 300 mg/kg, reduziu significativamente as
concentrações plasmáticas de glicose quando comparado com o grupo controle,
confirmando a ação hipoglicemiante relatada pela população (KANEGUSUKU et al.,
2002).
Já o extrato metanólico das folhas, raízes e galhos apresentou atividade
antiespamódica nos modelos de contração induzida por acetilcolina em íleo e
duodeno de cobaias e ratos (EMENDÖRFER et al., 2005).
O extrato metanólico das partes aéreas apresentou também a atividade
antiviral contra herpes simples (HSV-1), cuja atividade foi atribuída à presença de
flavonoides e taninos (MÜLLER et al., 2007).
Uma pesquisa realizada anteriormente com a R. imperialis e R. rosaefolius
demonstrou que extratos e compostos obtidos das raízes de R. imperialis possuem
importante ação antimicrobiana. Uma substância isolada denominada como ácido 3-
O-metil-4-metilelágico, pode ser responsável pelo efeito encontrado (KANEGUSUKU
et al., 2002; ARDENGHI et al., 2006).
Alguns estudos já realizados com extratos de espécies deste gênero
mostraram potencial antimicrobiano e analgésico (THIEM; GOSLINSKA, 2004).
Outra pesquisa fitoquímica identificou presença de compostos triterpênicos,
esteroidais e derivados do ácido elágico (NIERO et al., 1999; KANEGUSUKU et al.,
2002). O composto niga-ichigosideo F1 isolado dessa espécie mostrou ação
antinociceptiva, cujo mecanismo de ação está relacionado com a via dopaminérgica,
glutamatérgica, colinérgica, além de envolver os sistemas taquixinérgico e
oxidonitrégico (ARDENGHI et al., 2006).
3.2.3.2 Rubus rosaefolius
Esta espécie é um arbusto de flores brancas e frutos vermelhos, conhecida
também como “amora vermelha”, “amora do mato” ou “framboesa” (Figura 4)
(JORGE; MARKMAN, 1993). Na medicina popular suas folhas são utilizadas para
aliviar cólicas menstruais, diarreia e inflamação de garganta, seus frutos se
40
consumidos excessivamente têm ação laxante. A indústria utiliza como flavorizante e
corante (COIMBRA, 1994).
Figura 4 - Frutos maduros e partes aéreas da R. rosaefolius
Fonte: Philippine Medicinal Plants
Um estudo das partes aéreas da R. rosaefolius indicou a presença de
triterpenos pentacíclicos: o ácido tormêntico e o ácido 28 -O- metoxitormêntico e de
três esteroides: estigmasterol, sitosterol e campesterol. Os testes de atividade
antinociceptiva demonstraram significantes efeitos na nocicepção de origem
inflamatória. Quando comparados com medicamentos usados clinicamente, o extrato
foi cerca de seis vezes mais potente ( KANEGUSUKU et al., 2002).
3.2.4 Solanum sessiliflorum
A Solanum sessiliflorun (Solanaceae) é também conhecida como maná,
maná-cubiu, topiro e tomate de índio, originária da Amazônia Ocidental (Figura 5)
(LOPES; PEREIRA, 2005). Esta espécie está distribuída em toda a Amazônia
brasileira, peruana e colombiana. Popularmente tem sido utilizada para controlar
hipercolesterolemia, ácido úrico, glicose, hipertensão, enxaqueca e depressão, cujas
funções são atribuídas aos altos teores de niacina (SILVA-FILHO et al., 2005).
41
Figura 5 – Frutos maduros e partes aéreas da S. sessiliflorum
Fonte: Novidades no mercado
Atualmente estão sendo realizados estudos a fim de verificar o período de
conservação, amadurecimento e germinação das sementes de maná-cubiu. Uma
pesquisa realizada recentemente avaliou a qualidade e o período de conservação
pós-colheita de maná-cubiu por meio da caracterização fisico-química e fisiológica
dos frutos mantidos sob condições ambientais (LOPES; PEREIRA, 2005; SILVA;
ROCHA; SALOMÃO, 2011).
Apesar dos frutos serem muito utilizados são poucos os estudos publicados
sobre a espécie, e a maioria é na área de agronomia, com o intuito de estudar o
envelhecimento acelerado, para a avaliação do vigor das sementes de maná-cubiu,
determinação da maturidade de frutos baseados na aparência e na composição
química para colheita e armazenamento (PEREIRA; FILHO-MARTINS, 2010;
SOUZA et al., 2008).
Sandoval (2010), avaliou o efeito antimicrobiano de extratos de S.
sessiliflorum sobre a bactéria Helicobacter pylori. Os resultados mostraram um efeito
inibitório superior a alguns antibióticos de referência disponíveis no mercado.
Ainda, Rincon e colaboradores (2011), avaliaram o teor de compostos
fenólicos e a atividade antioxidante de três variedades de frutos de S. sessiliflorum
pelo método do sequestro do radical DPPH•. Eles verificaram que há boa correlação
entre o teor de polifenóis e a atividade antioxidante (r= 0,9156), por isso, sugeriram
que esses frutos são promissores fontes de alimentos funcionais.
42
Outro estudo relata sobre a atividade antioxidante, o teor de compostos
fenólicos solúveis totais (parte comestível das sementes e cascas) e o teor de ácido
ascórbico (parte comestível) da S. sessiliflorum (CONTRERAS-CALDERÓN et al.,
2011). Porém, ainda são poucos os estudos com estes frutos relacionando o perfil
fitoquímico e a atividade antioxidante.
3.2.5 Solanum quitoense Lam.
A Solanum quitoense cresce em regiões de grande altitude. Ela é nativa dos
Andes e é cultivada para consumo em países da América Central e em alguns
países da América do Sul. A naranjila (Figura 6), como é conhecida, produz um fruto
redondo e sua casca é coberta por pelos. No período de maturação, a naranjila
passa da cor verde para laranja. A fruta contém quatro compartimentos separados
por partes membranosas e preenchidos com polpa, suas sementes são planas e
rígidas (ACOSTA; PÉREZ; VAILLANT, 2009).
Figura 6 – Frutos maduros e partes aéreas de S. quitoense Lam.
Fonte: Products e Services
O estudo conduzido por Acosta; Pérez e Vaillant (2009), verificaram alto teor
de açúcar, principalmente sacarose nos frutos de S. quitoense, e relataram a
43
presença de compostos fenólicos e carotenoides, aos quais atribuíram a atividade
antioxidante.
Em outro estudo foi analisado o extrato comestível da naranjila, detectando a
presença de compostos fenólicos como antocianinas e derivados do ácido
hidroxicinâmico, como também altas concentrações de carotenoides. Isto indica
potencial ação antioxidante destes frutos, o que os torna de interesse nutricional e
de pesquisa (MERTZ et al., 2009).
3.2.6 Diospyros inconstans
D. inconstans é uma espécie nativa do sul do Brasil. Ela é conhecida como
fruta-de-jacu-macho ou caqui-do-mato (Figura 7) e apresenta hábito arbóreo. Esta
espécie constitui fonte de alimento para aves, recomendada como ornamental e
apropriada para arborização urbana (CALIL; LEONHARDT; OLIVEIRA, 2001).
Figura 7 – Frutos maduros e partes aéreas de Diospyros inconstans
Fonte: Fotografias de la flora autoctona del Uruguay
Na literatura não tem muitos artigos relatando essa espécie, porém há artigos
sobre outras espécies de Diospyros. Um estudo recente teve como objetivo a
caracterização fitoquímica e perfil antioxidante da fruta de preto sapote (Diospyros
digyna Jacq.), o qual relatou a presença de compostos fenólicos, carotenoides e
44
tocoferóis e a capacidade antioxidante foi medida pelo DPPH (YAHIA; GUTIERREZ-
OROZCO; LEON, 2011).
3.3 Radicais livres e estresse oxidativo
Radicais livres são espécies químicas que têm um ou mais elétrons não
pareados na última camada eletrônica deixando-os muito instáveis e reativos (GATÉ,
1999).
Espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio
(ERNs) incluem os radicais livres e espécies não radicalares como: ânion superóxido
(O2•-), radical hidroxila (HO•-), alcoxila (RO •-), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido
nitroso (N2O), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2-), nitratos (NO3
-) e peroxinitritos
(ONOO-) (FERREIRA et al., 2011).
As EROs e ERNs promovem a oxidação de proteínas, lipídeos e ácidos
nucleicos provocando severas mudanças em nível celular, quanto aos aspectos
morfológicos e fisiológicos (KAHARAMAN et al., 2003).
A geração de radicais livres e espécies reativas não radicalares são
originadas do metabolismo do oxigênio, sendo que a principal fonte geradora é a
mitocôndria por meio da cadeia transportadora de elétrons (BARBOSA et al., 2010).
No entanto, existem outras fontes geradoras de espécies reativas: macrófagos e
neutróflos, endotélio, epitélio, sistemas enzimáticos (xantina oxidase, NADPH-
oxidase, NADPH-citocromo P450 redutase, ciclo-oxigenases, óxido nítrico sintetase),
reações com metais (ferro e cobre) via reação de Fenton e de Haber-Weiss, e
reação não enzimática entre os radicais superóxido e óxido nítrico resultando na
geração de peroxinitrito (FERREIRA et al., 2011).
A geração de radicais livres é um processo contínuo e fisiológico. Durante os
processos metabólicos, os radicais agem como mediadores para a transferência de
elétrons nas diversas reações bioquímicas. Quando esses radicais são produzidos
em quantidades adequadas geram ATP (energia), ativam genes e participam de
mecanismos de defesa durante o processo de infecção. Já a produção excessiva
causa danos oxidativos contra células e tecidos (FERREIRA; MATSUBARA, 1997;
HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).
45
As espécies reativas têm importante papel fisiológico, pois atuam mantendo
diversas funções celulares como: produção de energia, fagocitose, regulação do
crescimento celular, sinalização intracelular e síntese de substâncias biológicas
importantes (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Evidências mostram que o estresse oxidativo ocasionado pelas espécies
reativas tem ação deletéria ao organismo, causando envelhecimento, transformação
e morte celular, o que afeta em alguns processos patológicos, como: indução do
câncer e doenças neurodegenerativas e também na fisiopatologia de doenças
crônicas, por exemplo, doenças autoimunes, cardiopatias, entre outras
(VASCONCELOS et al., 2007).
O radical hidroxila é o mais reativo e mais lesivo. Quando este é formado o
organismo não consegue se defender, causando modificações no DNA, danos nas
proteínas, inativação enzimática, peroxidação lipídica (VASCONCELOS et al., 2007).
As EROS formadas pela redução do oxigênio são: o radical superóxido, o não
radical peroxido de hidrogênio, ácido hipocloroso e o radical hidroxil. O superóxido
pode ser produzido a partir da Co-Q ou de enzimas que contêm metais como
citocromo P450, xantina-oxidase. Quando um superóxido recebe um elétron, ele é
reduzido a peroxido de hidrogênio. O radical hidroxil é formado a partir da reação
entre o ânion superóxido com Fe3+ ou Cu2+ pela reação de Fenton (Figura 8), e a
partir da reação entre o peróxido de hidrogênio com Fe2+, reação de Haber-Weiss
(HAIDAL et al., 2011).
Figura 8: Reação de Fenton ou Haber - Weiss
Fonte: (RESENDE; SALGADO; CHAVES, 2003)
A maioria dos radicais livres formados é removida pela ação do sistema
superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. No entanto, algumas vezes
46
o ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio não são removidos rapidamente, e
assim, eles podem reagir entre si e produzir o radical hidroxil, o qual iniciará uma
cascata de lipoperoxidação causando danos aos tecidos. O peróxido de hidrogênio
gera outras EROs com capacidade ainda maior como, o radical hidroxil e ácido
hipocloroso (PAIXÃO-SILVA et al., 2011).
O peróxido de hidrogênio é convertido pela mieloperoxidase presente no
neutrófilo, em ácido hiplocoroso, uma espécie não radicalar que oxida vários
compostos biológicos (VASCONCELOS et al., 2007).
O estresse oxidativo ocorre em virtude de um desequilíbrio entre a geração de
compostos oxidantes e a defesa antioxidante. O organismo pode sofrer o estresse
oxidativo causado pelas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, as quais podem
ser originárias do próprio organismo ou do ambiente. Entre as milhares de
moléculas-alvo dessas espécies encontram-se as proteínas, os lipídeos e o DNA
(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Todos os componentes celulares são susceptíveis às ações do oxigênio,
porém a membrana celular é a mais atingida em função da peroxidação lipídica, a
qual pode ser avaliada ou utilizada como um indicador do estresse oxidativo. A
reação entre EROs e/ou ERNs e os ácidos graxos poli-insaturados presentes nas
membranas celulares e nas lipoproteínas ocorre por diversos mecanismos, e em
virtude desse processo ser tão complexo é importante avaliar os produtos derivados
da lipoperoxidação, pois estão associados ao envelhecimento e o surgimento de
diversas doenças (LIMA; ABDALLA, 2001).
A lipoperoxidação pode ser definida por uma cascata de eventos bioquímicos
resultante da ação dos radicais livres sobre os lipídeos insaturados das membranas
celulares, levando a destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca
de metabólitos e, numa condição extrema, à morte celular. As alterações na
membrana levam a alterações na permeabilidade, alterando fluxo iônico e o fluxo de
outras substâncias, o que resulta na perda da seletividade para entrada e/ou saída
de nutrientes e substâncias tóxicas à célula (LIMA; ABDALLA, 2001).
