Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Campus de Araraquara
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos
“Micelas poliméricas contendo pontos quânticos a base de óxido de
Zinco com superfície modificada para futura aplicação em
diagnóstico e vetorização de fármacos”
Aluna: Nathalia Cristina Rissi
Orientadora: Profa. Dra. Leila A. Chiavacci Favorin
Araraquara-SP
2016
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Campus de Araraquara
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos
“Micelas poliméricas contendo pontos quânticos a base de óxido de
Zinco com superfície modificada para futura aplicação em
diagnóstico e vetorização de fármacos”
Aluna: Nathalia Cristina Rissi
Orientadora: Profa. Dra. Leila A. Chiavacci Favorin
Araraquara-SP
2016
Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e
Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutora em Ciências Farmacêuticas.
Lista de Abreviaturas
Pontos quânticos (PQs)
Nanopartículas (NPs)
Oxido de tri-n-octylphosphine (TOPO)
Trinoctylphosphine (TOP)
Oxido de zinco (ZnO)
Doxorrubicina (Dox)
3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS)
Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)
Hidróxido de lítio (LiOH)
Luminescência (PL)
Excitação (PLE)
Emissão (PL)
Espectroscopia de Infravermelho (IV)
Difração de raios-X (DRX)
Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS)
Região ultravioleta visível (UV-Vis)
Rendimento quântico (QY)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Lista de Figuras
Figura 1. Processo luminescente dos PQs e seus diferentes níveis de Eg de
acordo com o tamanho dos nanocristais. Adaptado (Ioannou e Griffin, 2010)
........................................................................................... 28
Figura 2. Estrutura cristalina do tipo wurtzita do ZnO sem defeitos (a), dois
dos principais defeitos encontrados: vacâncias de oxigênio Vo (b) e as
vacâncias de zinco Vzn (c). Adaptado de (Janotti e Van De Walle, 2009) .... 29
Figura 3. Esquema de sistema ternóstico a base de PQ, recoberto por uma
camada de polímero contendo fármaco e as funcionalizações através
anticorpos e ácido fólico. ............................................................ 38
Figura 4. Esquema de um sistema teranóstico formado por micela polimérica
contendo os PQs e fármaco lipofílico e também as funcionalizações através
de anticorpos e do ácido fólico na superfície do sistema. ...................... 39
CAPÍTULO I
Figura I.1. Modelo estrutural dos PQs a base de Zno modificado pelo GPTMS
e HTMS (a) e pelo AO/HTMS (b). .................................................... 51
Figura I.2. Espectros de IV do ZnO modificado pelo GPTMS (a, b, c) e pelo
HTMS e AO/HTMS. ..................................................................... 52
Figura I.3. Espectros de absorção no UV-vis da suspensão coloidal de ZnO no
comprimento de onda limite de 355 nm ........................................... 53
Figura I.4. Espectros de absorção no UV-vis do ZnO modificado pelo GPTMS
(a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e) no comprimento de onda
limite de 360 nm. ..................................................................... 54
Figura I.5. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH (a); and 0,1 M
HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).em clorofórmio ....................................... 57
Figura I.6. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,1 M GPTMS_0,2 M LiOH (a1); 0,1 M
GPTMS_0,1 M LiOH (b1) ),1 M GPTMS_0,05 M LiOH (c1) em água. ............. 58
Figura I.7. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,2 M GPTMS_0,4 M LiOH (a2); 0,2 M
LiOH_0,2 M LiOH (b2) 0,2 M GPTMS_ 0,1 M LiOH (c2) em água. ............... 59
Figura I.8. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH (a3); 0,3 M
GPTMS_0,3 M LiOH (b3) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c3) em água. .......... 60
Figura I.9. Micrografias das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH (a), 0,2 M
GPTMS_0,1 M LiOH (b) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c) e o tamanho médio
das amostras entre 3,5- 4 nm (a1), (b1), (c1), respectivamente .............. 62
Figura I.10..Micrografias das amostras 0,1 M HTMS _0,05 M LiOH (d) e 0,1 M
HTMS/AO _0,05 M LiOH (e) e o tamanho médio das amostras de 4,5 nm (d1) e
(e1), respectivamente. ............................................................... 63
Figura I.11..DRX das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH, 0,2 M GPTMS_0,1
M LiOH, 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (a) e das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M
LiOH, 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH (b). ........................................... 64
Figura I.12..XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a); O 1 s (b); C 1s (c) do ZnO puro.
........................................................................................... 66
Figura I.13..XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a1); O 1 s (b1); C 1s (c1), Si 2p (d1)
da amostra 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH ............................................. 67
Figura I.14. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a2); O 1 s (b2); C 1s (c2), Si 2p (d2)
da amostra 0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH. ............................................. 68
Figura I.15. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a3); O 1 s (b3); C 1s (c3), Si 2p (d3)
da amostra 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH. ............................................ 69
Figura I.16. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a5); O 1 s (b5); C 1s (c5), Si 2p (d5)
da amostra 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH. ......................................... 70
Figura I.17. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a6); O 1 s (b6); C 1s (c6), Si 2p (d6)
da amostra 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH............................................... 71
Figura I.18. Espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) do ZnO
modificado pelo GPTMS (a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e). .. 74
Figura I.19. Simulação da estrutura cristalina de ZnO-QDs contendo defeitos
de superfície e defeitos intrínsecos (a) e a redução desses defeitos através
da passivação de superfície pelos organo-silanos (b). .......................... 76
CAPÍTULO II
Figura II.1. Estrutura molecular do pluronic P123, F127 e F68................83
Figura II.2. Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)
das micelas poliméricas formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e Pluronic F127 (c,
d). ....................................................................................... 92
Figura II.3. Estudo de estabilidade por período um de 30 dias, utilizando a
técnica de espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)
das micelas poliméricas formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e Pluronic F127 (c,
d). ....................................................................................... 93
Figura II.4. Espectros de excitação (PLE) e emissão (PL) das micelas
formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e pelo Pluronic F127 (c, d). ................ 95
Figura II.5. Distribuição do tamanho das micelas poliméricas; (a) Micela
Pluronic F68 HTMS_AO; (b) Micela Pluronic F68 HTMS, (c) Micela Pluronic
F127 HTMS_AO e (d) Micela Pluronic F127 HTMS. ................................ 98
Figura II. 6. Ensaio de citotoxicidade em células HaCaT (a, c) e em células
HepG2 (b, e) Nos gráficos o eixo y corresponde a porcentagem de células
vivas após contato com as amostras e o eixo x representa a porcentagem (%)
de micelas poliméricas utilizadas no ensaio de mtt. Os dados referem-se à
média de três experimentos independentes (Média ± erro padrão)..........104
Figura II. 7. Esquema de um citômetro de fluxo................................105
Figura II.8. Histogramas em citometria de fluxo da micela F127 HTMS (a) e
da micela F127 HTMS/AO. Nos gráficos o eixo y corresponde ao número de
células analisadas em função da dispersão lateral de luz (“side scatter” ou
SS), já o eixo x representa a dispersão da lluz a partir da fonte de excitação
no mesmo eixo que o feixe, ou seja, “forward scatter” ou FS................107
Figura II.9. Esquema que mostra os dois tipos de PQs hidrofóbicos presente
em nosso estudo (a), a localização dos PQs no núcleo hidrofóbico da micela
polimérica (b), excitação das micelas em 350 nm e emissão em 550 nm,
região do verde (c) e a quantificação através da luminescência das células
em que houve a internalização das micelas contendo os PQs(d).............108
Lista de Tabelas
CAPITULO I
Tabela I. 1- Nome das amostras representadas pela modificação dos PQs a
base de ZnO com o GPTMS, a quantidade de suspensão coloidal utilizada e a
razão de hidrólise entre o LiOH e o GPTMS................................... 44
Tabela I. 2 - Concentrações atômicas em porcentagem dos fotoelétrons Zn
2p, O 1s, C1s e Si 2p.............................................................. 69
Tabela I.3 - Valores de QY das amostras selecionadas...................... 76
CAPÍTULO II
Tabela II. 1 - Quantidades utilizadas de Pluronic P123/ Pluronic F127 e de
água.................................................................................. 83
Tabela II. 2– Identificação das amostras e do tipo de copolímero utilizado,
assim como o PQ hidrofóbico utilizado e a quantidade de cada
um.................................................................................... 83
Tabela II.3 - Valores de QY das amostras selecionadas..................... 90
Tabela II. 4 – Tamanho, índice de polidispersidade (pdi) e potencial zeta das
amostras selecionadas............................................................ 93
Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS/AO (3) .................. 94
Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS (3) ....................... 94
Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F127HTMS/AO (3) .................. 95
Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F127HTMS (3) ....................... 95
Resumo
Com os avanços obtidos nos últimos anos, é possível observar um interesse crescente no
desenvolvimento de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e tratamento do câncer.
Estes sistemas também conhecidos como “teranósticos” têm se mostrado interessantes, pois
ampliam a capacidade de liberação sustentada de fármacos anticancerígenos em células
específicas, além de proporcionar um monitoramento ótico através da luminescência de pontos
quânticos (PQs). Diante deste contexto, o presente estudo teve como objetivo estabilizar as
nanopartículas (NPs) de ZnO em meio aquoso e orgânico. Com isso, a superfície dos PQs foi
modificada com o 3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) (i) e Hexadecyltrimethoxysilane
(HTMS) (ii). A ligação entre as NPs e as moléculas dos modificadores ocorreu através da reação de
hidrolise e condensação, utilizando como catalisador básico o hidróxido de lítio (LiOH). Esta reação
conduziu a formação de uma camada de siloxano ao redor das NPs,a qual se formou devido a forte
afinidade que os organo-silanos possuem com a superfície hidroxilada do ZnO, resultando nas
ligações covalentes do tipo ZnO-Si-O. Ainda com o objetivo de aumentar a estabilidade do ZnO e
consequentemente suas propriedades luminescentes foi sintetizado uma bicamada de Ácido Oleico
(AO) e HTMS (iii). As modificações na superfície do ZnO foram confirmadas pelas técnicas de
espectroscopia de Infravermelho (IV) e também pelo estudo da composição química e da
concentração atômica dos fotoelétrons presentes nas camadas superficiais dos PQs, através da
espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS). O comportamento ótico dos PQs foi feita
através da espectroscopia de absorção na região do UV-Vis. Com está técnica identificamos o
comprimento de onda limite associado ao pico excitônico do ZnO e como valor do comprimento de
onda limite (λ) foi possível calcular o tamanho médio das NPs e que foi de aproximadamente 3 nm.
