Mutação e Mutação e Mutação e Mutação e Conservação Conservação Conservação Conservação Mi biMi biMicrobianaMicrobiana
MACROMOLÉCULAS DA INFORMAÇÃO CELULARMACROMOLÉCULAS DA INFORMAÇÃO CELULAR
GENÉTICA GENÉTICA –– BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR
Genética de ProcariotosGenética de Procariotos
• Ocupa apenas 10% do volume celular (1 mm comprimento)p p ( p )• Superenovelamento do DNA dupla fita helicoidal
SUPERENOVELAMENTO DO DNAU E EN VEL MEN D DN
- Estado de torção da molécula do DNA
-- POSITIVOPOSITIVO* Dupla hélice torna-se mais enoveladaDupla hélice torna se mais enovelada
-- NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO* Dupla hélice torna-se subenovelada* DNA torcido ao longo do seu eixo na direçãoDNA torcido ao longo do seu eixo na direçãooposta à da dupla hélice dextrógira* Forma mais encontrada na naturezaForma mais encontrada na natureza
QUEM FAZ?? Topoisomerase II (DNA girase)QUEM FAZ?? Topoisomerase II (DNA girase)
Replicação do DNA
O mecanismo de replicaçãoestá baseado no pareamentoestá baseado no pareamentodas bases da dupla hélice doDNADNA.
FITAS ANTIPARALELAS
A estrutura do DNA contéma informação necessáriapara perpetuar suap p psequência de bases
R li U id d d DNA d á d Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon:
1. Origem + Término
2 d ú d l2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclocelular
3. O genoma de uma célula procariótica constitui umúnico repliconp
4. Cada cromossomo eucariótico constitui váriosreplicons e todos são ativados uma única vez noreplicons e todos são ativados uma única vez nociclo celular ainda que não simultaneamente
REPLICAÇÃO DO DNA
1º PASSO = Retirar o superenovelamento do DNA1 PASSO Retirar o superenovelamento do DNA
2º PASSO = Desfazer a dupla hélice do DNAp
3º PASSO = Copiar a fita de DNA (sentido 5’ – 3’)
4º PASSO = Estabilizar a fita antiparalela e adicionarPRIMERS de RNAPRIMERS de RNA
5º PASSO = Ligar os fragmentos de Okasaki gerados na fitag g gantiparalela
6º P O R l DN6º PASSO = Renovelar o DNA
Polimerases: Enzimas que sintetizam DNA
A síntese de DNA ocorrepela adição de nucleotídeos ap çextremidade 3´OH da cadeiaem crescimento. O precursorem crescimento. O precursorda síntese é o desoxiri-bonucleosídeo 5´trifosfatobonucleosídeo 5 trifosfato
Sentido da síntese sempreSentido da síntese sempreé 5’ → 3’
A replicação é umprocesso extremamente fiel.As DNA-polimerases tematividade revisora
Fragmentos deFragmentos deOkasaki ocorrem nafita descontínua
A DNA polimerasep mIII é responsávelpela síntese damaior parte do DNAmaior parte do DNA
A DNA polimeraseI remove o primerde RNA e preenchede RNA e preencheas lacunas
A DNA ligase selaas quebrasq
O complexo de replicaçãop p ç
í (h l )A proteína DNA B (helicase)é responsável pelo movimentopara frente da forquilhapara frente da forquilha
d lí dCada core catalítico da DNAPolIII sintetiza uma das fitas-filhasfilhas
fO primossomo afasta uma dasfitas molde
Proteínas SSB mantem asfitas parentais separadas
T i ã d DNAT i ã d DNATranscrição do DNATranscrição do DNA
Sí t d RNA• Síntese de RNAm• RNA polimerase (adição de ribonucleotídeos)
Interações da RNA polimerase com sequênciasd t DNAde promotores no DNA
A DNA/RNA polimerase também erra, mas ... ReparaA DNA/RNA polimerase também erra, mas ... Repara
E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???E se o erro não for reparado???
MutaçãoMutação• O que é mutação???
Mu çMu çO que é mutação???
ã d ê i d l íd d i lSão mudanças na sequência dos nucleotídeos do materialgenético de um organismo (GENÓTIPO).g g
Mutações podem ser causadas por erros de cópia doMutações podem ser causadas por erros de cópia domaterial durante a divisão celular, por exposição a radiaçãoUV I i Q í i M ê i VíUV ou Ionizante, Agentes Químicos Mutagênicos ou Vírus.
