UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE ARAÇATUBA
EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO
CELULAR DO CORPO LÚTEO E MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE
Natália Paulozzi Costa
Zootecnista
ARAÇATUBA - SP 2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE ARAÇATUBA
EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO
CELULAR DO CORPO LÚTEO E MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE
Natália Paulozzi Costa
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes
Coorientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária – UNESP, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal).
ARAÇATUBA - SP
2014
Catalogação na Publicação(CIP) Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FMVA/UNESP
Costa,Natália Paulozzi Costa C837e Efeitos da somatotropina recombinante bovina na taxa de
concepção, composição celular do corpo lúteo e morfometria das
glândulas endometriais em vaca de corte / Natália Paulozzi Costa. --
Araçatuba: [s.n], 2014.
85 f. il.; + CD-ROM
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária, 2014.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Lombardi Costa Coorientadora: Profa. Dra. Cláudia Maria Bertan Membrive
1. Hormônio do crescimento. 2. Desenvolvimento embrionário. 3. Inseminação artificial. 4. BovinosI. T.
CDD 636.6089
Efeitos da somatotropina recombinante bovina na taxa de concepção, composição celular do corpo lúteo e morfometria das
glândulas endometriais em vacas de corte.
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
NATÁLIA PAULOZZI COSTA – Nascida em 23 de junho de 1987, na cidade
de Araçatuba/SP. Em 2005, ingressou no curso de Graduação em Zootecnia
pela Universidade Estadual de Maringá − UEM, na cidade de Maringá/PR,
concluído em dezembro de 2009. Em fevereiro de 2012, iniciou o curso de
Mestrado em Ciência Animal na Faculdade de Medicina Veterinária, UNESP,
Campus de Araçatuba/SP, na área de Medicina Veterinária Preventiva e
Produção Animal, sob a orientação da Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes e
Coorientação da Profa. Dra. Claudia Maria Bertan Membrive. Foi bolsista de
Mestrado da CAPES, no período de agosto de 2011 a julho de 2012.
“A vontade de Deus nunca irá levá-lo aonde a graça de Deus
não possa protegê-lo.”
Chico Xavier
Dedico este trabalho
Aos meus pais, Maristela Paulozzi e Paulo César Costa,que me apoiaram a
cada nova etapa.
Aos meus irmãos Renan e Nicholas.
Ao Guilherme Beraldi, por toda paciência e ajuda.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por iluminar meu caminho em sua imensa bondade.
À minha família, por sempre me apoiar e incentivar em tudo, minha eterna gratidão.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Faculdade
de Medicina Veterinária da UNESP, Campus de Araçatuba/SP, em especial a Profa.
Dra. Adj. Juliana Regina Peiró, pela oportunidade concedida.
À Universidade Estadual Paulista – UNESP “Júlio de Mesquita Filho”,
Faculdade de Medicina Veterinária, Campus de Araçatuba/SP, por disponibilizar a
estrutura física do Campus de Araçatuba para realização de parte dos estudos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de mestrado.
À Profa. Dra. Flávia Lombardi Lopes, pela cordial disponibilidade como
orientadora.
À Profa. Dra. Adj. Claudia Maria Bertan Membrive, pela coorientação e por todos
os conhecimentos passados, indispensáveis para o desenvolvimento do projeto e
crescimento profissional, além da confiança e apoio demonstrados.
Ao Prof. Dr. Adj. Mario Binelli, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP, pela valiosa contribuição
científica e por ter disponibilizado a estrutura do Laboratório de Fisiologia e
Endocrinologia Molecular (LFEM) para a realização das análises da composição
celular do corpo lúteo e morfometria das glândulas endometriais.
Ao Dr. Manoel Francisco de Sá Filho, Pós-Doutorando da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP,
pela valiosa contribuição na execução das análises estatísticas.
Ao Dr. Milton Maturana Filho, Pós-Doutorando da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP,
pela valiosa contribuição na execução das análises estatísticas.
Ao Prof. Dr. Ricardo de Francisco Strefezzi, da Faculdade Zootecnia e Engenharia
de Alimentos da USP, Campus de Pirassununga/SP, por disponibilizar sua estrutura
laboratorial para o preparo das lâminas histológicas.
À Profa. Dra. Caliê Castilho, da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
pelas valiosas considerações realizadas durante o exame geral de qualificação.
Ao Prof. Dr. Ricardo da Fonseca, da UNESP de Dracena/SP, pelas valiosas
sugestões realizadas durante o exame geral de qualificação.
À Profa. Dra. Ângela Maria Gonella Diazza, Doutoranda da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de
Pirassununga/SP, pela experiente contribuição na avaliação das células luteais e
morfometria das glândulas endometriais.
À médica veterinária, Rita Cristina Rossetti, por ter disponibilizado parte dos seus
dados para a presente dissertação.
Ao médico veterinário, Renato Girotto, da Empresa RG Genética, localizada em
Água Boa – MT, pelo imprescindível preparo dos animais e realização dos protocolos
de sincronização dos estros no Experimento 1.
Ao médico veterinário, Guilherme Agostinho Domingues, da Empresa Fazzembryo,
localizada em Araçatuba - SP, pelo imprescindível preparo dos animais e realização
dos protocolos de sincronização dos estros no Experimento 3.
Ao zootecnista, Robson Nunes Dinardi, pelo auxílio na aplicação dos tratamentos
realizados durante o Experimento 1.
Aos proprietários da Fazenda Santo Antônio, localizada em Araguaiana/MT, pela
disponibilidade de parte dos animais utilizados neste estudo.
Aos proprietários da Fazenda Jacareúna, localizada no município de São Félix do
Araguaia/MT e da Fazenda Guanabara localizada no município de Andradina/SP,
pela concessão de parte dos animais utilizados neste estudo.
Aos proprietários da Fazenda São José, localizada no município de Birigui/SP, pela
concessão dos animais utilizados no Experimento 3.
Aos funcionários e equipe de apoio de todas as fazendas acima mencionadas, pelo
acolhimento e auxílio nos procedimentos realizados.
À Coordenação Executiva da UNESP do Campus de Dracena/SP, em especial ao
Prof. Dr. Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo e Prof. Dr. Fábio Ermínio
Mingatto, por disponibilizar a estrutura física do Campus de Dracena para realização
de parte dos estudos.
À Doutoranda Saara Carolina Scolari, da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo, Campus de Pirassununga/SP, pela valiosa
contribuição no corte histológico do endométrio e corpo lúteo.
À aluna de Graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, Bárbara Piffero Mello, pela
grande e gentil contribuição na análise morfométrica do endométrio e na contagem das
células luteais realizadas no experimento 3.
À Doutoranda do Programa de Ciência Animal, da UNESP de Araçatuba/SP,
Mariângela Bueno Cordeiro, pela valiosa contribuição na coleta do sistema
reprodutivo e processamento das amostras durante o experimento 3.
Às alunas de graduação em Zootecnia da UNESP de Dracena, Leriana Garcia Reis
e Viviane do Nascimento Santana de Almeida, pela ajuda na coleta do sistema
reprodutivo e processamento das amostras durante o experimento 3.
Ao Mestrando do Programa de Ciência Animal, da UNESP de Araçatuba/SP,
David Giraldo pela valiosa contribuição na localização dos animais utilizados no
experimento 3.
A todos os técnicos de laboratório da UNESP, Campus de Dracena/SP, pelo auxílio
concedido, em especial ao Marcelo José Martini Bartholomei, pela ajuda na coleta dos
materiais biológicos realizada no experimento 3.
Ao frigorífico Brasfrigo, sediado na cidade de Birigui/SP, por realizar o abate dos
animais utilizados no experimento 3.
À MSD Saúde Animal, em especial ao veterinário João Paulo Barbuio, pelo auxílio
financeiro formalizado pela doação de todos os fármacos utilizados neste estudo.
À amiga Juraci Carreon Beraldi, pela grande contribuição na correção deste
trabalho.
E, por fim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização dos
meus estudos, muito obrigada.
SUMÁRIO
Página
I INTRODUÇÃO............................................................................ 25
II REVISÃO DE LITERATURA...................................................... 28
2.1 Limitações da eficiência reprodutiva em rebanhos bovinos de corte....................................................................................... 28
2.2 Mortalidade embrionária precoce......................................... 29
2.3 Mecanismo de ação do hormônio de crescimento............... 32
2.4 Efeitos da somatotropina recombinante bovina na performance reprodutiva de fêmeas bovinas.............................. 37
III OBJETIVOS................................................................................ 40
IV HIPÓTESE.................................................................................. 41
V MATERIAL E MÉTODOS........................................................... 41
5.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 41
5.1.1 Local do Experimento............................................. 41
5.1.2 Animais.................................................................... 41
5.1.3 Sincronização das ovulações.................................. 42
5.1.4 Procedimentos de IATF........................................... 43
5.1.5 Tratamento com bST............................................... 43
5.1.6 Diagnóstico de Gestação........................................ 43
5.1.7 Análise Estatística................................................... 43
5.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 44
5.2.1 Local do Experimento............................................. 44
5.2.2 Animais.................................................................... 44
5.2.3 Sincronização das ovulações.................................. 44
5.2.4 Procedimentos de IATF........................................... 45
5.2.5 Tratamento com bST............................................... 46
5.2.6 Diagnóstico de Gestação........................................ 46
5.2.7 Análise Estatística................................................... 46
5.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 46
5.3.1 Local do experimento.............................................. 46
5.3.2 Animais.................................................................... 47
5.3.3. Sincronização das ovulações................................. 47
5.3.4 Tratamento com bST............................................... 48
5.3.5 Coleta do Corpo Lúteo............................................ 48
5.3.6 Preparo Histológico do Corpo Lúteo....................... 49
5.3.7 Avaliação das células luteais esteroidogênicas...... 49
5.3.8 Análise estatística para avaliação do corpo lúteo... 49
5.3.9 Coleta do tecido Endometrial.................................. 50
5.3.10 Preparo histológico do tecido uterino.................... 50
5.3.11 Análise morfométrica das glândulas endometriais 51
5.3.12 Análise estatística da morfometria das glândulas endometriais.................................................................... 52
VI RESULTADOS.......................................................................... 52
6.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 52
6.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 53
6.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 54
VII DISCUSSÃO.............................................................................. 62
7.1 EXPERIMENTO 1................................................................. 62
7.2 EXPERIMENTO 2................................................................. 64
7.3 EXPERIMENTO 3................................................................. 65
VIII CONCLUSÃO........................................................................... 67
REFERÊNCIAS............................................................................... 68
LISTA DE ABREVIATURAS
µg = Micrograma
µm = Micrômetro
µm2 = Micrômetro ao quadrado
AGL = Ácidos graxos livres
ASBIA = Associação Brasileira de Inseminação Artificial
BE = Benzoato de estradiol
BEN = Balanço energético negativo
bST = Somatotropina recombinante bovina
ºC = Graus Celsius
CLG = Células luteais grandes
CLP = Células luteais pequenas
COX-2 = Cicloxigenase 2
D = Dia
DNA = Ácido desoxirribonucleico
E2 = Estradiol
ECC = Escore de condição corporal
eCG = Gonadotrofina coriônica equine
ECL = Eletroquimioluminescente
G = Grama
GH = Hormônio do crescimento
GHBP = Proteína ligadora do hormônio do crescimento
GHR = Receptor do hormônio do crescimento
GHRH = Hormônio liberador do hormônio do crescimento
GIRH = Hormônio inibidor do hormônio do crescimento
GTP = Guanosina trifosfato
H2O = Água
HE = Hematoxilina – Eosina
IA = Inseminação artificial
IATF = Inseminação artificial em tempo fixo
IEP = Intervalo entre partos
IFN-τ = Interferon-tau
IGF I = Fator de crescimento semelhante a insulina tipo I
IGF II = Fator de crescimento semelhante a insulina tipo II
IGFBP = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina
IGFBP2 = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 2
IGFBP3 = Proteína ligadora do fator de crescimento semelhante a insulina tipo 3
IGFs = Fatores de crescimento semelhantes a insulina
IGP = Índice geral de preços
IM = Intramuscular
JAK2 = Janus quinase 2
kDa = Quilodaltons
Kg = Kilograma
LH = Hormônio Luteinizante
Mg = Miligrama
mHZ = Mega-hertz
Ml = Mililitro
Mm = Milímetro
NaH2PO4 = Fosfato monossódico
NEFA = Acidos graxos não esterificados
OT = Ocitocina
P4 = Progesterona
PAF = Paraformaldeído
PBS = Tampão fosfato-salino
PGF2 = Prostaglandina F2
PKC = Proteína quinase-C
PLA2 = Fosfolipase A2
PLC = Fosfolipase C
RNAm = RNA mensageiro
SBTE = Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões
SC = Subcutânea
TETF = Transferência de embriões em tempo fixo
UI = Unidades Internacionais
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 - Representação esquemática do delineamento referente
ao Experimento 1: colocação do dispositivo intravaginal
contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal
associado a administração de 0,530mg de D-cloprostenol
e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de
1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30
horas após a aplicação da última injeção; aplicação no
D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =
194), 250mg bST via SC (Grupo bST 250; n=197) ou
500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=196) e
diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias
após IATF (D30) em vacas de corte.................................. 42
Figura 2 - Representação esquemática do delineamento referente
ao Experimento 2: colocação do dispositivo intravaginal
contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal
associado a administração de 112,5g de D-cloprostenol
e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de
1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30
horas após a aplicação da última injeção; aplicação no
D7 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =
124) ou 500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=119) e
diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias
após IATF (D30) em vacas de corte.................................. 45
Figura 3 - Representação esquemática do delineamento referente
ao Experimento 3: colocação do dispositivo intravaginal
contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal
associado a administração de 0,530mg de D-cloprostenol
e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de
1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); Dia esperado
para o estro (D0); aplicação no D0 de 5ml de solução
salina via SC (Grupo Controle; n = 9) ou 500mg bST via
SC (Grupo bST 500; n=11) e abate dos animais com
coleta de útero e corpo lúteo (D15) em vacas de corte......