O processo oxidativo pode estar relacionado à etiologia de diversas doenças
crônicas não transmissíveis, entre elas: aterosclerose, câncer, diabetes, obesidade e
transtornos neurodegenerativos, processos cardiovasculares e carcinogênicos
(GREEN; BRAND; MURPHY, 2004).
47
Em especial, na etiologia do câncer, o estresse oxidativo parece estar
envolvido nos processos oxidativos de iniciação, caracterizados pela mutação do
material genético. Ainda, as espécies reativas podem atuar como promotoras de
oncogenes e inclusive promover alterações genéticas implicadas na metástase
(ROSA; COIMBRA, 2009).
Outra doença envolvendo o processo de estresse oxidativo é a síndrome
metabólica. Esse processo manifesta-se principalmente na resistência insulínica,
alterações na insulina, hiperglicemia, disfunção endotelial, dislipidemia e obesidade.
Essas manifestações estão associadas tanto ao estresse oxidativo como também
aos hábitos de vida e herança genética (FERREIRA et al., 2011).
3.3.1 Metodologias para análise do estresse oxidativo
Os principais mecanismos de substâncias antioxidantes referem-se à
transferência de átomos de hidrogênio (HAT) e de transferência de elétrons (ET).
Muitos dos ensaios baseados em HAT são de reação competitiva entre o substrato e
o antioxidante com intuito de gerar radicais peroxila por meio da decomposição dos
compostos azoiniciadores, cuja ação pode ser monitorada pelos métodos ORAC,
TRAP. Já a transferência de elétron pode ser avaliada pela capacidade antioxidante
equivalente ao trolox (TEAC) e pelo método de redução do ferro (FRAP), pois
medem a capacidade de um antioxidante em reduzir um oxidante, cuja atividade
pode ser monitorada espectrofotometricamente (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005).
Existem diversos métodos para analisar a atividade antioxidante, o que
envolve desde ensaios químicos a testes mais complexos utilizando diversas
técnicas instrumentais. Outro aspecto relevante é que existem diferentes tipos de
radicais livres, os quais atuam de maneira diferente no organismo, portanto é difícil
analisar por um único método (ALVES et al., 2010).
O método ORAC avalia a capacidade de absorção de radicais oxigênio utiliza-
se uma substância fluorescente, comumente a fluoresceína como um marcador de
fluorescência, cujo objetivo é medir a diminuição da emissão de fluorescência na
presença de uma azoiniciador gerador de radicais, tal como o AAPH (dicloreto de
2,2'-azobis(2-amidinopropano)) (ALVES et al., 2010).
48
Este ensaio avalia a atividade antioxidante (transferência de átomos de
hidrogênio) por meio da inibição da oxidação da fluoresceína induzida pelo radical
peroxil gerado no meio de reação. A atividade antioxidante de uma dada substância
é determinada através da diferença entre a área da amostra subtraída pela área do
branco (Net ASC), medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da
substância antioxidante no decorrer do tempo (ALVES et al., 2010).
O método do ABTS (2,2’-azino-bis (3-etibenzotiazolin) 6-ácido sulfônico)
baseia-se na capacidade das moléculas antioxidantes em reduzir o radical ABTS. A
adição do ABTS com persulfato de potássio em um meio contendo antioxidantes
permite avaliar, por meio do grau da descoloração a capacidade antioxidante. Ele é
solúvel em ambos os solventes aquosos e orgânicos e podem determinar tanto
antioxidantes hidrofílicos quanto lipofílicos (VASCONCELOS et al., 2007).
Um dos métodos mais utilizados para verificar a atividade antioxidante é a
atividade sequestradora do radical DPPH (dicloreto de 2,2’-azobis (2-
amidinopropano), no qual ocorre a doação de um elétron para o radical DPPH
estabilizando-o e por isso este passa de uma coloração violeta para amarelo, cuja
alteração de cor pode se monitorada espectrofotometricamente a 517nm. Muitos
antioxidantes que reagem rápido com radicais peroxila podem reagir lentamente ou
pode ser inerte ao DPPH, devido inacessibilidade estérica (PRIOR; WU; SCHAICH,
2005).
No método de quelação de metais utiliza-se a fenantrolina ou ferrozina como
reagente cromogênico, o que torna a solução alaranjada de acordo com a
quantidade de ferro disponível. Portanto, quanto menor a quelação de íons pela
amostra maior o número de íons disponíveis para reação com ferrozina e maior será
a absorbância (CARVALHO-SILVA et al., 2012).
Predominantemente, os métodos utilizados para avaliar a capacidade
antioxidante visam determinar a habilidade que os antioxidantes têm em sequestrar
os radicais livres gerados no meio da reação; e avaliar a eficiência dos antioxidantes
em inibir a peroxidação lipídica (SILVA et al., 2011).
49
3.4 Defesas antioxidantes
Antioxidantes são substâncias ou moléculas capazes de inibir a oxidação de
outras moléculas, ou seja, são capazes de doar elétrons para o radical livre
inativando-o, tornando ele um composto estável, com intuito de prevenir a sua
superprodução, o que ocasionaria danos oxidativos (LUZ et al., 2011).
A defesa antioxidante tem por finalidade impedir e reduzir os danos
provocados pela ação dos radicais livres e espécies reativas. Esse sistema de
defesa é classificado em enzimático e não enzimático. Os sistemas enzimáticos
consistem de várias enzimas presentes no sistema metabólico e de detoxificação de
xenobióticos, e os sistemas não enzimáticos consistem de substâncias antioxidantes
que têm origem endógena, como por exemplo, a glutationa ou dietética, como a
ingestão de flavonoides, ácido ascórbico, carotenoides, tocoferol, etc (CHORILLI;
LEONARDI; SALGADO, 2007; BARBOSA et al., 2010).
O organismo é protegido por moléculas com atividade antioxidante de fontes
endógenas ou exógenas, obtidas pela alimentação ou suplementação. Algumas
moléculas como: tocoferóis, carotenoides, flavonoides, entre outros, possuem a
função de evitar o ataque de espécies reativas oxigênio e nitrogênio ou regenerar os
prejuízos causados no sistema biológico (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;
CATANIA; BARROS; FERREIRA, 2009).
As defesas antioxidantes enzimáticas compreendem as enzimas superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), NADPH-quinona oxidoredutase, glutationa
peroxidase (GPx), e enzimas de reparo (VASCONCELOS et al., 2007, BIANCHI;
ANTUNES, 1999). Desta forma, os agentes antioxidantes enzimáticos, removem
cataliticamente radicais e espécies reativas, protegendo as células e os tecidos do
estresse oxidativo (BIANCHI; ANTUNES, 1999; BERRA; MENCK; DI MASCIO,
2006).
O sistema de defesa enzimático desempenha as seguintes funções: a SOD
catalisa a dismutação do ânion superóxido (O2•-) à peróxido de hidrogênio (H2O2); a
CAT atua na decomposição de H2O2 a O2 e água (H2O) e a GPx, catalisa a redução
de peróxidos em geral, com utilização de glutationa reduzida como co-fator
(VASCONCELOS et al., 2007).
50
Os antioxidantes possuem diferentes mecanismos de ação, sendo os
principais: o impedimento da formação de radicais livres; interceptação de radicais
livres gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas; reparo das lesões
causadas pelas espécies reativas e o aumento da síntese de enzimas antioxidantes
(BIANCHI; ANTUNES, 1999).
A principal função dos antioxidantes é interagir com os radicais livres antes
que esses reajam com as moléculas biológicas, evitando as reações em cadeia.
Assim, os danos causados pelas espécies reativas podem ser reduzidos de acordo
com a atividade das substâncias endógenas e exógenas (PEREIRA; VIEIRA; LIMA,
2011).
A capacidade dos nutrientes antioxidantes em sequestrar radicais livres e
quelar metais têm sido associadas à inibição do excesso na produção de EROS. A
inibição de EROS está relacionada ao impacto benéfico à saúde humana por meio
de modulações de patogênese em diversas doenças tais como: aterosclerose,
hipertensão, doenças cardiovasculares, isquemia, diabetes mellitus, câncer e
doenças neurodegenerativas (SEIFRIED et al., 2007).
Muitos estudos têm mostrado que as frutas são ricas em nutrientes e
compostos antioxidantes como: os carboidratos, os minerais, a vitamina C, os
carotenoides, as substâncias fenólicas, dentre outras, sendo que estes constituintes
se concentram principalmente nas cascas e nas sementes (SOUSA; VIEIRA; LIMA,
2011; VIEIRA; SOUSA; MANCINI-FILHO, 2011).
Os principais antioxidantes dietéticos são algumas vitaminas, compostos
fenólicos e carotenoides. Os compostos fenólicos constituem uma importante classe
de fitoquímicos alimentares, cuja estrutura química contém pelo menos um anel
aromático no qual está ligado uma ou mais hidroxilas. Dependendo do número e da
posição das hidroxilas na molécula, sua ação antioxidante pode variar (KARAKAYA,
2004; CATALAN-BARRAJON et al., 2010).
Dentro do grupo de compostos fenólicos, os mais estudados são os
flavonoides. Eles são formados de dois aneis aromáticos com pontes de três
carbonos condensadas num oxigênio formando um anel intermediário, e são
divididos em diferentes classes: flavonóis, flavanonas, catequinas e antocianidinas
(CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007).
Quimicamente os flavonoides são doadores de elétrons. Na sua estrutura
química tem diversas hidroxilas que possuem ação antioxidante por reagirem e
51
inativarem ânion superóxido, oxigênio singlete, radicais peróxido e estabilizar
radicais livres por meio de hidrogenação ou complexação com espécies oxidantes.
Eles atuam também na inibição do ciclo celular e na indução da apoptose
(MACHADO et al., 2008).
A atividade antioxidante dos flavonoides depende da estrutura e pode ser
determinada por alguns fatores entre os quais: a reatividade como agente doador de
hidrogênios e elétrons; a reatividade perante outros antioxidantes; a estabilidade do
radical flavanoil formado e a capacidade de quelar metais de transição e interação
com as membranas. Os flavonoides são capazes de sequestrar os radicais, muitas
vezes até sendo mais efetivos que outros antioxidantes como, por exemplo, as
vitaminas C e E (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).
Os carotenoides são corantes naturais, cuja estrutura química apresenta
diversas insaturações, sendo que a ação antioxidante é proporcional ao número de
ligações duplas conjugadas, presentes nas moléculas (RAO; RAO, 2007). Os
carotenoides atuam na remoção do oxigênio singlete e de radicais peroxila, sendo o
beta-caroteno, o licopeno, a luteína, a beta-criptoxantina, a zeaxantina e a
astaxantina as substâncias mais citadas na literatura por sua ação antioxidante
(MÜLLER; FRÖHLICH; BÖHM, 2011).
A vitamina C também conhecida como ácido ascórbico possui diferentes
funções no organismo: cofator para diferentes enzimas, ação antioxidante e
participação no metabolismo iônico de minerais (CARDOSO; COZZOLINO, 2009).
Ela proporciona proteção contra a oxidação descontrolada no meio aquoso das
células, em virtude do seu alto poder redutor (COUTO; CANNIATTI-BRAZACA,
2010).
O ácido ascórbico é considerado um dos mais importantes antioxidantes
hidrossolúveis no organismo, sendo capaz de eliminar diversas espécies de radicais
livres e reduzir radicais tocoferóis novamente a sua forma ativa nas membranas
celulares, mantendo a sua integridade em células do organismo. Alguns estudos
mostram que essa vitamina pode prevenir mutações causadas por estresse oxidativo
(OLIVEIRA et al., 2011).
A vitamina E, cuja forma mais ativa é o α-tocoferol, pode ser encontrada em
lipoproteínas e em membranas, e sua ação antioxidante deve-se ao bloqueio da
lipoperoxidação por meio do sequestro do radical peroxila (SOUSA et al., 2007). O
radical peroxila oxida a vitamina E gerando o radical tocoferoxila (radical estável), e
52
que posteriormente é regenerado à vitamina E pela ação do ácido ascórbico, além
da glutationa e ácido úrico, que também são agentes de regeneração presentes no
plasma (JORDÃO JUNIOR et al., 1998).
A ação das substâncias antioxidantes, seja de fonte endógena ou exógena,
ocorre por meio da minimização ou até da remoção das substâncias oxidantes cuja
ação ocorre em algum dos três estágios do processo de oxidação: iniciação,
propagação ou término (CARDOSO; COZZOLINO, 2009).
Uma estratégia para a redução do estresse oxidativo e dos seus
consequentes danos à saúde, é a utilização de plantas frescas e/ou secas, bem
como de produtos alimentícios, cosméticos e fitoterápicos preparados à partir de
plantas com ação antioxidante (WAN-IBRAHIM; SIDIK; KUPPUSUAMY, 2010).
A descoberta dos efeitos deletérios que os radicais livres causam sobre as
células e sua possível relação com algumas doenças tanto como causador quanto
agravante, induzem a pesquisa de novas substâncias que possam minimizar ou até
mesmo prevenir os danos oxidativos às células (ALVES et al., 2010).