Ainda através desta técnica realizamos um estudo de estabilidade avaliando possíveis modificações
associada ao pico excitônico do ZnO. O tamanho final das NPs foi analisado através da microscopia
de transmissão eletrônica (MET), apresentando um tamanho médio entre 3,5- 4nm para as amostras
modificadas pelo GPTMS e de 4,5 nm para as amostras modificadas pelo HTMS e pela bicamada de
AO/HTMS. Já os difratogramas mostraram a presença de uma estrutura cristalina do tipo wurtzite e
de modo geral, picos alargados e pouco definidos, característica já descrita na literatura para a
presença de pequenos cristalitos de ZnO . De acordo com a técnica de luminescência obtivemos
informações a respeito dos níveis de energia em que os elétrons se encontravam dentro do band
gap, como por exemplo, a intensidade luminescente, assim como as cores emitidas pelos PQs. Os
resultados mostraram a importância das modificações em relação à luminescência, sendo possível
visualizar um aumento na emissão luminescente na região do verde devido à preservação das
vacâncias de oxigênio e também pela diminuição dos defeitos de superfície. A incorporação dos PQs
hidrofóbicos nas micelas poliméricas foi realizada com sucesso. Este fato pode ser observado
através dos espectros de absorção no UV-vis e também pelos espectros de excitação (PLE) e de
emissão (PL). Já com a técnica de DLS avaliamos parâmetros relacionados ao tamanho, distribuição
e pdi das micelas e que foram qualificadas com o estudo de estabilidade. A avaliação do potencial
citotóxico das micelas, apresentou uma boa viabilidade celular para as linhagens de HaCat e HepG2
principalmente, para as micelas formadas pelo Pluronic F68. Já a quantificação das células em que
houve a internalização foi feita através da citometria de fluxo. Os resultados mostraram a
capacidade desta técnica em detectar o número de células fluorescentes. Apesar da baixa
porcentagem de internalização celular, os resultados representam de certa forma um potencial a
ser explorado em relação ao sistema, incluindo modificações na síntese dos PQs tornando-os mais
luminescentes, característica que diminui o limite de detecção e também a fixação de moléculas
sinalizadoras ao redor das micelas, facilitando assim sua internalização em células especificas de
determinados tipos de câncer.
Abstract
With the advances obtained in recent years, it is possible to observe a growing interest in the
development of multifunctional systems used, that can be used in the diagnosis and treatment of
cancer These systems also known as " theranostic " and have gained considerable attention due to
their capacity of release anticancer drugs into specific cells, besides to optical monitoring through
quantum dots (QDs). In this context, the present study was aimed to stabilize the nanoparticles
(NPs) of ZnO in water and organic medium. Thereby, QDs surface was modified with 3-
(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) (i) and Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS) (ii). The
binding between the NPs with the modifiers occurred by hydrolysis and condensation reaction under
basic catalysis (LiOH) thus leading to the formation of siloxane layer. This effect occurred due to
strong connection between the silanes with hydroxylated surface of ZnO that resulting in ZnO-Si-O
covalent bond. In order to improve the stability of ZnO-QDs and consequently their
photoluminescence properties, was synthesized a coating bilayer by OA and HTMS (iii). The surface
modification was confirmed by FT IR and also by XPS technique. The optical behavior was performed
by absorption spectroscopy in the UV-Vis region. With this technique was possible to identify the
limit wavelength associated with excitonic peak of ZnO, and through the value of wavelength limit
(λ) was calculated the average size of NPs (≈ 3 nm). In addition, using absorption spectroscopy in
UV-vis, it was analyzed possible changes related to excitonic peak. The finale size of the NPs was
analyzed by transmission electron microscopy (TEM) that showed an average size about 3,5- 4nm for
the samples modified by GPTMS, and 4,5 nm by HTMS and AO/HTMS bilayer. The XRD patterns
indicate the presence of a wurtzite crystal structure. In general, the peaks in diffractograms are
poorly defined which indicates the presence of small crystallites, characteristic already described in
literature for ZnO NPs. According to photoluminescence results, it was possible to obtain relevant
information regarding the energy levels of electrons within in the band gap, such as
photoluminescence intensity and color emitted. The results of capped ZnO-QDs by organo-silanes
showed an increase of photoluminescence intensity in green region due to vacancies preservation,
such as the decrease of surface defects. The encapsulation of hydrophobic QDs into polymeric
micelles was successful. This fact can be observed by absorption spectroscopy in UV-vis and by
photoluminescence measurements. DLS was carried out to measure the hydrodynamic size
distribution and polydispersity index (pdi) of ZnO-QDs capped encapsulated. The cytotoxicity of the
micelles showed a great cellular viability for the HaCat and HepG2 cells, mainly for the micelles
formed by Pluronic F68. The cellular internalization was performed by flow cytometry. The results
demonstrated the ability of this technique to detect the number of fluorescent cells. Despite the
low percentage of cells internalized, these results representing a potential to be explored, such as
the synthesis of QDs making them more luminescent, feature that improve the detection and also by
fixing of targeting molecules around the micelles, thus facilitating their internalization in specific
cancer cells
Keywords
Quantum dots (QDs), ZnO; Photoluminescence; Organosilanes; Oleic Acid and Surface modification.
Sumário
INTRODUÇÃO...................................................................... 22
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................ 26
Pontos Quânticos ................................................................. 26
Pontos quânticos a base de ZnO ............................................... 27
Modificações na superfcie dos PQs............................................. 31
Passivação do tipo inorgânica “Core Shell”................................... 31
Passivação do tipo orgânica..................................................... 31
Micelas Poliméricas............................................................... 31
Sistemas Teranósticos ........................................................... 31
OBJETIVO.......................................................................... 39
CAPÍTULO I
I)1 MATERIAL e MÉTODOS...................................................... 41
I)1.1 Métodos...................................................................... 42
I)1.1.1 Precursor oxiacetato de zinco.......................................... 42
I)1.1.2 Suspensão coloidal de ZnO............................................. 42
I)1.1.3 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do 3-
(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) e do
Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)............................................. 42
I) 1.1.4 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do Ácido Oleico
(AO) seguido pelo Hexadecyltrimethoxysilane
(HTMS)............................................................................... 42
I)1.3 Caracterização físico-química do pó de ZnO puro e do pó de ZnO
modificado pelo GPTMS, HTMS e AO/HTMS ................................... 45
I)1.3.1 Luminescência (PL)....................................................... 45
I)1.3.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV)................................. 45
I)1.3.4 Difração de raios-X (DRX)................................................ 45
I)1.3.5 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X
(XPS)................................................................................. 45
I)1.4 Caracterização físico-química do ZnO em suspensão coloidal, do ZnO
modificado pelo GPTMS em água e do ZnO modificado pelo HTMS e
AO/HTMS em clorofórmio)....................................................... 46
I)1.4.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível
(UV-Vis) ............................................................................. 46
I)1.4.2 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água e
do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em
clorofórmio......................................................................... 46
I)1.4.3 Rendimento quântico (quantum yield)................................ 46
I)1.4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)........................ 46
I)2 RESULTADOS e DISCUSSÕES................................................ 47
I)2.1 Suspensão coloidal e modificações na superfície do
ZnO................................................................................... 47
I)2.2.Espectroscopia vibracional na região do Infravermelho
(IV)................................................................................... 49
I)2.3 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível
(UV-Vis).............................................................................. 49
I)2.4 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água e do
ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em
clorofórmio......................................................................... 53
I)2.5 Microscopia de Transmissão Eletrônica (MET).......................... 58
I)2.6 Difração de raios-X (DRX).................................................. 60
I) 2.7 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X
(XPS)................................................................................. 62
I)2.8 Luminescência (PL).......................................................... 70
I)2.9 Rendimento quântico (quantum yield QY).............................. 74
I)3 CONCLUSÕES................................................................... 76
CAPÍTULO II
II) 1 MATERIAL e MÉTODOS .................................................... 79
II)1.1 Métodos..................................................................... 80
II)1.1.1 Obtenção das micelas poliméricas.................................... 80
II)1.2 Caracterização físico-química das Micelas Poliméricas contendo
os PQs hidrofóbicos................................................................ 80
II)1.2.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-
Vis)................................................................................... 80
II)1.2.2 Estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos incorporados nas
micelas poliméricas .............................................................. 81
II)1.2.3 Luminescência (PL)..................................................... 81
II)1.2.4 Rendimento quântico (quantum yield QY)......................... 81
II)1.2.5 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ............................... 81
II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas poliméricas
contendo os PQs hidrofóbicos ................................................... 85
II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas através
da citometria de fluxo............................................................. 86
I)2 RESULTADOS e DISCUSSÕES............................................... 82
II)2.1 Obtenção das micela poliméricas...................................... 82
II)2.1.1 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas
polimérica........................................................................... 83
II)2.1.2 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-
Vis)................................................................................... 85
II)2.1.3 Estudo de Estabilidade das micelas poliméricas contendo os PQs
através da técnica UV-vis........................................................ 86
II)2.1.4 Luminescência (PL)..................................................... 88
II)2.1.5 Rendimento quântico (quantum yield QY) ......................... 89
II)2.1.6 Espalhamento de luz dinâmico (DLS)................................. 90
II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas poliméricas contendo
os PQs hidrofóbicos .............................................................. 102
1 II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas através
da citometria de fluxo............................................................ 105
II)3 CONCLUSÕES.................................................................. 109
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 112
Introdução ________________________________________________________________________________________22
Nathalia Cristina Rissi _____________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
Com os avanços obtidos nos últimos anos, principalmente no campo
da nanotecnologia é possível observar um interesse crescente no
desenvolvimento de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e
tratamento do câncer. Estes sistemas também conhecidos como
“teranósticos” têm se mostrado interessantes, pois ampliam a capacidade de
liberação sustentada de fármacos anticancerígenos em células específicas,
além de proporcionar um monitoramento ótico através da luminescência de
pontos quânticos (PQs) (Frasco e Chaniotakis, 2010; Wang et al., 2010; Zhao
et al., 2013; Zhang et al., 2014).
Os PQs são nanopartículas (NPs) com diâmetro entre 2-10 nm
formados a partir de cristais semicondutores e que possuem propriedades
luminescentes (Wang, Gao e Su, 2010). De acordo com o tamanho, os PQs
podem emitir radiação em baixos comprimentos de onda na região do azul
para NPs de tamanhos menores e também em altos comprimentos de onda na
região do vermelho para tamanhos maiores (Ghasemi, Peymani e Afifi, 2009).
O óxido de zinco (ZnO) é um exemplo de PQ bastante utilizado na
área química e biológica devido suas propriedades luminescentes e sua baixa
toxicidade (Wang, Gao e Su, 2010). O ZnO é um óxido semicondutor
biodegradável e um material luminescente não tão caro como os PQs
tradicionalmente utilizados a base de Cádmio (Cd) (Fu et al., 2007). Além
disso, como citado anteriormente o ZnO possui uma toxicidade menor em
comparação aos PQs habituais (Xiao et al., 2011) e uma maior
biocompatibilidade (Ding et al., 2011). No entanto, esses PQs são geralmente
instáveis em água e tendem a se agregarem, apresentando uma baixa
luminescência (Li et al., 2015). Por este motivo, algumas estratégias vêm
sendo estudados com o objetivo de modificar sua superfície para assim,
aumentar sua estabilidade em ambientes aquosos (Gulia e Kakkar, 2013). Os
estudos realizados por Moussodia et al. (2008) e Moussodia et al. (2010),
Introdução ________________________________________________________________________________________23
Nathalia Cristina Rissi _____________________________________________________________________
mostraram resultados positivos em relação ao ZnO modificado por
organosilanos. A partir dos resultados foi possivel observar especilamente,
através da internalização ceular em Staphylococcus aureus, o potencial
desses PQs em atuarem com sondas biologicas. De acordo com os autores, a
estabilidade em água, uma boa luminescencia e uma baixa citotoxicidade
favorecem o uso destes PQs em várias aplicações biomédicas.
