Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204Instituto Internacional de Cromatografiahttp://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.005ISSN 1984-4433
PREPARO DE AMOSTRAS
186 Scientia Chromatographica 2014; 6(3)
Bruna Juliana Moreira1 Jennifer Michiko Chauca Yokoya2 Cristiane Masetto de Gaitani1
1Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil2Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-903, Ribeirão Preto, SP, Brasil*[email protected]
Recebido: 19/12/2014 Aceito: 30/12/2014
ResumoPara bioanálises, o processo de preparo da amostra deve ser realizado antes da determinação analítica. Esse procedimento visa eliminar componentes endógenos e/ou outros fármacos ou compostos interferentes e melhorar a detectabilidade e a seletividade. Para tanto, técnicas como a LLE e SPE são frequentemente usadas. A miniaturização da LLE tem sido realizada visando o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra eficientes, rápidas e econômicas e com menor uso de solventes orgânicos. A microextração líquido-líquido dispersiva é uma técnica de microextração, desenvolvida por Rezaee et al. em 2006 que representa a maior porcentagem (59,4%) das publicações na área de microextração em fase líquida e já foi aplicada para a análise de alimentos, frutas, vegetais, amostras biológicas e ambientais. Apresenta como vantagens baixo tempo de extração, simplicidade de operação, rapidez, baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de enriquecimento. No entanto, devido a algumas desvantagens como uso de solvente tóxico e a etapa de centrifugação, que dificulta a automação da técnica, algumas modificações experimentais têm sido propostas. Neste artigo, os autores discutem os fundamentos da técnica, suas inovações e sua aplicação em amostras biológicas.
Palavras-chave: amostra biológica, DLLME, inovações.
AbstractA sample preparation process must be performed before the analytical determination in bioanalysis. This procedure aims to eliminate endogenous compounds and/or other interferent drugs or compounds and to improve detectability and selectivity. For that, techniques such as LLE and SPE are frequently used. Efficient, fast, economical and less solvent consumptive sample preparation techniques have been carried out with the miniaturization of LLE. Dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) is a microextraction technique, developed by Rezaee et al. in 2006. It represents the highest percentage (59.4%) of the publications in the area of liquid phase microextraction and has already been applied to the analysis of food, fruits, vegetables, biological and environmental samples. Its advantages are low extraction time, simplicity of operation, rapidity, low cost, high recovery factor and high analyte enrichment. However, due to some disadvantages such as the use of toxic solvents and centrifugation, which hinders the automation, some experimental modifications have been proposed. In this article, the authors discuss the principles of the technique, innovations and applications for biological samples.Keywords: biological sample, DLLME, innovations.
Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME): fundamentos, inovações e aplicações biológicasDispersive liquid-liquid microextraction (DLLME): principles, innovations and biological applications
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 187
1. HistóricoBioanálises rotineiramente são utilizadas na
medicina forense e em estudos toxicológicos. Contudo, antes da determinação analítica, os analitos devem ser submetidos a um processo de preparo da amostra[1], que é uma etapa de extrema importância para a obtenção de resultados confiáveis[2] e cujo principal objetivo consiste em extrair e concentrar o analito de interesse para torná-lo compatível com o sistema analítico a ser utilizado[3,4], minimizar ou eliminar efeitos da matriz e melhorar os limites de detecção[5].
A extração líquido-líquido (LLE – liquid-liquid extraction) é amplamente aceita e utilizada como técnica de preparo de amostras para a análise de fármacos em fluidos biológicos como a urina e o plasma. Apesar de esta técnica oferecer alta reprodutibilidade, ela demanda tempo e trabalho laboratorial intenso, apresenta tendência à formação de emulsão, tem baixo potencial de automação e requer o uso de grande volume de solventes de alta pureza, o que a torna cara e tóxica, com a produção de perigosos resíduos laboratoriais[6]. Embora a extração em fase sólida (SPE – solid phase extraction) consuma menos tempo do que a LLE, esta ainda utiliza altas quantidades de solventes[7] e os cartuchos são caros e pouco reprodutíveis devido às diferenças entre os lotes de adsorventes. Portanto, sua otimização nem sempre é um procedimento simples[8].