A célula pode também causar mutações deliberadamentedurante processos conhecidos como hipermutaçãodurante processos conhecidos como hipermutação
COMO DETECTAR UM MUTANTE?COMO DETECTAR UM MUTANTE?
Varredura x SeleçãoVarredura x Seleção
• Qualquer característica pode ser mutadaQualquer característica pode ser mutada• Mutações selecionáveis vantagens aoorganismoorganismo→ Cepa mutante suplanta a parental
R i tê i fá (→ Resistência a fármacos (comodetectar??)
ÃSELEÇÃO ferramenta poderosa
• Mutações não-selecionáveis alteraçõesno fenótipo visíveis sem vantagemno fenótipo visíveis sem vantagem→ Perda de pigmentaçãoVARREDURA observação visualVARREDURA observação visual
BASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃOBASES MOLECULARES DA MUTAÇÃO
MUTAÇÃO INDUZIDA x MUTAÇÃO ESPONTÂNEAMUTAÇÃO INDUZIDA x MUTAÇÃO ESPONTÂNEA
Naturalmente semintervenção
Realizada deliberadamente, intervenção humana
intervenção
PontualPontualFrameshift
E d L itErro de Leitura
A Base Molecular da MutaçãoCódigo genético para as tríades das bases no mRNA e o respectivo aminoácido que codificam
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MutaçãoMutação
• Mutação de Ponto → alteração de um nucleotídeo
MutaçãoMutação
Mutação de Ponto → alteração de um nucleotídeo- mutação silenciosa (sem alteração do produto final)
ã i ( l ã d i á id )- mutação missense (alteração do aminoácido)- mutação nonsense (formação de um códon terminal)
• Mutação FrameshiftMutação Frameshift- deleção ou inserção de alguns pares de base
l ã d ód ê i i á i d fi l- alteração dos códons, sequência primária, produto final
• Mutação Espontânea- erro de leitura da DNA polimeraseerro de leitura da DNA polimerase
• Alteração de Fases (Frameshift)Alteração de Fases (Frameshift)
Inserção ou Deleção de Nucleotídeos = Alteração dos códonsInserção ou Deleção de Nucleotídeos = Alteração dos códons
Erros da Replicação (DNA) ouErros da Replicação (DNA) ouTranscrição (RNA)
Perda completa da funçãogênica
Se a mutação ocorrer em umgene vital a mutação sera fatalgene vital, a mutação sera fatal
Mutações por inserçõesMutações por inserções -Transposon
O P d M ãO Processo de Mutação
Mutação por alteração de fasesç p ç(frameshift)
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O Processo de Mutação - Correção
C ã d d d l it (f hift)_________________________________________________________________________________EQB353 – Microbiologia Industrial Escola de Química / UFRJ
Correção do quadro de leitura (frameshift)
Mutação Espontânea
Ocorre ao acaso, sem causa aparente e é rara: 1 célula bacteriana em cada 106 a 1010 células são mutantes1 célula bacteriana em cada 106 a 10 0 células são mutantes
Taxa de mutações espontâneas em vários loci de diferentes microrganismos
_________________________________________________________________________________EQB353 – Microbiologia Industrial Escola de Química / UFRJ
• Mutagênese sítio-dirigidaMutagênese sítio dirigida
Eventos aleatórios não dirigidas a um gene específico (mutaçõesEventos aleatórios não dirigidas a um gene específico (mutaçõesclássicas)
b d d ífDNA recombinante = indução de mutações específicas em genesespecíficos
TRANSPOSONTRANSPOSON
Elemento transponível quep qse insere no interior de umgene (perda da funçãog (p çgênica) – utilização paracausar mutaçõescausar mutações
TAXAS DE MUTAÇÃOTAXAS DE MUTAÇÃO
• Grande variação dependendo do tipo de mutaçãoGrande variação, dependendo do tipo de mutação• Algumas mutações são praticamente impossíveis de seremdetect d s / utr s sã muit frequentes (pr blem s dedetectadas / outras são muito frequentes (problemas demanutenção das estirpes em estoque)
• Frequência de Erros 10-6 a 10-7 / par de quilobase durante 1único ciclo de replicação (um gene tem ≅ 1000 pares bases)
• Eucariotos taxa de mutação menorPOR QUE????