48
Figura 4 - Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após
a IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à
IATF, tratadas com 5ml de solução salina (Grupo
Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg
(Grupo bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500;
n=196), via subcutânea (SC), p>0,05................................ 53
Figura 5 - Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após
a IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à
IATF, tratadas com 5ml de solução salina (Grupo
Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500;
n=119), via subcutânea (SC), p>0,05................................ 54
Figura 6 - Imagem das células luteais esteroidogênicas em
aumento de 40X: células luteais grandes (CLP; diâmetro
< 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20
μm), no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas
Nelore tratadas com 5ml de solução salina via SC (Grupo
Controle; n = 9) ................................................................. 56
Figura 7 - Imagem das células luteais esteroidogênicas em
aumento de 40X: células luteais grandes (CLP; diâmetro
< 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20
μm), no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas
Nelore tratadas com 500 mg de bST via SC (Grupo bST
500; n = 11)........................................................................
57
Figura 8 - Imagem das glândulas endometriais superficiais em
aumento de 20X, no D15 (D0 = dia esperado para o
estro) de novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST
via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com 5ml de solução
salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente........... 60
Figura 9 - Imagem das glândulas endometriais profundas em
aumento de 20X, no D15 (D0 = dia esperado para o
estro) de novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST
via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com 5ml de solução
salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente........... 61
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Média e erro padrão do peso dos ovários, diâmetro do
ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do
corpo lúteo, peso do corpo lúteo, porcentagem de CLG
e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore
tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou
com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia esperado
para o estro)..................................................................... 55
Tabela 2 - Avaliação do peso médio dos ovários, diâmetro do
ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do
corpo lúteo, peso do corpo lúteo, porcentagem de CLG
e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore
tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou
com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia esperado
para o estro)..................................................................... 59
EFEITOS DA SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA NA TAXA DE
CONCEPÇÃO, COMPOSIÇÃO CELULAR DO CORPO LÚTEO E
MORFOMETRIA DAS GLÂNDULAS ENDOMETRIAIS EM VACAS DE CORTE
RESUMO – Fêmeas bovinas leiteiras tratadas com somatotropina
recombinante bovina (bST) apresentam maior taxa de concepção. Verificou-se
que componentes maternais e embrionários são positivamente afetados pela
bST favorecendo a concepção. Entretanto, poucas investigações foram
realizadas em fêmeas de corte. Hipotetizou-se que vacas de corte tratadas com
bST, no dia da inseminação artificial em tempo fixo (IATF) ou sete dias após a
IATF, apresentam maiores taxas de concepção e que a morfometria das
glândulas endometriais e a proporção de células esteroidogênicas luteais são
alteradas por tal tratamento. No presente estudo objetivou-se avaliar o efeito da
aplicação de bST, na dose de 250 ou 500mg, no dia da IATF, na taxa de
concepção aos 30 dias de gestação (Experimento 1); verificar os efeitos da
aplicação de 500mg de bST, sete dias após a IATF, na taxa de concepção aos
30 dias de gestação (Experimento 2) e averiguar os efeitos da bST na
proporção de células esteroidogênicas luteais e na morfometria das glândulas
endometriais (Experimento 3). No Experimento 1, vacas Nelore (n=587)
receberam um dispositivo intravaginal contendo progesterona (1g; DIB®)
associado a uma injeção intramuscular (IM) de benzoato de estradiol (2mg;
Gonadiol®). Os dispositivos foram removidos oito dias após, quando as vacas
foram tratadas com D-cloprostenol (0,530µg; Ciosin®) e gonadotrofina
coriônica equina (300UI; Novormon®) e 24 horas após receberam benzoato de
estradiol (1mg; Gonadiol®), via IM. Após 30 horas da última injeção (D0) as
fêmeas foram submetidas à IATF e receberam 5ml de solução salina (Grupo
Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo bST 250;
n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), via subcutânea (SC). O diagnóstico
de gestação foi realizado 30 dias após a IATF por ultrassonografia. No
Experimento 2, vacas Nelore (n=243) receberam protocolo idêntico ao
Experimento1 e foram submetidas à IATF no D0. No D7 receberam 5ml de
solução salina (Grupo Controle; n= 124) ou bST (Boostin) na dose de 500mg
(Grupo bST 500; n=119), via SC. O diagnóstico de gestação foi realizado 30
dias após a IATF por ultrassonografia. No Experimento 3, vacas Nelore (n=20)
receberam protocolo idêntico ao Experimento 1 e foram tratadas, 48 horas
após a remoção do dispositivo intravaginal, com 5ml de solução salina (Grupo
Controle; n=9) ou bST (Boostin) na dose de 500mg (Grupo bST 500; n=11),
via subcutânea (SC). As fêmeas foram abatidas 15 dias após a aplicação de
bST. O corpo lúteo foi removido e avaliado quanto ao diâmetro, peso,
porcentagem de células luteais grandes (CLG) e pequenas (CLP) em relação a
porcentagem total de células esteroidogênicas. O tecido uterino foi removido,
do terço médio do corno uterino ipsolateral ao corpo lúteo, lâminas histológicas
foram preparadas e o tecido uterino corado com hematoxilina e eosina, sendo o
tecido endometrial avaliado quanto ao número, perímetro e área total das
glândulas endometriais superficiais e/ou profundas. Os dados foram analisados
por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc Glimmix do
SAS. No Experimento 1, não houve efeito de tratamento (p>0,05) nas taxas de
concepção que foram de 59,27%, 58,37% e 65,82% para o Grupo Controle,
bST 250 e bST 500, respectivamente. No Experimento 2, as taxas de
concepção não diferiram (p>0,05) entre os tratamentos e foram de 57,30% e
60,50% para o Grupo Controle e bST 500, respectivamente. No Experimento 3,
verificou- se que a aplicação de bST não promoveu alterações na composição
celular do corpo lúteo e na morfometria das glândulas endometriais. Conclui-se
que vacas tratadas com bST, no dia da IATF ou sete dias após a IATF, não
apresentam maiores taxas de concepção e que a morfometria das glândulas
endometriais e a proporção de células esteroidogênicas luteais não são
alteradas por tal tratamento.
Palavras-chave: Hormônio do crescimento, Desenvolvimento embrionário,
Inseminação artificial, Bovinos.
EFFECTS OF RECOMBINANT BOVINE SOMATOTROPIN ON CONCEPTION
RATE, CELL COMPOSITION OF CORPUS LUTEUM AND ENDOMETRIAL
GLANDS MORPHOMETRY IN BEEF COWS
SUMMARY – Dairy cows treated with recombinant bovine somatotropin (bST)
have higher conception rate. It was found that maternal and embryonic
components are positively affected by the design favoring bST. However, few
investigations have been done on beef cows. It was hypothesized that beef
cows treated with bST, the day timed AI (TAI) or seven days after TAI, have
higher conception rates and the morphology of the endometrial glands and the
proportion of steroidogenic luteal cells are altered by such treatment. The
present study aimed to evaluate the effect of bST at a dose of 250 or 500mg,
the day of TAI, the conception rate at 30 days of gestation (Experiment 1); verify
the effects of application of 500mg of bST, seven days after TAI, the conception
rate at 30 days of gestation (Experiment 2) and investigate the effects of bST in
the proportion of steroidogenic luteal cells and morphometry of the endometrial
glands (Experiment 3). In Experiment 1, Nelore cows (n=587) received an
intravaginal device containing progesterone (1g; DIB®) associated with an
intramuscular (IM) injection of estradiol benzoate (2mg; Gonadiol®). The
devices were removed after eight days, when cows were treated with D-
cloprostenol (0.530 mg; Ciosin®) and equine chorionic gonadotropin (300UI;
Novormon®) and after 24 hours received estradiol benzoate (1 mg; Gonadiol®),
via IM. After 30 hours of the last injection (D0) females were inseminated and
received 5ml of saline (Control Group; n=194) or somatotropin (Boostin®) at a
dose of 250mg (Group bST 250; n=197) or 500mg (Group bST 500; n=196),
subcutaneously (SC). Pregnancy diagnosis was performed 30 days after TAI by
ultrasonography. In Experiment 2, Nelore cows (n=243) received the
Experimento1 similar protocol and were inseminated on D0. In D7 received 5ml
of saline (Control Group; n=124) or somatotropin (Boostin®) at a dose of 500mg
(Group bST 500; n =119) subcutaneously. Pregnancy diagnosis was performed
30 days after TAI by ultrasonography. In Experiment 3, Nelore cows (n=20)
were identical to Experiment 1 protocol and were treated 48 hours after removal
of the intravaginal device with 5ml of saline (Control Group; n=9) or
somatotropin (Boostin®) 500mg dose (Group 500 bST; n = 11), subcutaneously
(SC). The heifers were slaughtered 15 days after application of bST. The
corpus luteum was removed and evaluated for size, weight, percentage of large
luteal cells (LLC) and small (SLC) in relation the total percentage of
steroidogenic cells. The uterine tissue was removed from the middle third of the
uterus ipasolateral the corpus luteum, histological slides were prepared and
stained uterine tissue with hematoxylin and eosin, and endometrial tissue were
evaluated on the number, perimeter and area of surface endometrial glands and
/ or deep. Data were analyzed by analysis of variance. The means were
analyzed by SAS Proc GLIMMIX. In Experiment 1, there was no effect of
treatment (p> 0.05) in conception rates which were 59.27%, 58.37% and
65.82% for the control, 250 and 500 bST groups, respectively. In Experiment 2,
the conception rates did not differ (p> 0.05) between treatments and were
57.30% and 60.50% for the control and bST Group 500, respectively. In
Experiment 3, it was found that the application of bST did not change the
cellular composition of the corpus luteum and the morphometry of the
endometrial glands. It was concluded that cows treated with bST, the day of TAI
or seven days after TAI, didn’t have higher rates of conception and the
morphometry of the endometrial glands and the proportion of steroidogenic
luteal cells were not affected by such treatment.
Keywords: Growth hormone, Embryonic development, Artificial insemination,
Cattle.
25
I INTRODUÇÃO
A demanda mundial por alimentos cresce rapidamente, de forma
proporcional ao aumento da população. Em 2014, o Brasil ocupa a posição de
maior exportador de carne bovina e tem recebido grande atenção mundial
devido ao modelo de criação extensiva e potencial de incremento na produção.
O rebanho bovino brasileiro é constituído por 198.655.689 animais, sendo 79%
destes destinados à produção de carne. Estima-se que a produção nacional de
carne bovina seja de 8.520.651 toneladas, proveniente do abate de 43.269.775
cabeças, sendo 1.940.000 toneladas do produto destinadas às exportações, o
que representa 22,76% da produção anual (ANUALPEC, 2014).
Atualmente o Brasil apresenta uma taxa de desfrute (número de animais
abatidos, dividido pelo número total de animais x 100) de 20% e abate de
carcaças com um peso médio de 15 arrobas (ANUALPEC, 2014). Em
comparação, os norte-americanos desfrutam de 35% do seu rebanho e abatem
carcaças pesando 24 arrobas (ANUALPEC, 2014). Embora detentor do maior
rebanho bovino comercial do mundo, o Brasil apresenta uma eficiência na
produção pecuária aquém da necessária, caracterizada inclusive pela baixa
eficiência reprodutiva nas operações de cria.