Já a microextração em fase sólida (SPME – solid phase microextraction) é uma técnica de extração rápida e livre de solventes que tem sido amplamente utilizada para a extração de compostos orgânicos, contudo apresenta como potenciais problemas o alto custo, o efeito memória (carry over) se houver a reutilização das fibras e um declínio no desempenho da fibra com o tempo[7].
Na última década, esforços foram realizados visando o desenvolvimento de técnicas de preparo de amostra eficientes, rápidas e econômicas[4] e conside-rando o atual enfoque na química verde, uma tendência no tratamento de amostras envolve a miniaturização da
LLE, por reduzir significativamente a proporção entre o volume do solvente e o volume da fase aquosa, levando ao desenvolvimento de técnicas de microextração em fase líquida, como a LPME – liquid phase microextraction). Neste contexto, diferentes técnicas de LPME têm sido exploradas como alternativas aos métodos convencionais, como a microextração em gota suspensa (SDME – single drop microextraction), a microextração em fase líquida com fibra oca (HF-LPME - hollow fiber - liquid phase microextraction), a extração sortiva em barra de agitação (SBSE – stir bar sorptive extraction) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME – dispersive liquid–liquid microextraction[7], sendo que a última tem representado a maior porcentagem (59,4%) das publicações na área de LPME[9].
2. DLLMEA DLLME é uma técnica de microextração,
desenvolvida por Rezaee et al. em 2006[3] para a determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água. Consiste no equilíbrio de distribuição do analito entre as fases doadora (amostra) e aceptora (solvente orgânico) e é ideal para a extração de compostos com propriedades lipofílicas moderadas a altas ou que possam ter seu coeficiente de distribuição (log D) alterado pelo controle do pH (analitos ionizáveis)[2].
A maioria das técnicas de LPME necessita de um tempo longo para alcançar o estado de equilíbrio, devido à pequena área de contato entre a amostra e o solvente extrator, o que afeta de forma negativa os fatores de enriquecimento. A DLLME supera essas limitações[10], já que o estado de equilíbrio é alcançado rapidamente, devido à utilização de um sistema ternário de solventes (amostra aquosa, solvente dispersor e solvente extrator), o que torna a extração independente do tempo. A razão entre o volume de fase aceptora e de fase doadora é da ordem de microlitros e mililitros, respectivamente, o que permite a obtenção de altos valores de enriquecimento[2,11-13].
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
188 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
O fator de enriquecimento e a recuperação são parâmetros utilizados para demonstrar a eficiência da extração e podem ser calculados utilizando-se as equações 1 e 2, respectivamente[11].
O fator de enriquecimento pode ser definido como a razão entre a concentração do analito na fase sedimentada (C
sed) e a concentração inicial do analito na
amostra (C0).
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Já a recuperação (R) é definida como a quantidade do analito, em porcentagem, que é transferida para a fase aceptora ao final da extração e pode ser calculada pela equação 2, na qual V
sed e V
aq são os volumes da fase
sedimentada e da amostra, respectivamente.
RC VC Vsed sed
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A Figura 1 mostra o procedimento para a realização da técnica. O solvente extrator e o solvente dispersor são injetados rapidamente na amostra aquosa com o auxílio de uma microseringa (A). A injeção da mistura
forma uma solução turva (B). Após a centrifugação, as gotículas do solvente extrator se depositam no fundo do tubo (C) e são retiradas com uma microsseringa (D) para posterior análise (E)[2,3,14,15].
3. Fatores que influenciam a eficiência da extração por DLLME
Alguns fatores podem afetar a eficiência desta microextração: o tipo de solvente extrator e dispersor escolhido, o volume de solvente extrator e dispersor utilizado, o pH da amostra e sua força iônica[3,11,16,17] e o tempo de extração[2] (Figura 2). Alguns trabalhos também analisam a influência do tempo de centrifugação e da velocidade de centrifugação[18,19].