Durante o processo de síntese dos PQs, a obtenção de partículas
muito pequenas favorece a formação de certos defeitos de superfície. Isto
ocorre porque alguns átomos presentes na superfície não possuem seus
orbitais totalmente preenchidos, formando as chamadas “dangling bons” ou
ligações soltas (Wang, Zhang e Zhang, 2014). Uma forma de reduzir estes
defeitos é através da passivação de superfície. A passivação de superfície é
um tipo de modificação realizada com o intuito de formar ligações entre os
átomos presentes na superfície dos PQs com outro material (Bera et al.,
2010).
Existem formas inorgânicas e orgânicas de se passivar a superfície
de um PQ, sendo as passivações do tipo inorgânica como, por exemplo, a
formação de core shell as mais utilizadas. Esse tipo de passivação é feita
através de um semicondutor (“core”) coberto por uma camada (“shell”) de
um semicondutor distinto, aumentando assim sua luminescência (Dabbousi et
al., 1997). Já as passivações do tipo orgânica são feitas geralmente com os
modificadores como, por exemplo, o óxido de trinoctylphosphine (TOPO), o
qual é muito utilizado na síntese de diversos PQs devido seu alto ponto de
ebulição. Usualmente, o TOPO é utilizado em combinação com outros
tensoativos ou co-solventes, tais como trinoctylphosphine (TOP),
hexadecilamina, ou o esteárico ácido, concedendo aos PQs uma
característica hidrofóbica. (Qu, Peng e Peng, 2001; Talapin et al., 2001).
Porém, existem algumas desvantagens no uso do TOPO e estão relacionadas
principalmente, com a sua toxicidade. Por este motivo, o ácido oleico (AO)
por ser menos tóxico e também mais barato vem sendo bastante explorado
Introdução ________________________________________________________________________________________24
Nathalia Cristina Rissi _____________________________________________________________________
como modificador na síntese de alguns PQs no lugar do tradicional
(Kumari et al., 2008).
Nos últimos anos, os organosilanes vêm ganhando destaque por
serem ótimos candidatos à passivação e estabilização do ZnO, pois suas
moléculas se ligam de forma covalente a superfície hidroxilada das NPs,
criando uma barreira de proteção do núcleo com a água (Jana, Earhart e
Ying, 2007; Jana et al., 2007; Wu et al., 2007; Aboulaich et al., 2012).
Outros relatos na literatura também descrevem modificações na
superfície utilizando como, por exemplo, o ácido glicólico, revestimento com
sílica, além da incorporação dos PQs em lipossomas e em micelas poliméricas
(Weissleder et al., 2005; Hezinger, Teßmar e Göpferich, 2008; Law et al.,
2008; Liu et al., 2011; Liu et al., 2012). Estudos têm demostrado que a
estabilidade dos PQs hidrofóbicos pode ser aumentada através da
encapsulação em polímeros anfifílicos. Este método permite que os PQs
sejam dispersos em meios aquosos, mantendo-os estáveis durante longos
períodos devido à proteção dos mesmos no interior da camada hidrofóbica
(Dubertret et al., 2002; Wu et al., 2003; Gao et al., 2004; Smith et al.,
2008).
A finalidade do uso de micelas formadas por copolímeros em bloco
na medicina é minimizar problemas relacionados com a solubilidade de
fármacos hidrofóbicos, toxicidade e farmacocinética inadequada. Os avanços
mais significativos foram feitos com a incorporação de agentes
anticancerígenos (Matsumura et al., 2004; Hamaguchi et al., 2005). Outra
estratégia para aumentar a seletividade de um vetor pelo seu alvo consiste
em fixar moléculas sinalizadoras às micelas poliméricas, mostrando-se
também eficazes no aumento da atividade anticancerígena (Sudimack e Lee,
2000; Bae et al., 2005; Mi, Liu e Feng, 2011). A capacidade em que as
micelas chegam ao tumor também favorece o uso de PQs hidrofóbicos como
marcadores biológicos em células tumorais, proporcionando a detecção das
Introdução ________________________________________________________________________________________25
Nathalia Cristina Rissi _____________________________________________________________________
mesmas de forma mais eficaz, contribuindo assim para o diagnóstico de
diversos tipos de tumores (Ding et al., 2011; Kumar et al., 2012; Liu et al.,
2012).
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 27
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Pontos Quânticos
Os PQs são NPs formadas a partir de cristais semicondutores
nanométricos que apresentam propriedades luminescentes (Ghasemi,
Peymani e Afifi, 2009). Os semicondutores dos grupos II - VI são os mais
utilizados, pois neste grupo é possível alterar propriedades de absorção em
função de alterações relacionada ao tamanho dos mesmos (Rossetti et al.,
2005; Prezhdo, 2009; Akimov, Neukirch e Prezhdo, 2013; Proshchenko e
Dahnovsky, 2015).
O processo luminescente dos PQs acontece pelo fato deles
possuírem uma banda de valência preenchida por elétrons e uma banda de
condução vazia separada por uma lacuna de energia denominada band gap.
De modo geral, as propriedades óticas dos PQs estão diretamente ligadas ao
confinamento quântico desses elétrons na banda de valência e da sua
transição para a banda de condução. A energia (Eg) necessária para que
ocorra a transição de uma banda para a outra está relacionada com o
tamanho das nanopartículas e consequentemente com as cores emitidas
(Samir et al., 2012). Por este motivo, o tamanho da partícula constitui um
dos aspectos mais estudados, uma vez que esse controle permite alterações
nas propriedades químicas e eletrônicas desses materiais (Trindade et al.,
2001). A Figura 1 mostra os diferentes níveis de Eg dos PQs em relação ao
tamanho dos nanocristais.
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 28
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Figura 1 Processo luminescente dos PQs e seus diferentes níveis de Eg de
acordo com o tamanho dos nanocristais. Adaptado (Ioannou e Griffin, 2010).
Pontos quânticos a base de ZnO
Durante o processo de síntese o ZnO pode se cristalizar em três
formas alotrópicas distintas, o Sal gema, a Esfarelita e a Wurtzita. Porém, a
estrutura mais estável é a do tipo wurtzita, na qual o oxigênio e o zinco
exibem geometria tetraédrica de ZnO4 orientados em uma só direção, com
camadas ocupadas por átomos de zinco que se alteram com camadas
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 29
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
ocupadas por átomos de oxigênio (Özgür et al., 2005). Diferente do ZnO em
tamanhos maiores, o ZnO nanoparticulado possui propriedades luminescentes
devido a presença de certos tipos de defeitos encontrados em sua rede
cristalina. Estes defeitos ocorrem durante o processo de síntese e interferem
diretamente na fluorescência emitida, criando níveis intermediários de
energia dentro da banda proibida. Exemplos dos principais defeitos
encontrados nas nanoparticulas de ZnO são: o oxigênio intersticial e o zinco
intersticial e os dois principais: as vacâncias de oxigênio (Vo) e as vacâncias
de zinco (Vzn), conforme mostra a Figura 2.
A emissão na região do visível pelo ZnO são influenciadas por
vários parâmetros relacionados aos defeitos, ou seja, métodos diferentes de
síntese podem resultar em nanopartículas do mesmo tamanho, porém com
emissões em diferentes regiões. Este efeito foi estudado por alguns autores e
revela a importância do método empregado em relação ao tipo de defeito
formado na rede cristalina (Sahai e Goswami, 2014).
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 30
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Figura 2 Estrutura cristalina do tipo wurtzita do ZnO sem defeitos (a), dois
dos principais defeitos encontrados: vacâncias de oxigênio Vo (b) e as
vacâncias de zinco Vzn (c). Adaptado de (Janotti e Van De Walle, 2009).
A utilização do processo “sol-gel” na preparação das NPs de ZnO
com efeito de confinamento quântico foi descrito de forma pioneira por
(Spanhel e Anderson, 1991). O termo sol é utilizado para definir a dispersão
de partículas coloidais (tamanho entre 1 e 1000nm) estabilizada por um
fluido, enquanto que o termo gel pode ser reconhecida como um sistema
formado pela estrutura rígida de partículas coloidais (gel coloidal) que
imobiliza a fase líquida nos interstícios De modo geral esta metodologia é
baseada na hidrólise e condensação de precursores (Brinker e Scherer, 1990;
2013). Segundo (Spanhel e Anderson, 1991) a obtenção dessas nanopartículas
por este método consiste em três etapas básicas: (1) preparação do
precursor; (2) hidrólise deste precursor para a formação da suspensão
coloidal e da (3) concentração da suspensão coloidal para formar o sol final.
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 31
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Através dessas etapas foi possível observar por microscopia eletrônica de
transmissão, a presença de nanopartículas de ZnO de aproximadamente 3,5
nm e que após 5 dias dobraram de tamanho. Segundo os autores esse
crescimento foi favorecido pela concentração da suspensão originando
diversos cristais, os quais alteram a banda de emissão do material.
Como citado anteriormente, o processo de síntese empregado para
a obtenção desses PQs é de grande importância. Por este motivo, é
considerável destacar alguns trabalhos relacionados com a síntese dos
materiais a base de zinco. Como o caso do estudo realizado por (Tokumoto
et al., 1999), que avaliou o estudo cinético da formação das nanoparticulas
de ZnO a partir de um precursor oxi-acetato de zinco, mostrando que as
suspensões coloidais obtidas eram compostas por nanopartículas esféricas
com distribuição de tamanho em torno de 2nm, que aumentavam com o do
tempo de reação.
A obtenção de NPs de ZnO também foram obtidas através da
hidrólise e condensação do precursor de oxi-acetato de zinco pela adição da
base KOH. A formação e crescimento do ZnO ocorre em diferentes etapas: no
inicio o precursor é consumido originando a fase de óxido; em seguida ocorre
o estabelecimento de um regime de equilíbrio entre as partículas nucleadas
que crescem por coalescência ; na etapa final as partículas pequenas se
dissolvem e precipitam sobre as nanoparticulas maiores (Caetano et al.,
2011).
Com o intuito de aumentar a luminescência dos PQs a base de ZnO
foi realizado através do processo sol-gel a dopagem dos mesmos com os íons
de Mg 2+. Esses íons influenciaram fortemente no crescimento e no tamanho
final desses PQs. Além disso, a dopagem segundo os autores aumentaram o
band gap das NPs e consequentemente a sua luminescência na região do
visível, que foi maior em até seis vezes quando comparada a suspensão
coloidal de ZnO (Manaia et al., 2015).
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 32
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Modificações na superfcie dos PQs
Passivação do tipo inorgânica “Core Shell”
De acordo com Vasudevan et. al., (2015), os PQs do tipo “core
shell” foram desenvolvidos para melhorar a eficiência luminescente de PQs
individuais. O uso de semicondutores distintos em relação ao núcleo favorece
o preenchimento de vazios presentes na estrutura dos PQs, proporcionando
assim uma melhoria no rendimento luminescente do material final (Reiss,
Protiere e Li, 2009). Existem dois tipos de core shell, o tipo I, o qual
apresenta um núcleo com uma energia menor que a energia do shell, como
por exemplo, o CdSe/ CdS, CdSe/ ZnS e InAs/ CdSe (core/shell) (Reiss,
Protiere e Li, 2009). E o tipo II, o qual apresenta um núcleo com uma energia
igual ou superior que a energia do shell, como por exemplo, o ZnTe/ CdSe,
CdTe/CdSe, CdS/ZnSe (core/shell) (Kim et al., 2003).