Homo sapiens = 80 anos / 4 gerações 2n = .......
Escherichia coli (g= 20 min) = 80 anos / 2.102.400 gerações n = 2.102.400
AGENTES MUTAGÊNICOSAGENTES MUTAGÊNICOS
• Taxa de mutações espontâneas são muito baixasA t í i fí i bi ló i t d t d• Agentes químicos e físicos ou biológicos aumento da taxa de
mutação
AGENTES QUÍMICOSAGENTES QUÍMICOS
a) Análogos Estruturaisg
- Pareamento incorreto das basesnucleotídicas
• Modificações químicas- Pareamento incorreto
Agem durante a replicação do DNA, modificando a mensagem proteica ou modificando a mensagem proteica ou impedindo sua duplicação.
Aumentam a freqüência das mutações pontuais
b) Á d N l DN él l d d d
AGENTES QUÍMICOSAGENTES QUÍMICOSb) Ácido Nitroso - altera o DNA em células que não estão se dividindo
através da remoção de grupos aminos das bases purinas edpirimidinas.
) l l õ d “ l k”c) Agentes alquilantes - promovem reações de “cross-link”entre asbases nitrogenadas, impedindo a abertura da
f d Dfita do DNA. Aumentam muito asmutações pontuais → substituição por grupos alquil.
E l E lf (EE ) E l lf (E )ex.: Etil-Etano-Sulfonato (EES); Etil-Metano-Sulfonato (EMS);Nitrosoguanidina (NTG)
d) Agentes intercalantes – se intercalam entre as bases nitrogenadas.f f d d lDeformam a fita de DNA ou provocam o deslocamento
do quadro de leitura.d fl P fl
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ex.: Acridinas, Acriflavinas, Proflavinas
AGENTES FÍSICOSAGENTES FÍSICOS
•• RADIAÇÃORADIAÇÃORADIAÇÃORADIAÇÃO
Vári s f rm s de r di çã sã lt mente mut ênic s- Várias formas de radiação são altamente mutagênicas- Radiações Eletromagnéticas
IONIZANTERadiação gama, raios cósmicos, raios X
NÃO-IONIZANTERadiação ultra-violeta (amplamente empregada para induzirRadiação ultra violeta (amplamente empregada para induzirmutação)
AGENTES FÍSICOSAGENTES FÍSICOS
•• RADIAÇÃORADIAÇÃO IONIZANTEIONIZANTERADIAÇÃORADIAÇÃO IONIZANTEIONIZANTE
I niz çã de á uIonização de águaEfeitos indiretos (radicais químicos livres – OH)
Danos no DNA dose da radiação (poucos danos) dose daradiação (letal para a célula)
Alto poder de penetração (diferentemente do U.V.)Pouco utilizada em processos de mutação – PERIGOSAPouco utilizada em processos de mutação PERIGOSA
AGENTES FÍSICOSAGENTES FÍSICOS
•• RADIAÇÃORADIAÇÃO NÃONÃO--IONIZANTEIONIZANTERADIAÇÃORADIAÇÃO NÃONÃO--IONIZANTEIONIZANTE
F t t ã m b s s pú i sForte atuação em bases púricas epirimidicas
Dímeros de Timina adjacentes
DNA polimerase repara, porém sep p , pos erros forem muitos ...
MANIPULAÇÃO DE GENES MICROBIANOSMANIPULAÇÃO DE GENES MICROBIANOS
•• MUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO--DIRIGIDADIRIGIDAMUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO DIRIGIDADIRIGIDA
Mut çã in vitr utiliz nd DNA sintétic e cl n em de DNAMutação in vitro utilizando DNA sintético e clonagem de DNApara introduzir mutações em genes sítios (sítios específicos)
Mutações manipuladas por engenharia genética
MSD ferramenta poderosap- Permite alteração de qualquer base em um gene específico- Síntese de pequeno iniciador oligonucleotídico de DNA contendoSíntese de pequeno iniciador oligonucleotídico de DNA contendoa mutação (alteração de base) → pareamento com uma fitasimples de DNA contendo o gene alvosimples de DNA contendo o gene-alvo.