Mantendo-se baixa a eficiência reprodutiva, a única maneira de se
aumentar o volume de carne produzido é aumentando a área destinada à
exploração pecuária. Contudo, tal prática torna-se indesejável pelas óbvias
implicações ambientais negativas. Assim, evidencia-se a importância de se
aumentar a eficiência reprodutiva das explorações pecuárias com o objetivo de
incrementar a produção de carne, sem necessariamente aumentar o número
de matrizes. Para tanto, torna-se imprescindível aumentar a taxa de prenhez
(número de bezerros nascidos, dividido pelo número de fêmeas em reprodução
x 100) e concepção (número de bezerros nascidos dividido pelo número de
fêmeas inseminadas x 100). Entretanto, para que a bovinocultura brasileira
atinja maiores índices de produtividade, além da eficiência reprodutiva, o
melhoramento genético necessita ser priorizado (BARUSELLI et al., 2006).
26
Tais requisitos tem alavancado o emprego da inseminação artificial (IA).
Para otimizar seu emprego foram desenvolvidos protocolos hormonais que
permitem a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) em 100% das fêmeas
tratadas em um momento predeterminado, procedimento que exclui a
necessidade da detecção de estros. Além disso, a IATF possibilita a indução da
ciclicidade de fêmeas em anestro no período pós-parto (DAY, 2005; PURSLEY
et al., 1995; VASCONCELOS et al., 1994). No Brasil, segundo estimativas da
Associação Brasileira de Inseminação Artificial (ASBIA), estima-se que 27,19%
das fêmeas bovinas tenham sido inseminadas em 2012, destas 32,96% fêmeas
de corte e 19,21% fêmeas de leite, sendo aproximadamente 50% do total de
inseminações realizadas por IATF (ASBIA, 2012). Apesar dos bons resultados
obtidos com o emprego da IATF, as taxas de prenhez à primeira inseminação
dificilmente são maiores que 60% em vacas de corte e 30% em vacas leiteiras
de alta produção, indicando que uma proporção expressiva de fêmeas
inseminadas não se torna prenhes. A taxa média de concepção em rebanhos
de corte comerciais no Brasil com o emprego da IATF é de 49,1% (BARUSELLI
et al., 2008; SÁ FILHO et al., 2009).
Considerando a importância do incremento genético aliado ao aumento
da eficiência reprodutiva, o Brasil também se tornou líder mundial no emprego
da técnica de transferência de embriões em tempo fixo (TETF). A TETF, aliada
à produção de embriões in vitro, constituem biotécnicas poderosas na
disseminação de produtos nascidos oriundos de animais geneticamente
superiores. Entretanto, as taxas de concepção no emprego da TETF
dificilmente superam 50%. Segundo a Sociedade Brasileira de Tecnologia de
Embriões (SBTE), o Brasil é líder mundial na produção in vitro de embriões
bovinos, sendo responsável por 70% do total de embriões gerados no mundo
através desta biotecnologia (FAEMG, 2013).
Para se atingir uma boa produtividade, a eficiência reprodutiva das
fêmeas deve ser melhorada. Em fêmeas bovinas de corte os principais
desafios biológicos para o estabelecimento da prenhez ocorrem no período
27
especialmente crítico, compreendido entre os dias 15 e 19 após a fecundação
(BINELLI et al., 2001).
Em fêmeas bovinas, durante o período crítico, o concepto (embrião e
membranas associadas) deve produzir competentemente moléculas que
interagem com o endométrio inibindo a síntese de prostaglandina F2 (PGF2)
e consequentemente a luteólise. Contudo, a simples existência do concepto no
útero não assegura o bloqueio efetivo da luteólise. A supressão da síntese de
PGF2 endometrial pelo concepto torna-se necessária para o estabelecimento
da prenhez (BINELLI et al., 1999). Imediatamente após a ovulação, se inicia o
desenvolvimento do corpo lúteo, uma estrutura glandular transitória, com
capacidade de sintetizar vários hormônios, sendo que o principal é a
progesterona (P4), fundamental para preparar adequadamente o meio uterino
para o desenvolvimento do concepto. Para a determinação de uma prenhez,
deve ocorrer o reconhecimento fisiológico da presença do concepto. A luteólise
é promovida na ausência da fertilização ou quando o concepto é incapaz de
promover competentemente tal reconhecimento.
Diante deste contexto, estratégias farmacológicas podem ser
empregadas com a finalidade de reduzir a mortalidade embrionária entre os
dias 15 e 19 da gestação. Tais estratégias objetivam minimizar a capacidade
de síntese de PGF2 no endométrio materno e/ou maximizar o estímulo anti-
luteolítico induzido pelo concepto. Nesse contexto, a administração de
somatotropina recombinante bovina (bST) constitui uma estratégia que objetiva
maximizar o estímulo anti-luteolítico induzido pelo concepto, favorecendo o
reconhecimento materno-fetal. Verificou-se que o uso da bST aumenta a
expressão de RNAm nas células endometriais para proteínas que constituem o
histotrófo e favorece maior crescimento do concepto durante o estágio de pré e
peri-implantação. Vários estudos foram realizados para avaliar os efeitos da
bST na performance reprodutiva de vacas leiteiras em lactação e em doadoras
e receptoras de embriões. Entretanto, em fêmeas bovinas de corte, o estudo
dos efeitos da bST na reprodução são escassos e a determinação da dose com
melhor custo/benefício ainda não foi suficientemente estabelecida.
28
II REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Limitações da eficiência reprodutiva em rebanhos bovinos de corte
Na criação de bovinos a produtividade está diretamente relacionada à
eficiência reprodutiva das fêmeas, que devem apresentar um intervalo entre
partos (IEP) de 12 meses, gerando a produção de 1 bezerro/matriz/ano. Em
2013, o rebanho nacional era composto por 78.595.090 matrizes, destas
63.817.516 eram vacas e 14.777.574 novilhas com mais de 24 meses. Em
2014, estima-se uma produção nacional de 55.274.645 bezerros (ANUALPEC,
2014). Quando se estabelece uma relação entre o número de matrizes em
idade reprodutiva e o número de bezerros nascidos no ano subsequente,
estima-se uma produção nacional média de 0,70 bezerro/matriz/ano e um IEP
de 17 meses. Nos últimos sete anos, houve uma grande agregação ao valor do
bezerro ao desmame, onde o Índice Geral de Preços (IGP) passou de 60 por
bezerro em 2006 para 183,0 IGP/bezerro em 2013 (ANUALPEC, 2014).
Conclui-se que a baixa eficiência reprodutiva nas operações de cria,
caracterizada pela baixa eficiência na produção de bezerros nascidos, reduz a
lucratividade e a competitividade do setor pecuário.
Segundo a Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ), para
obter uma eficiência reprodutiva de 100% a matriz deve ter o primeiro parto aos
36 meses e o IEP de 12 meses. Em rebanhos bovinos, a mortalidade
embrionária é uma das maiores causas de falhas reprodutivas, conforme
revisado por Santos et al. (2004) e Sartori (2004). Nos primeiros sete dias pós-
inseminação tal mortalidade foi associada a falhas de fertilização, defeitos
genéticos e anormalidades no desenvolvimento embrionário até o estágio de
blastocisto. Neste período, a mortalidade normalmente é inferior a 10%, mas
em vacas de leite sob estresse calórico pode ultrapassar 40% (SARTORI,
2004; SARTORI et al., 2002). Em fêmeas bovinas os principais desafios
biológicos para o estabelecimento da prenhez ocorrem no período
especialmente compreendido entre os dias 15 e 19 após a fecundação, esse
29
designado de “período crítico” (BINELLI et al., 2001). Neste período específico
foram reportadas perdas embrionárias de 20 a 40% em fêmeas zebuínas,
grande parte atribuídas à incapacidade do concepto em promover o
reconhecimento materno fetal e, desta forma, determinando a mortalidade
embrionária precoce (MACHADO et al., 2009).
2.2 Mortalidade embrionária precoce
O ciclo estral de fêmeas bovinas é mediado por um conjunto de
mecanismos neuroendócrinos. A ocorrência da luteólise, entre os dias 15 e 19
do ciclo estral, determina o fim da fase progestacional, o desenvolvimento de
um folículo pré-ovulatório e o estro. Em fêmeas bovinas um “período crítico” é
determinado quando o estado fisiológico reprodutivo da fêmea deve ser
definido para a manutenção do corpo lúteo e da prenhez ou para o
desencadeamento da luteólise e do estro. A luteólise é desencadeada pela
ocorrência de 5 a 8 pulsos de PGF2, ocorridos durante 2 ou 3 dias,
compreendidos entre o 15º e 19o dias do ciclo. Na presença do concepto, o
reconhecimento materno-fetal deve ser estabelecido de forma competente para
evitar a liberação dos pulsos de PGF2 (BINELLI et al., 2001). Segundo Godkin
et al. (2008), durante este período, na ocorrência de uma prenhez, o concepto
(embrião e membranas associadas) deve tornar-se capaz de enviar sinais anti-
luteolíticos apropriados ao endométrio e este responder a tais sinais, inibindo a
síntese de PGF2 endometrial. Frequentemente, tal evento fisiológico não é
bem sucedido, resultando na ocorrência da luteólise, na mortalidade
embrionária e em perdas representativas na pecuária.
A mortalidade embrionária associada à falha na manutenção do corpo
lúteo aumenta os intervalos entre partos (HANK, 1979). Falhas de fertilização
até o 8° dia pós-inseminação são responsáveis por 10% dos casos de fracasso
reprodutivo, enquanto as mortes embrionárias entre os dias 8 e 16 pós-
inseminação contribuem com mais de 30% dos referidos casos (DISKIN;
30
SREENAN, 1980). Isso justifica relatos de taxas de nascimento após única
inseminação de 50 a 55% para novilhas (ROCHE et al., 1977; SREENAN;
MULVEHILL, 1975), de 52% a 57% para vacas selecionadas para a produção
leiteira (MAWHINNEY; ROCHE, 1978) e de 53% para vacas especializadas na
produção de carne (ROCHE et al., 1977).
Em fêmeas bovinas, é de amplo conhecimento que a PGF2 é o
principal agente luteolítico e tem como função promover a luteólise
(CARAMBULA et al., 2002; MEIDAN et al., 1999). Sabe-se ainda que a
estimulação da síntese de PGF2 envolve fatores endócrinos como o estradiol
(E2), a ocitocina (OT), a progesterona (P4) e o hormônio luteinizante (LH). O
papel do E2 neste contexto foi pouco estudado. Contudo, sabe-se que durante
o período crítico a supressão do E2, por meio da irradiação ou cauterização de
folículos retarda a luteólise (HUGHES et al., 1987). Além disso, vacas prenhes
apresentam diminuição do E2 circulante (PRITCHARD et al., 1994),
provavelmente em função de uma redução no desenvolvimento folicular e na
produção de E2 pelo folículo (THATCHER et al., 1991). Em contrapartida, a
administração de E2 em vacas cíclicas estimula a luteólise e promove o estro
(THATCHER et al., 1986) e quando aplicado em vacas no 18° dia da prenhez
estimula apenas de maneira modesta a produção de PGF2 (THATCHER et
al., 1991). Sugere-se que, possivelmente, a presença do embrião atenua os
efeitos do E2.
A síntese de PGF2 no endométrio de fêmeas bovinas resulta de uma
complexa cascata de eventos intracelulares que ocorrem de maneira altamente
coordenada. Tais eventos envolvem a ativação sequencial de várias proteínas
como a proteína acopladora da guanosina trifosfato (GTP), a fosfolipase C
(PLC), a proteína quinase-C (PKC), a fosfolipase A2 (PLA2) e a ciclooxigenase
2 (COX-2).
Concentrações circulantes de P4 parecem estar correlacionadas
positivamente com o reconhecimento da prenhez em bovinos. Verificou-se
maior concentração de P4 no leite de vacas inseminadas e prenhes do que em
vacas inseminadas e não prenhes (BULLMAN; LAMMING, 1978; LAMMING et
31
al., 1989; MANN et al., 1999). Sugere-se que a alta concentração de P4 durante
o período crítico é importante para a manutenção da prenhez.