Muitas pesquisas estão voltadas para encontrar produtos naturais com
atividade antioxidante, em virtude dos possíveis problemas que os antioxidantes
sintéticos podem causar, os quais podem ser substituídos pelos naturais ou serem
associados (SOUSA et al., 2007).
3.5 Atividade citotóxica
A palavra câncer refere-se ao termo neoplasia, isto é, tumores malignos,
caracterizados não somente pelo crescimento descontrolado de células
transformadas, mas pela capacidade de se diferenciarem e invadirem tecidos e
órgãos, vizinhos ou distantes. Esta capacidade invasiva é denominada de metástase
(ALMEIDA et al., 2005).
O desenvolvimento do câncer é um processo complexo de vários estágios, e
que normalmente está relacionado a alterações genéticas, as quais podem ser
desencadeadas por múltiplos fatores, classificados em genéticos e ambientais. A
célula tumoral pode ser decorrente de uma mutação direta e consequente ativação
de oncogenes, ou inativação de genes supressores de tumor, o que resulta em
53
proliferação descontrolada, e deflagração do câncer (DORAI; AGGARWAL, 2004;
BYRNE et al., 2006; BENSON; LIAU, 2008).
Evidências sugerem que, para ocorrer a proliferação descontrolada das
células tumorais, além da alteração no DNA, ocorre significativa alteração no
metabolismo energético das células neoplásicas e consequente aumento na geração
de espécies reativas de oxigênio (LÓPEZ-LÁZARO, 2010).
A hereditariedade é um importante fator para o desenvolvimento do câncer,
mas, a maioria dos casos está relacionada a fatores externos associados aos
hábitos de vida, que podem induzir mutações genéticas tais como: contaminação por
metais, radiações, excesso de produção de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio, inflamações crônicas e xenobióticos (medicamentos, tabaco, álcool,
pesticidas, etc.), os quais podem ser determinantes até mesmo, no tipo de tumor
desenvolvido (DORAI; AGGARWAL, 2004; ALMEIDA et al., 2005; BENSON; LIAU,
2008).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam para a ocorrência
de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele
não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. É esperado
um total de 257.870 casos novos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo
feminino sendo que as regiões Sul e Sudeste, de maneira geral, apresentam as
maiores taxas (INCA, 2012).
Os três principais tipos de tratamento para o câncer são: cirurgia, radioterapia
e quimioterapia. Na prática clínica, os agentes antineoplásicos são de extrema
importância, classificados de acordo com os grupamentos químicos e a ação sobre o
ciclo celular, sendo classificados em: ciclo-celular específicos e ciclo-celular não
específicos, denominados ainda, de agentes alquilantes (ALMEIDA et al., 2005).
Os quimioterápicos atuam de forma não específica, isto é, destroem ou
inibem o crescimento tanto de células neoplásicas como células normais,
especialmente as de crescimento rápido, como as gastrintestinais, capilares e as do
sistema hematopoiético e imunológico. Tal evento, explica boa parte dos efeitos
colaterais da quimioterapia, tais como: náuseas, vômitos, diarreia ou constipação,
perda de apetite e peso, alopecia, suscetibilidade às infecções, dor, febre,
depressão, e outros efeitos adversos (ALMEIDA et al., 2005; COOLBRANDT et al.,
2011).
54
Dentre alguns produtos naturais citotóxicos utilizados têm-se os alcaloides
vegetais como os alcaloides da vinca (vimblastina e vincristina), que inibem o fuso
mitótico, ligando-se às proteínas microtubulares, interrompendo a divisão celular na
metáfase. O taxol (Paclitaxel®) o qual inibe o fuso mitótico, pois promove a
estabilização dos microtúbulos, protegendo-os da despolimerização, o que resulta
no bloqueio da multiplicação celular e na perda da viabilidade celular. As
podofilotoxinas etoposida e teniposida, derivados semissintéticos da podofilotoxina
extraída da raiz Polophyllum peltatum, que bloqueiam as células nas fases S e G2 e
inibem a enzima topoisomerase II (ALMEIDA et al., 2005; COOLBRANDT et al.,
2011).
Os antioxidantes dietéticos podem ser benéficos na prevenção da neoplasia
em virtude do seu papel em função da resposta imune, pois as células fagocitárias
produzem radicais livres como defesa ao organismo contra a infecção gerada e a
ingestão adequada desses antioxidantes é relevante para prevenir danos causados
pelos oxidantes das próprias células imunes (MACHADO et al., 2008).
55
56
4 METODOLOGIA
4.1 Material vegetal
Os frutos de R. imperialis (V.C.Filho 012) e R. rosaefolius (V.C.Filho 035)
foram coletados na comunidade de São Sebastião no município de Treze de Maio -
SC; os frutos de G. achachairu (HBR 52637) no município de Camboriú – SC; e os
frutos de P. glomerata (V.C.Filho 52), D. inconstans (V.C.Filho 55), S. sessiliflorum
(V.C.Filho 53) e S. quitoense (V.C.Filho 54) foram obtidos na Epagri do município de
Itajaí – SC. As espécies foram identificadas pelo professor Dr. Oscar B. Iza da
Univali e uma exsicata foi registrada e depositada no herbário Barbosa Rodrigues de
Itajaí – SC.
No quadro 1 está reprentado a identificação das plantas em relação ao nome
científico e popular, além da parte da planta utilizada e sigla adotada para descrição
no texto e apresentação de gráficos e tabelas
57
Quadro 1 - Identificação das plantas em relação ao nome científico, nome popular, extrato metanólico das suas diferentes partes e sua sigla.
Nome Científico Nome popular Extrato metanólico Sigla
Garcinia achachairu
Garcinia achachairu
Garcinia achachairu
Garcinia achachairu
Garcinia Sementes
Cascas das sementes
Polpa
Cascas dos frutos
SG
CSG
PG
CG
Garcinia
Garcinia
Garcinia
Solanum quitoense
Solanum quitoense
Naranjila
Naranjila
Polpa
Cascas dos frutos
PN
CN
Rubus rosaefolius amora-vermelha Frutos RR
Diospyros inconstans
Diospyros inconstans
Diospyros inconstans
Jacu
Jacu
Jacu
Cascas dos frutos
Polpa
Sementes
CJ
PJ
SJ
Solanum sessiliflorun
Solanum sessiliflorun
Maná
Maná
Cascas dos frutos
Polpa
CM
PM
Rubus imperialis amora-branca Frutos RI
Plinia glomerata
Plinia glomerata
cabeludinha
cabeludinha
Cascas dos frutos
Polpa + sementes
CC
PSC
Derivados da fração Acetato de Etila obtida a partir do extrato metanólico das
sementes da Garcinia
Fração 1 (15-60)
Fração 2 (61- 120)
Fração 3 (121-170)
Fração 4 (171-176)
Garcinia Sementes da Garcinia
Sementes da Garcinia
Sementes da Garcinia
Sementes da Garcinia
Fr. 1
Garcinia Fr. 2
Garcinia Fr. 3
Garcinia Fr. 4
Subfração 3 (5 - 67)
Subfração 4 (76-88)
Garcinia
Garcinia
Sementes da Garcinia
Sementes da Garcinia
Sub-Fr. 3
Sub-Fr. 4
4.2 Preparação de extratos
O material moído e seco (frutos) foi macerado com metanol durante sete dias,
com troca do solvente no quarto dia a fim de renovar o líquido extrator e esgotar a
58
droga vegetal. Após término do processo de maceração, o solvente foi evaporado à
pressão reduzida em rotaevaporador à 50°C e acondicionado em recipiente
previamente tarado em dessecador até peso constante para determinação do
rendimento total do extrato (Quadro 2). Os extratos obtidos foram denominados de
“Extrato Metanólico Bruto” (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998).
Quadro 2: Rendimento dos extratos metanólicos brutos expresso em gramas e em percentual em relação a massa de frutos utilizados para preparação dos extratos.
Nome Científico Extrato
metanólico
Massa dos
frutos (g)
Massa do
extrato MeOH
(g)
Rendimento
%
Garcinia achachairu Semente 38,57 5,17 11
Garcinia achachairu Casca da
semente 49,40 10,56 9
Garcinia achachairu Polpa 345,0 37,18 13
Garcinia achachairu Casca do fruto 489,0 43,77 21
Solanum quitoense Polpa 304,70 11,91 7
Solanum quitoense Casca do fruto 142,35 3,83 5
Rubus rosaefolius Fruto 70,53 4,79 9
Diospyros inconstans Casca do fruto 82,90 7,13 5
Diospyros inconstans Polpa 82,90 4,51 3
Diospyros inconstans Semente 94,94 4,72 3
Solanum sessiliflorun Casca do fruto 166,78 4,71 4
Solanum sessiliflorun Polpa 144,84 4,62 3
Rubus imperialis Fruto 67,0 3,89 6
Plinia glomerata Casca do fruto 406,0 36,12 9
Plinia glomerata Polpa +
semente 366,0 24,13 7
Paralelamente, uma alíquota do extrato metanólico (100 mg) foi solubilizado
com cerca de 2 ml de clorofórmio, filtrado e evaporado o solvente. Um solução de 2
59
mg/ml em clorofórmio foi preparada e injetada diretamente no cromatógrafo gasoso.
O mesmo procedimento foi realizado para o extrato metanólico analisado via CLAE.
No entanto, o solvente utilizado foi o metanol e a solução injetada na concentração
de 0,31 mg/ml.
Considerando a fácil coleta e rendimento, o extrato bruto das sementes de G.
achachairu foram particionados com diferentes solventes de polaridade crescente,
como diclorometano, acetato de etila e butanol para a obtenção das respectivas
frações semi-purificadas e possibilitar um estudo fitoquímico mais aprofundado
(HOSTETTMANN, 1997; NIERO et al., 2003).
4.2.1 Purificação da fração de acetato de etila de G. achachairu
Considerando que o extrato metanólico das sementes mostrou melhor perfil
cromatográfico, esta foi selecionada para procedimentos de purificação por meio de
cromatografia em coluna.
Neste sentido, 700 mg foi submetida à usando cromatografia de coluna (CC)
em sílica gel (85,98g) em uma coluna de dimensão 3,5x50 cm empacotada com
CHCl3 100% e eluída com CHCl3:MeOH aumentando-se gradativamente a
polaridade. Foram coletadas 176 frações de aproximadamente 20 ml cada. As
frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de cromatografia em
camada delgada (CCD) em quatro frações: fração 1 (15-60); fração 2 (61-120);
fração 3 (121-170) e fração 4 (171-176).
A fração 4 (171-176; 173,67 mg) foi recromatografada utilizando sistema de
cromatografia flash, sílica gel (10,242 g) de granulometria 70-230 mesh (Φ = 0,063-
0,20 nm), empacotada com 95:05 CHCl3:MeOH e eluída com o mesmo sistema de
solventes. Rendendo 90 novas subfrações, que foram reunidas de acordo com a
semelhança analisada por CCD. A subfração 4 (76-88; 34,9 mg) eluída CHCl3:MeOH
80:20% apresentou-se como um sólido amorfo e coloração marrom e está em
processo de identificação.
A fração 3 (121-170; 179,3 mg) foi recromatografada em CC, utilizando sílica
gel (8,47g), empacotada com 100% CHCl3 e eluída com CHCl3 e MeOH aumentando
gradativamente a polaridade, rendendo 77 subfrações, que foram reunidas de
60
acordo com perfil semelhante, através de CCD. A subfração 3 (5-67; 49,3 mg) eluída
CHCl3:MeOH 95:05% apresentou-se como um sólido amorfo e coloração marrom e
está em processo identificação. Um fluxograma das operações realizadas encontra-
se na Figura 9.
Figura 9: Fluxograma das operações realizadas para purificação da fração acetato
de etila das sementes de Garcinia achachairu.
4.2.2 Caracterização fitoquímica
Alíquotas dos extratos metanólicos e das frações foram analisadas por meio
de cromatografia em camada delgada (CCD), na tentativa de estabelecer o perfil
fitoquímico dos frutos. As amostras foram eluídas com diferentes sistemas de
solventes com aumento gradual de polaridade, para melhor resolução e perfil
cromatográfico. As diferentes classes de compostos foram reveladas com reagentes
61
específicos como: anisaldeído sulfúrico para terpenos e esteroides; cloreto férrico
para fenólicos; hidróxido de potássio para cumarinas; dragendorff para alcaloides;
entre outros (UGAZ, 1994).
4.2.3 Doseamento de polifenóis totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão. O
reagente de Folin-Ciocalteau é uma solução de íons complexos poliméricos
formados a partir de heteropoliácidos fosfomolibdicos e fosfotúngsticos. Esse
reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um complexo azul que pode ser
monitorado espectrofotometricamente a 750 nm (SINGLETON; ROSSI JR, 1965;
SOUSA et al., 2007).
A curva de calibração foi construída utilizando como padrão o ácido gálico
(Vetec®) 99% de pureza. As leituras das absorbâncias foram realizadas em
comprimento de onda de 750 nm em espectrofômetro de absorção UV-Visível marca
Spectrophometer SP 2000 UV (Bel Photonics). Para determinação do teor de
polifenóis nas amostras, os extratos foram dissolvidos em metanol e diluídos em
água destilada. O cálculo foi realizado por meio da equação da reta obtida pela
curva de calibração e o resultado expresso em equivalente de ácido gálico/mg de
extrato.
4.2.4 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada em massa.
