Aplicação de métodos rápidos para controle microbiológico
Neliane F.A.SilveiraITAL
SEMINÁRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP
28 DE SETEMBRO DE 2006
Grandes tendências
• Hoje: Todos preocupados com :
• Inocuidade e Qualidade dos alimentos: Monitoramento e Análise Microbiologicas
QUALIDADE DOS ALIMENTOS
• Verificado por : Indicadores• Bactérias totais• Mesófilos• Psicrotroficas• Termofilas • S. aureus - homem- portador• Fungos- limpeza do local• Contaminação fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli• Enterobacteriaceae
Inocuidade• Verificada pelos patogenos:• Gram-positivos-( Intoxicação)-Listeria
monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, Bacillus cereus
• Gram negativos: (Infecção) Salmonella, Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer, E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.
Verificação:
• Métodos tradicionais, culturais, clássicos
• Métodos alternativos ou rápidos : Porque a procura??????
• Culturais: Problemas: pouco elaborados, trabalhosos, demorados, muito material de laboratório, requer pessoal treinado, sujeito a falhas humanas.
Problemas com os métodos tradicionais:
• Sensibilidade insuficiente- capacidade de detectar o que o método propõe,
• Especificidade:Detecta so microrganismo procurado- nem sempre ocorre!- da falso negativos
• Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-ele obtem o mesmo resultado- não ocorre
• Reprodutibilidade: Gerar resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!
Métodos novos no mercado
• No período de 1993 ate 2000- houve uma explosão no mercado de testes alternativos começando em países desenvolvidos : ate o ano 2000- muita confusão na área!!!
• Atualmente: O mercado filtrou os que não funcionavam e hoje os que estão ai, são métodos confiáveis!
Objetivos dos métodos rápidos em análises microbiologicas
• 1.Melhorar a eficiência dos laboratórios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analítica
• 2. Aumentar confiabilidade dos resultados_ não é preparado pelo analista- kit vem pronto
• 3. Aumentar a precisão dos resultados• Mesmo assim: deve ter um microbiologista
treinado
Métodos Rápidos- 3 grupos
• 1. Automação laboratorial
• 2. Métodos rápidos para avaliar a qualidade
• 3.Métodos rápidos para avaliar inocuidade
1. Automação laboratorial
• Utilizado nas etapas da analise:• a . Pesagem- Por ex, através de um
aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a aliquota desejada, e já dilui acrescentando a água necessaria para a diluição!
• b . Homogeneização- Uso do stomacher-homogeneizador de pistão
Continuação: automação laboratorial
• c .Semeadura - Utilização de um aparelho chamado- spiral plater- a amostra é semeada na placa, atraves de uma canula, que verte o inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.
• d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com novos meios como os cromogenicos - uteis para identificar certos microrganismos - já seleciona melhor, evitando testes bioquimicos inúteis
Contagem Direta• 1. Membrana filtrante_ Utilizada para líquidos onde grande
quantidade é necessitada para amostra : utilizada em água, refrigerantes,
• 2. Métodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico
• ronídeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O número de tubos com gás e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta visível,da o numero mais provável de E.coli por grama
• E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da fluorescência
Um exemplo:Colilert
Vantagens: SimplesNão requer trabalho de preparoExecução rápidaNao exige confirmaçãoNão requer equipamento de leitura
Desvantagem: ser aprovado só p/ água
Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes(mesmo principio) a este aqui exposto,
esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiroconhecido no mercado.
1 . Galactopiranosídeo ortonitrofenilONPG
ortonitrofenil ortonitrofenol
(Cor amarela)
oxidação
( Pó = reagente Colilert )
Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais → orto nitro fenil galacturonidase
2. 4-metil umbeliferil glucoronídeoglucoronidase
( Pó = reagente Colilert )
4 metil umbeliferil
oxidação
4-metil umbeliferona
Produção de brilho fluorescente
Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli
COLILERT
VANTAGENS DESVANTAGENS
Resultado em 24h
Praticidade na inoculação: placa de Petri, pipeta,...
Economia de tempo
Leitura após 28h fornece resultado não confiável devido
ao efeito limitado do antibiótico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -
28h após a incubação.
Apenas para amostras de água.
QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.
É uma adaptação do sistema dos tubos múltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma tabela de leitura com base estatística.