Estudos recentes revelam a importância do uso de core shell em
diversas aplicações biológicas, como o caso do estudo realizado por He et
al., (2016). Neste estudo os PQs formados pelos semicondutores
CdSeTe/CdS/C, mostraram uma baixa toxicidade e boa biocompatibilidade
devido à formação da camada final de carbono. Os testes foram realizados
através da internalização em células do tipo carcinoma cervical, indicando
excelentes propriedades óticas na região do infravermelho próximo e
também a viabilidade celular deste core shell.
O uso de PQs do tipo core shell na determinação da vitamina B6
também foi alvo do estudo realizado por (Koneswaran e Narayanaswamy,
2015), que teve como base a obtenção de um método simples e sensível para
determinação desta vitamina através da fluorescência da camada de L-
cisteina em torno dos PQs do tipo CdS/ZnS. O mecanismo utilizado foi
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 33
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
baseado na extinção da fluorescência dos PQs em relação à concentração de
vitamina B6.
O tipo de método empregado na obtenção dos core shell é de
grande importância, sendo tema do estudo realizado por (Chen, J. et al.,
2015), que apresentaram um método de síntese simples e econômico. A
técnica desenvolvida consistia na obtenção do core-shell do tipo CdTe/CdS
através de diferentes tempos de reação utilizando o método de micro-ondas,
o qual apresentou resultados positivos em relação a uniformidade de
tamanho, assim como uma elevada intensidade fluorescente. E através dos
ensaios biológicos foi possível observar uma baixa toxidade e boa
biocompatibilidade, facilitando o uso deste core shell como sonda biológica.
Já no estudo realizado por Aldeek et al., (2011), os PQs a base de
CdSe foram recobertos por uma camada de ZnO e utilizados com sucesso na
imagem do biofilme bacteriano (Shewanella oneidensis). Segundo os autores
o revestimento com o ZnO mostrou-se mais luminescente quando comparado
com o CdSe sozinho, apresentando um rendimento quântico de 24%. Os PQs
do tipo de CdTe/CdS também foram revestidos com o ZnO e apresentaram
em solução aquosa uma maior estabilidade, maior luminescência e uma
menor toxicidade. Este efeito ocorreu pela passivação da superfície através
da camada de ZnO, apresentando futuramente um grande potencial na
internalização celular.
Passivação do tipo orgânica
As passivações do tipo orgânica também vêm ganhando destaque,
através da utilização de ligantes capazes de diminuir os defeitos de
superfície. Segundo Carrillo-Carrión et al., (2009), o uso de ligantes
formados por grandes cadeias orgânicas tende a diminuir a luminescência,
porém aumentam os níveis de fotoestabilidade dos PQs em comparação com
ligantes formados por cadeias menores.
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 34
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Como dito anteriormente as passivações do tipo orgânica são feitas
geralmente com o TOPO é utilizado em combinação com outros tensoativos
ou co-solventes, tais como o TOP, hexadecilamina, ou o esteárico ácido,
concedendo aos PQs uma característica hidrofóbica. (Qu, Peng e Peng, 2001;
Talapin et al., 2001). Segundo Hammer, Emrick e Barnes, (2007) as
características hidrofóbicas dos passivadores torna possível à dispersão dos
PQs hidrofóbicos em solventes orgânicos, podendo assim ser encapsulados
em micelas poliméricas, lipossomas entre outros sistemas. Este método
permite que os PQs hidrofóbicos sejam dispersos em meios aquosos,
mantendo-os estáveis durante longos períodos devido à proteção dos mesmos
no interior da camada hidrofóbica (Dubertret et al., 2002; Wu et al., 2003;
Gao et al., 2004; Smith et al., 2008).
O Ácido Oleico (AO) também vem sendo muito utilizado como
passivador na síntese de PQs no lugar do tradicional TOPO, devido sua baixa
toxicidade e também por ser mais barato e seguro. Um estudo realizado por
Kumari et al.,(2008), comparou o uso do TOPO e do AO na passivação de PQs
a base de CdSe, apresentando resultados satisfatórios para o AO em relação
a estabilidade estérica e fotoestabilidade desses PQs.
As passivações do tipo orgânica além de aumentar o rendimento
luminescente dos PQs também possuem o propósito de estabilizar as NPs em
água. Com isso, Li et al., (2015), utilizaram como passivador de superfície do
ZnO, o hidrofóbico hexadecyltrimethoxysilane (HTMS) juntamente com o
hidrofílico aminopropiltrietoxisilano (APS), formando assim uma bicamada
em torno das NPs. Segundo os autores a utilização de um passivador
hidrofóbico ao redor do núcleo e funcionalizado com outro de caráter
hidrofílico, permitiu que as NPs fossem estabilizadas em água e com uma
intensidade luminescente melhorada cerca de 10 vezes em relação ao ZnO
puro.
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 35
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Um estudo realizado por Moghaddam et al., (2015), também
utilizou como passivador de superfície do ZnO um organosilano, no caso o
aminopropyltriethoxysilane (APTES). Os resultados mostram a capacidade
desse passivador na estabilização das NPs em água, além do aumento no
rendimento luminescente. A passivação além de diminuir os defeitos de
superfície através do revestimento, também preservou as vacâncias de
oxigênio presentes na estrutura do ZnO. Esse efeito ocorreu devido o meio
alcalino utilizado para a reação de hidrolise e condensação entre os
grupamentos do APTES com o ZnO, podendo ter gerado novos ânions de
oxigênio, os quais preencheram as vacâncias de oxigênio.
Os estudos realizados por Moussodia et al. (2008) e Moussodia et
al. (2010), mostraram resultados positivos em relação ao ZnO modificado por
organosilanos. A partir dos resultados foi possivel observar especilamente,
através da internalização ceular em Staphylococcus aureus, o potencial
desses PQs em atuarem com sondas biologicas. De acordo com os autores, a
estabilidade em água, uma boa luminescencia e uma baixa citotoxicidade
favorecem o uso destes PQs em várias aplicações biomédicas.
Micelas Poliméricas
As micelas poliméricas têm sido muito utilizadas nas indústrias
farmacêuticas para a incorporação de fármacos. Atualmente, os estudos
envolvendo a associação de moléculas farmacologicamente ativas com
membranas celulares têm encontrado sua principal aplicação no
planejamento de medicamentos e nos sistemas carregadores/liberadores,
através do encapsulamento de vetores transportadores de fármacos
específicos para liberação controlada nas regiões (tecidos e órgãos) a serem
tratadas (Qiu e Bae, 2006)
As micelas poliméricas são partículas dispersas em água de ordem
manométrica (10 – 100 nm), sendo preparadas a partir de polímeros
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 36
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
sintéticos, os quais contêm partes hidrofílicas e hidrofóbicas. A parte
hidrofílica geralmente é formada por unidades de óxido de etileno (POE) e
sua parte hidrofóbica formada por aminoácidos (Adams e Kwon, 2003). O
tipo de micela mais comumente utilizada é a de forma esférica. No entanto,
várias morfologias dependendo da característica do copolímero são
atingíveis, podendo então ocorrer uma transição entre micelas e vesículas
(Choucair e Eisenberg, 2003). Para a formação de micelas esféricas a parte
hidrofílica do polímero não deve sobrepor-se a porção hidrofóbica (Allen,
Maysinger e Eisenberg, 1999). As propriedades que definem as micelas
incluem a concentração micelar crítica (CMC), o número de agregação, o
tamanho e a forma. A maior força que dirige a micelização é o decréscimo
da energia livre do sistema devido à remoção dos fragmentos hidrofóbicos do
meio aquoso com a formação da micela. Em ambientes aquosos as micelas
são compostas por uma camada interna, constituída pelos blocos
hidrofóbicos dos copolímeros, estabilizados pela camada externa de blocos
hidrofílicos (Qiu e Bae, 2006).
A finalidade do uso de micelas formadas por copolímeros em bloco
na ciência é minimizar problemas relacionados com a solubilidade de
fármacos hidrofóbicos, toxicidade e farmacocinética inadequadas. Os
avanços mais significativos foram feitos com a incorporação de agentes
anticancerígenos. Outra estratégia para aumentar a seletividade de um vetor
pelo seu alvo consiste em fixar moléculas sinalizadoras às micelas
poliméricas, mostrando-se também eficazes no aumento da atividade
anticancerígena (Bae et al., 2005; Mi, Liu e Feng, 2011). As micelas
poliméricas e os pontos quânticos têm sido utilizados como sistemas de
entrega de fármacos, além de possuir a capacidade de imagem, tanto “in
vitro” como “in vivo” (Allen, Maysinger e Eisenberg, 1999).
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 37
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Sistemas Teranósticos
Segundo Ho e Leong, (2010), a superfície dos PQs permite a
obtenção de sistemas multifuncionais direcionados ao diagnóstico e
tratamento de doenças. A versatilidade do uso dos PQs como sistemas
multifuncionais provém da possibilidade de conjugação com vários tipos de
moléculas em sua superfície. Estes sistemas, também são conhecidos como
“teranósticos”, sendo um termo utilizado para designar a combinação entre
terapia e diagnóstico.
Um exemplo de sucesso de sistema teranóstico a base de PQs no
tratamento do câncer de próstata foi realizado por Bagalkot et al., (2007).
Os resultados deste estudo apresentaram uma alta especificidade e
sensibilidade desses PQs funcionalizados com o aptâmero A10 RNA e com o
fármaco anticancerígeno, a Doxorrubicina (Dox), que foi intercalado junto à
haste do aptâmero
Segundo Chakravarthy et al., (2011) a capacidade de fornecer uma
terapia alvo para identificar e atacar especificamente certos tipos células
seria um grande avanço no tratamento farmacológico de doenças
pulmonares. Por este motivo, o estudo relatou a capacidade de PQs de
CdSe/CdS/ZnS conjugados com a Dox em alvejar os macrófagos alveolares,
células que desempenham um papel crucial na patogênese das lesões
pulmonares inflamatórias. Através das propriedades luminescentes do
complexo foi possível a confirmação visual da captação intracelular, bem
como a dissociação da Dox no núcleo, que é necessário para a ação do
fármaco.
PQs a base de ZnO também foram utilizados como sistemas
teranósticos através de sua encapsulação como o polímero de quitosana,
sendo assim possível veicular a Dox. Os resultados indicam uma nova geração
de PQs associados a fármacos anticancerígenos e encapsulados com
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 38
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
polímeros biocompatíveis na terapia e diagnóstico (Yuan, Hein e Misra,
2010).
A Figura 3 ilustra uma possível estrutura de um sistema teranóstico
a base de PQs formado por uma camada de polímero com a função de
proteger e veicular fármacos lipofílicos, e também as possíveis
funcionalizações através de anticorpos e do ácido fólico na superfície do PQ.
Já a Figura 4 ilustra um sistema teranóstico formado por uma micela
polimérica contendo os PQs e fármaco lipofílico e também das possíveis
funcionalizações através de anticorpos e do ácido fólico na superfície do
sistema.
Figura 3 Esquema de sistema teranóstico a base de PQ, recoberto por uma
camada de polímero contendo fármaco e as funcionalizações através
anticorpos e ácido fólico.
Revisão Bibliográfica ___________________________________________________________________ 39
Nathalia Cristina Rissi
_________________________________________________________________
Figura 4 Esquema de um sistema teranóstico formado por micela polimérica
contendo os PQs e fármaco lipofílico e também as funcionalizações através
de anticorpos e do ácido fólico na superfície do sistema.