Na DLLME convencional, o solvente extrator deve satisfazer algumas condições como ser imiscível na amostra (fase doadora), ter maior densidade que esta e possuir alta capacidade de extração do composto de interesse[2,20]. Entre os solventes mais utilizados como extratores estão os hidrocarbonetos halogenados como clorofórmio, diclorometano, clorobenzeno, tetracloreto de carbono e tetracloroetileno[2,11-13]. Estes solventes
Figura 1. Procedimento para realização da DLLME.
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 189
podem ser substituídos por líquidos iônicos, que além de menos tóxicos, podem ser injetados diluídos no sistema analítico (HPLC)[21,22]. A seleção do solvente extrator apropriado é o parâmetro mais importante desta técnica de extração[2] e, na prática, ele representa cerca de 1-3% do volume total da mistura de solventes utilizada[23]. Em relação ao volume de solvente extrator, o aumento do volume deste solvente promove aumento do volume da fase sedimentada[3] e, embora a recuperação permaneça quase constante, o fator de enriquecimento poderá diminuir, levando a perdas na detectabilidade dos analitos de interesse. Geralmente são utilizados de 5-100 µL[2].
O solvente dispersor, por sua vez, tem como principal característica ser solúvel tanto na fase doadora quanto na fase aceptora. A seleção apropriada deste promove o aumento na eficiência de extração, pois favorece a dispersão do solvente extrator na forma de pequenas gotículas na amostra, de modo que a área superficial do solvente extrator em contato com a amostra contendo o analito seja infinitamente grande. Os solventes dispersores comumente utilizados são: metanol, etanol, acetonitrila, acetona e tetraidrofurano[2,11-13,24]. O volume de solvente dispersor afeta diretamente a formação da solução turva e, consequentemente, a eficiência da extração. Também foi constatado que
variações no seu volume leva a alterações no volume de fase sedimentada[16]. Nos trabalhos de Yan et al.[24,25] e de Farajzadeh et al.[24,25] foi observado que o aumento do volume de solvente dispersor promoveu o aumento da solubilidade do solvente extrator na amostra com consequente diminuição do volume de fase sedimentada. Normalmente são usados de 0,5-1,5 mL de solvente dispersor[2].
O pH da amostra é um parâmetro essencial porque afeta tanto a eficiência da extração como a seletividade da DLLME[26]. Usando como exemplo analitos básicos, é necessário manter o pH da amostra acima do valor de pKa, para que eles fiquem na forma não ionizada, aumentando assim, a tendência de serem extraídos pelo solvente extrator[27,28]. No trabalho de Melwanki et al.[20], por exemplo, foi necessária a adição de amônia na amostra de urina para facilitar a partição do 7-aminoflunitrazepam para o solvente extrator com o objetivo de melhorar a recuperação.
Outro parâmetro de interesse é a força iônica da amostra. A adição de sal pode promover melhora no rendimento da extração[29] devido à diminuição da solubilidade dos compostos de interesse na fase aquosa e aumento de sua transferência para a fase orgânica[11], fenômeno denominado de salting out, no qual moléculas de água formam esferas de hidratação ao redor das moléculas do sal dissociadas, com consequente diminuição da concentração de água disponível para dissolver as moléculas do analito[20]. Contudo, essa adição também promove redução na solubilidade do solvente extrator na amostra, o que promove aumento no volume de fase sedimentada e diminuição do fator de enriquecimento[29].
Por fim, na DLLME, o tempo de extração é definido como o intervalo entre a injeção da mistura dos solventes e a centrifugação[17,30]. Como a transferência de massa é um processo tempo-dependente, os perfis de extração em relação ao tempo devem ser estabelecidos[13]. Contudo, como o equilíbrio da extração é alcançado
Figura 2. Principais parâmetros que afetam a eficiência da DLLME.
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
190 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
rapidamente, vários autores consideram que o tempo não é um fator significante para a extração[13,30,31].