A análise por cromatografia gasosa acoplada ao massa foi realizada
utilizando um cromatógrafo gasoso Shimadzu (Modelo QP – 2010s série) equipado
com injetor AOC – 20i e uma coluna de sílica fundida – TRX-1 (30 m x 0,25 mm),
espessura 0,1 µm. A temperatura do injetor foi de 300°C e a do forno iniciou a 80°C
permanecendo por 1 minuto em seguida a velocidade de aquecimento foi a uma
taxa de 25ºC/min até 210ºC. Logo a velocidade foi novamente alterada de 15ºC/min
62
até 290ºC, finalizando numa taxa de 12ºC/min até 310°C permanecendo por 10 min.
Como gás de arraste foi utilizado o hélio (99,999%) a uma taxa constante baixa 0,80
ml/min.
As amostras de G. achachairu e P. glomerata (2 µl) foram injetadas a uma
razão de proporção de 40:1. A linha de transferência MS foi mantida na temperatura
de 250°C acoplada ao detector de massas equipado com um software database
NIST08. A identificação dos compostos foi realizada por comparação dos dados da
biblioteca NIST08.
4.2.5 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE
A análise foi conduzida utilizando um cromatógrafo de alta perfomace
(Waters) equipado com uma bomba 600-F 717 e amostrador automático, seguido
pela linha eliminadora de gás AF e equipado com detector visivel (PDA 2996). A
coluna empregada foi fase reversa C18 (25 cm; 4,6 d.i; 0,5 µm de espessura; Luna,
Phenomenex) a 25°C.
A separação cromatógrafica foi realizada sob fluxo de eluente de 0,9 ml/ min
com gradiente de polaridade, utilizando-se metanol: acetonitrila: água (acidificada
com H3PO4; pH 3,57), na proporção inicial de 8:2:90, passando para 88:2:10 em 25
minutos. A varredura do espectro UV-Vis foi realizada de 200-400 nm (detecção de
256 nm). Os solventes utilizados eram de grau HPLC, todos foram filtrados (0,2 µm,
Scheicher e Shuell, Maidstone, Kent, UK) e desgaseificados através do ultrassom
antes do uso. As amostras foram injetadas (0,31mg/ml) automaticamente em
volumes de 20µl e comparado com quercitrina (0,31mg/ml), para a P. Glomerata e
gutiferona A para G. achachairu.
63
4.3 Análise da atividade antioxidante
4.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH•
O método DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) tem como base a redução da
absorbância na região do visível (comprimento de onda de 517 nm) do radical
DPPH• por antioxidantes (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
Para a avaliação da atividade antioxidante, foram preparadas soluções
metanólicas de cada extrato na concentração de 1 mg/ml, as quais foram diluídas
sequencialmente. Para a semente da garcínia, polpa + semente da cabeludinha e
casca da cabeludinha as concentrações variaram de 3,125 à 50 µg/ml. Para os
demais extratos as concentrações variaram de 7,8 à 250 µg/ml.
Em seguida foi adicionado 1 ml da solução de DPPH• 0,004%, que após
homogeneização foram incubadas protegidas da luz em temperatura ambiente
durante 30 minutos.
Os experimentos foram efetuados em triplicata de triplicata e o percentual do
radical DPPH nas amostras calculado pela seguinte equação:
% de DPPH• = [(A - BA) x 100]/ C,
onde:
A: absorbância das amostras (com DPPH•)
BA: absorbância do branco das amostras (sem DPPH•)
C: absorbância do controle negativo (100 % de DPPH•)
A percentagem de atividade antioxidante corresponde à quantidade de DDPH•
consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária
para decrescer a concentração inicial de DPPH• em 50% foi denominada de
concentração efetiva (CE50). Quanto maior o consumo de DPPH• por uma amostra,
menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante.
A atividade das amostras foi comparada com as vitaminas C e E,
determinadas por meio da obtenção da curva padrão de trolox (análogo à vitamina
E) e da vitamina C, analisadas nas mesmas condições.
64
4.3.2 Atividade sequestradora do radical ABTS•
A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pela atividade redutora
frente ao radical ABTS•, o cátion do ácido 2,2'-azinobis-(3-etil-benzotiazolino-6-
sulfônico) foi obtido pela reação entre ABTS (7 mM) com persulfato de potássio (2,45
mM) após um período de 12 horas à temperatura ambiente, no escuro e sob
agitação, segundo metodologia descrita por Re e colaboradores (2003). A redução
do radical ABTS• por substâncias antioxidantes doadoras de hidrogênio pode ser
monitorada espectrofotometricamente pelo desaparecimento da cor verde em 734
nm.
O radical formado foi diluído com etanol até absorbância de 0,7 ± 0,2 à 734
nm. Em 1 ml das diluições de cada extrato foi adicionado 3 ml do radical ABTS•, e
após 6 min de reação no escuro foi efetuada a leitura. A atividade das amostras foi
comparada com a vitamina C e com a vitamina E, analisadas nas mesmas
condições.
4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante pelo método ORAC
Esse método consiste em avaliar a capacidade de absorção do radical
oxigênio (ORAC) por uma substância antioxidante, gerado no meio de reação após a
adição de um agente azoiniciador como o AAPH (dihidrocloreto de 2,2'-azobis(2-
amidinopropano) que oxida uma proteína fluorescente, e o decaimento da
fluorescência indica a oxidação desta em função do tempo (CAO; ALESSIO;
CUTLER, 1993).
O método do ORAC baseia-se em um mecanismo de transferência de átomos
de hidrogênio que mede a capacidade de captura de um radical específico, o peroxil,
gerado a partir de uma molécula orgânica de AAPH (ZULUETA; ESTEVE; FRÍGOLA,
2009).
O experimento foi realizado em placa de 96 poços. Foi adicionado 50 µl da
solução de fluoresceína (80 nM), 50 µl das amostras testadas ou 50 µl do tampão
fosfato sódio 75 mM (pH 7,4) nos poços controles (branco), os quais foram
65
incubados à 37 °C por 15 minutos. Após, foi adicionado 100 µl de APPH (200 mM).
A atividade antioxidante foi monitorada cineticamente a cada 2 minutos durante 80
minutos após a adição do AAPH, em leitor de microplaca marca TECAN-GENios
com filtro de excitação 485 nm e de emissão 528 nm. A atividade antioxidante das
substâncias está expressa como área sob a curva de fluorescência integrada ao
longo do tempo (ti: tempo inicial e tf: tempo final) usando o software GraphPad
Prisma®. O procedimento foi realizado em triplicata para cada amostra em cada
concentração. Os resultados foram expressos em unidades de ORAC e em
milimoles equivalentes de trolox/g.ml-1 de extrato (mM TE/g.ml-1 de extrato). Assim,
os maiores valores de TE significam maior capacidade antioxidante da amostra
(POBLETE et al., 2009).
ORAC= ___[ASC – ASCº]____ . f (referência)
[ASCreferência – ASC°]
Onde:
ASC = Área sob a curva na presença das amostras testadas, integradas entre o
tempo zero e 80 minutos;
ASCº = Área sob a curva do controle (branco).
ASCreferência= Área sob a curva para o composto de referência (trolox – 25 µM).
f = fator de diluição, igual à razão entre o volume total de AAPH+fluoresceína e o
volume da amostra;
(referência) = concentração do composto referência (trolox) em mM
4.3.4 Avaliação da atividade antioxidante pelo método de quelação de metais.
Esse método tem por finalidade medir a atividade antioxidante baseada na
capacidade de quelação do íon ferro. O ferro é o elemento mais importante na pró-
oxidação lipídica, entre os metais de transição, sendo de alta reatividade. A
fenantrolina pode quantitativamente formar complexos com o Fe2+. Na presença de
agentes quelantes, a competição dos quelantes com a fenantrolina pelo ferro, resulta
no descrécimo da coloração. Quando ocorrem baixas absorbâncias indicam alta
66
atividade quelante de metal (DECKER; WELCH, 1990; TANG et al., 2002; GULÇIN,
2006).
Em cada tubo contendo 50 µl de diferentes concentrações dos extratos
metanólicos (100, 75, 50, 25 10 µl) ou controle negativo (sem tratamento) foi
adicionado 50 µl da solução de sulfato ferroso 2 mM, e o volume completado com
água destilada até o volume final de 2 ml, os quais foram agitados e incubados por
10 minutos em local escuro. Após essa etapa foi acrescentado 200 µl fenantrolina
em cada tubo, agitado e incubado por 10 min., em seguida foi realizado a leitura da
absorbância a 510 nm. Como controle positivo foi utilizado EDTA numa
concentração de 10 mM.
4.4 Cultura celular
Para avaliação da atividade citotóxica in vitro foram utilizadas células tumorais
B16F10 (melanoma murino), obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro.
As células foram mantidas em garrafas plásticas de cultura, contendo meio
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagles Medium), suplementado com 10% de soro fetal
bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 50 µg/ml de anfotericina
B, 10 mM HEPES, pH 7.4, em estufa umidificada a 37 oC e com 5% CO2. Antes da
realização dos experimentos, o número de células viáveis foi avaliado pelo método
de Azul de Trypan (FRESHNEY, 1987) e a contagem realizada em câmara de
Neubauer.
4.4.1 Tratamento Celular
Os extratos foram dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido) e utilizados
imediatamente após a preparação das suspensões, os quais foram diluídos em meio
de cultura a fim de obter as concentrações desejadas nos experimentos. As células
(3 x 104) foram incubadas com os extratos em placas de 96 poços em diferentes
tempos. Foram utilizados controles de células sem tratamento e com o diluente
67
DMSO nas mesmas proporções utilizadas para dissolver os extratos. A
concentração máxima de DMSO adicionada às células foi de 0,1%.
4.4.2 Ensaio de Viabilidade Celular
A viabilidade celular foi analisada pelo método MTT [3-(4,5-Dimetilthiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazólio brometo] (MOSMANN, 1983). O MTT é um sal de tetrazólio de
cor amarela, que é reduzido a formazan, de cor violeta, pelas desidrogenases
mitocondriais das células viáveis. Decorrido o tempo de incubação, o meio de cultura
foi retirado e acrescentado um novo meio contendo o MTT (0,5mg/ml) seguido de
incubação por 2 horas, a 37°C. Este meio foi retirado e o precipitado formazan
dissolvido com DMSO e a leitura feita em leitor de microplacas Spectrostarnano
(BWG-LABTECH) a 540 nm. A densidade óptica obtida do grupo controle, células
sem tratamento, foi considerado como 100% de células viáveis, a fim de estabelecer
as curvas de concentração vs resposta .
4.5 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Para
comparação das médias aritméticas foi utilizado a análise de variância (ANOVA) e o
teste de Tuhey, usando o software Prisma 6,0 (GrahPad Prisma) e o programa
Instat®. Adotou-se o nível de significância de 5% de probabilidade (p<0,05).
68
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise Fitoquímica
5.1.1 Análise fitoquímica preliminar por cromatografia em camada delgada
A cromatografia em camada delgada - CCD é uma técnica que embora
simples, é muito utilizada em screening fitoquímicos na tentativa de detectar
diferentes classes de substâncias em extratos vegetais. No entanto, quando se
trabalha com extratos, oriundos dos frutos, observa-se um certo grau de dificuldade
na caracterização e no isolamento das substâncias bioativas, em função do alto teor
de açúcares.
As figuras 10A e 10B mostram o perfil fitoquímico das diferentes partes de G.
achachairu utilizando diferentes eluentes e reveladas com anisaldeído sulfúrico e
cloreto férrico, respectivamente. Como pode ser observado, apenas o extrato das
sementes quando eluído na proporção 65:35 (hexano:acetona) e revelado com
anisaldeído apresentou manchas características de compostos mais apolares
semelhantes a esteróis e terpenoides. Por outro lado, os demais extratos mostraram
substâncias de caráter mais polares com retenção total das manchas no ponto de
origem da cromatoplaca. Considerando que o extrato metanólico das sementes
apresentou melhor perfil cromatográfico, foi analisada em comparação a alguns
compostos previamente isolados de outras espécies. Nesta análise, é possível
observar apenas a presença de gutiferona A, quando revelada com cloreto férrico
(Figura 10B).
69
Figura 10 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes partes dos frutos de garcinia (G. achachairu) comparados com diferentes padrões comumente encontrados em plantas e isolados em outras partes de G. achachairu.
GC (casca dos frutos da garcinia); GCS (casca das sementes da garcinia); GS (sementes da garcinia); GP (polpa da garcinia); GA (gutiferona A); V (volkensiflavona) Eluentes - A: 65:35 hexano/acetona; B: 80:20 clorofórmio/metanol. Reveladores: 10A: Anisaldeído sulfúrico; 10B: Cloreto férrico.
Marques e colaboradores (2012), analisaram o perfil fitoquímico do extrato
metanólico das sementes de G. achachairu e detectaram a presença de doze
compostos, dos quais sete foram identificados, sendo o composto majoritário a
Gutiferona A (Figura 11).
Um estudo de Okoko (2009), mostrou que o extrato metanólico das sementes
de Garcinia kola após procedimentos de cromatografia em coluna rendeu cinco
frações. Na fração ME4 observou-se a presença de quatro compostos: os
biflavonoides GB1 e GB2, o ácido garcinal e o ácido garcinoico, aos quais foi
atribuída a atividade antioxidante encontrada no extrato das sementes G. kola. No
entanto, em nosso trabalho não foi evidenciado estes compostos, quando analisados
por CCD.