Objetivo __________________________________________________________________41
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________
OBJETIVO
Modificar a superfície dos PQs a base de ZnO, tornando-os
hidrofílicos através da ligação com o 3-(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane
(GPTMS) e hidrofóbicos através da ligação com o Hexadecyltrimethoxysilane
(HTMS) e da bicamada formada entre o Ácido Oleico (AO) e o HTMS. O
objetivo das modificações está principalmente, relacionado com a
estabilização das NPs em ambientes aquosos, assim como a análise de suas
propriedades luminescentes e da toxicidade dos PQs hidrofóbicos, uma vez
que os mesmos serão incorporados em micelas poliméricas. As micelas, além
de permitir a veiculação dos PQs hidrofóbicos em sistemas biológicos,
também possuem o papel de direcioná-los às células tumorais, possibilitando
futuramente o uso deste sistema no diagnóstico do câncer.
CAPÍTULO I
Obtenção e caracterização dos PQs a base
de Zno em suspensão coloidal e do ZnO
modificado pelo GPTMS (i), HTMS (ii) e pela
bicamada de AO/HTMS (iii).
Capítulo I _______________________________________________________________________________________43
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 1 MATERIAL E MÉTODOS
Materiais
•Acetato de zinco diidratado (Zn (CH3COO)2.2H2O) – Qhemis;
•Hidróxido de Lítio - Vetec Química Fina;
•Álcool Etílico absoluto PA – Synth;
•(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) – Sigma;
•Rodamina 6G – Sigma.
Equipamentos
•Lavadora Ultra- Sônica Digital SoniClean 2 – Seers Medical;
•Centrífuga HITACHI HIMAC CR22GII;
•Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis;
•Espectrofotômetro no infravermelho Shimadzu® modelo IR Prestige-21;
•Fluorímetro SPEX F2121 e detector de germânio North Coast Scientific
Corporation;
•Microscópio Eletrônico de Transmissão (PHILIPS; modelo CM 200 SUPER
TWIN);
•Difração de Raios X - SIEMENS modelo D5000, DIFFRAC PLUS XRD Commee.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________44
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 1.1 Métodos
I) 1.1.1 Precursor oxiacetato de zinco
O precursor que originará os PQs de ZnO foi preparado pelo método
proposto por (Spanhel e Anderson, 1991) a partir de uma dispersão etanólica
(0,1 mol. L-1) de acetato de zinco, Zn (CH3COO)2.2H2O mantida sob refluxo a
80°C durante 3 horas. Foi acoplado um sistema de destilação e uma saída
contendo cloreto de cálcio previamente seco e calcinado, de modo a evitar
contato da dispersão com a umidade exterior. Em seguida esta dispersão
precursora foi resfriada a temperatura ambiente e estocada em freezer a
temperatura próxima de -10°C.
I) 1.1.2 Suspensão coloidal de ZnO
Os PQs foram sintetizados através da reação hidrólise e
condensação (sol-gel), utilizando uma dispersão etanólica de hidróxido de
lítio (LiOH) á 0,5 M que foi adicionada ao precursor (descrito na etapa
anterior) sob agitação magnética a 40°C, seguindo o tempo de reação de 40
minutos e uma a razão de hidrólise r: [OH+]/[Zn2+] = 1,4 (Spanhel e
Anderson, 1991). Já a obtenção das NPs na forma de pó foi feita da
proporção de 1:4 de suspensão coloidal para heptano, precipitando assim as
NPs. Este precipitado foi separado do resto da suspensão através a
centrifugação por 10 minutos (10000 rpm) e seco á vácuo a temperatura
ambiente
Capítulo I _______________________________________________________________________________________45
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 1.1.3 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do 3-
(Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS) e do
Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)
A superfície dos PQs foi modificada de forma individual e através
dos organosilanos, utilizando uma quantidade de 10 ml suspensão coloidal
contendo o GPTMS para os PQs hidrofílicos e o HTMS para os PQs hidrofóbicos
A concentração do catalisador básico (LiOH) utilizado para promover a
ligação entre os organo-silanos com o ZnO variou em função da quantidade
de GPTMS, conforme listado pela Tabela I. 1. Já a concentração de LiOH e
HTMS foi de 0,05 M e 0,1 M, respectivamente. Ambas as reações foram
realizadas separadamente em banho de ultrassom a temperatura ambiente e
durante 15 minutos e após este período observamos a formação de um
precipitado branco, que foi separado do resto da suspensão através da
centrifugação e logo em seguida seco a vácuo para obtenção dos PQs na
forma de pó.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________46
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Tabela I. 1- Nome das amostras representadas pela modificação dos PQs a
base de ZnO com o GPTMS, a quantidade de suspensão coloidal utilizada e a
razão de hidrólise entre o LiOH e o GPTMS.
Nome amostra
Quantidade de suspensão
coloidal de ZnO (ml)
Razão de hidrólise
[LiOH]/[GPTMS] (Molar)
0,1 M GPTMS_0,2 M LiOH 10 0,2/ 0,1
0,1 M GPTMS_0,1 M LiOH 10 0,1/0,1
0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH 10 0,05/0,1
0,2 M GPTMS_0,4 M LiOH 10 0,4/0,2
0,2 M GPTMS_0,2 M LiOH 10 0,2/0,2
0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH 10 0,1/0,2
0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH 10 0,6/0,3
0,3 M GPTMS_0,3 M LiOH 10 0,3/0,3
0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH 10 0,15/0,3
I) 1.1.4 Modificações da superfície dos PQs de ZnO através do
Ácido Oleico (AO) seguido pelo Hexadecyltrimethoxysilane (HTMS)
A superfície dos PQs também foi revestida por uma bicamada
lipofílica, sendo formada primeiramente por uma camada de AO e por fim
por uma de HTMS Para tal modificação também foi utilizada 10 ml de
suspensão coloidal contendo 0,05 M de AO. A reação entre os PQs de ZnO
com o AO foi feita sob banho de ultrassom, durante 5 minutos a temperatura
de 60 oC. Logo em seguida foi adicionado o HTMS (0,1 M) e o LiOH (0,05 M),
os quais reagiram com as NPs revestidas pelo AO também sob banho de
Capítulo I _______________________________________________________________________________________47
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
ultrassom durante 15 minutos a temperatura ambiente. Após este período
também observamos a formação de um precipitado branco, que foi separado
do resto da suspensão através da centrifugação e logo em seguida seco a
vácuo para obtenção dos PQs na forma de pó.
I) 1.3 Caracterização físico-química do pó de ZnO puro e do pó de
ZnO modificado pelo GPTMS, HTMS e AO/HTMS
I) 1.3.1 Luminescência (PL)
Os espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) dos PQs foram
registados no fluorímetro SPEX F2121 com detector de germânio North Coast
Scientific Corporation com uma lâmpada de xénon (20 kW) como a fonte de
excitação
I) 1.3.2 Espectroscopia de Infravermelho (IV)
Os espectros de absorção no infravermelho médio de 4000 a 400
cm-1 foram obtidos em um espectrofotômetro Shimadzu Fourier Transform
Infrared Spectrophotometer, modelo IR Prestige-21 IR Affinity-1 FTIR-8400S
(Kyoto, Japan). Para a obtenção dos espectros confeccionaram-se pastilhas
de 200 mg de brometo de potássio (KBr) contendo as amostras na
concentração de 1%.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________48
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 1.3.4 Difração de raios-X (DRX)
O DRX foram analisados pelo difratômetro Siemens D5000 CuK
utilizando radiação CuK, λ = 1.5418 Å, monocromatizada por cristal de
grafite. Os dados da intensidade de difração foram medidos em uma faixa 2θ
= 5 - 70°, com passo de 0.1° e tempo de exposição por passo de 3 s.
I) 1.3.5 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X
(XPS)
As análises foram realizadas utilizando o equipamento UNI-SPECS
UHV Surface Analysis System (LEFE - IQ/UNESP). Para excitação dos
fotoelétrons foi utilizada a radiação Mg Kα (hν = 1253,6 eV). Os espectros de
alta resolução foram medidos com uma energia de passagem do analisador
de 10 eV.
I) 1.4 Caracterização físico-química do ZnO em suspensão coloidal,
do ZnO modificado pelo GPTMS em água e do ZnO modificado pelo HTMS e
AO/HTMS em clorofórmio
I) 1.4.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível
(UV-Vis)
Os espectros de absorção no UV-Vis foram coletados pelo
Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis utilizando uma sonda de imersão como probe, a
qual possui um caminho ótico de 2 mm. A faixa de comprimento de onda variou de
200 a 500 nm, sendo o tempo médio de leitura de 0,2 s e o intervalo de dados de 1
nm.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________49
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 1.4.2 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS
em água e do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio
O estudo de estabilidade também foi avaliado através técnica UV-vis,
os parâmetros utilizados estão descritos no item anterior.
I) 1.2.3 Rendimento quântico (quantum yield QY)
O QY relativo das amostras em estudo será comparado com uma
solução de rodamina 6G em etanol (QY = 95%), a qual é utilizada
frequentemente como referência para a emissão na região do verde. Para a
obtenção dos valores de QY foi necessário primeiramente nivelar as amostras
em uma mesma absorbância utilizando a técnica de UV-vis (item I.1.4.1) e
após esta etapa excita-las para a obtenção dos espectros de emissão (PL) (i
tem I. 1.3.1).
I) 1.4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As micrografias foram obtidas através do Microscópio Eletrônico de
Transmissão (PHILIPS; modelo CM 200 SUPER TWIN) operado em 200 kV. As
amostras foram gotejadas em grades individuais de carbono.
I) 2 RESULTADOS e DISCUSSÕES
I) 2.1 Suspensão coloidal e modificações na superfície do ZnO
Nosso estudo começa pela obtenção dos PQs de ZnO,
primeiramente em suspensão coloidal. Esta suspensão foi obtida pelo
processo sol-gel através da adição do catalisador de LiOH no precursor de
acetato de zinco (Spanhel e Anderson, 1991). Após esta etapa, a superfície
dos PQs foi modificada com o GPTMS (i) e HTMS (ii) pela reação de hidrolise
Capítulo I _______________________________________________________________________________________50
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
e condensação, também utilizando como catalisador o LiOH. Esta reação
conduziu a formação de uma camada de siloxano ao redor das NPs, a qual se
formou devido a forte afinidade que os organo-silanos possuem com a
superfície hidroxilada do ZnO, resultando nas ligações covalentes do tipo
ZnO-Si-O (Jana, Earhart e Ying, 2007; Moussodia, Balan e Schneider, 2008;
Moussodia et al., 2010; Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015; Moghaddam et
al., 2015) (que será confirmada a seguir pelas técnicas de FT IR e XPS).
Ainda com o objetivo de aumentar a estabilidade do ZnO e
consequentemente suas propriedades luminescentes foi sintetizado uma
bicamada de AO e HTMS (iii). O revestimento das NPs com o AO aconteceu
através das ligações de hidrogênio entre a superfície hidroxilada do ZnO com
o grupo funcional carboxila presente no AO, formando assim uma primeira
camada de proteção às NPs. Após a adição do HTMS ao ZnO protegido pelo
AO foi possível sob catalise básica, a hidrolise do grupamento siloxano
presente no HTMS e a seguir com a reação de condensação a formação de
uma bicamada ao redor das NPs. Segundo Li et al., (2015) a organização de
uma bicamada ao redor dos PQs além de favorecer a proteção dos mesmas
contra a ação da água, também possui a propriedade de aumentar a
luminescência dos PQs.