O principal regulador deste reconhecimento é o interferon-tau (IFN-τ),
secretado no lúmen uterino pelo concepto (BINELLI et al., 1999). Um possível
mecanismo, por meio do qual a P4 estimula a manutenção da prenhez, seria
pela estimulação da secreção IFN-τ. Reportou-se que o aumento na
concentração de P4, durante a fase luteal e o período crítico, estimula o
reconhecimento da prenhez. Durante o período critico, o concepto apresenta
um rápido aumento de tamanho. Thatcher e Hansen (1992) demonstraram que
no décimo sétimo dia os conceptos variavam o tamanho de 15-250 milimetros
(mm). Observou-se que a luteólise pode ocorrer mesmo na presença do
concepto, quando o mesmo não apresenta tamanho suficiente para produzir
IFN-τ em quantidade suficiente para promover, de forma bem sucedida, o
reconhecimento materno-fetal. A produção de IFN-τ foi positivamente
correlacionada ao tamanho do embrião e concepto (MANN; LAMMING, 2001).
Em fêmeas bovinas, durante tal período crítico, o concepto (embrião e
membranas associadas) deve produzir competentemente moléculas que
interagem com o endométrio inibindo a síntese de PGF2. Especificamente,
esse reconhecimento requer que moléculas produzidas pelo concepto
interajam com o endométrio para alterar a sua “pré-programação”, bloqueando
assim a secreção de PGF2 e impedindo a luteólise (BINELLI et al., 1999).
Neste contexto, as funções do concepto e do endométrio podem ser
melhoradas, para aumentar as possibilidades de êxito no reconhecimento
materno-fetal, reduzindo a mortalidade embrionária precoce ocorrida durante o
período critico.
O hormônio de crescimento (GH) e os componentes da família dos
fatores de crescimento semelhante à insulina (IGFs) podem estimular o
desenvolvimento do concepto e desempenhar um papel importante no
crescimento do mesmo e no processo de reconhecimento materno da prenhez
(LUCY et al., 1995).
32
2.3 Mecanismo de ação do hormônio de crescimento
A secreção hipofisária de GH está sob o controle de dois neuropeptídios
do hipotálamo, o hormônio liberador de GH (GHRH) e o hormônio inibidor do
GH (GIRH) reconhecido posteriormente como sendo a dopamina (TUGGLE;
TRENKLE, 1996). Um mecanismo de feedback negativo ajuda a manter em
equilíbrio da concentração de GH no organismo, logo, elevada taxa de GH na
circulação promove redução dos estímulos à adenohipófise e/ou reduz a
interação do mesmo com seus receptores teciduais, minimizando seus efeitos
(BACHA, 2013).
Após a liberação de GH pela glândula hipófise, o mesmo se conjuga a
proteína ligadora de GH (GHBP), identificada no soro de várias espécies
(BAUMANN, 1994), que liga-se ao domínio extracelular do receptor hepático de
GH (GHR). Demonstrou-se que a GHBP aumenta os efeitos do GH como
promotor de crescimento in vivo, provavelmente através do aumento da meia-
vida na circulação. Posteriormente, o GH é ligado a um receptor na membrana
das células-alvo. Tais receptores são altamente expressos no fígado, mas
também são encontradas em outros tecidos (SORENSEN et al., 1992). Membro
da superfamília de receptores de citocinas, GHR é capaz de se associar e
ativar a Janus quinase 2 (JAK2) que, por sua vez, ativa uma série de vias
intracelulares (WOJCIK; POSTEL-VINAY, 1995).
Os mecanismos de ação do GH podem ser divididos em diretos e
indiretos. O primeiro seria mediado pela cascata de sinalização intracelular
gerada pela ligação do GH ao seu receptor na membrana plasmática. O
segundo mecanismo seria intermediado pela regulação da síntese dos IGFs,
sintetizados principalmente no fígado (BACHA, 2013). Os efeitos biológicos do
GH são, em grande parte, mediados pela produção do fator de crescimento
semelhante à insulina tipo I (IGF I) no fígado e em tecidos periféricos
(BOGUSZEWSKI, 2001). Parte dos efeitos do GH também é mediado pelo fator
de crescimento semelhantes à insulina tipo II (IGF II), liberado em resposta ao
GH nos tecidos alvos. Além da síntese hepática, a produção local de IGF I e
33
IGF II tem também sido demonstrada em diversos outros tecidos e órgãos
(RENAVILLE et al., 2002).
O GH é um hormônio polipeptídeo, com peso molecular de 22
quilodaltons (kDa) constituído por 191 aminoácidos (CASAGRANDE;
CZEPIELEWSKI, 2007). O IGF-I é constituído por 70 aminoácidos e IGF-II por
67 aminoácidos, ambos polipeptídeos de cadeia simples com
aproximadamente 7,5 kDa. O IGF-I e IGF-II apresentam homologia em 70%
dos aminoácidos de suas cadeias, e uma homologia de 50% com a pró-
insulina. A sequência de IGF-I é altamente conservada entre espécies,
enquanto a de IGF-II difere entre as espécies (JONES; CLEMMONS, 1995).
As moléculas de IGF-I e IGF-II interagem com dois tipos de receptores,
tipo I e II, que diferem na sua sequência de aminoácidos, estrutura secundária
e especificidade de ligação-ligante (RAJARAM et al., 1997). O receptor tipo I
tem uma estrutura heterotetramérica homóloga à do receptor de insulina e
apresenta elevada afinidade para o IGF-I. O receptor de tipo II é idêntico ao
receptor da nanose 6-fosfato cátion-independente, com uma afinidade muito
fraca para o IGF-I e nenhuma afinidade para a insulina.
Os IGFs estão presentes em todos os fluidos biológicos, estando 95 a
99% ligados a uma família de seis proteínas estruturais ligadoras de fatores de
crescimento semelhantes à insulina (IGFBPs) (RAJARAM et al., 1997). Em
adultos, a maior parte das proteínas de ligação das IGFs está presente em um
complexo de 150 kDa que contém a IGFBP-3 (45-50 kDa) e uma proteína
adicional de 85 kDa conhecida como subunidade ácido-lábil. As IGFBPs
diferem nas funções e afinidade para o IGF-I e IGF-II. Além de servir como
proteínas transportadoras, há uma crescente evidência de que as IGFBPs
agem como potencializadoras ou moduladoras de várias atividades fisiológicas
complexas das IGFs.
Tratamentos com GH exógeno em vacas leiteiras em lactação,
independentemente da fase de lactação e modo de administração, aumentam
consideravelmente as concentrações de GH plasmático em até cinco vezes.
Utilizando-se de um sistema de detecção eletroquímioluminescente (ECL) e
34
anticorpos monoclonais, verificou-se que as concentrações de GH no leite
foram significativamente mais elevadas (P <0,05) em animais tratados quando
comparados ao grupo controle (BERTOZZI et al., 2001).
Os efeitos fisiológicos e metabólicos do GH em animais de produção
foram bastante documentados (CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU;
BONNEAU, 2001). A eficiência alimentar pode ser melhorada com a
administração de GH (CHILLIARD et al., 2001). O GH leva a um aumento da
lipólise, aumento da síntese de proteínas agregado a diminuição da
degradação de proteínas, bem como, promove um incremento de proteína no
organismo, fundamental para o crescimento (RENAVILLE et al., 2002).
O GH tem ação antagonista direta aos efeitos provocados pela insulina
sendo hiperglicemiante, diminuindo a utilização e oxidação de glicose pelos
tecidos (AIRES, 1991; GHANAAT; TAYEK, 2005), favorecendo a utilização de
ácidos graxos no tecido adiposo e na musculatura esquelética e cardíaca e
produção de glicose pelo fígado (GANONG, 1991; GHANAAT; TAYEK, 2005;
PELL, 1990). O GH é caracterizado como um hormônio “diabetogênico”, pois
aumenta a concentração de glicose circulante e estimula a liberação de mais
insulina para manter a glicemia adequada (CRUZAT et al., 2008; PELL,1990).
Os IGFs apresentam ações semelhantes à insulina em alguns tecidos,
importante atividade insulínica, aumentando a oxidação da glicose em
adipócitos (AIRES, 1991). Nesta situação a insulina é liberada, pois as células
ficam saturadas de glicogênio e o excesso de glicose no sangue estimula a
secreção de insulina, e a hiperglicemia pode ser desenvolvida devido a um
excesso de tamponamento pelo IGFBP-1 nos IGFs livres (ROTUNNO; ZAIA,
2001). Tanto a insulina quanto o IGF-I parecem concorrer para manter normais
os valores de glicose no sangue. O IGF-I auxilia na homeostase da glicose
favorecendo seu transporte para dentro das células, durante o jejum e na
ausência de insulina (NYOMBA et al., 1997). A ação hipoglicemiante da
insulina pode ser impedida pela ação do GH, resultando num quadro de
resistência à insulina com menor captação da glicose pelas células musculares
e adiposas e estimulação da gliconeogênese hepática (BERNE; LEVY, 1990;
35
ROTUNNO; ZAIA, 2001). A ação diabetogênica do GH é apontada como uma
das maiores limitações ao uso crônico de altas doses de GH, pois pode
provocar hiperglicemia, fator de risco para diversas complicações
cardiovasculares (ADAMS, 2000; BORST, 2004).
O GH também é considerado um hormônio “anabólico”, pois promove
um balanço proteico positivo (FRYBURG et al., 1991), aumento na quantidade
de massa muscular (MACHIDA; BOOTH, 2004) e liberação de IGF-1 (ADAMS,
2000), o qual está envolvido na estimulação do processo hipertrófico muscular
(CHEN et al., 2005; MACHIDA; BOOTH, 2004). Os efeitos do GH no
metabolismo proteico dependem da interação entre o GH, as IGFs e os
substratos, em especial, as proteínas (CRUZAT et al., 2008; RENNIE, 2003),
aumentando transporte e a concentração no interior da célula da maioria dos
aminoácidos. O GH estimula a síntese proteica celular, pois aumenta a
transcrição de RNA que, consequentemente, eleva a síntese, por meio dos
ribossomos, de novas proteínas na célula (GUYTON; HALL, 2006; MEDEIROS;
SOUSA, 2008). O GH também desfavorece o catabolismo proteico e de
aminoácidos (GUYTON; HALL, 2006; MEDEIROS; SOUSA, 2008.) diminuindo
o seu uso como fonte de energia. Também está bem estabelecido que o GH
exógeno aumente a massa muscular e diminui o conteúdo lipídico da carcaça
(CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU; BONNEAU, 2001). Estas mudanças
envolvem pelo menos um aumento na síntese de proteínas em animais
alimentados com um nível adequado de proteínas. Assim, o tratamento com
GH cria um estado de balanço positivo de nitrogênio, aumentando a retenção
de nitrogênio e diminuindo o catabolismo proteico. Além disso, proteínas
musculares podem ser mobilizadas, mas de forma limitada, porque a
administração de GH diminui oxidação de aminoácidos e a excreção de
nitrogênio urinário, o que explica o aumento em deposição de proteína em
animais em crescimento (CHILLIARD et al., 2001).
Nos tecidos, o GH aumenta a conversão de ácidos graxos em acetil-
CoA, sendo este utilizado para a produção de energia e, assim, favorecendo a
utilização da gordura para a produção de energia (BERNE; LEVY, 1990). O GH
36
mobiliza grandes quantidades de AGL, do tecido adiposo, para suprir a maior
parte das necessidades energéticas das células (GUYTON, 1982; ROTUNNO;
ZAIA, 2001). O tratamento com GH estimula a lipólise, elevando as
concentrações circulantes de ácidos graxos livres (AGL), aumentando a
capacidade do organismo de responder a estímulos lipolíticos e reduzindo a
oxidação de glicose no tecido adiposo em suínos, ovinos e bovinos (BREIER,
1999; CHILLIARD et al., 2001; LOUVEAU; BONNEAU, 2001). A redução da
deposição de lipídios resulta da diminuição na taxa de lipogênese in vivo
(DUNSHEA et al., 1992) e in vitro (LOUVEAU; BONNEAU, 2001; WANG et al.,
1999) e de um decréscimo na expressão de RNAm e atividades de várias
enzimas lipogênicas (LOUVEAU; BONNEAU, 2001; WANG et al., 1999). Além
disso, administração de GH em bovinos e suínos diminui bruscamente a
quantidade de RNAm da lipoproteína lipase e estearoil-CoA desnaturase no
tecido adiposo (BESWICK; KENNELY, 2000; WANG et al., 1999).
Nas vacas em lactação, a administração de GH é caracterizada por um
aumento no teor de ácidos graxos não esterificados (NEFA) na circulação,
resultante da lipomobilização. A administração de GH também eleva as
concentrações de insulina e glicose no plasma (CHILLIARD et al., 2001;
LOUVEAU; BONNEAU, 2001).