70
Figura 11 – Estrutura química da Gutiferona A isolada do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.
Fonte: Dal Molin e colaboradores (2012)
Em relação aos frutos da maná-cubiu (S. sessiliflorum) e amora-vermelha (R.
rosaefolius) quando avaliados por CCD, foi observado que todas as amostras dos
extratos, ficaram retidos na origem da cromatoplaca nos sistemas de eluentes
utilizados, sugerindo a presença de compostos polares com perfil característico de
carboidratos quando revelados com anisaldeído sulfúrico (Figura 12).
Figura 12 – Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes frutos com dois sistemas distintos de eluentes. A: Sistema apolar. B: Sistema polar.
PM (polpa da Maná-cubiu - Solanum sessiliflorun); CM (cascas da Maná-cubiu - Solanum sessiliflorun); RR (frutos amoara- vermelha - Rubus rosafolius). Eluentes - A: 70:30 hexano/acetona; B: 80:20 clorofórmio/ metanol. Reveladore anisaldeído sulfúrico.
71
Alguns extratos das polpas das espécies estudadas foram submetidos à
cromatografia em camada delgada utilizando-se eluente e reagente específicos para
açúcares, além dos padrões de sacarose, maltose, frutose e glicose. A figura 13A
mostra que os extratos das cascas e da polpa + sementes da cabeludinha (P.
glomerata) contêm sacarose e frutose. Os extratos dos frutos da amora-branca (R.
imperialis) e vermelha (R. rosafolius) apresentam apenas frutose e glicose (Figura
13B).
Embora estudos anteriores realizados em nossos laboratórios com as partes
aéreas de R. imperialis e R. rosaefolius, tenham demonstrado diferentes classes de
compostos como triterpenóides, esteróides e derivados do ácido elágico, nos
cromatogramas dos frutos destas espécies não foram detectados (NIERO et al,
1999, KANEGUSUKU et al., 2007; NIERO; CECHINEL-FILHO, 2008).
Figura 13 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos das cascas e da polpa + semente da cabeludinha (P. glomerata) (A) e dos extratos metanólicos dos frutos de amora vermelha (R. rosafolius) e amora-branca (R. imperialis) (B) com diferentes padrões de açúcares.
M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); CC (casca da cabeludinha – P. glomerata); PSC (polpa + semente da cabeludinha – P. glomerata); RR (amora-vermelha – R. rosafolius) e RI (amora-branca – R. imperialis). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético: água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.
Da mesma forma, na cromatoplaca contendo o extrato da polpa do maná
cubiú (S. sessiliflorum) é possivel observar a presença da maltose, sacarose e
glicose, por outro lado, nas cascas dos frutos apenas a frutose (Figura 14A). Quando
se analisa as CCDs dos extratos da polpa e cascas da naranjila (S. quitoense) é
A B
72
possível observar a presença de maltose, sacarose e glicose, não apresentando
frutose nestas amostras (Figura 14B).
Figura 14 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da polpa e casca do fruto maná cubiú (S. sessiliflorum) (A) e do extrato da polpa e casca da naranjila (S. quitoense) (B) com diferentes padrões de açúcares.
M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); PM (polpa do maná cubiú – S. sessiliflorum); CM (cascas dos frutos do maná cubiú – S. sessiliflorum); CN (cascas dos frutos da naranjila – S. quitoense) e PN (polpa da naranjila – S. quitoense). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético: água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.
A figura 15A apresenta o perfil por CCD dos extratos metanólicos das
sementes, polpa e cascas da jacu (D. inconstans). Nesta cromatoplaca é posssivel
observar a presença de sacarose, glicose e frutose, porém não apresenta maltose.
Já os extratos metanólicos das diferentes partes dos frutos da Garcinia (G.
achachairu) contêm sacarose e frutose (Figura 15 B).
A B
73
Figura 15 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da semente da jacu, polpa da jacu e casca da jacu (D. inconstans) (A) e dos extratos metanólicos das diferentes partes da garcinia (G. achachairu) (B) com diferentes padrões de açúcares.
M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); JS (semente da jacu – D. inconstans); JP (polpa da jacu – D. inconstans); JC (cascas da jacu - D. inconstans) e CG (casca da garcinia – G. achachairu); SG (sementes da garcinia – G. achachairu); PG (polpa da garcinia – G. achachairu); CSG (cascas da semente da garcinia – G. achachairu). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético:água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.
Estudar os frutos destas espécies acarretou algumas dificuldades em virtude
de serem ricas em açúcares (sacarose/glicose/frutose) o que dificulta a investigação
de outros constituintes químicos que posam ter alguma propriedade funcional. Foi
possível observar também que as cascas, as sementes e as frutas inteiras possuem
propriedades funcionais, ao contrário da polpa a qual muitas vezes tem pouca ou
nenhuma propriedade, quando separada de outra parte da fruta, a não ser grande
quantidade de açúcar.
Outro grande desafio foi trabalhar com extrato bruto ao invés de substâncias
isoladas, pois, no momento das análises in vitro, a complexidade da mistura de
inúmeras substâncias (clorofila, açúcares, etc.) dificulta a análise biológica. No
entanto, deve-se salientar que o extrato pode apresentar ação sinérgica, o que não é
possível observar em susbtâncias isoladas, por isso, neste trabalho inicialmente
avaliou-se o perfil fitoquímico dos extratos e a atividade antioxidante pelos métodos
DPPH e ABTS, e somente os extratos com melhores resultados foram avaliados
quanto aos demais métodos de análise biológica e fitoquímica.
As frutas são as principais fontes dietéticas de polifenóis, porém muitos
fatores intrínsecos (cultivo, variedade, estágio de maturação) e extrínsecos
B A
74
(condições climáticas e edáficas) podem interferir tanto na qualidade quanto na
quantidade desses polifenóis. Portanto, uma boa ação antioxidante muitas vezes
depende da estrutura química e da concentração desses fitoquímicos (MELO et al.,
2008).
Para obter uma boa atividade antioxidante de um extrato vegetal é necessária
a máxima extração dos compostos bioativos, sendo que esses apresentam
polaridades diferentes, e por isso a escolha do solvente é determinante. Assim,
preferem-se solventes universais como o metanol, que extraem inúmeras
substâncias, e separação dos compostos por polaridade é feita posteriormente com
extrações sucessivas com solventes de diferentes (DUZZIONO et al., 2010).
Assim, o ideal é isolar e quantificar o maior número de compostos bioativos
presentes, a fim de conhecer melhor a capacidade antioxidante de uma fruta, e
também utilizar vários métodos possíveis para avaliar a sua atividade antioxidante
(DUZZIONO et al., 2010).
5.1.2 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada ao massa
Na tentativa de melhor analisar a composição química dos extratos
metanólicos das sementes e das cascas dos frutos de G. achachairu e polpa +
sementes e as cascas dos frutos de P. glomerata, uma análise por cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massa foi realizada. Neste aspecto, os
extratos metanólicos secos foram solubilizados com clorofórmio a fim de evitar a
extração dos açúcares e permitir um melhor perfil cromatográfico. A figura 16 mostra
o perfil qualitativo de diferentes partes dos frutos das amostras analisadas.
Como pode ser observado, o extrato da polpa + sementes (Figura 16 b) e
das cascas dos frutos (Figura 16 c) de P. glomerata apresentaram perfil
cromatográfico semelhante. Já os extratos das cascas dos frutos (Figura 16 d) e das
sementes (Figura 16 a) de G. achachairu apresentaram um perfil bem diferente. As
sementes apresentaram um melhor perfil cromatográfico tanto em número de
substâncias quanto em concentração, mostrando que as sementes de G. achachairu
são muito mais promissoras sob o ponto de vista fitoquímico, do que as cascas dos
frutos.
75
Figura 16 - Perfil cromatográfico da sobreposição da análise dos diferentes extratos clorofórmicos das sementes (a) e das cascas dos frutos (d) de G. achachairu; polpa + semente (b) e casca dos frutos (c) de P. glomerata.
Tendo em vista que o extrato das sementes de G. achachairu apresentou
melhor perfil cromatográfico, uma nova análise foi realizada (Figura 17).
76
Figura 17 - Perfil cromatográfico do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (2 µg/ml) comparados com a biblioteca de referência.
Este cromatograma mostra aproximadamente nove compostos, os quais
foram identificados por comparação com a biblioteca de referência como:
o-diidroxibenzeno (1), metil éster do ácido palmítico (2), ácido palmítico (3), cis–metil
éster do ácido vacênico (4), 12-metil éster do ácido octacenoico (5), metil éster do
ácido esteárico (6), palmitina (7), oleína (8) e estearina (9). As estruturas estão
demonstradas na figura 18.
77
Figura 18 – Estruturas químicas dos compostos presentes extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu.
Um estudo realizado por Cano-Campos e colaboradores (2011), analisou o
perfil fitoquímico do extrato dos frutos de Randia echinocarpa. A cromatografia
gasosa da fração hexânica mostrou a presença de ácidos graxos e esteróis, sendo
os principais, ácido palmítico, ácido linoleico, campesterol, estigmasterol e β-
sitosterol. Os autores verificaram atividade antimutagênica desta fração hexânica
frente a diversos agentes mutagênicos e atribuíram a atividade biológica aos
componentes presentes, justificando, por exemplo, que o β- sitosterol altera a
permeabilidade da membrana celular impendindo a penetração dos agentes
mutagênicos.
Os mesmos autores sugerem que o consumo de frutas exóticas deveria ser
estimulado, visto que várias destas frutas são ricas em compostos esteroidais,
ácidos graxos, pigmentos e compostos fenólicos que apresentam potencial atividade
biológica, especificamente, atividade antimutagênica a qual está intimamente
relacionada com ação antitumoral, visto que todo tumor inicia-se após a mutação de
78
uma célula normal (CANO-CAMPOS et al., 2011).
Considerando que alguns fitoesteróis apresentam importante papel na
atividade antimutagênica como supracitado, uma análise cromatográfica em
condições de temperatura mais elevada foi realizada na possibilidade de detectar
esta classe de substâncias (Figura 19).
Como pode ser observado, o extrato clorofórmico das sementes de G.
achachairu apresenta β-sitosterol e ɤ-sitosterol identificados nos tempos de retenção
de 12,5 e 13,5 min., respectivamente, além de outros compostos já identificados no
cromatograma sugerindo que a atividade encontrada, pode estar em parte,
relacionada com a presença destas substâncias.
Um estudo realizado por Iyer e Patil (2012), relatou o efeito anti-
hiperlipidêmico e antitumoral do extrato etanólico, da fração clorofórmica e do
fitoesterol (estigmast-5-en-3β-ol) isolado de Salvadora persica L. Os autores
sugerem que dietas ricas em alimentos contendo substâncias com ação
antioxidante, principalmente fitosteróis, podem contribuir para a terapêutica
antitumoral e anti-hiperlipidêmica.
Figura 19 - Identificação dos esteróis do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (temperatura inicial da coluna 180°C).
O óleo dos frutos de Pistacia lentiscus L. mostrou um importante potencial
nutritivo, cujo perfil fitoquímico analisado por cromatografia gasosa, evidenciou a
79
presença de ácidos graxos monoinsaturados, ácidos graxos essenciais (ômega-3) e
fitoesteróis, tais como β-sitosterol e campesterol. Este óleo pode ser utilizado tanto
para fins medicinais como para indústria alimentícia, cuja composição pode ser
comparável a de outros óleos comumentes utilizados e obtidos do amedoim e
girassol (TRABELSI et al., 2012).
Wannes e colaboradores (2010), descrevem sobre a composição química do
pericarpo, sementes e óleo dos frutos inteiros de Myrtus communis var. italica ,
enfatizando sobre a distribuição de ácidos graxos e glicerol lipídeos, sendo os mais
predominantes o ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico e linolênico presentes
em todas as partes analisadas porém em diferentes proporções. Também foi
identificado nos frutos inteiros e nas sementes, ácidos graxos monoinsaturados e
poliinsaturados, e no pericarpo concentrações elevadas de ácidos graxos saturados
(WANNES et al., 2010).
Os estudos citados acima apresentam ácidos graxos e fitoesteróis
semelhantes aos encontrados nos frutos em nosso trabalho, mostrando a
importância destes tanto para fins medicinais quanto para a indústria alimentícia.
Atualmente muitas pesquisas estão direcionadas ao perfil fitoquimico de
plantas medicinais, principalmente dos seus frutos. Em outro trabalho foi
determinada a composição dos lipídeos presentes nas sementes, no pericarpo e nas
frutas inteiras de Coriandrum sativum L. Os principais ácidos graxos identificados
foram o ácido linoleico, palmítico e oleico. Além disso, foram detectados tocoferol e o
tocotrienóis no óleo da fruta inteira, no óleo das sementes e no óleo do pericarpo em
diferentes proporções (SRITI et al., 2010).
Os componentes lipídicos dos frutos, mesmo sendo em quantidades menores
contribuem para o desenvolvimento do aroma e do sabor característico de cada
espécie durante a maturação, além de contribuírem para o valor nutricional (SRITI et
al., 2010).
80
5.1.3 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE
Considerando que a cromatografia gasosa é utilizada para identificação de
compostos mais apolares, uma análise de extratos metanólicos das cascas e da
polpa + sementes da P. glomerata, foi realizada utilizando a cromatografia líquida de
alta eficiência.