•• APLICAÇÃOAPLICAÇÃO DADA MUTAÇÃOMUTAÇÃO SÍTIOSÍTIO--DIRIGIDADIRIGIDA
Avaliar a atividade de proteínas contendo substituiçõesconhecidas de aminoácidosconhecidas de aminoácidos
M d d i á id d d d i ( liMudança de um aminoácido de uma dada enzima (analisa-se ecompara-se com a enzima selvagem)
Muito aplicado em estudos de enzimologia (catálise, resistência,p gsusceptibilidade a agentes quimicos ou fisicos, interações comoutras proteínas)outras proteínas)
Quais aminoácidos são importantes no sitio catalítico de umaQuais aminoácidos são importantes no sitio catalítico de umaenzima
à à Íà à ÍEXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO SÍTIO EXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO SÍTIO DIRIGIDADIRIGIDA
Mutação sítio dirigida no gene codificador para Lipaseç g g f p p
(LipA e LipC) produzida por Pseudomonas sp.42A2
Alteração do aminoácido Prolina no sítio catalíticoAlteração do aminoácido Prolina no sítio catalítico
foram feitas várias tentativas com diferentes aminoácidos
= CONSEQUÊNCIA???
P d d Ati id d P ?? P li i á id i t t- Perda da Atividade – Pq ?? Prolina aminoácido importante
estruturação
Bofill C, Prim N, Mormeneo M, Manresa A, Pastor FI, Diaz P Biochimie. 2010 Mar;92(3):307-16.
E E P E P Ã EXEMPLO DE APLICAÇÃO DA MUTAÇÃO INDUZIDA MUTAÇÃO INDUZIDA
Agentes físicos e químicosAgentes físicos e químicos
Aumentar a expressão da enzima celulase utilizando
mutação induzida em fungo Trichoderma sp.
Agentes Químicos e Agentes Físicosg Q g
Mutação com radiação U VMutação com radiação U.V.
Radiação UV
Tempo e distância
20 ml da suspensãoem uma concentraçãode 108 esporos/ml
Meio Sólido CMC
Mutação com NitrosoguanidinaMutação com Nitrosoguanidina
Tempo
Volume
1 ml de NTG a 0,1%+
9 ml da suspensão
Meio Sólido CMC
9 ml da suspensão
Seleção das estirpes mutantesSeleção das estirpes mutantes
Seleciona-se as placas correspondentes aos tratamentosp p m
onde o índice de sobrevivência dos esporos for de 90 a 99%.
A partir das placas selecionadas as colônias mutantes queA partir das placas selecionadas, as colônias mutantes que
tenham produzido hidrólise nos meios CMC, serão inoculadas
no meio de celulose-azure em tubos. Após a incubação a 28ºC
por 7 a 14 dias as culturas degradadoras do celulose azurepor 7 a 14 dias, as culturas degradadoras do celulose-azure
serão selecionadas.
Conservação de Micro-organismos
P ã l d d d d d- Preservar para evitar variação na qualidade e na quantidade daresposta, mantendo a linhagem com alto potencial de produção.
- Evitar contaminaçãoEvitar contaminação.
COLEÇÕES DE CULTURASCOLEÇÕES DE CULTURAS
Conservam micro-organismos com características conhecidas.
American Type Culture Collection (ATCC), USANorthern Regional Research Laboratory (NRRL) USANorthern Regional Research Laboratory (NRRL), USAInstituto Zimotécnico (IZ) da Escola Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, USP-Piracicaba
_________________________________________________________________________________EQB353 – Microbiologia Industrial Escola de Química / UFRJ
QuaisQuais osos métodosmétodos dede conservaçãoconservação dosdos micromicroQuaisQuais osos métodosmétodos dede conservaçãoconservação dosdos micromicro--organismos?organismos?
LIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOLIOFILIZAÇÃOCONGELAMENTOCONGELAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTORESFRIAMENTOCRIOCRIO--CONGELAMENTOCONGELAMENTOÓLEOÓLEOÓLEOÓLEOAREIAAREIAÁGUAÁGUAÁGUAÁGUA
â d Pâ d PImportância da PreservaçãoImportância da Preservação
• armazenamento de culturas por longos períodos e utilização
óperiódica para pesquisa e/ou produção
– contaminação
– perda de viabilidade
t ã ( d d t í ti fi i ló i )– mutação (perda das características fisiológicas)
• solução → metodologia de preservação de longa duração
diminuição do crescimento e das atividades metabólicas– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas
• crescimento em meio mínimo
• resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura
â d Pâ d PImportância da PreservaçãoImportância da Preservação
• preservação a longo prazo
– evita problemas com o novo isolamento de microrganismos
– economia de tempo, mão de obra e custos com material dep ,
consumo
• importante função da coleção de culturas
– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para
preservação por períodos prolongadospreservação por períodos prolongados
– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza
Escolha do Método de PreservaçãoEscolha do Método de Preservação
• pontos a serem considerados• pontos a serem considerados
– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de
preservação e durante o armazenamento
– manutenção das propriedades originais: perda dep p g p
características de interesse científico ou industrial
pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo
– custos de preservação e manutenção
Escolha do Método de PreservaçãoEscolha do Método de Preservação
– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente
e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento
– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas
com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método
– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades
adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada paraq ç p ç q p
embalagem de envio e condições de transporte
– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros
Técnicas mais empregadas
1) Transferência periódica para meios de cultura novos( é d b l )(técnica das subculturas ou repiques sucessivos)Parâmetros relevantes: meio de cultura, T estocagem, Dt
transferênciastempo máximo estocagem = 6 meses.
Armazenamento R i d Armazenamento a 4 oC
Repique a cada 3 meses
2) Conservação de culturas sob camada de óleo mineralt á i t 12 tempo máximo estocagem = 12 meses.
Nas duas técnicas, o espaço ocupado nos arquivos é grande, mas os métodos são bastante simples usados em rotinas nos laboratórios
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métodos são bastante simples usados em rotinas nos laboratórios
Técnicas mais empregadas
3) Secagem em suportes inertesd é l l é l íl é l dsuportes empregados: areia estéril, solo estéril, sílica, pérolas de
vidro ou de porcelana, sabugo de milho, entre outrostempo máximo estocagem = 6 a 10 anostempo máximo estocagem = 6 a 10 anos
Suporte Inoculação com I b ã Suporte esterilizado
Inoculação com suspensão de
esporos
Incubação em estufa
Secagem em Armazenamento Secagem em estufa por 2
semanas
Armazenamento a 4 oC
Metodologia normalmente empregada para esporos de fungos filamentosos e esporos de Clostridium ou Bacillus
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p
Técnicas mais empregadas
4) Estocagem em baixa temperatura (congelamento)) g p ( g )
T= -20 a -1960C utilização de gelo seco ou N líquidoutilização de gelo seco ou N2 líquidouso de agente protetor (glicerol ou dimetil sulfóxido) tempo máximo estocagem = anosp g
C s i t l Crescimento das células em meio de cultura
Suspensão em solução de
glicerol 10%
Congelamento em ampolas fechadas g
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Técnicas mais empregadas4) Conservação por liofilização
sublimação da água pré-congeladat á i st 10 20 stempo máximo estocagem = 10 a 20 anos
suspensão concentrada de
Frascos mergulha-dos em solução de
Liofilizador (vácuo -
células em pequenos frascos
çgelo seco e álcool( -780C)
provocando dessecamento)
frascos selados
Vantagens:
pelo fogo; estocagem a T
ambienteVantag n requer pouco espaço para a estocagem;o tempo de estocagem é bastante elevado; o produto final, com baixo teor de umidade, tem maior estabilidade;
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pé de fácil transporte.
Ativação de Micro-organismosUma vez conservados devem ser ativados de maneira a produzir
altos teores do produto desejado e se manter vivo.
Técnicas mais empregadas:
1) Transferência periódica para meios de cultura novos(ou repiques sucessivos)
Lactobacillus casei aumenta sua produção em 90% após 9 repiques sucessivos
2) Choques térmicos - banho-maria por 1 minuto um cultivo de micro-organismo crescido em meio tioglicolato de sódio a 370C /4 dias
Obtêm-se cepas resistentes ao calor e produtoras de altos teores desolventes (Clostridium acetobutylicum)
3) Radiações – produção de penicilina por Penicillium chrysogenum
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