4. Vantagens e desvantagensAs vantagens desta técnica incluem baixo
tempo de extração, simplicidade de operação, rapidez, baixo custo, alta recuperação do analito e alto fator de enriquecimento[2,4,23,30].
As desvantagens são: uso de solventes tóxicos[32,33], todo o processo de extração é manual e a centrifugação limita o volume de amostra a ser utilizado, é a etapa que demanda maior tempo no processo[12,13,15,16,34] e dificulta a automação da técnica[10]. No entanto, modificações experimentais têm superado muitas destas desvantagens[9].
5. Inovações e exemplos de aplicações em amostras biológicas
A DLLME representa uma ferramenta importante para a análise de matrizes relativamente simples como amostras aquosas. Porém, várias publicações já relataram seu uso para análise de alimentos, frutas, vegetais assim como amostras biológicas e ambientais[35].
Para ilustrar o uso da DLLME em matrizes
biológicas foi feita uma pesquisa e seleção de trabalhos
na base de dados Web of Science, considerando o período
de 2010 a 2014 e utilizando como palavras-chave na
busca em títulos de trabalhos: “dispersive liquid-liquid
microextraction” and “urine”, “plasma”, “blood”,
“serum”, “saliva” e “hair”. Com estas palavras foram
encontrados um total de 103 artigos (Figura 3).
As recentes modificações na DLLME encontradas
na literatura buscaram contornar certas dificuldades e/
ou problemas encontrados inerentes à técnica, como o
uso de solventes extratores mais densos do que a água,
que geralmente são solventes halogenados e, portanto,
tóxicos; aumentar a taxa de transferência do soluto para
o solvente extrator, entre outros. A Tabela 1 mostra
algumas aplicações dessas variações da DLLME em
matrizes biológicas.
A DLLME pode ser classificada em duas
categorias: DLLME com solventes extratores de alta
densidade e DLLME com solventes extratores de baixa
densidade[67].
Figura 3. Pesquisa realizada na base de dados Web of Science relacionando matrizes biológicas e extração por DLLME, no período de 2010 a 2014.
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DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
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Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
194 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
Na primeira categoria estão enquadrados:
• DLLME utilizando líquidos iônicos (IL-DLLME – Ionic liquid dispersive liquid–liquid microextraction). Os líquidos iônicos são sais líquidos com pontos de fusão perto ou abaixo da temperatura ambiente. Eles consistem geralmente de um cátion orgânico de nitrogênio ou fósforo que é contrabalanceado por um ânion orgânico ou inorgânico e possuem propriedades únicas tais como pressão de vapor negligenciável, estabilidade térmica (mesmo em temperaturas elevadas)[5], baixa solubilidade em água, baixa volatilidade e toxicidade[68]. Devido à química verde, seu uso tem aumentado em química analítica, principalmente na análise de amostras biológicas[5], podendo ser utilizados como solventes extratores[69] o que permite a substituição dos solventes clorados[35], perigosos e tóxicos. Devido à alta viscosidade do IL é necessária criteriosa otimização da proporção entre os volumes de solvente extrator e dispersor[10]. Para melhorar a dispersão do IL na amostra foi proposto, por Zho et al.[70] o uso do controle da temperatura na DLLME. A aplicação em amostras biológicas pode ser exemplificada por Sun et al.[64] que desenvolveram um método para a quantificação de um plastificante e seu metabólito em amostras de urina por HPLC-UV. A mistura de solventes (metanol e [C
6MIM][PF
6], 350 e 50 µL, respectivamente)
foi injetada na amostra para a formação da dispersão. A seguir, a amostra foi colocada em banho maria à 30°C, a dispersão foi se desfazendo e a mistura gradualmente tornou-se límpida, indicando a solubilidade do IL na amostra. Após isto, a amostra foi colocada em um banho de gelo por 10 minutos e a dispersão novamente formada, centrifugada e o sedimento recolhido com auxílio de uma
micro seringa, diluído em metanol e submetido à análise por HPLC. O limite de quantificação foi de 3,1 µg L-1 e de 10,6 µg L−1, recuperação de 97,4 a 112,5%, e fatores de enriquecimento de 164 e 115, para o plastificante e metabólito, respectivamente.