Deve se ressaltar que durante o estudo as reações também foram
feitas em outras concentrações de HTMS e AO mais HTMS. No entanto,
conforme aumentava a concentração dos mesmos, era possível observar a
formação de um precipitado branco muito consistente, dificultando a
dispersão no clorofórmio e consequentemente a sua utilização.. .A Figura I.1
representa uma proposta de modelo estrutural do ZnO modificado pelos
organo-silanos e também pela modificação com o AO.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________51
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.1 Modelo estrutural dos PQs a base de ZnO modificado pelo GPTMS e
HTMS (a) e pelo AO/HTMS (b).
I) 2.2 Espectroscopia vibracional na região do Infravermelho (IV)
A modificação da superfície dos PQs foi confirmada de forma
qualitativa através dos espectros de IV. Segundo Spanhel e Anderson, (1991),
a obtenção dos PQs de ZnO pelo processo sol-gel é algo bastante complexo.
Sabe-se que durante a reação os mesmos são obtidos na forma de cristais
puros. Entretanto, também há a formação de grupos acetatos e outros
subprodutos, podendo estar ligados ou adsorvidos na superfície dessas NPs.
Através da Figura I.2 observamos a presença de um amplo pico na escala de
≈ 3400 cm-1 característico do grupamento hidroxila (OH), no intervalo de
1400-1600 cm -1 constatamos a presença de picos referentes ao modo de
estiramento (simétrico e assimétrico) do grupo acetato (COO-). Já os picos
de vibração dentro da escala de 2942- 2857 cm-1 podem ser atribuídos aos
modos de alongamento (simétrico e assimétrico) do C-H do grupo CH2.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________52
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
(Jimenez-Gonzalez, Urueta e Suarez-Parra, 1998; Xiong, Pal e Serrano, 2007;
Sharma et al., 2012). Os picos entre 870 cm-1 são atribuídos às ligações de
Zn-O-Si e sugere que a superfície do ZnO foi modificada com sucesso pelo
organo-silanos (Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015) (Aboulaich et al.,
2012; Li et al., 2015).
Figura I.2 Espectros de IV do ZnO modificado pelo GPTMS (a, b, c) e pelo
HTMS e AO/HTMS.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________53
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 2.3 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-
Vis)
O comportamento ótico dos PQs de ZnO começa pela absorção na
região do UV-Vis. Com está técnica foi possível identificar o comprimento de
onda limite associado ao pico excitônico do ZnO (Yu et al., 2003). O método
utilizado foi aquele proposto por Nedelijkovic et al., (1993) (Nedelijkovic et
al., 1993), o qual utiliza a interseção da tangente do pico com o eixo do
comprimento de onda Conforme mostrado na Figura I.3 foi possível através
do espectro de absorção da suspensão coloidal identificar o pico excitônico
do ZnO no comprimento de onda próximo a 355 nm, característica típica de
NPs de PQs (Pesika et al., 2002)
Figura I.3 Espectros de absorção no UV-vis da suspensão coloidal de ZnO no
comprimento de onda limite de 355 nm.
Os espectros de absorção dos PQs modificados pelo GPTMS em água
e dos PQs modificados pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio, na
concentração de 4 mg/ml também apresentaram picos excitônicos bem
Capítulo I _______________________________________________________________________________________54
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
definidos, porém no comprimento de onda próximo a 360 nm, conforme
mostra a seguir pela Figura I.4.
Figura I.4 Espectros de absorção no UV-vis do ZnO modificado pelo GPTMS
(a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e) no comprimento de onda
limite de 360 nm.
Com o valor do comprimento de onda limite (λ) encontrado e do
modelo proposto por Brus (1983) foi possível calcular o tamanho médio das
NPs. Este modelo se baseia na energia de confinamento do primeiro estado
eletrônico excitado, podendo ser aproximado pela Equação (I) para PQs.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________55
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
𝑬𝒈 = 𝑬𝒈𝒃𝒖𝒍𝒌 +
𝒉𝟐𝝅𝟐
𝟐𝒆𝒓𝟐 (
𝟏
𝒎𝒆 ∗ 𝒎𝟎
+𝟏
𝒎𝒉 ∗ 𝒎𝟎
) − 𝟏. 𝟖 𝒆𝟒𝝅𝜺𝜺𝟎 𝒓 ⁄
−𝟎. 𝟏𝟐𝟒𝒆𝟑
𝒉𝟐 (𝟒𝝅𝜺𝜺𝟎 )𝟐
(𝟏
𝒎𝒆 ∗ 𝒎𝟎
+𝟏
𝒎𝒉 ∗ 𝒎𝟎
) − 𝟏
Equação (I)
Sendo,
Eg = gap de energia da partícula (bulk) = 3,4 eV; h = h/2ᴨ, h= constante de
Plank = 6,62 x 10-34 J·s; r = raio da partícula; e = carga do elétron = 1,603 x
10-19 C; Ɛ0 = permissividade do espaço livre = 8,854 x 10-14 F; Ɛ =
permissividade relativa = 3,7; m0 = massa do elétron livre = 9,110 x 10-31 kg;
me *= massa efetiva do elétron = 0,24; mh *= massa efetiva do buraco =
0,45.
Assim, o tamanho médio das NPs em suspensão coloidal e após as
modificações foi de aproximadamente 2,3 e 3 nm, respectivamente.
I) 2.4 Estudo de estabilidade do ZnO modificado pelo GPTMS em água
e do ZnO modificado pelo HTMS e AO/HTMS em clorofórmio
Ainda pela espectroscopia de absorção na região do UV-Vis,
acompanhamos por um período de 15 dias possíveis alterações relacionadas
ao pico excitônico dos PQs na concentração de 4mg/ml. As Figuras I.5, 6,7 e
8mostram os espectros de absorção e através deles constatamos que a
absorbância e o tamanho da maioria dos PQs permaneceram intactos durante
o período analisado. Esta propriedade pode ser explicada pela capacidade
Capítulo I _______________________________________________________________________________________56
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
que a camada formada pelos modificadores tem em proteger e impedir a
agregação entre as NPs (Li et al., 2015). Este resultado corrobora com
aquele apresentado por Aboulaich e colaboradores (2009), em que suas NPs
modificadas pelo (poly)aminoalkoxysilane apresentaram em água uma
estabilidade tanto luminescente quanto de tamanho por um período de 14
dias.
No entanto, observamos um declínio do pico excitônico para a
amostra 0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH (Figura I.8-a3). Segundo dados encontrados
na literatura a instabilidade em água desta amostra pode estar relacionada
com o excesso de LiOH em relação ao GPTMS. Este efeito pode ser observado
no estudo realizado por Innocenzi e colaboradores (2009), o qual mostra que
em condições altamente básicas, o GPTMS, sofre uma rápida hidrólise e
condensação em seus grupamentos, formando uma matriz composta pelas
ligações do tipo Si-O-Si (Innocenzi et al., 2009). A formação desta possível
matriz entre as moléculas do GPTMS no caso deste estudo pode ter diminuído
a camada de proteção em torno das NPs, tornando o núcleo da amostra 0,3 M
GPTMS_ 0,6 M LiOH mais vulnerável a ação deletéria da água.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________57
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.5 Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH (a); and 0,1 M
HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).em clorofórmio
Capítulo I _______________________________________________________________________________________58
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.6 Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,1 M GPTMS_0,2 M LiOH (a1); 0,1 M
GPTMS_0,1 M LiOH (b1) ),1 M GPTMS_0,05 M LiOH (c1) em água.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________59
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.7. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,2 M GPTMS_0,4 M LiOH (a2); 0,2 M
LiOH_0,2 M LiOH (b2) 0,2 M GPTMS_ 0,1 M LiOH (c2) em água.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________60
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.8. Avaliação de possíveis modificações relacionadas ao pico
excitônico do ZnO por um período de 15 dias através da espectroscopia de
absorção no UV-vis das amostras 0,3 M GPTMS_0,6 M LiOH (a3); 0,3 M
GPTMS_0,3 M LiOH (b3) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c3) em água.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________61
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 2.5 Microscopia de Transmissão Eletrônica (MET)
A Figura I.9 (a, b ,c ) apresenta as micrografias de três amostras
contendo o GPTMS como modificador, assim como uma menor concentração
de LiOH. Já as Figuras I.10 (d, e) apresentam as micrografias do ZnO
modificado pelo HTMS e AO/HTMS. Os resultados mostram uma aparência
esférica das NPs independente do modificador utilizado. O tamanho médio
calculado a partir das micrografias apresentou um tamanho médio de 3,5 –
4nm pra a modificação com o GPTMS (Figura I 9 -a1, b1, c1) e de 4,5 nm para
as modificações com o HTMS e AO/HTMS (Figura I.10 –d1, e1),
respectivamente. Estes resultados representam o tamanho médio final das
NPs após as modificações, sendo diferente dos valores encontrados através
da equação de Brus (1983), a qual consegue somente identificar o tamanho
das NPs de ZnO em função do seu pico excitônico, conforme mostrado
anteriormente
Capítulo I _______________________________________________________________________________________62
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.9. Micrografias das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH (a), 0,2 M
GPTMS_0,1 M LiOH (b) e 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (c) e o tamanho médio
das amostras entre 3,5- 4 nm (a1), (b1), (c1), respectivamente.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________63
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.10. Micrografias das amostras 0,1 M HTMS _0,05 M LiOH (d) e 0,1 M
HTMS/AO _0,05 M LiOH (e) e o tamanho médio das amostras de 4,5 nm (d1) e
(e1), respectivamente.
I) 2.6 Difração de raios-X (DRX)
Através da técnica de DRX identificamos picos correspondentes aos
planos difratores: (100), (002), (101), (102), (110), (103) e (200), indicando a
presença de uma estrutura cristalina do tipo wurtzite (Spanhel e Anderson,
1991; Aboulaich et al., 2012; Li et al., 2015). De modo geral, os
difratogramas representados pela Figura I.11 (a , b) apresentaram picos
alargados e pouco definidos, característica já descrita na literatura para a
presença de pequenos cristalitos de ZnO (Qian et al., 2011).
Capítulo I _______________________________________________________________________________________64
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Entretanto, observamos que as amostras de ZnO modificado pelo
GPTMS apresentaram em relação ao ZnO puro picos um pouco mais intensos
e conforme a concentração de GPTMS foi sendo aumentada, também
identificamos a presença de novos picos junto a estrutura wurtzite. Este
resultado pode identificar o começo de uma possível nova fase cristalina
sendo formada devido à modificação com o GPTMS, podendo ser visualizada
pela Figura I.11-a. Já a Figura I.11-b mostra os difratogramas das amostras
de ZnO modificada pelo HTMS e AO/HTMS, os quais apresentaram em 22
graus um pico bem definido que segundo a literatura pode ser atribuído a
camada formada pelo HTMS (Li et al., 2015).
Figura I.11. DRX das amostras 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH, 0,2 M GPTMS_0,1 M
LiOH, 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH (a) e das amostras 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH,
0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH (b).