100ml de amostra de água
+ “Colilert ”Distribuição na cartela contendo os tubos
Leitura sob luz UV Selagem da cartelaincubação
Tabela Resultado em NMP
Contagem direta- continuação-
• 3. Sistemas prontos para uso-• Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com
sulcos- amostra é diluida-Ex:Contagem total• Placas de Petrifilm-3M - cartões-Coliformes,
S. aureus, Fungos, Contagem total, etc.• Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem• Ilustração:
PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)
Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral
Fabricante= 3M Prods para Microbiologia
Princípio de funcionamento Modificação do método tradicional de contagem de células viáveis em placas
Placas de Petrifilm
Vista Superiorou planta
Filme de polipropileno
Adesivo c/ corante indicador
Géis hidrossolúveis a frio
Nutriente e géis hidros. A fri
adesivo
Papel quadriculado c/ polietileno
Vista lateral
Amostra diluída 1ml
Espalhar o inóculo com um difusor
1 minuto
Gelificação do meio de cultura
Incubação
Contagem de Aeróbios → colônias vermelhasContagem de coliformes → colônias vermelhas com gás
Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem de E. coli → colônias azuis com gás
Placas para:
Leveduras = Colônias pequenas , rosa escuro a azul esverdeada;
Bolores = colônias grandes , coloração variada
SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Amostra na
diluição desejada
Meio de cultura
liofilizadoSimplate
+ 100ml de água destilada estéril
agitação Meio de cultura rehidratado
1ml
9ml
Homogeneização
Remoção do excesso do líquido
incubação
35oC/24h( CT ; colif.)
25oC/72h( B e L )
(Placa de plástico com 84 cavidades)
LEITURA
Colônias vermelhas: presença de
coliformes totais
Luz UVColônias
fluorescentes: presença de E.coli
Tabela de NMP
Simplate CEC
Simplate TPC = Contagem total de bactérias por fluorescência
Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactérias por indicador de cor
Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem Indireta
• 1.Técnica de Bioluminescência
• Princípio: Quantidade de ATP detectada a partir de células
• metabolicamente ativas (residuos orgânicos, inclusive microrganismos).
• Mecanismo: reação de enzima luciferina-luciferase (cauda do vagalume)
• ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um luminometro
1.Bioluminescência:
Aplicação comum: Monitoramento de Higienização em plantas processadoras de alimentos.
Equipamentos comercializados à base de bioluminescência:Lightning e Hi-Lyte.
Consistem em um swab aplicado a superfície a ser checada: introduz num tubo com os reagentes necessários e o coloca no luminometro que mede a intensidade da luz:
Quanto mais sujo, + luz!
SISTEMA LIGHTNING Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa e sanificação de superfícies .
Princípio do método: emissão de bioluminiscência por ATP.
1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg +2 Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato
2. Luciferil adenilato - luciferase + O2 Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ
O substrato Luciferina sofre fosforilação através da enzima luciferase , na presença de ATP.
A molécula de ATP pode ser encontrada em : células microbianas viáveis; células não microbianas ( sangue, carne,...)
Sistema Lightning detecta
ATP residual em superfícies
Componentes - sistema Lightning
Swab ; luminômetro ; alicate ; software
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina +
Luciferase
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina +
Luciferase
Procedimento de uso
1 ) Esfregaço numa determinada superfície.
2 ) Peça 1 em 2
3) Entortar a região “a” com a mão : escorrimento do buffer ao longo da haste
4) Alicate → amassar a região “c” para romper a barreira “b”: permitindo o
contato entre buffer + esfera + estremidade da haste
5 ) Agitar o conjunto 3
6) Introduzir a peça 1 no luminômetro e fazer a leitura 3
Contagem Indireta - cont.
2. Técnica de Impedãncia/Condutãncia
Principio: Microrganismos alteram a corrente elétrica de um meiode cultura: devido às atividades metabólicas: Na multiplicação, as moléculas grandes (proteínas, lípides,)se transformas em moléculas menores:aminoacidos, ac. graxos, que sao quimicamente maisativas: o acumulo destes compostos: alterações mensuráveis
Ex,: BACTOMETER- Bio_Mérieux. A quantidade de microrganiamos presentes é definida pela determinação do TEMPO DE DETECÇÃODetecção ocorre qdo. a conc. Atinge 106-107 microrg./ml.