• DLLME utilizando solventes de baixa toxicidade (LT-DLLME – low toxicity dispersive liquid–liquid microextraction). Desenvolvida por Leong et al.[67], esta técnica utiliza solventes bromados, iodados e outros solventes halogenados como o 1-bromo-3-metilbutano ao invés dos solventes altamente tóxicos normalmente utilizados na DLLME convencional. Alguns solventes bromados, em particular, são menos tóxicos até mesmo quando comparados aos solventes de baixa densidade utilizados na DLLME da segunda categoria.
Em relação à segunda categoria, DLLME com solventes extratores de baixa densidade, são usados dispositivos especiais de extração para facilitar a coleta do solvente extrator ou um solvente auxiliar para ajuste da densidade da mistura de solventes[35]. Como exemplo, são citados na literatura:
• DLLME com solidificação da gota orgânica flutuante (DLLME-SFO – Dispersive liquid–liquid microextraction based on solidification of a floating organic drop). Desenvolvida por Leong e Huang[71], é considerada simples, rápida e de baixo custo[32] e não necessita utilizar tubos especiais para a extração[72]. O solvente extrator deve ter ponto de fusão próximo à temperatura ambiente, na faixa de 10–30°C, como o 1-undecanol, o n-hexadecano, o 2-dodecanol, o 1-decanol e o difenil éter. Estes solventes são de menor toxicidade e menos densos do que a água[32,35]. Após a DLLME, o solvente extrator fica localizado na região superior do tubo e é resfriado pela colocação deste em um banho
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 195
de gelo. O solvente solidificado é transferido para um frasco adequado e é imediatamente retornado ao estado líquido à temperatura ambiente, podendo ser diluído ou diretamente injetado em um sistema analítico adequado. A DLLME-SFO é amplamente aplicada em preparo de amostras ambientais e raramente aplicada à análise de fármacos em fluidos biológicos complexos[44,72].
• DLLME com solventes de baixa densidade e quebra da emulsão com solvente (LDS-SD-DLLME – low-density-solvent based solvent demulsification). Nesta microextração, os solventes extrator e dispersor são injetados na amostra e a quebra da emulsão é realizada pela adição de mais solvente dispersor, que agora atua como agente desmulsificante[73]. O solvente extrator é coletado da fase superior e analisado. A extração requer dois a três minutos e não necessita de centrifugação, portanto, é mais rápida que a DLLME convencional[67]. Como solventes extratores podem ser avaliados: 1-octanol, n-hexano, tolueno, cicloexano e orto-xileno[73].
Além disso, várias técnicas de dispersão podem ser utilizadas, modificando a DLLME convencional[67]
(Figura 4):
A) Microextração liquido-líquido assistida por ar (AALLME – air-assisted liquid–liquid microextraction). É uma nova versão da DLLME na qual alguns microlitros de solvente extrator são transferidos para a amostra aquosa presente em um tubo de fundo cônico e a mistura (solvente extrator e amostra) é repetidamente sugada e injetada para dentro do tubo com o auxílio de uma seringa de vidro. Após a realização de ciclos pré-determinados, a mistura é centrifugada e a fase orgânica é coletada para análise[67,74]. Nesta extração o solvente dispersor não é utilizado e a dimensão
da agulha da seringa é um parâmetro a ser avaliado[74]. No trabalho de Farajzadeh et al.[74], esta variação foi aplicada para a quantificação de ftalato de ésteres em amostras de leite de vaca.