Como pode ser observado na figura 20, no extrato das cascas de P.
glomerata (Figura 20B) há aproximadamente quatro compostos, observados nos
tempos de retenção de 3,5; 4,5; 18,5; 21,5 minutos, respectivamente. Por outro lado,
o cromatograma obtido do extrato da polpa + semente (Figura 20C) mostra um perfil
cromatográfico bastante diferente com cerca de dez constituintes químicos
aproximadamente. Quando se compara o perfil cromatográfico do padrão
(Quercitrina) com os cromatogramas dos extratos, observa-se claramente que
apenas no extrato das cascas de P. glomerata, a quercetrina parece estar presente
em baixas concentrações. É importante mencionar que a quercitrina é um dos
principais constituintes das partes aéreas conforme relatado por Serafin et al. (2007).
Considerando que esse estudo foi realizado em partes da planta e época de coletas
diferentes, fica claro que fatores edáficos, influenciam diretamente na concentração
de constituintes químicos (GLOBO-NETO; LOPES, 2007).
Hong e colaboradores (2013), mostraram que a quercitrina apresenta
atividade antioxidante, antimelanogênica e antitumoral. Outro estudo recente
demonstrou atividade antioxidante da quercitrina contra radiação UVB induzida (YI et
al., 2013).
O presente trabalho mostrou que os extratos metanólicos da casca e da polpa
+ semente de P. glomerata apresentaram uma atividade antioxidante tanto no
método de DPPH quanto ABTS, além de um elevado teor de polifenóis comparados
aos outros extratos estudados.
Diante do exposto, e considerando a baixa concentração de quercitrina nos
extratos estudados é evidente que outros compostos devem estar contribuindo para
atividade antioxidante encontrada.
81
Figura 20 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico (0,31 mg/ml) das cascas dos frutos (B) e polpa + semente de P. glomerata (C) comparados com padrão interno quercitrina (A).
Em relação aos extratos metanólicos de G. achachairu, as figuras 21 A e B,
mostram que a gutiferona A está presente, em baixas concentrações. Isto vem de
encontro às análises cromatográficas por meio de CCD realizadas neste trabalho e
CLAE-MS realizada por Marques e colaboradores (2012). Entretanto, quando se
analisa o cromatograma das cascas dos frutos (Figuras 22 A e B), fica claro que a
gutiferona A não está presente.
O efeito citotóxico e antioxidante observado neste estudo para o extrato
metanólico das sementes de G. achachairu, pode ser justificado pela presença da
gutiferona A, que quando avaliada isoladamente apresentou tais propriedades. Por
outo lado, a mesma analogia não pode ser usada para as cascas dos frutos, tendo
em vista que a Gutiferona A não está presente. Neste aspecto, pode-se sugerir que
outros compostos presentes, poderão estar contribuindo para o efeito encontrado,
entre eles os polifenóis.
82
Figura 21 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das sementes de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml).
Figura 22 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das cascas dos frutos de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml).
5.1.4 Doseamento de polifenóis totais
A figura 23 apresenta a curva padrão de doseamento do ácido gálico com o
reativo Folin-Ciocalteu e a equação da reta utilizada para determinação do teor de
polifenóis dos extratos metanólicos. Os resultados estão expressos em mg
equivalente ao ácido gálico (GAE) por g de extrato (Quadro 3).
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência
natural, os compostos fenólicos são os mais estudados. Comumente, nos extratos
vegetais que tem ação antioxidante, os derivados fenólicos são as substâncias
responsáveis por tal efeito. Eles atuam principalmente por suas propriedades
redutoras dependentes da estrutura química. Esta propriedade desempenha um
a) Gutiferona A
b) Ext. MeOH das sementes
de G. achachairu
a
b
83
papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de
metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do
processo oxidativo (SOUSA et al., 2007).
Figura 23 - Curva para polifenóis totais de ácido gálico (µg/ml).
Os teores de polifenóis totais foram quantificados apenas nos extratos
metanólicos que apresentaram CE50 frente ao radical DPPH• inferior a 100 µg/ml. Os
extratos das cascas de garcinia (9,7 mg GAE.g-1), polpa + semente da cabeludinha
(8,9 mg GAE.g-1), cascas da naranjila (8,8 mg GAE.g-1) e sementes da jacu (9,3 mg
GAE.g-1) apresentaram teores de polifenóis superiores ao do extrato das sementes
da garcinia (8,4 mg GAE.g-1), cuja atividade antioxidante pelo método DPPH• foi
mais ativa e apresentou menor CE50 indicando que provavelmente esta ação deva-
se não somente a concentração de polifenóis presentes no extrato, mas também ao
tipo de polifenol, pois a ação antioxidante destas substâncias está relacionada com a
estrutura química destes compostos e a disponibilidade das hidroxilas.
84
Quadro 3: Teor de polifenóis totais equivalentes ao ácido gálico por grama de extrato metanólico dos frutos.
Nome científico Nome popular Extrato metanólico Sigla Polifenóis Totais
(mg GAE.g-1)
G. achachairu Garcinia Sementes SG 8,4
G. achachairu Garcinia Casca das sementes CSG 2,3
G. achachairu Garcinia Casca dos frutos CG 9,7
S. quitoense Naranjila Cascas dos frutos CN 8,8
R. rosaefolius Amora-vermelha Frutos RR 5,4
D. inconstans Jacu Sementes SJ 9,3
S. sessiliflorun Maná Cascas dos frutos CM 4,2
R. imperialis Amora-branca Frutos RI 8,1
P. glomerata Cabeludinha Polpa + sementes PSC 8,9
P. glomerata Cabeludinha Cascas dos frutos CC 8,3
Muitos fatores influenciam a atividade antioxidante dos compostos de
natureza fenólica, em especial, a posição de substituição e o número de grupos
hidroxilas, as propriedades de outros grupos substituintes e a possibilidade de
formação de ligações de hidrogênio (PANALLA et al., 2001; CHENG et al., 2002;
FOTI, 2007).
Fu e colaboradores (2012), analisaram as frações das frutas de G.
xanthochymus em relação ao conteúdo de polifenóis, e mostraram que a fração de
acetato de etila foi a que apresentou maior teor de polifenóis (13,53 ± 0,09 mg
GA/100mg), seguida da fração éter de petróleo (8,21 ± 0,05 mg GA/100mg). Este
estudo relatou maiores teores de polifenóis do que os apresentados neste trabalho,
mostrando a importância da análise fitoquímica de cada espécie e de suas distintas
partes.
Segundo Panalla e colaboradores (2001), compostos contendo a hidroxila na
posição para são mais ativos que aqueles substituídos em orto ou meta. Ainda, a
atividade antioxidante não depende apenas da força de energia da ligação da
hidroxila, mas também da estabilização das espécies cátion-radicalar e radicalar
formadas (CAO et al., 2005; FOTI, 2007; SCOTTI et al., 2007; SOUZA et al., 2007).
85
Almeida et al. (2011), mostraram o conteúdo de compostos fenólicos de onze
frutas exóticas cultivadas no nordeste do Brasil. A atividade antioxidante foi avaliada
pelos métodos do DPPH e ABTS. As frutas murici e mangaba apresentaram boa
atividade antioxidante, havendo correlação positiva entre o teor de polifenóis e a
atividade antioxidante analisada pelos métodos ABTS e DPPH (R=0,94 P ≤ 0,001) e
(R = 0,88, P ≤ 0,001) respectivamente, o que justifica o doseamento de polifenóis
quando se avalia a atividade antioxidante.
Dembitsky e colaboradores (2011), identificaram as características físico-
químicas e nutricionais de vinte frutas exóticas e da influência de seus compostos
ativos. Foram realizadas investigações in vitro e in vivo, as quais demonstraram que
essas frutas exóticas alteraram positivamente o perfil lipídico, sendo relacionado a
atividade antioxidante com o teor de polifenóis.
A bioatividade de algumas frutas raras como: durian, fruta cobra e mangostão,
foi investigada por Gorinstein et al. (2011). Essas frutas foram comparadas entre si e
também com frutas convencionais: durian com manga e abacate, fruta cobra com
mangostão e kiwi. O conteúdo de polifenóis e potencial antioxidante foram
analisados em diferentes extratos (metanol, água, acetona e hexano). Para essa
investigação foi realizado estudo in vivo com 25 ratos, cujas rações foram
suplementadas com as frutas exóticas, e observou-se que as rações suplementadas
afetaram positivamente o perfil lipídico, sendo possível concluir que os compostos
bioativos apresentavam significativa atividade antioxidante.
Constata-se que os resultados desses trabalhos, mostram perspectivas
promissoras para a utilização das frutas exóticas por causa da atividade antioxidante
e dos seus teores de polifenóis, enfatizando a necessidade de promover o consumo
dessas frutas exóticas as quais podem auxiliar no equilíbrio nutricional do
organismo. Tais estudos apontam para a importância de pesquisas que avaliam a
composição química e atividade antioxidante não somente de plantas medicinais
como também de frutas exóticas, com potencial nutritivo e de renda para as regiões
onde são coletadas.
86
5.2 Avaliação da Atividade Biológica
5.2.1 Atividade sequestradora do radical DPPH•
Os extratos metanólicos dos frutos e das distintas partes foram avaliados
inicialmente quanto à atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical
livre DPPH•, como uma forma de “screening”, a fim de selecionar os frutos a serem
estudados em relação ao perfil fitoquímico e demais atividades biológicas.
O método do sequestro do radical DPPH• baseia-se na redução da
concentração do radical DPPH•. É um dos mais empregados na seleção de
compostos orgânicos com possível atividade antioxidante. Nessa reação, a espécie
DPPH• é reduzida pelas substâncias antioxidantes, normalmente por transferência
de um átomo de hidrogênio (BONDET; BRAND-WILLIAMS; BERSET, 1997; SOUSA
et al., 2007).
Na figura 24 estão apresentadas as CE50 dos extratos metanólicos das
diferentes partes dos frutos frente ao radical DPPH• comparados aos controles
positivos trolox (CE50 = 11,9 µg/ml) e vitamina C (CE50 = 6,8 µg/ml).
Os extratos metanólicos das sementes de G. achachairu (SG), dos frutos de
R. imperialis (RI), das cascas da cabeludinha (P. glomerata) (CC), da polpa +
sementes da cabeludinha (P. glomerata) (PSC) apresentaram CE50 inferior a 30
µg/ml, 27 ± 3,2; 24 ± 1,2; 15,9 ± 2,4 e 16,3 ± 1,8 µg/ml, respectivamente.
O extrato metanólico das cascas de P. glomerata apresentou atividade
estatisticamente semelhante aos controles positivos trolox e vitamina C, indicando
importante potencial antioxidante, a qual foi semelhante para o fruto (polpa +
semente).
87
Figura 24 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes da garcinia – G. achachairu), RI (frutos da amora-branca – R. imperialis), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas + sementes da cabeludinha – P. glomerata) e dos controles positivos trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.
SG RI CC PSC Trolox Vit. C0
5
10
15
20
25
30
35**b*b
**b*b
**a*a **c
*a*a
**a
CE
50 (
µµ µµg/
ml)
*aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si e com o padrão trolox (p < 0,05). **aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si e com o padrão vitamina C (p < 0,05).
Os extratos metanólicos das cascas de garcinia - CG (92,9 ± 9,1 µg/ml), da
casca da naranjila - CN (134,6 ± 3,7 µg/ml), Rubus rosaefolius - RR (291,7 ± 4,2
µg/ml), sementes da jacu - SJ (164,4 ± 8,9 µg/ml) e das cascas da mana-cubiú - CM
(313,3 ± 1,2 µg/ml) apresentaram CE50 superior a 100 µg/ml (Figura 25), indicando
baixo potencial antioxidante destes extratos.
Ferreira, Rosso e Mercante (2010), nos seus estudos, também realizados
com Rubus, mostraram a atividade antioxidante de diferentes extratos da amora-
preta (Rubus spp), apresentando valores em uma faixa de 946,5 a 2.209,6 mM
TEAC/100 g de amora-preta.
88
Figura 25 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: CG (cascas dos frutos da garcinia – G. achachairu), CN (cascas dos frutos da naranjila - S. quitoense), RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), SJ (sementes da jacu – D. inconstans), CM (cascas da maná cubiú- S. sessiliflorun) pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.
CG CN RR SJ CM0
50
100
150
200
250
300
350
a
b
c
d
cC
E50
(µµ µµg/
ml)
aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si (p < 0,05).
Na análise de extratos etanólicos das sementes das Rubus coreanun (FBSE)
e do vinho (WBSE), Ku e Mu (2008), registraram uma CE50: 4,58 µg/ml e CE50: 4,28
µg/ml, respectivamente frente ao radical DPPH, cujos valores foram muito inferiores
aos obtidos neste estudo, considerando que R. imperialis apresentou CE50: 24 ± 1,2
µg/ml e R. rosaefolius CE50: 291,7 ± 4,2 µg/ml. Tal diferença provavelmente deve-se
a composição de distintos polifenóis nestas espécies, bem como a utilização de
sementes, que normalmente concentram mais substâncias bioativas, enquanto a
polpa concentra maior teor de açúcares e fibras.