A administração de GH aumentou as concentrações de IGF-I no plasma
em quase quatro vezes 48 horas pós-injeção, atingiu seu pico máximo 10 dias
após a aplicação, permanecendo elevada até o 14o dia pós-aplicação quando
comparada às vacas tratadas com placebo (BERTOZZI et al., 2001). Como
observado em cordeiros, o tratamento crônico com GH leva a um aumento
dose-dependente no número de GHR com alta afinidade hepática e a
autorregulação do GHR. A estimulação do GH em mecanismos pós-receptores
pode levar a um aumento da síntese do IGF-I e um aumento nas
concentrações plasmáticas (BREIER et al., 1994; SÉVE et al., 1993). Este
aumento de IGF-I no soro é acompanhada por um aumento de
aproximadamente 140% na abundância de RNAm de IGF-I no fígado
(VANDERKOOI et al., 1995). A regulação da síntese de IGF-I, em grande
37
parte, é devido ao nível de abundância de RNAm (SÉVE et al., 1993),
evidenciando que o aumento da síntese de IGF-I no fígado é, em grande parte,
responsável pelo aumento na concentração de IGF-I no soro de animais
tratados com GH.
No entanto, em vacas leiteiras, a resposta de IGF-I circulante às injeções
de GH é maior no fim da lactação ou após a secagem do que no início da
lactação, quando as vacas têm um grande balanço energético negativo
(CHILLIARD et al., 2001).
Utilizando-se da técnica de Western Blotting, observou-se que os
tratamentos com GH aumentam a quantidade de IGFBP-3 no soro em
aproximadamente 60% e diminuem a quantidade de IGFBP-2 em 25%
(BERTOZZI et al., 2001). Estes resultados permitem sugerir que a relação
calculada de IGFBP-3/IGFBP-2 é drasticamente alterada pelo tratamento com
GH, e amplifica diferenças significativas entre os animais tratados e não
tratados (BERTOZZI et al., 2001).
2.4 Efeitos da somatotropina recombinante bovina na performance reprodutiva
de fêmeas bovinas
A bST já vem sendo utilizada no Brasil há mais de 30 anos, desde o
início da década de 80. A partir de 1982, usando a tecnologia de recombinação
de DNA, a bST passou a ser produzida em escala comercial possibilitando seu
emprego na produção animal (BAUMAN et al., 1985). A ação anabólica da bST
na glândula mamária, resulta em aumento do número de células alveolares
secretoras e ao estímulo a galactopoiese (BAUMAN, 1992; LEE et al., 2007;
PEEL et al., 1983). Por essa razão, a bST foi um dos primeiros fatores de
crescimento produzidos em grande escala para a indústria da produção animal,
visando aumentar a produção de leite em vacas leiteiras (BAUMAN, 1999).
O uso da bST tem sido proibido em alguns países como Canadá e na
União Europeia (CASTIGLIEGO et al., 2011). Até o momento, não foram
observados efeitos negativos da bST na saúde animal. Após três décadas de
38
pesquisa sobre a bST, não foram encontradas evidências científicas de que o
consumo de leite e carne de animais tratados ofereçam riscos à saúde
humana, inclusive em relação a diminuição da idade da puberdade e a
incidência de câncer de mama (RAYMOND et al., 2009).
A bST e o IGF-I participam da regulação do desenvolvimento folicular,
maturação do oócito, taxa de fertilização, desenvolvimento inicial embrionário,
função do corpo lúteo e reconhecimento materno da prenhez (HERNÁNDEZ-
CERÓN; GUTIERREZ-AGUILAR, 2013).
O número de folículos em crescimento é aumentado quando a vaca ou
novilha é tratada com bST (LUCY, 2000; LUCY et al., 1999). O mecanismo pelo
qual a bST aumenta o desenvolvimento folicular não é completamente
entendido, mas, provavelmente, resulte do efeito estimulatório da bST e/ou
fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), este hormônio secundário
liberado em resposta a bST (ETHERTON; BAUMAN, 1998). A bST também
atua na melhoria da qualidade do oócito e desenvolvimento embrionário
(IZADYAR et al., 1996; LUCY, 2000; LUCY et al., 1999; MOREIRA et al.,
2001a; THATCHER et al., 2001).
A administração da bST na inseminação (BILBY et al. 2006; IZADYAR et
al., 1996; MOREIRA et al., 2000), antes da transferência de embrião
(MOREIRA et al., 2001) e em vacas em balanço energético positivo e em mais
de 100 dias de lactação (BELL et al., 2008; STARBUCK et al., 2006) promoveu
aumentado na taxa de concepção. A bST utilizada na superovulação de
doadoras, determinou melhoria na qualidade dos embriões e aumento na taxa
de prenhez (LEE et al., 2007). Entretanto, alguns estudos possibilitaram
evidenciar que a utilização da bST em repetidos protocolos de superovulação
não afetou a taxa de prenhez em novilhas receptoras no momento da
transferência (HASLER et al., 2003), não aumentou a quantidade de embriões
produzidos (BORGES et al., 2001; NEVES et al., 2005) e não incrementou a
resposta ovariana quanto ao número e qualidade de embriões (MORAES
JUNIOR et al., 2008).
39
As consequências do tratamento com bST na fertilidade não são claros.
Em estudos prévios, vacas tratadas com bST tiveram um aumento no intervalo
entre parto-concepção que foi atribuído, pelo menos em partes, ao aumento do
anestro (ESTEBAN et al., 1994a; 1994b). Em contraste, bST tanto aumentou
sucesso na taxa de prenhez (MOREIRA et al., 2000; MOREIRA et al., 2001a)
como também não teve efeito (BLEVINS et al., 2006; JOUSAN et al., 2007;
SANTOS et al., 2004) quando as vacas foram inseminadas utilizando um
protocolo de IATF. O tratamento com bST aumentou a taxa de prenhez em
vacas de segundo serviço que se encontravam em estro (MORALES-ROURA
et al., 2001).
A bST pode ser particularmente efetiva em aumentar a fertilidade
durante períodos de estresse calórico. Isto porque o IGF-I, cuja secreção é
estimulada pela bST (JOUSAN et al., 2007; MCGUIRE et al., 1992), apresenta
propriedades termo protetoras e pode reduzir o efeito da temperatura elevada
no desenvolvimento e apoptose de culturas de embriões bovinos (JOUSAN;
HANSEN, 2004; 2007). De fato, a proporção de vacas lactantes em estresse
por calor que receberam embriões produzidos in vitro que se tornaram prenhes
foi maior quando os embriões foram cultivados em IGF-I antes da transferência
(BLOCK et al., 2003; BLOCK; HANSEN, 2007).
Apesar do uso da bST no verão aumentar IGF-I e melhorar resistência
embrionária ao estresse calórico, não houve efeito da bST na taxa de prenhez
em um estudo que examinou efeito da bST na fertilidade durante estresse
calórico (JOUSAN et al., 2007). Neste experimento, vacas receberam bST
todos os 14 dias iniciando 13 dias antes da IATF. A falha para observar
aumento na fertilidade causada pela bST pode ter sido promovida pelo fato do
bST também promover aumento da temperatura corporal.
Em bovinos o útero e o embrião apresentam receptores para o GH e
IGF-I que por ação endócrina, parácrina e autócrina atuam em ambas as
estruturas durante o estabelecimento da prenhez (KOLLE et al., 2001;
RHOADS et al., 2008; YASEEN et al., 2001). De fato, experimentos realizados
in vivo e in vitro permitiram evidenciar o efeito positivo do GH e IGF-I nas
40
funções uterinas aumentando a expressão de RNAm para proteínas que
constituem o histotrófo e no desenvolvimento do concepto durante o estágio de
pré e peri-implantação em muitas espécies (BILBY et al., 2006; KOLLE et al.,
2002; MARKHAM; KAYE, 2003; SPENCER et al., 1999; WHATES et al., 1998).
Assim o GH e IGF-I constituem uma importante estratégia para promover um
maior desenvolvimento do concepto e uma redução nas perdas embrionárias.
Alguns autores sugerem que tais benefícios sejam dose-dependentes (BILBY
et al., 2004; RIVERA et al., 2010).
Moreira et al. (2002) verificaram que a administração de bST
incrementou as taxas de fertilização, acelerou o desenvolvimento embrionário e
melhorou a qualidade dos embriões. Moreira et al. (2002a) administraram
500mg de bST em doadoras de embriões e/ou receptoras e verificaram que a
administração de bST aumentou a porcentagem de embriões transferíveis, o
número de blastocistos obtidos por lavagem e as taxas de prenhez. A maioria
dos trabalhos realizados com bST abordam seus efeitos em vacas leiteiras em
lactação e doadoras de embrião mestiças. Até o momento existem poucas
investigações realizadas em fêmeas de corte.
III OBJETIVOS
No presente estudo objetivou-se: avaliar o efeito da aplicação de bST,
na dose de 250 ou 500mg, no dia da IATF, na taxa de concepção aos 30 dias
de gestação (Experimento 1); verificar os efeitos da aplicação de 500mg de
bST, sete dias após a IATF, na taxa de concepção aos 30 dias de gestação
(Experimento 2) e averiguar os efeitos do bST na morfometria das glândulas
endometriais e na proporção de células esteroidogênicas luteais (Experimento
3).
41
IV HIPÓTESE
No presente estudo, a hipótese é que vacas de corte tratadas com bST,
no dia da IATF ou sete dias após a IATF, apresentam maiores taxas de
concepção e que a morfometria das glândulas endometriais e a proporção de
células esteroidogênicas luteais são alteradas por tal tratamento.
V MATERIAL E MÉTODOS
5.1 EXPERIMENTO 1
5.1.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda
Santo Antônio, localizada em Araguaiana, situada no estado do Mato Grosso.
O município apresenta latitude de 15º44'02" sul e longitude de 51º49'53" oeste,
estando a uma altitude de 269 metros, caracterizando-se como uma região de
clima tropical.
5.1.2 Animais. Neste estudo foram utilizadas vacas Nelore (n=587),
pluríparas, entre 40 e 70 dias pós-parto. O escore de condição corporal (escala
de 1 a 5) foi de 3,01 + 0,01; 3,00 + 0,01 e 3,00 + 0,01 para o grupo Controle,
bST 250 e bST 500, respectivamente. A condição ovariana foi avaliada por
ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic Equipament, Modelo SSD-500,
Tokyo-Japão), no dia da colocação dos dispositivos, quando verificou-se 30%
das fêmeas cíclicas e 70% em anestro. As fêmeas foram mantidas em pasto de
Brachiaria brizantha com fornecimento de água e suplementação mineral ad
libitum. Os animais utilizados neste estudo foram divididos em oito lotes de
manejo, todos submetidos à IATF no mesmo dia. Os diferentes tratamentos
foram equitativamente divididos em cada lote. Todos os procedimentos
experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação
42
Animal da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Araçatuba,
Araçatuba/SP, Brasil (Protocolo número 2013/00602).
5.1.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização dos
estros está representado na Figura 1. Foram utilizados dispositivos
intravaginais contendo 1g progesterona (DIB®; MSV Saúde Animal) associados
a uma injeção intramuscular (IM) de 2mg benzoato de estradiol (Gonadiol®;
MSV Saúde Animal) no dia da colocação do dispositivo. Os dispositivos foram
removidos oito dias após, quando as vacas foram tratadas com 0,530 mg de D-
cloprostenol (Ciosin®; MSV Saúde Animal) e 300UI eCG (Novormon®; MSV
Saúde Animal). As fêmeas foram tratadas com 1mg de benzoato de estradiol
(Gonadiol®; MSV Saúde Animal), via IM 24 horas após a remoção dos
dispositivos. Após 30 horas da última injeção as vacas foram submetidas à
IATF. O dia da IATF foi considerado o D0.
Figura 1 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 1:
colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração
de 0,530mg de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via iM (D-2); administração de
43
1mg de benzoato de estradiol via IM (D-1); IATF (D0) 30 horas após a aplicação da
última injeção; aplicação no D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =
194), 250mg bST via SC (Grupo bST 250; n=197) ou 500mg bST via SC (Grupo bST
500; n=196) e diagnóstico de gestação por ultrassonografia 30 dias após IATF (D30)
em vacas de corte
5.1.4 Procedimento de IATF. Foi utilizado o sêmen de um reprodutor da
raça Aberdeen Angus, com características físicas e morfológicas dentro dos
padrões andrológicos recomendados. As inseminações foram realizadas por
três inseminadores divididos equitativamente entre os diferentes grupos de
tratamento.