B) DLLME utilizando tensoativos (SA-DLLME – surfactant-assisted dispersive liquid–liquid microextraction). Neste caso, o tensoativo é utilizado como solvente dispersor, pois também apresenta solubilidade em ambas as fases (orgânica e aquosa) e também diminui a tensão interfacial entre elas. A sua concentração é um importante parâmetro para uma extração efetiva, pois concentrações superiores à concentração micelar crítica promovem a diminuição da recuperação do composto de interesse por aumentar a solubilidade deste na amostra[57]. Uma das maiores desvantagens da SA-DLLME é que um pouco do tensoativo também pode ser extraído da amostra aquosa, junto com o solvente extrator, o que pode limitar a escolha do sistema de detecção[67]. No trabalho de Behbahani et al.[57], foi feita a quantificação da carbamazepina e zonisamida em urina e plasma por HPLC-UV, utilizando a SA-DLLME. Foram utilizados o CTAB
Figura 4. Técnicas de dispersão utilizadas na DLLME assistida.
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
196 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
como agente emulsificante e 1-octanol como solvente extrator, que após misturados foram injetados rapidamente no tubo contendo a amostra. O método foi preciso e exato, sendo obtidos altos valores de recuperação e de fator de enriquecimento.
C) DLLME assistida por ultrassom (UA-DLLME – Ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction). Tem sido a mais utilizada entre as técnicas de dispersão[29]. O ultrassom pode acelerar a formação de uma solução turva fina, aumentando a eficiência de extração[60], porém, o tempo necessário para a extração é superior ao da DLLME convencional e a degradação do analito pode ocorrer sob certas condições[75]. Em contrapartida, tem-se redução no consumo de solventes[67] e melhora na eficiência da extração[72]. Um procedimento clássico dessa variação pode ser exemplificado por Fernandez et al.[50], que usaram 0,5 mL de urina contendo 7 benzodiazepínicos e análise por UPLC-UV. A extração foi realizada usando 1,5 mL de acetona (solvente dispersor) e 160 µL de clorofórmio (solvente extrator). A mistura (amostra + solventes) foi submetida à ultrassonicação por 4,5 minutos e observada a formação das gotículas dispersas. Em seguida foi feita a centrifugação e a fase sedimentada foi recuperada com auxílio de uma seringa. A extração foi parcialmente desenvolvida com auxílio da metodologia de superfície de resposta usando design de Doehlert e atingiu limite de quantificação na faixa de 1,8 a 7,4 ng mL−1, com recuperação de 96 a 114%.
D) DLLME assistida por vórtex (VALLME – vortex-assisted liquid–liquid microextraction). Assim como o uso de ultrassom, o uso de vórtex reduz o consumo de solventes[67] e melhora a eficiência da extração[72]. O trabalho realizado por Alshana et al.[32] determinou bisfenol A, o principal composto de resinas e
policarbonato, caracterizado como disrruptor endócrino, em amostras de urina por CE-UV. Os tubos contendo a amostra e solventes extrator e dispersor (1-undecanol e acetona, respectivamente) foram submetidos à agitação em vórtex por um minuto e foi observada a formação da suspensão dos componentes. O tubo foi centrifugado e levado ao freezer à –20°C onde, após 5 minutos, a gota orgânica flutuante solidificou-se e posteriormente foi separada. Em seguida, a gota solidificada se liquefez, à temperatura ambiente, e foi realizada a análise por CE. Os autores destacam rapidez no tempo de extração (2 minutos), baixo limite de quantificação e baixos valores de coeficiente de variação (1,9%) quando comparado às outras microtécnicas de extração, como SPME e SDME.
E) DLLME assistida por micro-ondas (MA-DLLME – microwave-assisted dispersive liquid-liquid microextraction)[67]. Assim como a SA-DLLME, a MA-DLLME também tem sido pouco utilizada. Neste caso, os efeitos do tempo e da potência do micro-ondas devem ser analisados, pois a degradação dos analitos devido a irradiação pode ocorrer, o que pode promover a diminuição da recuperação[76]. Em 2011, Xu et al.[66] fizeram o uso desta técnica associada ao uso de IL para a extração de sulfonamidas em várias matrizes. Foi observado que a temperatura, fortemente relacionada com o tempo de irradiação e potência utilizada, pode afetar a transferência de massa dos analitos e a área de contato entre o solvente extrator e a solução aquosa. Além disso, o aumento do tempo de extração contribuiu para a diminuição da viscosidade do IL e para a transferência de massa.