Carvalho, Ishikawa, Gouvêa (2012), demonstraram que o extrato aquoso das
folhas de Plinia edulis foi citotóxico contra células de câncer de mama (Linhagem
MCF-7) e a atividade antioxidante foi semelhante a do ácido ascórbico (20 µg/ml
sequestrando aproximadamente 100% DPPH•), a qual foi relacionada à presença de
polifenóis 54.34 ± 0.02 mg/g equivalente ao ácido gálico. No presente estudo o
extrato metanólico das cascas e da polpa com sementes dos frutos de P. glomerata
(cabeludinha) apresentaram CE50 de 15,9 ± 2,4 µg/ml e 16,3 ± 1,8 µg/ml
respectivamente, demonstrando também significativa atividade antioxidante.
Celli, Pereira-Netto e Beta (2011), estudaram a atividade antioxidante do
extrato acetônico dos frutos de duas variedades de Eugenia uniflora L. (vermelha e a
89
roxa). Os frutos de ambas as variedades foram classificados em quatro estágios de
desenvolvimento: verde (imaturo), amarelo, laranja e vermelho (maduro). Para
ambas as variedades, a melhor atividade antioxidante foi no estágio imaturo (os
extratos sequestraram 75% do radical DPPH•).
O estudo acima demonstra que para a análise de atividade biológica de
frutos, as melhores amostras são a de frutos imaturos, pois a concentração de
metabólitos secundários parece ser maior durante o desenvolvimento dos frutos, já
que a maioria destes metabólitos execem papel de defesa e reserva para a planta,
enquanto que na maturação destes, há um aumento na concentração de açúcares.
No entanto, o objetivo deste trabalho é avaliar o potencial nutracêutico uma vez que
a população consome os frutos maduros, e por isso, ainda que a atividade biológica
seja menor, é desta forma que ocorre o consumo destes frutos.
Na figura 26 estão apresentadas as CE50 das frações e subfrações obtidas a
partir da fração acetato de etila submetidas à cromatrografia em coluna bem como
das subfrações que foram purificadas também por cromatografia em coluna e do
composto majoritário, isolado anteriormente deste extrato (Gutiferona A), frente ao
radical DPPH.
A gutiferona A mostrou maior atividade antioxidante (CE50= 10,75 ± 2,7 µg/ml)
quando comparada com as frações: Fr.1 (CE50=15,04 ± 3,1 µg/ml), Fr.3 (CE50= 12,97
± 2,2 µg/ml) e Fr.4 (CE50= 17,32 ± 4,2 µg/ml) e com as subfrações: SubFr. (3
CE50=24,29 ± 4,91 µg/ml) e SubFr.4 (.CE50=21,50 ± 4,12 µg/ml).
Ainda, deve-se destacar que as subfrações apresentaram antividade
antioxidante inferior às frações de origem, indicando que o sinergismo entre os
diferentes polifenóis presentes nas frações parece ser importante para a atividade
antioxidante.
Embora não se tenha elucidado quimicamente as substâncias presentes nas
subfrações 3 e 4, uma análise por CCD mostrou que são substâncias diferentes da
gutiferona A. No entanto, estudos estão em andamento na tentativa de elucidar
estas estruturas.
90
Figura 26 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes da garcinia (G. achachairu) e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.
Fr. 1 Fr. 3 Fr. 4 Gut. A SubFr.3 SubFr.40
10
20
30
aa
a
a
a
aC
E50
(µµ µµ
g/m
l)
aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si em nivel de 5% (p < 0,05).
FU et al. (2012), ao avaliar a atividade antioxidante da G. xanthochymus
observaram que as frações das folhas tiveram melhor resultado tanto para redução
do radical DPPH• quanto ABTS•, com CI50 da fração de acetato de etila de 6,10
µg/ml para o radical DPPH• e 6,74 µg/ml para o radical ABTS•. Esse resultado foi
relacionado ao conteúdo fenólico e a atividade antioxidante foi equivalente ao BHT.
Já WANG et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante por meio do sequestro do
radical DPPH• da G. mangostana Linn. O extrato bruto etanólico do pericarpo de
mangostão apresentou uma IC50: 7,32 ± 0,4 µg/ml.
No presente estudo, o extrato metanólico da SG apresentou CE50 de 27 ± 3,2
µg/ml e CG CE50 de 92,9 ± 9,1 µg/ml, sendo menos efetivos que os extratos citados
nos trabalhos de outras espécies de garcinia. Isso pode estar relacionado com a
possível diferença na constituição química entre as espécies ou a efeitos sazonais
(GOBBO NETO, 2007).
Neste trabalho, a gutiferona A, composto isolado das sementes de G.
achachairu teve maior atividade antioxidante tanto no sequestro do radical DPPH•
quanto no ABTS•, com CE50: 10,75 ± 2,7 e 8,48 ± 1,46 µg/ml, respectivamente.
Vieira e colaboradores (2011), analisaram a capacidade antioxidante do
extrato aquoso e hidroalcóolico de sete frutas, sendo elas: acerola, bacari, cajá, caju,
goiaba e tamarindo. A bacari apresentou maior atividade antioxidante tanto no
extrato aquoso quanto no hidroalcóolico (aquoso CE50: 4700,24 µg/ml, hidroalcóolico
91
CE50: 2356,96 µg/ml) e a menor atividade foi a da acerola (aquoso CE50: 24,42
µg/ml, hidroalcóolico CE50: 1,74 µg/ml). Esse estudo aborda a capacidade
antioxidante de diversas frutas e pode-se observar que dependendo da forma de
preparação do extrato, pode interferir na capacidade antioxidante.
5.2.2 Atividade sequestradora do radical ABTS•
Na figura 27 estão expressos os resultados da atividade antioxidante dos
extratos metanólicos pelo método do sequestro do radical livre ABTS••••, cujas plantas
mais ativas foram a G. achachairu (extrato metanólico das sementes - SG) com
CE50= 23,28 ± 1,43 µg/ml e P. glomerata (tanto o extrato metanólico das cascas - CC
com CE50= 23,54 ± 1,2 µg/ml como o extrato da polpa + sementes – PSC com CE50=
24,8 ± 0,7 µg/ml). A atividade foi comparada com os controles positivos trolox (CE50
= 8,2 µg/ml ± 0,9 µg/ml) e vitamina C (CE50 = 6,6 ± 1,1 µg/ml).
Figura 27- Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes de G. achachairu), CG (cascas de G. achachairu), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata), RI (frutos de R. imperialis) trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.
S.G C.G CC PSC RI Trolox Vit. C0
5
10
15
20
25
30
35
a
b
a a
b
c cCE
50 (
µµ µµg/
ml)
aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si (p < 0,05).
92
Um estudo da antioxidante da G. xanthochymus em relação à capacidade de
eliminação de radicais livres por sequestro do ABTS• mostrou que a fração de
acetato de etila das folhas (IC50: 6,74 ± 0,09 µg/ml) e a fração de éter de petróleo
dos frutos (IC50: 8 ± 0,31 µg/ml) foram mais efetivas que o padrão BHT (IC50: 9,29±
0,14 µg/ml) (FU et al., 2012).
Victoria et al. (2012), investigaram o óleo essencial (OE) das folhas de
Eugenia uniflora L. em relação as suas propriedades antioxidantes, antibacterianas e
antifúngicas. O OE apresentou atividade antioxidante nos dois métodos utilizados
(DPPH• e ABTS•), com IC50 de 833,3 ± 20,7 e 8,1 ± 0,20 µg/ml, respectivamente. O
óleo dessa planta foi mais potente no ensaio do ABTS, sugerindo que o mecanismo
da planta é baseado principalmente na transferência de elétrons.
Nossos resultados mostram que a G. achachairu foi mais potente no ensaio
do ABTS em relação à atividade antioxidante e a P. glomerata foi mais ativa no
sequestro do radical DPPH•.
Os extratos que apresentaram menor atividade antioxidante pelo método
ABTS• estão apresentados na figura 28. Dos três extratos, o mais ativo foi o das
sementes da jacu (Diospyros inconstans) (CE50: 73,20 ± 0,009 µg/ml), seguido pelo
extrato das cascas da naranjila (S. quitoense Lam.) com CE50= 99,71 ± 0,01 µg/ml e
da amora-vermelha (R. rosafolius) com CE50 de 135,52 ± 0,2 µg/ml.
Figura 28 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), CN (cascas dos frutos da naranjila- S. quitoense), SJ (sementes da jacu – D. inconstans) pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.
RR CN S.J0
25
50
75
100
125
150 a
b
c
CE
50 (
µµ µµg/
ml)
aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si (p < 0,05).
93
Krishnaiah, Sarbatly e Nithyanandam (2011), realizaram uma revisão sobre o
potencial antioxidante de diversos extratos de plantas medicinais utilizando caule,
raiz, casca, folhas, frutos e sementes. Muitos antioxidantes sintéticos são utilizados
como aditivos alimentares, no entanto, diversas plantas possuem atividade
antioxidante semelhante a estes sintéticos, como por exemplo, Diospyros abyssinica,
demonstrando que há espécies que podem servir como alternativa para indústria em
relação ao processamento de alimentos.
As sementes de D. inconstans pesquisada neste estudo foi a mais ativa
perante aos outros dois gêneros em relação a atividade do radical ABTS•, como
pode ser observado na figura 28.
Rubus sp. é utilizada na medicina tradicional por sua atividade
anticonvulsivante, relaxante muscular, antimicrobiana e agente de eliminação
radicais. Martini e colaboradores (2009), testaram a atividade antimicrobiana das
folhas de Rubus ulmifolius e seus polifenóis isolados contra duas cepas do H. pylori.
Todos os polifenóis, bem como o extrato da folha mostraram atividade antibacteriana
contra ambas às cepas de H. pylori.
Na figura 29 estão apresentados os resultados das CE50 das frações e
subfrações das sementes de G. achachairu e da gutiferona A, as quais foram
testadas pelo método do ABTS•, sendo que a fração 3 (CE50: 10,93 ± 2,38 µg/ml) foi
a que obteve melhor resultado dentre as frações avaliadas com uma atividade
semelhante à gutiferona A (CE50: 8,48 ± 1,46 µg/ml). Tal como observado no teste
do DPPH, as subfrações apresentaram atividade antioxidante inferior às frações de
origem, pois a SubFr.3 apresentou CE50: 24,94 ± 8,65 µg/ml e a SubFr.4 uma CE50:
17,65 ± 4,55 µg/ml.
94
Figura 29 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes de G. achachairu e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.
Fr. 1 Fr. 3 Fr. 4 Gut. A SubFr.3 SubFr.40
5
10
15
20
25
30
35
a
a
a
a
a
a
CE
50(µµ µµ
g/m
l)
aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si (p < 0,05).
Marques e colaboradores (2012), identificaram através de cromatografia
líquida acoplada a espectrometria de massas, os principais compostos encontrados
no extrato das sementes de G. achachairu, sendo que esse extrato apresentou 12
compostos, dos quais eles identificaram sete, sendo o majoritário, o composto
gutiferona A.
A gutiferona A é uma benzofenona poliisoprenilada com ação citotóxica in
vitro e ação antitumoral em modelos de roedores. Pardo-Andreu e colaboradores
(2011), relataram que a atividade antitumoral desta substância parece estar
relacionada com a permeabilização da membrana mitocondrial, com consequente
geração de EROs e depleção de ATP.
Dias e colaboradores (2012), sintetizaram seis derivados da gutiferona A e
avaliaram a atividade antimicrobiana contra fungos oportunistas e patogênicos. Esse
estudo mostrou que os derivados da gutiferona A apresentaram atividade antifúngica
mais potente do que a molécula original não sendo citotóxicos.
95
5.2.3 Avaliação da atividade antioxidante pela capacidade de absorção do radical
oxigênio (ORAC).
O ensaio ORAC combina o tempo e o percentual de inibição da ação do
radical pelo antioxidante, sendo este o único método que permite a medida total dos
radicais gerados e usa a área sob a curva (ASC) para a quantificação ao invés da
“lag fase” utilizada pelos outros métodos para quantificação dos radicais
(VASCONCELOS et al., 2007).
A figura 30 representa o decaimento da intensidade fluorescência da
fluoresceína na presença do controle (trolox). A ASC do controle (fluoresceína +
AAPH) foi de 306814 enquanto que a ASC do trolox na concentração de 25 µM foi
de 1,39 x 106.
Figura 30 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações de trolox.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
10000
20000
30000
40000
50000
C
5 µM10 µM
25 µM50 µM
100 µM
Tempo (min)
15 µM75 µM
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
A figura 31 apresenta o decaimento da intensidade de fluorescência da
fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu, em
diferentes concentrações em função do tempo. A ASC do controle (fluoresceína +
AAPH) foi de 226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada
(75 µg/ml) foi de 2.03 x 106 (1.550,3 mM TE/g.ml-1 de extrato).
96
Figura 31 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000 C
5 µg/ml20 µg/ml35 µg/ml50 µg/ml
75 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
O conteúdo de polifenóis totais nos frutos de Garcinia multifolia foi de 21,54
mg GAE/g e nos frutos de G. villosa de 27,64 mg GAE/g. No método do ORAC
mostrou-se que as flores (590,23 mmol TE/g) apresentaram atividade antioxidante
superior aos frutos (741,16 mmol TE/g) (DANIELS et al., 2011).