Capítulo I _______________________________________________________________________________________65
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
I) 2.7 Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS)
O estudo da composição química, assim como a concentração
atômica dos fotoelétrons presentes nas camadas superficiais do ZnO puro,
ZnO modificado pelo GPTMS e modificado pelo HTMS e AO/HTMS foram feitas
pela técnica de espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS). Através da
técnica de XPS foi possível identificar os fotoelétrons Zn 2p, O 1s, C1s e Si
2p. O pico referente ao Zn 2p aparece em 1021 e 1023 eV, confirmando a
ligação existente entre o Zn2+ com um átomo de oxigênio (O) e entre o OH2,
respectivamente (Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-a). A região O 1s também
possui uma componente distinta com a energia em 529,7 eV característico da
ligação do ZnO. O pico O 1s também foi deconvoluído em mais três
componentes, com a energia em aproximadamente 531, 532 e 533 eV,
característicos das ligações OH, C=O (531 eV), O-C, O-Si (532 eV) e O-C=O
(533 eV). O grupamento carbolina (C=O) e o grupo acetato (O-C=O) foram
provavelmente formados durante o processo sol-gel para obtenção da
suspensão coloidal de ZnO (Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-b). A
deconvolução do pico de C 1s resultou em quatro componentes,
representados pela energia em aproximadamente 284,5, 286, 287 e 288,2
eV, característicos das ligações CH, C-O, C=O e O-C=O respectivamente
(Figuras I.12, 13, 14, 15, 16 e 17-c). Já a deconcolução do pico de Si 2p
resultou em uma componente com energia em 101,96 eV, característico da
ligação de ZnO-SiOx (Figuras I 13, 14, 15, 16 e 17-d). Os picos referentes ao
Zn 2p, O 1s e C 1s da amostra de ZnO puro também apresentaram as mesmas
energias de ligação e como já esperado não apresentou a energia de ligação
do ZnO-SiOx.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________66
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.12. XPS dos fotoelétrons: Zn 2p (a); O 1 s (b); C 1s (c) do ZnO puro.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________67
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.13. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a1); O 1 s (b1); C 1s (c1), Si 2p (d1)
da amostra 0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________68
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.14.. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a2); O 1 s (b2); C 1s (c2), Si 2p (d2)
da amostra 0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________69
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.15. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a3); O 1 s (b3); C 1s (c3), Si 2p (d3)
da amostra 0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________70
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.16. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a5); O 1 s (b5); C 1s (c5), Si 2p (d5)
da amostra 0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________71
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.17. XPS dos fotoelétrons Zn 2p (a6); O 1 s (b6); C 1s (c6), Si 2p (d6)
da amostra 0,1 M HTMS_0,05 M LiOH.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________72
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
A Tabela I.2 mostra as concentrações atômicas em porcentagem
dos fotoelétrons Zn 2p, O 1s, C1s e Si 2p das amostras citadas acima. Através
dos resultados observamos que as amostras contendo GPTMS e 0,05 – 0,15 M
apresentaram uma diminuição na concentração do fotoelétron Zn 2p,
conforme as quantidades foram sendo aumentadas, indicando possivelmente
um maior número de ligações com o GPTMS. A concentração do fotoelétron
O 1s também apresentou um aumento entre as amostras, que pode ter
ocorrido pela presença de átomos de oxigênio nas moléculas do GPTMS. Este
efeito também foi observado na porcentagem de Si 2p, que aumentou em
relação a maior concentração de GPTMS.
Através das concentrações atômicas dos PQs hidrofóbicos
verificamos que a porcentagem do fotoelétron Zn 2p (4%) foi bem menor
para a amostra contendo somente o HTMS. Este resultado sugere uma maior
organização do HTMS em torno das NPs, visto que a concentração do
fotoelétron C 1spara está amostra foi maior (76,8%). Já a concentração de Zn
2p (19,1%) para a amostra modificada pelo o AO juntamente com o
HTMS,reforça a teoria em que se baseia na formação de uma bicamada
Também observada através da menor concentração de Si 2p (1,7%) em
comparação com a amostra modificada somente pelo HTMS.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________73
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Tabela I. 2 - Concentrações atômicas em porcentagem dos fotoelétrons Zn
2p, O 1s, C1s e Si 2p.
ZnO
(%)
0,1 M
GPTMS_
0,05 M
LiOH (%)
0,2 M
GPTMS_
0,1 M
LiOH (%)
0,3 M
GPTMS_
0,15 M
LiOH (%)
0,1 M
HTMS_
0,05 M
LiOH (%)
0,1 M
HTMS/AO_
0,05 M
LiOH (%)
Zn 2p 27,4 24,5 21,5 20,6 4 19,1
O 1s 46,5 40,9 42,5 42,6 13,4 22,5
C 1s 26,1 29,7 30,5 31,6 76,8 56,6
Si 2p _ 4,9 4,5 5,2 5,8 1,7
Zn/Si _ 5,0 4,6 3,9 0,7 11,2
I) 2.8 Luminescência (PL)
De acordo com a técnica de luminescência é possível obter
informações sobre os níveis de energia em que os elétrons se encontram
dentro do band gap, como por exemplo, a intensidade luminescente, assim
como as cores emitidas pelos PQs. A Figura I.18 mostra os espectros de
excitação (PLE) das amostras de ZnO modificado pelo GPTMS (a) e
modificado pelo HTMS e AO/HTMS (b). Com os espectros observamos a
presença picos de excitação em ≈ 365 nm seguidos dos picos de emissão (PL)
que apresentaram picos principais ≈ 550 nm, região de emissão da cor verde.
Já o pó do ZnO puro apresentou pico de excitação em ≈ 372 nm e de
emissão em ≈ 580 nm, região de emissão próxima ao amarelo. Através da
análise luminescente também observamos que a intensidade do pó de ZnO
puro foi bem menor em relação aos modificados
Capítulo I _______________________________________________________________________________________74
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.18. Espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL) do ZnO
modificado pelo GPTMS (a, b, c) e modificado pelo HTMS e AO/HTMS (e).
Capítulo I _______________________________________________________________________________________75
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Os resultado mencionados acima indicam que a baixa intensidade
luminescente e o deslocamento da região do verde para o amarelo para o pó
de ZnO puro pode estar relacionado com prováveis mudanças nas vacâncias
de oxigênio (Vo) e também pelo aumento dos defeitos de superfície. Como
visto anteriormente, essas propriedades estão relacionadas com a
intensidade luminescente e com a emissão de cores pelos PQs. O resultado
negativo para o ZnO puro, provavelmente ocorreu durante o processo de
secagem para a obtenção do pó. Esse interessante fenômeno pode estar
ligado com a estabilidade que o ambiente coloidal proporciona as NPs, pois
neste ambiente a superfície das mesmas está rodeada pelos íons de OH- e as
Vo preenchidas pelos ânions de oxigênio.
O aumento na luminescência e a emissão na região no verde tanto
do ZnO modificado pelo GPTMS quanto pelo HTMS e AO/HTMS corroboram
com os resultados apresentados por Moghaddam et al., (2015), que
utilizaram o aminopropyltriethoxysilane (APTES) para estabilização do ZnO
em água. De acordo com o estudo, a estabilidade luminescente pode estar
relacionado com o meio alcalino utilizado para promover a reação de
hidrólise e condensação entre os grupamentos presentes no APTES com o
ZnO. Segundo os autores, a catálise básica pode ter gerado novos ânions de
oxigênio durante a reação, podendo assim ter preenchido as Vo.
Sendo assim, uma das melhores maneiras de diminuir os defeitos
presentes na estrutura cristalina dos PQs é através da chamada passivação
de superfície. Este processo tem como principal objetivo aumentar o
rendimento luminescente através da ligação entre os átomos presentes na
superfície dos PQs com outro tipo de material (Bera et al., 2010). A
passivação da superfície, geralmente é realizada pelo depósito de uma
camada de nivelamento de característica inorgânica ou orgânica. As
passivações do tipo inorgânica como, por exemplo, a formação de core shell
Capítulo I _______________________________________________________________________________________76
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
são as mais utilizadas. No entanto, a literatura também tem demostrado um
número considerável de passivações do tipo orgânica utilizando solventes
organometálicos como TOPO e o TOP (Qu, Peng e Peng, 2001; Talapin et al.,
2001). Estas moléculas se aderem à superfície dos PQs reduzindo o
espaçamento interpartículas, além de funcionarem como agentes de
proteção (Bera et al., 2010).
Nosso estudo também focou na passivação do tipo orgânica através
da modificação de superfície com o GPTMS, HTMS e AO/HTMS. A importância
no uso desses modificadores não só está relacionada com sua menor
toxicidade em comparação ao TOPO, mas também com sua capacidade de
formar ligações covalentes em torno do ZnO, aumentando ainda mais sua
estabilidade. A conservação das propriedades luminescentes do pó é de
grande importância, uma vez que está forma apresenta uma maior
estabilidade em relação às dispersões Com isso, os resultados aqui presentes
podem estar relacionados com a preservação das vacâncias e diminuição dos
defeitos de superfície presentes na estrutura cristalina do ZnO e será
representado a seguir pela Figura I.19.
Capítulo I _______________________________________________________________________________________77
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Figura I.19. Simulação da estrutura cristalina de ZnO-QDs contendo defeitos
de superfície e os defeitos intrínseco (a), redução desses defeitos através da
passivação de superfície pelos organo-silanos (b)
I) 2.9 Rendimento quântico (quantum yield QY)
A razão do número de fótons emitidos pelo número de fótons
absorvidos foi analisada através do rendimento quântico das amostras de
ZnO modificado pelo GPTMS e modificado pelo HTMS e AO/HTMS em
comparação com a Rodamina 6G. Para realização desta analise foi necessário
primeiramente nivelar as amostras em uma mesma absorbância através da
espectroscopia de absorção no UV-vis. Após esta etapa através dos valores
relativos à intersecção das amostras com a rodamina 6G, sendo 344 nm para
as amostras de ZnO modificado e 340 nm para a suspensão coloidal foi
possível excita-las nos comprimentos de onda relativos e obter os espectros
de emissão (PL). De acordo, com o método descrito por
Capítulo I _______________________________________________________________________________________78
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
Demas e Crosby, (1971) e através da equação (II) foi possível calcular o QY
das amostras analisadas.
𝑸𝒀𝒙 = 𝑸𝒓[𝑨𝒙/ 𝑨𝒓 ] (𝒏𝒙
𝟐
𝒏𝒓 𝟐
)
Equação (II)
Sendo, QYr = 0,95 (rendimento quântico da rodamina 6G); Ax = área da
luminescência da amostra; Ar = área da luminescência da rodamina 6G; n2x
= índice de refração do solvente em que a amostra está dispersa; n2r =
índice de refração do solvente em que a rodamina 6G está dispersa.
De modo geral, os resultados de QY apresentados demonstrou que
os modificadores de superfície não interferiram quando comparado com a
suspensão coloidal de ZnO (10,2%). O aumento no QY entre as amostras de
ZnO modificado pode ser explicado através da redução dos defeitos
presentes na estrutura do ZnO. Esse efeito pode ser observado entre as
amostras modificadas pelo GPTMS, especialmente para a amostra of 0.3M
LiOH GPTMS_0,15 M, a qual apresentou um maior QY (10,8%) em relação as
amostras contendo uma menor quantidade do GPTMS. Já o melhor resultado
para as amostras de ZnO modificado pelo AO/HTMS pode ser explicado pela
formação de uma bicamada ao redor das NPs. Este resultado também foi
observado por Li et al., (2015), devido a formação de uma bicamada
formada pelo HTMS seguido pelo aminopropyltriethoxysilane (APS). De
acordo com este estudo o uso de um modificador hidrofóbico funcionalizado
com um modificador hidrofílico promoveu uma maior estabilidade do ZnO em
água, além de aumentar sua luminescência em aproximadamente 10 vezes
Capítulo I _______________________________________________________________________________________79
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
em comparação com o ZnO desprotegido. Os valores do QY referente à
suspensão coloidal de ZnO e ao ZnO modificado pelo GPTMS e pelo HTMS e
pela bicamada de AO/HTMS, e serão citados a seguir pela Tabela I.3.