F) DLLME assistida por agitação manual. Pode ser realizada para dispersão e extração ou como um passo de pré-mistura antes da extração[67].
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 197
Chung et al.[77] utilizaram agitação manual previamente à DLLME com uso de ultrassom e verificaram que a agitação manual contribui para garantir que todos os analitos estejam dispersos na amostra, aumentando a eficiência da extração e sua precisão, já que todos os analitos tem a mesma probabilidade de entrar em contato com o solvente extrator. Aplicações da DLLME por agitação manual são bastante empregadas[37-39,41,46,54,78]. Um dos trabalhos que usa este tipo de DLLME é o de Vela-Soria et al.[78]. Nele, os autores quantificaram 14 disrruptores endócrinos em amostras de urina por CG-MS. A mistura de solvente dispersor (acetona) e extrator (triclorometano) foi adicionada à amostra e realizada a agitação manual por 10 segundos. A seguir, a amostra foi centrifugada e a fase orgânica recolhida com auxílio de uma seringa. Foram obtidos valores de recuperação na faixa de 94 a 105%, e limites de quantificação na faixa de 0,2 a 0,5 ng mL-1.
Alguns trabalhos utilizam ainda associações entre as variações da DLLME, como, por exemplo, Rajabi et al.[33] que fizeram uso de ultrassom com IL e controle de temperatura para realizar a quantificação de anetol, estagol e para-anisaldeído em amostras de urina por HPLC-UV. No método desenvolvido, a amostra de urina foi colocada em um tubo previamente contendo o IL [C
6MIM][PF
6] e uma barra magnética. O tubo foi
aquecido em banho-maria a 70°C por 2 minutos. Nesta fase, o calor causa a dispersão do IL na amostra. Em seguida, o tubo foi colocado em banho ultrassônico contendo água gelada por 4 minutos, o que levou à formação do ponto nuvem novamente. Em seguida, o tubo foi centrifugado e a fase sedimentada coletada para posterior análise.
6. Delineamento experimentalRecentemente, vários trabalhos envolvendo a
DLLME tem utilizado um delineamento experimental
com duas etapas - delineamento Plackett–Burman (PBD – Plackett–Burman design) seguido de delineamento composto central (CCD – central composite design) para a determinação das condições experimentais. O PBD é utilizado para analisar de forma rápida quais as principais variáveis que afetam a recuperação da extração[18], enquanto que o CCD é utilizado para determinar as condições ótimas para os fatores considerados críticos nesta extração[79].
7. Pré-tratamento de amostras biológicas submetidas à DLLME
Quando se trata da extração de analitos em matrizes biológicas, as quais são altamente complexas, muitas vezes faz-se necessário um pré-tratamento da amostra. Entre esses procedimentos adicionais e compatíveis com a DLLME, especialmente quando a matriz é o plasma ou soro, está a precipitação de proteínas. Este procedimento é necessário para reduzir os interferentes da matriz e evitar o entupimento da coluna cromatográfica[56]. Um das maneiras mais utilizadas para a precipitação de proteínas consiste no uso de acetonitrila gelada ou à temperatura ambiente, acetona[45,46], álcoois como metanol ou etanol[61], ácidos como o tricloroacético 10%[40,61] ou 30%[53], clorídrico 6 M[55,56], sulfúrico, fórmico ou acético[56], ou mistura de solução de sulfato de zinco a 15% (p/v) com acetonitrila[56,61]. Entretanto, em todos estes procedimentos o sobrenadante deve ser compatível com o procedimento de extração. Por exemplo, Tarazona et al.[55] relatam que quando a precipitação de proteínas foi feita com acetonitrila, não foi observada a formação do ponto nuvem quando a mistura de solventes extrator e dispersor foi injetada na solução. Xiao et al.[58] descrevem que, após realizar a DLLME com IL, foi necessário realizar uma back extraction para recuperar os analitos que estavam no IL para a fase aquosa e posterior injeção no sistema cromatográfico. Huang et al.[80] relatam que quando a DLLME é usada com CE, é necessário evaporar o solvente de extração e reconstituir o resíduo em meio adequado para evitar a queda da corrente elétrica no início da análise. Para a
Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM DLLME: inovações e aplicações biológicas
198 Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204
remoção de lipídeos, normalmente é realizada uma etapa
de filtração do sobrenadante, após centrifugação, com
filtro de 0,45 µm[44,81] e posterior DLLME.