5.1.5 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na
Figura 1. Durante o procedimento de IATF as vacas receberam 5ml de solução
salina (Grupo Controle; n= 194); bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo
bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), aplicados via subcutânea
(SC) na fossa ísqueo-retal.
5.1.6 Diagnóstico de Gestação. O diagnóstico de gestação foi realizado
30 dias após a IATF (D30) por ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic
Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão) com transdutor linear de 5mHz.
As fêmeas foram classificadas em prenhes (presença do feto) ou não prenhes
(ausência do feto).
5.1.7 Análise Estatística. Foi utilizado o programa estatístico SAS (SAS,
2003; SAS Institute, Cary, NC, USA). Os dados foram analisados por análise
de variância e os grupos foram comparados pelo Glimmix procedimento do
SAS. No modelo inicial, para análise da taxa de concepção, incluiu-se os
efeitos de tratamento, lote, ECC e as interações. Para a obtenção do modelo
estatístico final, as variáveis explanatórias foram sequencialmente removidas
através do critério estatístico de Wald, utilizando como critério de remoção o
44
valor de P > 0,20. No modelo estatístico final considerou-se apenas o efeito de
tratamento. Nas análises considerou-se um nível de significância de 5%.
5.2 EXPERIMENTO 2
5.2.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda
Jacareúna, localizada no município de São Félix do Araguaia, estado do Mato
Grosso e na Fazenda Guanabara, localizada no município de Andradina,
estado de São Paulo. O município de São Félix do Araguaia apresenta latitude
de 11º37’02” sul, longitude de 50º40’10” oeste, altitude de 195 metros e
caracteriza-se como clima tropical. O município de Andradina apresenta
latitude de 20º53’38” sul, longitude de 51º23’01” oeste, altitude de 405 metros e
caracteriza-se como clima tropical.
5.2.2 Animais. Foram utilizadas vacas Nelore (n=243), pluríparas, entre
35 e 70 dias pós-parto. O escore de condição corporal (escala de 1 a 5) foi de
2,8 + 0,01 e 2,9 + 0,01 para o Grupo Controle e bST 500 respectivamente. As
fêmeas foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha e Panicum maximum,
com fornecimento de água e suplementação mineral ad libitum. Todos os
procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus
de Dracena, Dracena/SP, Brasil (Protocolo número 02/2008).
5.2.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização dos
estros está representado na Figura 2. Foram utilizados dispositivos
intravaginais contendo 1g progesterona (DIB®; MSV Saúde Animal) associados
a uma injeção intramuscular (IM) de 2mg benzoato de estradiol (Gonadiol®;
MSV Saúde Animal) no dia da colocação do dispositivo. Os dispositivos foram
removidos oito dias após, quando as vacas foram tratadas com 112,5g de D-
cloprostenol (Preloban®; Intervet Schering-Plough) e 300UI eCG (Folligon®;
Intervet Schering-Plough). As fêmeas foram tratadas via IM com 1mg de
45
benzoato de estradiol (Gonadiol®; MSV Saúde Animal) 24 horas após a
remoção dos dispositivos. Após 30 horas da última injeção as vacas foram
submetidas à IATF.
Figura 2 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 2:
colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração
de 112,5g de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de
1mg de benzoato de estradiol via iM (D-1); IATF (D0) 30 horas após a aplicação da
última injeção; aplicação no D7 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n =
124) ou 500mg bST via SC (Grupo bST 500; n=119) e diagnóstico de gestação por
ultrassonografia 30 dias após IATF (D30) em vacas de corte.
5.2.4 Procedimento de IATF. Para a realização da IATF foi utilizado o
sêmen 14 de reprodutores, com características morfológicas e funcionais
dentro dos padrões andrológicos recomendados. O sêmen de cada reprodutor
foi distribuído equitativamente entre os diferentes grupos de tratamento. A
inseminação foi realizada por dois técnicos na Fazenda Jacareúna e por dois
técnicos na Fazenda Guanabara. Os técnicos foram equitativamente
distribuídos entre os diferentes grupos de tratamento.
46
5.2.5 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na
Figura 2. Sete dias após a IATF (D7), as vacas receberam 5ml de solução
salina (Grupo Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500; n=119), via
SC na fossa ísqueo-retal.
5.2.6 Diagnóstico de Gestação. O diagnóstico de gestação foi realizado
30 dias após a IATF (D30) por ultrassonografia (Aloka Ultrasound Diagnostic
Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão) com transdutor linear de 5mHz.
As fêmeas foram classificadas em prenhes (presença do feto) ou não prenhes
(ausência do feto).
5.2.7 Análise Estatística. A análise estatística foi realizada utilizando o
programa estatístico SAS (SAS, 2003; SAS Institute, Cary, NC, USA). Os
dados foram analisados por análise de variância e os grupos foram
comparados pelo Glimmix procedimento do SAS. No modelo inicial, para
análise da taxa de concepção, incluiu-se os efeitos de tratamento, lote, ECC e
as interações. Para a obtenção do modelo estatístico final, as variáveis
explanatórias foram sequencialmente removidas através do critério estatístico
de Wald, utilizando como critério de remoção o valor de P > 0,20. No modelo
estatístico final considerou-se apenas o efeito de tratamento. O nível de
significância utilizado para todos os dados obtidos foi de 5%.
5.3 EXPERIMENTO 3
5.3.1 Local do Experimento. O experimento foi conduzido na Fazenda
São José, localizada em Birigui, situada no estado do São Paulo. O município
apresenta uma latitude 21º17'19" sul e uma longitude 50º20'24" oeste, estando
a uma altitude de 450 metros e caracteriza-se como uma região de clima
subtropical.
47
5.3.2 Animais. Foram utilizadas 20 novilhas da raça Nelore (Bos taurus
indicus) não prenhas e cíclicas. As fêmeas foram previamente avaliadas quanto
à idade, peso e escore de condição corporal. O escore de condição corporal
(escala de 1 a 5) foi de 2,80 + 0,01 e 2,80 + 0,01 para o grupo Controle e bST
500, respectivamente. A condição ovariana foi avaliada por ultrassonografia
(Aloka Ultrasound Diagnostic Equipament, Modelo SSD-500, Tokyo-Japão), no
dia da colocação dos dispositivos, quando se verificou 40% das fêmeas cíclicas
e 60% em anestro. Durante o experimento, as novilhas foram mantidas em
confinamento e recebiam uma ração contendo em sua formulação: 1.220 kg
cana de açúcar picada + 850 kg de germe de milho + 500 kg de polpa de
laranja + 340 kg de torta de algodão + 30 kg de uréia + 60 kg de núcleo mineral
(Nutri proteinado S para bovinos de corte - Cobrac). As novilhas tiveram livre
acesso a sal mineral e água. Todos os procedimentos experimentais foram
aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Araçatuba,
Araçatuba/SP, Brasil (Protocolo número 2013/00602).
5.3.3 Sincronização das ovulações. O protocolo de sincronização das
ovulações está representado na Figura 3. As fêmeas tiveram os estros
sincronizados pelo uso de um dispositivo intravaginal novo contendo 1g de
Progesterona (DIB®, MSV Saúde Animal) associado a uma injeção de 2mg de
Benzoato de Estradiol (RIC-BE®, Tecnopec) via intramuscular (IM). Após oito
dias, os dispositivos foram retirados e os animais receberam uma injeção de
0,530 mg de D-Cloprostenol (Sincrocio®, Ouro Fino) e 300UI de eCG
(Novormon®, MSV Saúde Animal), via IM. As fêmeas foram tratadas com 1 mg
de benzoato de estradiol (RIC-BE®, Tecnopec), via IM 24 horas após a
remoção dos implantes. Após 30 horas da ultima injeção as fêmeas receberam
os tratamentos, foi considerado o D0.
48
Figura 3 – Representação esquemática do delineamento referente ao Experimento 3:
colocação do dispositivo intravaginal contendo 1g P4 associado a 2mg de benzoato de
estradiol via IM (D-10); retirada do dispositivo intravaginal associado a administração
de 0,530mg de D-cloprostenol e 300UI de eCG ambos via IM (D-2); administração de
1mg de benzoato de estradiol via iM (D-1); Dia esperado para o estro (D0); aplicação
no D0 de 5ml de solução salina via SC (Grupo Controle; n = 9) ou 500mg bST via SC
(Grupo bST 500; n=11) e abate dos animais com coleta de útero e corpo lúteo (D15)
em vacas de corte.
5.3.4 Tratamento com bST. Os tratamentos estão representados na
Figura 3. As novilhas receberam 5ml de solução salina (Grupo Controle; n= 10);
ou bST (Boostin) na dose de 500mg (Grupo bST 500; n=11), aplicados via
subcutânea (SC) na fossa ísqueo-retal.
5.3.5 Coleta do Corpo Lúteo. Imediatamente após o abate das fêmeas
no D15, os ovários foram removidos, pesados separadamente e aferidos
quanto ao diâmetro. O corpo lúteo foi isolado e mensurado quanto ao diâmetro
e peso. O corpo lúteo foi segmentado em quatro cortes que foram
imediatamente acondicionados em solução fixadora de formol tamponado
49
(PAF), pH 7,0. Posteriormente os fragmentos foram lavados por seis vezes
consecutivas, a cada 12 horas, com solução de PBS pH 7,5.
5.3.6 Preparo Histológico do Corpo lúteo. Após a fixação o tecido foi
desidratado, através de imersão em uma sequência de soluções alcoólicas em
concentrações graduais e crescentes. Inicialmente imergiu-se o tecido por 60
minutos em álcool 70%; posteriormente em álcool 90% por 60 minutos, seguido
por dupla lavagem com álcool absoluto totalizando 120 minutos e finalmente
uma dupla lavagem com xilol totalizando mais 120 minutos. Após a
desidratação o tecido foi “emblocado” em parafina (Histosec). O tecido foi
submetido a secções de 6 a 8m de espessura. Posteriormente, este tecido foi
tratado com xilol novamente para remoção da parafina. Em seguida foi
reidratado e submetido à coloração com hematoxilina-eosina (HE).
5.3.7 Avaliação das células luteais esteroidogênicas. As lâminas coradas
foram submetidas a um sistema de análise de imagem computadorizada (Leco
2001, MI, EUA) acoplado a uma câmera fotográfica (Axioplan 2, Modelo: MC 80
DX - Microscope Camera, Marca: ZEISS). As imagens foram registradas com a
câmera. Posteriormente foram submetidas à análise morfométrica por um
sistema de análise de imagem computadorizada conectado a um microscópio
de luz. As células esteroidogênicas foram individualmente mensuradas quanto
ao diâmetro, onde se considerou CLP quando o diâmetro médio foi < 20m e
CLG quando foi > 20m. Para estimar a porcentagem de CLG e CLP foram
contadas 200 células no total, obtidas em 16 lâminas/animal/tempo. Tal
avaliação foi realizada automaticamente pelo Select Measurements Windows
pela medição dos campos selecionados aleatoriamente.
5.3.8 Análise estatística para avaliação do corpo lúteo. A análise
estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SAS (2009 versão 9.2;
SAS Institute Inc., Cary, NC), considerando as vacas como unidade
experimental. Foi procedida uma análise pontual levando em conta, no modelo,
50
o efeito do tratamento (tratamento controle ou tratamento bST). Considerou-se
vaca com efeito aleatório e vaca dentro de cada tratamento. As variáveis
contínuas foram testadas quanto à normalidade utilizando o artifício “Guided
Data Analysis” do SAS e quando necessário foram transformadas, conforme a
sugestão do programa para alcançar a normalidade. Os dados foram
analisados por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc
Glimmix do SAS. Em todas as análises considerou-se um nível de significância
de 5%. Todos os resultados foram apresentados na forma de média ± erro
padrão não transformados.
5.3.9 Coleta do tecido endometrial. Imediatamente após o abate das
fêmeas no D15, o sistema genital foi isolado e o corno uterino ipsolateral ao
corpo lúteo foi seccionado longitudinalmente de modo a expor o tecido
endometrial. Foi realizada uma secção do corno uterino em todo o seu
diâmetro, no terço médio do corno contralateral ao corpo lúteo. O tecido foi
imediatamente acondicionado em solução fixadora de formol tamponado (PAF),
pH 7,0 (500ml de formol 40%, 20g de NaH2PO4 + H2O, 32,5g de NaH2PO4 e 5
litros de água destilada) por 24 horas. Posteriormente, os fragmentos foram
lavados por seis vezes consecutivas, a cada 12 horas, com solução de PBS pH
7,5.