Curva-padrão: Determina microrganismos presentes
METODOS RÁPIDOS PARA AVALIAÇÃO DE INOCUIDADE• A. Bioquímicos:Métodos que a partir
de uma cepa obtida por algum metodo de detecção- é inoculada em kits- e são observadas para capacidade de realizar determinadas reações bioquimicas:
• Ex: Galerias API_ Bio-Mérieux
• BBLRapid test- Salmonella- OXOID
OXOID Salmonella RAPID TEST Fabricante = Unipath Ltd
Somente linhagens móveis
Amostra pré-enriquecida em BPW por 18h/37oC
+
Rappaport-Vassiliadis modificado
Lisina Ferro Desoxicolato modificado
Verde Brilhante modificado
Lisina Ferro Cistina Vermelho Neutro
modificado41oC / 24h
Leitura
A B
Tubo A = cor preta → produção H2S
Tubo B = vermelha ou preta → ausência fermentação da lactose
METODOS RÁPIDOS PARA AVALIAÇÃO DE INOCUIDADE
• B. Imunologicos: 4 grupos:
• B1.Imunoenzimaticos• B2.Imunocaptura• B3.Imunoimobilização• B4.Coaglutinação
B1. Imunoenzimáticos
O tipo mais empregado: sandwich.
O patógeno PROCURADO é capturado da amostra por anti-corposadsorvidos à superfície de uma matriz sólida (esferas de de polietileno, placas de micro-titulação, papel, etc).
O complexo ántigeno-anticorpo reage com o conjugado, formanovo anti-corpo específico p/ o microrganismo em teste. Ligadaa enzima cromogenica (fosfatase alcalina/peroxidase), o sandwich reage com o substrato da enzima cromogenica e mostra cor: teste positivo.
Ex. UniqueVidas- Bio Merieux- automatizado
B2- Imunocaptura• Principio: capacidade dos microrganismos aderirem à
superfície• de partículas metálicas revestidas de anti-corpos
específicos
• Ligando os antígenos bacterianos + anti-corpos: o sistema tem
• um suporte com ímã que atrai as partículas metálicas, e o que fica
• é um concentrado de microrganismos procurados: entaofaz um
• enriquecimento e plaqueamento ! Sorologia: deve ser feita em colonias suspeitas, dando assim resultado imediato,
B3- Imunoimobilização• Princípio: Bactérias móveis cultivadas em meios semi-sólidos
tem• sua mobilidade bloqueada pela adição de anti-corpos
flagelares • específicos.• Forma uma banda de precipitação visível na interface• ANTI-CORPO/BACTÉRIA.• Aplicável a qualquer microrganismo flagelado (móvel).
• Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas câmaras de plástico interligadas em L . Na câmara horizontal fica o caldo de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio semi-solido
• onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.
B4- Coaglutinação
• Conhecido como aglutinação de látex(passiva reversa)
• Uso: toxinas microbianas
• Aglutinação de partículas de látex sensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas.
• Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa deenterotoxinas estafilocócicas.
Métodos rápidos para avaliar inocuidade
• C. MÉTODOS MOLECULARES
• C1. Sondas genéticas- pouco usadas: Separa fita de DNA- sonda reage-marcador- cor- le se no colorimetro
• C2.PCR- tradicional e automatizado- BAX SYSTEM - desnatura fita dupla do DNA-94C/ -pareamento com primers-37C/-síntese da fita complementar-amplia muito o DNA do patogeno de tiver-definitivo- não confirma!
• C3.Ribotipagem-Ribotipo- Sofisticação em analises
Considerações finais
A Escolha da metodologia a ser adotada na realização da análisedeve ser norteada por:
Precisão pretendidaCusto/tempo da análiseSimplicidadeTreinamento do analistaDisponibilidade de meios e reagentesAssistência técnica do fabricanteEspaço no laboratório, entre outros fatores!Pode se utilizar qualquer método em qualquer fase da analise
Pre requisito: Microbiologista treinado sempre!
Bibliografia consultada
• FRANCO, B D G M, Métodos alternativo de análise microbiológica de alimentos: uma revisão, USP, faculdade de Ciências farmacêuticas - Depto, de Alimentos e Nutrição experimental, 1999
• FRANCO, BDGM, Métodos rápidos em microbiologia de alimentos- Curso Métodos de Analise em Microbiologia de Alimentos-ITAL, 2006
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