Quando a matriz é urina, grande parte dos trabalhos
descritos na literatura realiza apenas uma centrifugação,
usando o sobrenadante para as análises[44,47,48,51,82]. Shi
et al.[40] adicionaram à urina ácido tricloroacético 10%
e, em seguida, foi realizada filtração em membrana de
0,45 µm. Já Shamsipur e Mirmohammadi[38] realizaram
ultrassonicação das amostras de urina ao observarem um
depósito lipídico no fundo do tubo. Em contrapartida,
tecidos sólidos como fígado[49,83], cérebro[52], por exemplo,
requerem procedimentos mais longos, dispendiosos e
específicos.
A Figura 5 mostra uma amostra de 5 mL de urina
(A) que foi submetida à DLLME, com consequente
formação de uma solução turva (B) após a adição dos
solventes extrator e dispersor e a separação do solvente
extrator no fundo do tubo cônico após a centrifugação (C).
8. DLLME associada a outras técnicas de extração
Além das recentes modificações inclusas na DLLME, tem-se empregado a mesma em associação com outras técnicas de extração, tais como SPE[84,85], MIP[86,87] e eletromembrana[43]. Mashayekhi et al.[84] relatam que a associação de SPE-DLLME é uma técnica hifenada eficiente, que oferece as vantagens de ambos os métodos tais como simplicidade, baixo consumo e exposição a solventes, baixos custo e tempo de extração com altos valores de recuperação e fatores de enriquecimento. Neste caso, o eluente da SPE foi usado como solvente dispersor para a DLLME, realizada posteriormente, para a extração de ecstasy e anfetaminas em urina e análise por cromatografia gasosa.
9. Conclusões e perspectivas
Figura 5. Uso da DLLME em amostras biológicas.
DLLME: inovações e aplicações biológicas Moreira BJ; Yokoya JMC; Gaitani CM
Scientia Chromatographica 2014; 6(3):186-204 199
A DLLME foi inicialmente delineada para a extração de compostos em amostras aquosas e, portanto, a aplicação da mesma esteve voltada majoritariamente para a análise de resíduos de medicamentos, pesticidas, entre outros, em água. Desde o primeiro trabalho de Rezaee, em 2006[88], até o momento atual, muitas inovações foram trazidas para a DLLME. No entanto, nem todas foram aplicadas ainda às matrizes biológicas. Alguns exemplos são a supramolecular-based-DLLME, partitioned dispersive liquid-liquid microextraction (PDLLME), entre outras[88].
As matrizes biológicas são extremamente complexas e podem conter interferentes como lipídeos, fosfolipídeos, proteínas, hormônios e minerais. Uma das matrizes mais utilizadas é o plasma, o qual possui alta viscosidade e, portanto, esta característica pode interferir na dispersão dos solventes extrator e dispersor
na amostra quando a DLLME é utilizada. Desta forma,
é necessário realizar algum pré-tratamento para que seja
possível conduzir qualquer procedimento de preparo de
amostra e minimizar a presença de interferentes.
Uma das tendências da DLLME é a melhora na
seletividade pela associação de diferentes técnicas de
preparo de amostra, como discutido nesta revisão. Apesar
das vantagens da DLLME, uma grande desvantagem
é a dificuldade na automação. Nesse sentido, alguns
avanços têm sido avaliados, porém, ainda não aplicados
às amostras biológicas[29,89]. Assim, espera-se que
futuramente ainda menos solventes e em menor volume
sejam usados, e que sejam desenvolvidos outros modos
que simplifiquem a DLLME reduzindo ainda mais o
tempo e o custo, além de torná-la uma técnica high-
throughput.
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