Na figura 32 estão representados as curvas do decaimento da fluorescência
da fluoresceína na presença de diferentes concentrações da fração 3 obtidas das
sementes de G. achachairu. Pode-se observar que a atividade antioxidante é
dependente da concentração. A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de
226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada foi de 1.5441
x 106 sendo equivalente a 4.246,5 mM TE/g.ml-1 de amostra.
97
Figura 32 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 3 das sementes de G. achachairu.
0 10 20 30 40 50 60 70 800
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000C
1 µg/ml2 µg/ml4 µg/ml8 µg/ml12 µg/ml20 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
A figura 33 mostra a curva do decaimento da intensidade da fluorescência da
fluoresceína na presença do subfração 3, mostrando que quanto maior a
concentração dessa subfração em função tempo, mais efetiva em relação a
atividade antioxidante.
A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC
da subfração na maior concentração testada (20 µg/ml) foi de 411190 (4.824,2 mM
TE/g.ml-1 de amostra). Nesta metodologia, a subfração apresentou atividade
antioxidante superior à fração de origem.
Wang et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante pelo método do ORAC
da G. mangostana Linn. O extrato bruto etanólico do pericarpo de mangostão
(MPEE) apresentou atividade equivalente a 562 ± 5,4 µmol TE/g de fruto.
98
Figura 33 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 3 das sementes da garcinia (G. achachairu).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
2500
5000
7500
10000
12500 C
2 µg/ml12 µg/ml20 µg/ml30 µg/ml40 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
A figura abaixo mostra o decaimento da fluorescência da fluoresceína perante
a fração 4 obtida das sementes da garcinia (Figura 34). A ASC do controle
(fluoresceína + AAPH) foi de 226975 enquanto que a ASC do extrato na maior
concentração testada foi de 2.07 x 106 (2971,25 mM TE/g.ml-1 de amostra).
Figura 34 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
C
2 µg/ml
8 µg/ml12 µg/ml
40 µg/ml4 µg/ml 20 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
99
Na Figura 35 apresenta-se o decaimento da intensidade da fluorescência da
fluoresceína na presença da subfração 4 (oriunda da purificação da fração 4) das
sementes de G. achachairu. Pode-se observar que quanto maior a concentração da
subfração maior a atividade antioxidante em função do tempo. A ASC do controle
(fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC do extrato na maior
concentração testada foi de 605635 (506 mM TE/g.ml-1).
Figura 35 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
2500
5000
7500
10000
12500
C
2 µg/ml8 µg/ml
20 µg/ml40 µg/ml
60 µg/ml12 µg/ml50 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
A figura 36 mostra os resultados da gutiferona A pelo método do ORAC. A
ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC da
gutiferona A na maior concentração testada foi de 356171, o que é equivalente a
404 mM TE/M de gutiferona A.
100
Figura 36 - Curva de decaimento da intensidade da fluorescência da fluoresceína na presença da Gutiferona A em diferentes concentrações (µM).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
2500
5000
7500
10000
12500C
5 µg/ml10 µg/ml15 µg/ml25 µg/ml40 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
Carvalho et al. (2012), investigaram a atividade citotóxica, antioxidante e
mutagênica da molécula isolada 7-epi-clusianona obtida do pericarpo da Garcinia
brasiliensis e do extrato de hexano em diferentes concentrações, mostrando que em
relação à atividade antioxidante a molécula isolada teve maior atividade que o
extrato em todas as concentrações.
Em nossos estudos somente os extratos metanólicos de G. achachairu, as
frações e subfrações e o composto isolado (gutiferona A) das sementes de G.
achachairu, e o extrato metanólico das cascas de P. glomerata foram avaliados pelo
método do ORAC, tendo em vista que, somente estes apresentaram CE50 inferior a
30 µg/ml nos métodos do sequestro do radical DPPH e ABTS.
Na figura 37 observa-se o decaimento da intensidade da fluorescência da
fluoresceína na presença do radical AAPH e quando adicionadas diferentes
concentrações do extrato metanólico da casca de P. glomerata. A atividade
antioxidante é observada pela redução do decaimento da fluorescência em função
da concentração e do tempo. A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de
226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada foi de 1.78 x
106 (133,4 mM TE/g.ml-1).
101
Figura 37 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das cascas de cabeludinha (P. glomerata).
0 10 20 30 40 50 60 70 800
10000
20000
30000
40000
50000 C
5 µg/ml20 µg/ml35 µg/ml50 µg/ml75 µg/ml
Tempo (min)
Fluo
resc
ênci
a (U
R)
Mertz et al. (2009), relatam um estudo sobre a atividade antioxidante, o teor
de compostos fenólicos e carotenoides de três frutas tropicais (blackberry andina,
naranjila e tomate de árvore), analisando a parte comestível dessas frutas. Os
ácidos fenólicos foram detectados na polpa da naranjila, já os carotenoides foram
semelhantes nas duas variedades de tomate, sendo a atividade antioxidante
analisada pelo método ORAC e equivalente ao suco das frutas: maçã (1,9 mM
TE/g), tomate (1,6 mM TE/g) uva vermelha (4,0 mM TE/g) e laranja (6,8 mM TE/g).
Daniels e colaboradores (2011), investigaram a capacidade antioxidante das
folhas, bulbos, raízes, flores e frutos da Gethyllis multifoliae e Gethyllis villosa. As
flores e os frutos dessas espécies mostraram maior atividade antioxidante quando
comparados com folhas, bulbos e raízes. Esse estudo avaliou a capacidade
antioxidante de outros gêneros, mas relatou de forma importante que muitas vezes
as frutas possuem maior atividade antioxidante do que as demais partes das plantas,
ainda que, as frutas cotenham muitos açúcares, como: glicose, sacarose, frutose,
entre outros.
102
5.2.4 Avaliação antioxidante pelo método de quelação de metais.
A atividade antioxidante do extrato metanólico das sementes de G.
achachairu foi verificada também pela habilidade de quelação do metal ferro (Figura
38). Na concentração de 100 µg/ml o extrato quelou aproximadamente 72%,
impedindo que o metal livre pudesse gerar radicais. Como pode ser observado, à
medida que a concentração aumenta há um acréscimo no percentual de quelação
de metal produzindo um efeito dose-resposta. Por outro lado, os extratos das demais
plantas avaliadas não apresentaram atividade quelante.
Figura 38 - Gráfico do percentual da atividade de quelação de metais em função das diferentes concentrações do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.
10 25 40 55 70 85 1000
10
20
30
40
50
60
70
80
Conc. (µµµµg/ml)
% a
tivi
dad
e q
uel
ação
Okoko (2009), verificou a atividade quelante de metais de diferentes frações
do extrato metanólico das sementes de G. kola, sendo que a maior atividade
quelante em percentual foi de 35% com 1,5 µg/ml de fração.
5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica.
Em relação à atividade citotóxica pode-se observar que tanto o extrato
metanólico das sementes de G. achachairu quanto o composto isolado, gutiferona A,
103
inibiram o crescimento das células tumorais B16F10 (melanona murino), com valores
calculados de CI50 de: 49,6 ± 2,1 µg/ml e 48,6 ± 5,4 µM, respectivamente (Figura
39).
Figura 39 - Atividade citotóxica do extrato metanólico das sementes de G. achachairu e do composto isolado gutiferona A em células de melanoma murino (B16F10).
30 45 60 75 90
10
25
40
55
70
85
100
semente da garcinia ( µµµµg/ml)
% c
élu
las
viáv
eis
30 45 60 75 90
10
25
40
55
70
85
100
gutiferona A ( µµµµM)
% c
élu
las
viav
éis
Nguyen, Trinh, Nguyen (2012), isolaram três novas benzofenonas
poliisoprenilada, quatro xantonas e o citrato de trimetilo a partir do pericarpo de
Garcinia cochinchinensis. Essas estruturas foram elucidadas por métodos
espectroscópicos, e posteriormente todas as gutiferonas foram testadas quanto a
sua citotoxicidade em três linhagens de células humanas, sendo: MCF-7, Hela e
NCI-H460. A gutiferona Q mostrou melhor atividade citotóxica, IC50 no intervalo de
2,74-4,04 mg/ml contra as células testadas, cujos valores são bem maiores do que
os valores encontrados neste trabalho.
Shadid e colaboradores (2007), avaliaram a atividade citotóxica de compostos
isolados do extrato clorofórmico de G. cantleyana (CI50 variando de 0,22 –
17,17µg/ml) em diferentes linhagens celulares de câncer de ovário, de mama e de
cólon. Estes distintos valores devem-se não somente a diferença da atividade
antitumoral intrínsica dos compostos, mas também da resistência das diferentes
linhagens de células tumorais frente aos tratamentos, por exemplo, células de
melanoma são resistentes a inúmeros compostos utilizados na clínica.
Deng e colaboradores (2012), isolaram da resina de Garcinia hanburyi três
novas xantonas, sendo: ácido garcinólico, ácido 10α-etoxi-9,10-dihidromorellico,
ácido 10α-etoxi-9,10-dihidrogambogênico e mais seis compostos conhecidos. Esses
compostos apresentaram citotoxicidade contra diferentes linhagens celulares.
104
A fração 4 das sementes de G. achachairu na maior concentração testada,
90 µg/ml, apresentou uma citotoxicidade de aproximadamente 43 %, já a fração 3 na
concentração de 90 µg/ml apresentou citotoxicidade de 70 % (CI50 77 µg/ml) (Figura
40).
Figura 40 - Atividade citotóxica das frações da semente de G.achachairu em células de melanoma murino (B16F10).
30 45 60 75 90
0
25
50
75
100
Fr. 3Fr. 4
Conc. (µµµµg/ml)
% c
élul
as v
iáve
is
Muitas pesquisas têm sido realizadas com diferentes plantas em diferentes
áreas da pesquisa farmacêutica, a fim de obter resultados que auxiliem na busca por
novos fitoterápicos ou até mesmo medicamentos que auxiliem na saúde das
pessoas, ou pelo simples fato de ingerir um alimento que contenha compostos
biativos capazes de prevenir ou auxiliar no tratamento de muitas doenças.
Pode-se observar que atualmente existem muitas pesquisas relacionadas às
frutas em virtude destas possuírem compostos biotivos capazes de diversas funções
no nosso organismo, principalmente de atuarem como antioxidantes, e assim evitar
a formação ou a propagação dos danos causados pelos radicais livres, os quais
estão implicados com a etiologia de diversas doenças crônicas não transmissíveis,
como as doenças cardiovasculares e neoplasias.
105
106
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base nos resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que:
� A avaliação fitoquímica dos extratos metanólicos indicou que somente nos
extratos das sementes de G. achachairu detectaram-se compostos fenólicos,
enquanto nos demais extratos não foram detectados quando revelados com
cloreto férrico.
� O perfil fitoquímico dos extratos dos frutos de S. sessiliflorum (maná-cubiú)
e R. rosaefolius (amora-vermelha) indicou a presença de compostos polares
como carboidratos quando revelados com anisaldeído sulfúrico
� O estudo comparativo com alguns padrões de açúcares mostrou que os
extratos das sementes de G. achachairu contêm sacarose e frutose. O extrato
da casca e da polpa de Plinia glomerata apresentaram sacarose e frutose.
� O extrato da polpa, casca e a semente de D. inconstans (jacu) apresentou
glicose, sacarose e frutose, já o extrato da polpa de S. sessiliflorum (maná-
cubiú) apresentou maltose, sacarose e glicose, sua casca apenas frutose. No
extrato da polpa S. quitoense (naranjila) foi possível observar a presença de
maltose e glicose.
� A análise cromatográfica por CGMS do extrato mais apolar de P. glomerata e
G.achachairu revelou que apresentam composição química distinta e que G.
achachairu apresenta principalmente ésteres de ácidos graxos e os fitosterois
α-sitosterol e γ- sitosterol.
� A análise cromatográfica por CLAE do extrato mais polar de P. glomerata e
G.achachairu também revelou que apresentam composição química distinta e
que G. achachairu apresenta principalmente Gutiferona A.
� Os resultados obtidos no ensaio da atividade antioxidante com o sequestro do
radical DPPH• os extratos metanólicos que obtiveram melhor ação
107
antioxidante foram os das cascas da Cabeludinha (CC) e o da polpa +
sementes da Cabeludinha (PSC).
� No método do sequestro do radical livre ABTS••••, a atividade antioxidante dos
extratos metanólicos mais ativos foram da G. achachairu (extrato metanólico
das sementes - SG) e P. glomerata (extrato metanólico da casca - CC)
comparadas com os controles positivo trolox e vitamina C.
� No método do ORAC o extrato metanólico das sementes de G. achachairu,
em diferentes concentrações em função do tempo, foi o que melhor
apresentou atividade antioxidante, superior inclusive ao do composto isolado
Gutiferona A.
� Em relação à determinação de compostos fenólicos totais os extratos
metanólicos das cascas dos frutos da garcinia e as sementes da Jacu
apresentaram maior conteúdo de polifenóis.
� Na determinação do potencial antioxidante pelo método de quelante de
metais, o extrato metanólico das sementes de G. Achachairu foi o único que
mostrou atividade antioxidante.
� No teste de citotoxicidade, o extrato metanólico das sementes de G.
achachairu e o seu composto isolado (Gutiferona A), inibiram o crescimento
das células tumorais B16F10, sendo que ambos inibiram em 50% o
crescimento celular em concentração inferior a 50 µg/ml.
108
REFERÊNCIAS
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