5.3.10 Preparo histológico do tecido uterino. Após a fixação o tecido foi
desidratado, através de imersão numa sequência de soluções alcoólicas em
concentrações graduais e crescentes. A graduação foi iniciada imergindo-se o
tecido por 60 minutos em álcool 70%; posteriormente em álcool 90% por 60
minutos, seguido por dupla lavagem com álcool absoluto totalizando 120
minutos e finalmente uma dupla lavagem com xilol P.A – ACS totalizando 120
minutos. Após a desidratação do tecido o material foi primeiramente incluso por
duas horas em parafina histológica (Histosec), uma hora por vez, para posterior
“emblocamento” de forma a obter blocos de resina com o fragmento de tecido
em seu interior. Após a inclusão das amostras, secções endometriais de 4µm
51
de espessura foram cortadas em micrótomo (Leica RM 2155 – Rotary
Microtome) e dispostas em lâminas de vidro previamente identificadas. Em
seguida, as lâminas foram colocadas por 2 horas em estufa sob temperatura de
56°C a 58°C, com intuito de derreter o excesso de parafina, e posteriormente
foram transferidas para cubetas de coloração para dar seguimento a
desparafinação. Na Bateria I de coloração (Bateria I: submeteram-se as
cubetas a xilol I por 10 minutos, xilol II por 10 minutos, álcool 100% I por 5
minutos, álcool 100% II por 5 minutos, álcool 90% por 5 minutos, álcool 70%
por 5 minutos). Após os passos supracitados seguiu-se com o protocolo de
coloração Hematoxilina - Eosina (HE). Nesse, as cubetas foram submetidas à
água destilada por 15 minutos, corante hematoxilina de Harris por 1 minuto,
água corrente por 4 minutos, corante eosina a 5% por 1 minuto. Após a
coloração com HE, os cortes foram desidratados com a Bateria II de coloração
(Bateria II: submeteram-se as cubetas a álcool 95% por 5 minutos, álcool
100% I por 5 minutos, álcool 100% II por 5 minutos, xilol diafranizador por 5
minutos, xilol intermediário por 5 minutos e xilol de montagem por no mínimo
15 minutos). A seguir, colocou-se sobre cada corte corado uma gota de
bálsamo do Canadá (Entellan, Marca: Merk) e cobriu-se esse com lamínula. O
tempo estimado para que o material ficasse seco e pronto para a análise por
microscopia de luz foi de 72 horas.
5.3.11 Análise morfométrica das glândulas endometriais. Após a
obtenção das lâminas histológicas coradas, estas foram submetidas a um
sistema de análise de imagem computadorizada programado a um microscópio
de luz com câmera fotográfica (Axioplan 2, Modelo: MC 80 DX - Microscope
Camera, Marca: ZEISS), com o objetivo de obter fotos tiradas de 10 campos
ópticos selecionados aleatoriamente, 5 a partir de uma região superficial do
endométrio e 5 a partir de uma região de profundidade, com uma lente de
aumento 10x. Posteriormente, as fotos foram analisadas através do “software”
Image-Pro® PLUS-The Proven SolutionTM para obtenção do número de
glândulas, perímetro (μm) e área (μm2) das glândulas endometriais superficiais.
52
Foi mensurado do número de glândulas, perímetro (μm) e área (μm2) das
glândulas endometriais profundas; assim como todas estas medidas para as
glândulas totais (superficiais + profundas). A contagem do número de glândulas
endometriais foi realizada pela leitura de 10 campos ópticos selecionados
anteriormente.
5.3.12 Análise estatística da morfometria das glândulas endometriais. A
análise estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SAS (versão
9.2; SAS Institute Inc., Cary, NC). A análise estatística considerando a
avaliação do número de glândulas endometriais sob o efeito de tratamento em
determinado tempo, considerou-se as vacas como unidade experimental. Fez-
se uma análise pontual levando em conta, no modelo, o efeito do tratamento
(tratamento controle ou tratamento com bST). Considerou-se vaca com efeito
aleatório e vaca dentro de cada tratamento. Na análise estatística considerando
apenas efeito de tratamento (tratamento controle ou bST), considerou-se vaca
com efeito aleatório e vaca dentro de cada tratamento. As variáveis contínuas
foram testadas quanto à normalidade utilizando o artifício “Guided Data
Analysis” do SAS e quando necessário foram transformadas conforme a
sugestão do programa para alcançar a normalidade. Os dados foram
analisados por análise de variância. As médias foram analisadas pelo Proc
Glimmix do SAS. Em todas as análises considerou-se um nível de significância
de 5%. Todos os resultados foram apresentados na forma de média ± erro
padrão não transformados.
VI RESULTADOS
6.1 Experimento 1. As taxas de concepção não diferiram entre os
tratamentos (p>0,05) e foram de 59,27% (115/194), 58,37% (115/197) e
65,82% (129/196) para os grupos Controle, bST 250 e bST 500
respectivamente, conforme representado na Figura 4.
53
Figura 4 – Experimento 1: Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após a
IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à IATF, tratadas com 5ml de
solução salina (Grupo Controle; n= 194) ou bST (Boostin) na dose de 250mg (Grupo
bST 250; n=197) ou 500mg (Grupo bST 500; n=196), via subcutânea (SC), p>0,05
6.2 Experimento 2. As taxas de concepção não diferiram (p>0,05) entre
os tratamentos e foram de 57,3% (71/124) e 60,50% (62/119) para o Grupo
Controle e bST 500 respectivamente, conforme representado na Figura 5.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Grupo Controle Grupo bST 250 Grupo bST 500
54
Figura 5 – Experimento 2: Efeito do tratamento na taxa de concepção 30 dias após a
IATF (D30), em vacas Nelore pluríparas submetidas à IATF, tratadas com 5ml de
solução salina (Grupo Controle; n= 124) ou 500mg de bST (Grupo bST 500; n=119),
via subcutânea (SC), p>0,05.
6.3 Experimento 3. As variáveis analisadas em relação ao corpo lúteo
estão representadas na Tabela 1. As imagens utilizadas para a composição
celular do corpo lúteo estão ilustradas nas Figuras 6 e 7. Não houve diferença
(p>0.05) entre o grupo controle e bST 500 para o peso médio dos ovários
(5,405 + 0,917 vs. 6,496 + 0,479g respectivamente; p=0,2712), diâmetro do
ovário esquerdo (2,068 + 0,140 vs. 2,254 + 0,096cm respectivamente;
p=0,2734), diâmetro do ovário direito (2,250 + 0,125 vs. 2,286 + 0,124cm
respectivamente; p=0,8435), diâmetro do corpo lúteo (1,335 + 0,054 vs. 1,590
+ 0,147cm respectivamente; p=0,1737), peso do corpo lúteo (2,325 + 0,226 vs.
3,010 + 0,313g respectivamente; p=0,1172), porcentagem de CLG (12,062 +
1,778 vs. 8,772 + 1,392% respectivamente; p=0,1589) e porcentagem de CLP
(77,187 + 10,980 vs. 91,22 + 1,392% respectivamente; p=0,1538).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Grupo Controle Grupo bST 500
55
Tabela 1 – Experimento 3: Média e erro padrão do peso dos ovários, diâmetro do
ovário esquerdo, diâmetro do ovário direito, diâmetro do corpo lúteo, peso do corpo
lúteo, porcentagem de CLG e porcentagem de CLP no D15, em novilhas Nelore
tratadas com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou com 500mg de bST (n=11) no D0
(D0=dia esperado para o estro)
Variáveis Grupo Controle
(n=9)
Grupo bST 500mg
(n=11)
Valor de
P
Peso Médio dos Ovários (g)
[(ovário esquerdo + ovário
direito)/2]
5,405 + 0,917
6,496 + 0,479
0,2712
Diâmetro Ovário Esquerdo (cm) 2,068 + 0,140 2,254 + 0,096 0,2734
Diâmetro Ovário Direito (cm) 2,25 + 0,125 2,286 + 0,124 0,8435
Diâmetro do Corpo Lúteo (cm) 1,335 + 0,054 1,590 + 0,147 0,1737
Peso do Corpo lúteo (g) 2,325 + 0,226 3,010 + 0,313 0,1172
CLG (%) 12,062 + 1,788 8,772 + 1,392 0,1589
CLP (%) 77,187 + 10,980 91,22 + 1,392 0,1538
56
Figura 6 – Experimento 3: Imagem das células luteais esteroidogênicas do corpo lúteo,
coradas por hematoxilina-eosina, em aumento de 40X, ilustrando células luteais
grandes (CLP; diâmetro < 20 μm) e células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20 μm)
no D15 (D0 = dia esperado para o estro) em novilhas Nelore tratadas com 5ml de
solução salina via SC (Grupo Controle; n = 9).
57
Figura 7 – Experimento 3: Imagem das células luteais esteroidogênicas do corpo lúteo,
coradas por hematoxilina-eosina, em aumento de 40X, ilustrando células luteais
grandes (CLP; diâmetro < 20 μm); células luteais pequenas (CLP; diâmetro > 20 μm),
no D15 (D0 = dia esperado para o estro) de novilhas Nelore tratadas com 500 mg de
bST via SC (Grupo bST 500; n = 11).
58
As variáveis analisadas em relação às glândulas endometriais estão
representadas na Tabela 2. As imagens utilizadas para a avaliação das
glândulas endometriais superficiais, profundas e totais estão ilustradas nas
Figuras 8 e 9. Não foi observada diferença significativa (p>0.05) entre o grupo
controle e bST 500 para as glândulas endometriais superficiais quanto ao
número (19,984 + 2,014 vs. 17,340 + 2,039 respectivamente; p=0,2596),
perímetro (208,371 + 34,713 vs. 251,536 + 17,346m respectivamente;
p=0,2437) e área (3173,54 + 659,087 vs. 3885,92 + 476,580m2
respectivamente; p=0,8435). Não foi observada diferença significativa (p>0.05)
entre o grupo controle e bST 500 para as glândulas endometriais profundas
quanto ao número (25,566 + 2,226 vs. 29,935 + 1,683 respectivamente;
p=0,2506), perímetro (170,287 + 23,807 vs. 198,817 + 10,834m
respectivamente; p=0,2437) e área (1920,89 + 254,89 vs. 2153,333 +
196,100m2 respectivamente; p=0,3806). Não foi observada diferença
significativa (p>0.05) entre o grupo controle e bST 500 para as glândulas
endometriais totais quanto ao número (45,550 + 8,063 vs. 47,275 + 2,644
respectivamente; p=0,8230), perímetro (378,658 + 55,636 vs. 450,353 +
19,632m respectivamente; p=0,1790) e área (5094,43 + 875,523 vs. 6039,253
+ 555,09m2 respectivamente; p=0,3359).
59
Tabela 2 – Experimento 3: Avaliação do número, perímetro (m) e área (m2) das
glândulas endometriais superficiais, profundas e totais em novilhas Nelore tratadas
com 5ml de solução salina via SC (n=9) ou com 500mg de bST (n=11) no D0 (D0=dia
esperado para o estro).
Variáveis Grupo Controle
(n=9)
Grupo bST 500mg
(n=11)
Valor de
P
Número de glândulas
endometriais superficiais
19,984 + 2,014
17,340 + 2,039
0,2506
Perímetro das glândulas
endometriais superficiais (m)
208,371 + 34,713
251,536 + 17,346
0,2437
Área das glândulas endometriais
superficiais (m2)
3173,54 + 659,087
3885,92, + 476,580
0,8435
Número de glândulas
endometriais profundas
25,566 + 2,226
29,935 + 1,683
0,2506
Perímetro das glândulas
endometriais profundas (m)
170,287 + 23,807
198,817 + 10,834
0,2437
Área das glândulas endometriais
profundas (m2)
1920,89 + 254,89
2153,333 +
196,100
0,3806
Número de glândulas
endometriais totais
45,550 + 8,063
47,275 + 2,644
0,8230
Perímetro das glândulas
endometriais totais (m)
378,658 + 55,636
450,353 + 19,632
0,1790
Área das glândulas endometriais
totais (m2)
5094,43 + 875,523
6039,253 + 555,09
0,3359
60
Figura 8 – Experimento 3: Imagem das glândulas endometriais superficiais, coradas
por hematoxilina-eosina, em aumento de 20X no D15 (D0 = dia esperado para o estro)
em novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou
com 5ml de solução salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente.
61
Figura 9 – Experimento 3: Imagem das glândulas endometriais profundas, coradas por
hematoxilina-eosina, em aumento de 20X no D15 (D0 = dia esperado para o estro) em
novilhas Nelore tratadas com 500mg de bST via SC (Grupo bST 500; n = 11) ou com
5ml de solução salina SC (Grupo Controle; n=9), respectivamente.
62
VII DISCUSSÃO
7.1 EXPERIMENTO 1
O uso do bST em protocolos de IATF tem sido associado a maiores
taxas de concepção em vacas de leite (MOREIRA et al., 2001), porém, são
poucos os relatos em vacas de corte. Recentemente, Albuquerque et al. (2012)
utilizaram em vacas Nelore paridas, protocolo de sincronização similar ao
utilizado neste estudo, associado a aplicação de 0 (n=294), 167 (n=304) ou
333mg (n=298) de bST no dia da IATF. A taxa de concepção encontrada foi de
37,4% no grupo controle, 45,4% para a dose de 167mg e 46% para as tratadas
com 333mg, tendo havido efeito de tratamento, embora não tenha havido efeito
de dose. É possível observar que embora tenha havido incremento na
fertilidade, a taxa de concepção do grupo controle foi menor (37,4%)
comparado à taxa usualmente encontrada em rebanhos comerciais de 49,1%.
(BARUSELLI et al., 2008; SÁ FILHO et al., 2009). Os mesmos autores
verificaram em um segundo experimento que, quando vacas Nelore foram
submetidas a IATF e receberam duas aplicações de bST, na dose de 333mg
no dia da IATF e onze dias após, a taxa de concepção não foi aumentada,
sendo de 48% no grupo controle e 42,3% no tratado. Pode-se observar, no
segundo estudo destes autores, que a taxa de concepção do grupo controle foi
maior quando comparada a taxa de concepção do primeiro estudo (48% vs.
37,4%), ou seja, quando a taxa do grupo controle foi de 48% o incremento na
fertilidade não pode ser observado.
No presente estudo, quando o bST foi administrado no dia da IATF, na
dose de 250 e 500mg, as taxas de concepção não foram aumentadas (59,27%
vs. 58,37% vs. 65,82%). Nesta ocasião, verificou-se uma maior taxa de
concepção no grupo controle (59,27%) comparada a taxa relatada em
rebanhos. Altas taxas de concepção no grupo controle também foram
evidenciadas no experimento 2 deste estudo (57,3%), ocasião que não houve
incremento na taxa de concepção. Tais evidências permitem sugerir que o bST
63
aumenta a taxa de concepção em rebanhos de corte usualmente com menores
taxas de concepção. Possivelmente, vacas com baixa condição corporal sejam
favorecidas pela aplicação de bST.
Em vários estudos evidenciou-se que a aplicação de bST promoveu um
aumento progressivo nas concentrações plasmáticas de GH e IGF-I ao longo
dos primeiros 7 dias, quando evidencia-se um pico destes hormônios,
prosseguido de um declínio diário gradual (RIBEIRO et al., 2013; ABOIN et al.,
2013). Desta forma, presume-se que a aplicação de bST no momento da IATF,
promove maiores concentrações de bST no período que coincidiria com o início
do desenvolvimento embrionário até o sétimo dia de desenvolvimento.
Kolle et al. (2001) demonstrou que receptores de GH estão presentes no
embrião a partir do estágio de duas células quando atua no metabolismo de
glicogênio e no transporte de lipídios ao embrião. Spencer et al. (1999)
demonstraram que o epitélio glandular do útero ovino respondeu a
administração intra-uterina de GH aumentando a expressão de RNAm das
proteínas que constituem o histotrófo, condição que favoreceu uma maior
produção de IFN-τ. Ribeiro et al. (2013) também verificaram que o GH e IGF-I
além de estimular a secreção de uma maior quantidade de histotrófo, iduziu a
proliferação celular e promoveu efeitos anti-apoptóticos. O aumento da
proliferação celular e o elongamento do concepto tornam-se extremamente
importantes para prevenir a luteólise e manter a gestação (SPENCER et al.,
1999). Tais ações associadas potencializariam o desenvolvimento do embrião
aumentando as possibilidades de sobrevivência embrionária. Considerando
estes relatos, no presente experimento, seria esperado um aumento na taxa de
concepção, evento que não foi caracterizado. De fato, a dose de bST para
vacas de corte não está estabelecida e as respostas dos embriões ao GH in
vitro foram usualmente dose-dependentes (MARKHAM; KAYE, 2003). Os
mesmos autores enfatizam a importância da dose de bST na subsequente
concentração de GH e IGF-I no estímulo a fertilidade. Possivelmente, a
ausência de incremento na fertilidade decorra de uma inadequada dose
64
utilizada, sugere-se que haja uma dose resposta que merece ser melhor
averiguada.
Em espécies de laboratório o excesso de IGF-I no útero afetou
negativamente a sobrevivência embrionária (PINTO et al., 2002). De fato, Bilby
et al. (1999) e Starbuck et al. (2003) relataram que a administração de bST em
vacas de corte e vacas leiteiras tipicamente aumentam as concentrações de
IGF-I mas falham em aumentar a fertilidade. Segundo Chi et al. (2000)
quantidades excessivas de IGF-I foram correlacionadas a uma maior apoptose
na massa celular interna do embrião (CHI et al., 2000). Tais efeitos negativos
seriam mediados por uma redução nos receptores de IGF nas células
embrionárias, desta forma determinando um redução na absorção de glicose
pelo embrião.
7.2 EXPERIMENTO 2
Considerando que a administração de bST foi realizada 7 dias após a
IATF, presume-se que os maiores efeitos ocorreriam do 7o ao 14o dia de
desenvolvimento do concepto, fase de elongamento do mesmo. Ribeiro et al.
(2013) trataram vacas leiteiras em lactação com 325mg de bST no dia da IA ou
a mesma dose no dia da IA e 14 dias após. Os autores verificaram que a
utilização de duas aplicações de bST reduziu a taxa de concepção quando
comparado à administração de uma única aplicação de bST, porém, promoveu
um aumento progressivo nas concentrações plasmáticas de GH e IGF-I ao
longo dos primeiros 7 dias. Os autores verificaram que o uso de duas doses
aumentou o diâmetro longitudinal da vesícula aminiótica e o tamanho do
concepto aos 34 e 48 dias de prenhez em relação ao grupo controle e única
dose, embora as taxas de concepção não tenham diferido. No presente estudo
a taxa de concepção não foi favorecida em animais tratados com 500mg de
bST sete dias após a IATF.
65
No estudo de Ribeiro et al. (2013) a dose de 325mg promoveu aumento
nas concentrações de GH e IGF-I mas não foi suficiente para alterar as
concentrações de P4. No presente estudo, no experimento 2, as concentrações
de P4 não foram alteradas no D7 e D16 em vacas de corte que receberam
500mg de bST sete dias após a IATF. De fato, os estudos com bST para
aumentar a fertilidade não relatam seus efeitos no tecido luteal e não
correlacionam seus efeitos positivos na fertilidade a maiores concentrações de
P4.
Experimentos realizados in vivo e in vitro evidenciaram que o GH e IGF-I
estimulam as funções uterinas e o desenvolvimento do concepto durante o
estágio de pré e peri-implantação em muitas espécies (WHATES et al., 1998;
SPENCER et al., 1999; KOLLE et al., 2002; MOREIRA et al., 2002;
MARKHAM; KAYE, 2003; BILBY et al., 2006). Assim GH e IGF-I constitui uma
importante estratégia para promover o maior desenvolvimento do concepto e
desta forma reduzir a mortalidade embrionária. Sugere-se que tais benefícios
são dose-dependentes (BILBY et al., 2004; RIVERA et al., 2010).
Possivelmente, no presente estudo, o aumento na taxa de concepção não
tenha sido evidenciado pela alta taxa de concepção do grupo controle,
conforme também discutido no experimento 1 e pelo uso de uma dose
inadequada de bST nas vacas de corte.
7.3 EXPERIMENTO 3
Evidenciou-se em alguns estudos in vivo e in vitro que a bST favorece o
crescimento do tecido luteal. O RNAm e a proteína do receptor de bST foram
localizados no CL (SCOTT et al., 1992) e nas CLG (LUCY et al., 1993). A
administração de bST aumentou o peso do CL (LUCY et al., 1995) e as
concentrações plasmáticas de P4 plasmática em fêmeas bovinas (GALLO;
BLOCK, 1991; SCHEMM et al., 1990). Lucy et al. (1995) trataram vacas de
leite com 25mg/dia bST (n=8) ou solução salina (n=8) por 16 dias após estro.
As vacas foram abatidas 17 dias após a injeção de bST e os ovários, útero e
66
concepto foram coletados. Verificou-se que a bST aumentou o peso do CL e o
número de folículos grandes (10 a 15 mm de diâmetro). Os mecanismos
através dos quais a bST aumenta o peso do CL não estão esclarecidos. A
diferenciação de células da granulosa, durante o período de peri-ovulação pode
ter sido estimulado porque a bST foi iniciada no dia do estro (LUCY et al.,
1995). Estudos posteriores, no entanto, não conseguiram demonstrar um efeito
positivo da bST no CL durante o período peri-ovulatório (LUCY et al., 1994).
No presente estudo, considerando os efeitos do GH e IGF-I no
crescimento dos tecidos, hipotetizou-se que a proporção de çelulas luteais
esteroidogênicas seria alterada por tal tratamento. Tal efeito não foi observado,
a proporção de CLG e CLP não foi diferente para novilhas tratadas com 500mg
de bST quando comparada ao grupo controle. Verificou-se que o peso e
diâmetro dos ovários e CL, assim como a proporção de CLG e CLP não foi
alterada me fêmeas tratadas com bST. De fato, os estudos com bST para
aumentar a fertilidade não correlacionam seus efeitos positivos na fertilidade a
maiores concentrações de P4. No estudo de Ribeiro et al. (2013) a dose de
325mg promoveu aumento nas concentrações de GH e IGF-I mas não foi
suficiente para alterar as concentrações de P4. De fato, Aboin et al. (2013)
verificaram que as concentrações séricas de P4 e catabolismo de P4 hepática
não foram afetadas pela administração BST e pelo aumento subsequente nas
concentrações de IGF-I sérico. Da mesma forma, Cooke et al. (2012) avaliaram
novilhas sem corpo lúteo, mas recebendo P4 exógena como uma abordagem
para estimar o catabolismo hepático de P4. Estes autores relataram que
novilhas que receberam 250mg de bST apresentaram semelhantes
concentrações plasmáticas de P4 e semelhante taxa de degradação de P4
hepática, no D6, D8 e D10 em relação à administração do tratamento, em
comparação com grupos que receberam solução salina.
Em bovinos o útero e o concepto apresentam receptores para o GH e
fator IGF-I, que por ação endócrina, parácrina e autócrina atuam em ambas as
estruturas durante o estabelecimento da prenhez (KOLLE et al., 2001;
RHOADS et al., 2008; YASEEN et al., 2001). De fato, experimentos realizados
67
in vivo e in vitro permitiram evidenciar o efeito positivo do GH e IGF-I nas
funções uterinas aumentando a expressão de RNAm para proteínas que
constituem o histotrófo e no desenvolvimento do concepto durante o estágio de
pré e peri-implantação em muitas espécies (BILBY et al., 2006; KOLLE et al.,
2002; MARKHAM; KAYE, 2003; SPENCER et al., 1999; WHATES et al., 1998).
Considerando os efeitos de ambos no crescimento dos tecidos e seus efeitos
positivos na secreção de histotrófo hipotetizou-se no presente estudo que a
aplicação de bST promoveria alterações na morfometria das glândulas
endometriais. Os receptores para a bST e IGF-1 estão presentes no
endométrio de vacas (WATHES et al., 1998) e em alta concentração nas
glândulas endometriais. Sugere-se que o IGF-1 regularia a atividade secretória
de tais glândulas (MOREIRA et al., 2002a). Portanto, o aumento nas
concentrações de IGF-1 em consequência do tratamento com bST exerceria
um efeito estimulatório na atividade secretória das glândulas endometriais. Tal
efeito promoveria um ambiente uterino mais favorável ao desenvolvimento do
embrião e concepto, facilitando a manutenção da gestação (MOREIRA et al.,
2002a). Entretanto, tal efeito não foi evidenciado considerando não ter havido
aumento no número, perímetro e área das glândulas endometriais superficiais,
profundas e totais. Desta forma, possivelmente a ação do bST no histotrófo
decorra da maior expressão e síntese de proteínas que constituem o mesmo
sem que haja uma promoção no número de células endometriais.
VIII CONCLUSÃO
Conclui-se que vacas tratadas com bST, no dia da IATF ou sete dias
após a IATF, não apresentam maiores taxas de concepção e que a
morfometria das glândulas endometriais e a proporção de células
esteroidogênicas luteais não são alteradas por tal tratamento.
68
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69
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