Tabela I.3 - Valores de QY das amostras selecionadas.
Amostra
QY (%)
Suspensão coloidal de ZnO
10,2
0,1 M GPTMS_0,05 M LiOH
6,8
0,2 M GPTMS_0,1 M LiOH
7,7
0,3 M GPTMS_0,15 M LiOH
10,8
0,1 M HTMS/AO_0,05 M LiOH
11,3
0,1 M HTMS_0,05 M LiOH
7,2
I) 3 CONCLUSÕES
Através dos resultados apresentados neste capítulo concluímos a
importância das modificações de superfície, não só em relação à estabilidade
das NPs em ambiente aquoso e orgânico, mas também em relação às
propriedades luminescentes do ZnO. A importância das modificações em
relação à luminescência foi visualizada através da preservação das vacâncias
de oxigênio e também pela diminuição dos defeitos de superfície presentes
nas NPs, após serem submetidas ao processo de secagem para a obtenção do
pó. Os resultados negativos relacionados ao pó de ZnO puro, incluindo a
baixa intensidade luminescente e o deslocamento da região de emissão do
verde para o amarelo, pode ser explicado pelo fato do ambiente coloidal
Capítulo I _______________________________________________________________________________________80
Nathalia Cristina Rissi
__________________________________________________________________________________
proporcionar uma maior estabilidade as NPs, sendo afetado durante o
processo de secagem. Já as amostras na forma de pó do ZnO modificado pelo
GPTMS e pelo HTMS e pela bicamada formada entre AO/HTMS apresentaram
resultados positivos em relação a intensidade luminescente, assim como a
emissão na região do verde
Sendo assim, os resultados aqui apresentados apontam de certa
forma o potencial do ZnO modificado pelo GPTMS em atuar futuramente
como sondas luminescentes. Isto porque o GPTMS possui a capacidade de
tornar as NPs hidrofílicas e consequentemente estáveis em meios aquosos,
característica que representa um grande avanço na utilização dos mesmos
em diversas aplicações biológicas. Já o ZnO modificado pelo HTMS e pelo
AO/HTMS revela a capacidade desses PQs em serem incorporados em
sistemas anfifílicos, devido a capacidade desses modificadores em formarem
uma camada hidrofóbica de proteção as NPs. A incorporação desses PQs em
micelas poliméricas tem como finalidade auxiliar na aplicação biológica
desses PQs hidrofóbicos e será apresentada no próximo Capítulo.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 82
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 1 MATERIAL e MÈTODOS
Materiais
•Rhodamina 6G – Sigma Aldrich;
•Pluronic F127 – Sigma Aldrich;
•Pluronic F68 – Sigma Aldrich;
•Pluronic P123 – Sigma Aldrich;
•Água Mili-Q - Millipore Corporation;
•MTT - 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide.
Equipamentos
•Chapa aquecedora – IKA;
•Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis;
•Espectrofotômetro no infravermelho Shimadzu® modelo IR Prestige-21;
•Fluorímetro SPEX F2121 e detector de germânio North Coast Scientific
Corporation;
•ZetaTamanhor Nano-ZS - Malvern Instruments;
• Citometro de Fluxo - FACSDiva –BD Biosciences.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 83
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 1.1 Métodos
II) 1.1.1 Obtenção das micelas poliméricas
Primeiramente, foram obtidas as micelas poliméricas puras e forma
individual e através dos copolímeros em bloco, Pluronic F127; Pluronic F68 e
também da associação do Pluronic F127 com o Pluronic P123. A escolha da
quantidade de 0,6 g dos copolímeros em 30 ml de água foi baseada na
concentração micelar crítica (CMC) de cada um, sendo 2,8 x 10-6 M para o
Pluronic F127; 4,8 x 10-4 M para o Pluronic F68 e 4,4 x 10-6 M para o Pluronic
P123 (Kabanov, Batrakova e Miller, 2003). A técnica utilizada foi descrita por
Zhang, Yu e Eisenberg, (1996), a qual consiste na hidratação do filme
polimérico. Resumidamente, a quantidade de 0,6 g de cada copolímero foi
solubilizada em 10 ml de clorofórmio, sendo posteriormente evaporado,
formando assim o filme polimérico. A quantidade de 30 ml de água em
temperatura ambiente foi sendo adicionada aos poucos, permanecendo em
agitação a 700 rpm durante 30 minutos. A Figura II.1 mostra a estrutura
molecular dos copolímeros utilizados.
Figura II.1. Estrutura molecular do pluronic P123, F127 e F68.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 84
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 1.1.2 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas
poliméricas
A incorporação dos PQs hidrofóbicos foi feita através da dispersão
de 0,03; 0,05 e 0,09g do pó seco em clorofórmio e adicionados junto à
quantidade de 0,6g dos copolímeros. A metodologia utilizada para a
obtenção dessas micelas é a mesma descrita no item anterior.
II) 1.2 Caracterização físico-química das Micelas Poliméricas
contendo os PQs hidrofóbicos
II) 1.2.1 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível
(UV-Vis)
Os espectros de absorção no UV-Vis foram coletados pelo
Espectrofotômetro Cary 60 UV-Vis utilizando uma sonda de imersão como
probe , a qual possui um caminho ótico de 2 mm. A faixa de comprimento de
onda variou de 200 a 500 nm, sendo o tempo médio de leitura de 0,2 s e o
intervalo de dados de 1 nm.
II)1.2.2 Estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos
incorporados nas micelas poliméricas
O estudo de estabilidade também foi avaliado através técnica UV-vis,
os parâmetros utilizados estão descritos no item anterior.
II) 1.2.3 Luminescência (PL)
As medidas de luminescência das micelas poliméricas contendo os
PQs hidrofóbicos foram realizadas no fluorímetro SPEX F2121 e detector de
germânio North Coast Scientific Corporation. A lâmpada de Xenônio de 450W
foi utilizada para excitação das amostras. Através das medidas foi possível
obter os espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 85
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 1.2.4 Rendimento quântico (quantum yield QY)
O QY relativo das amostras em estudo será comparado com uma
solução de rodamina 6G em etanol (QY = 95%), a qual é utilizada
frequentemente como referência para a emissão na região do verde. Para a
obtenção dos valores de QY foi necessário primeiramente nivelar as amostras
em uma mesma absorbância utilizando a técnica de UV-vis e após esta etapa
excita-las para a obtenção dos espectros de emissão (PL)
II) 1.2.5 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
O tamanho das micelas poliméricas pura e das micelas contendo os
PQs hidrofóbicos foram feitas através ZetaTamanhor Nano-ZS, Malvern
Instruments, para isso as amostras foram diluídas 10 x e submetidas por
alguns minutos no banho de ultrassom para melhor homogeneização. A
técnica consiste num feixe de laser atravessar a amostra, onde as micelas
espalham a luz de determinado modo onde se capta um sinal, o qual é
enviado e processado através do software que executa os cálculos de
tamanho médio e índice de polidispersidade (pdi).
II)1.2.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas
poliméricas contendo os PQs hidrofóbicos
O MTT é um método colorimétrico utilizado para medir a
viabilidade celular e a citotoxicidade. Neste ensaio, as células vivas são
capazes de reduzir o 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-
tetrazolium bromide (MTT), formando cristais insolúveis de formazana de
coloração violeta (Mosmann, 1983).
As células HaCaT e HepG2 (2x105 células/poço) foram cultivadas
em placas de 96 poços por 24 horas e tratadas com 100 µL das micelas
contendo os PQs hidrofóbicos em diferentes concentrações e por 24 horas. As
amostras foram removidas e colocou-se 10 µL do corante tetrazólico MTT em
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 86
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
cada poço. As placas foram incubadas por quatro horas em contato com MTT
a 5% CO2 e temperatura de 37°C. A atividade da desidrogenase mitocondrial
reduziu o MTT amarelo para um sal de formazana roxo insolúvel, o qual foi
solubilizado em isopropanol e sua absorbância foi lida a 540 nm no leitor de
placas. Neste método, as células que permaneceram vivas após o contato
com as amostras conseguem reduzir o sal MTT através da enzima presente na
mitocôndria (organela responsável pela respiração celular). Sendo assim,
através da quantificação do cristal de formazana de cor púrpura pela
espectroscopia de absorção UV-Visível foi possível quantificar a porcentagem
de células vivas. Como controle negativo foi utilizado o meio de cultura
DMEM e como controle positivo o Dimetilsulfóxido a 10%. Foram realizados
três experimentos independentes e as concentrações foram testadas em
triplicatas. A porcentagem de células mortas foi calculada em relação ao
controle negativo, representando a citotoxicidade de cada tratamento,
segundo proposto por Zhang et al., (2004) e, em seguida, foi determinada
também a porcentagem de células vivas.
II) 1.2.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas
através da citometria de fluxo
A internalização celular das micelas poliméricas contendo os PQs
foi analisada por citometria de fluxo. A metodologia de cultivo da linhagem
de células HepG2, assim como o plaqueamento estão descritos no item
anterior. Para este ensaio as células tratadas com as micelas foram
incubadas durante um período de 24 horas e após este período, foram
lavadas com o tampão PBS e removidas da placa através da tripsina. A
suspensão de células foi então centrifugada e o sobrenadante descartado.
Uma nova suspensão celular foi obtida em PBS e analisada pelo citometro
(FACSDiva –BD Biosciences) com um laser de excitação de 488 nm e canal FL1
(530/30 nm, região de emissão do verde).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 87
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2 RESULTADOS e DISCUSSÕES
II) 2.1 Obtenção das micelas poliméricas
As micelas poliméricas foram obtidas através da técnica descrita
por Zhang, Yu e Eisenberg, (1996), a qual consiste na hidratação do filme
polimérico. Através desta técnica constatamos que conforme a água foi
sendo adicionada sob agitação ao filme polimérico, a polaridade do meio
torna-se cada vez mais desfavorável à solubilização dos blocos hidrofóbicos e
quando a água chegou a uma determinada concentração estes blocos
associam-se, formando assim as micelas. A escolha no uso destes
copolímeros foi baseada em diversos estudos, os quais mostram a capacidade
dos mesmos em contribuir para a veiculação de fármacos lipofílicos, além de
atingirem com maior precisão diversas células cancerígenas (Wei et al.,
2009; Sahu et al., 2011; Zhang et al., 2011; Cai et al., 2015). A associação
entre o Pluronic F127/ Pluronic P123 foi feita nas concentrações de 10:0 e de
0:10 (p/p), conforme mostra a Tabela II. 1.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 88
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Tabela II. 1 - Quantidades utilizadas de Pluronic P123/ Pluronic F127 e de
água.
Quantidade
Pluronic P123 (g)
Quantidade
Pluonic F127 (g)
Quantidade de
Água (ml)
1
0,600
0
30
2 0,54 0,06 30
3 0,48 0,12 30
4 0,42 0,18 30
5 0,36 0,24 30
6 0,30 0,30 30
7 0,24 0,36 30
8 0,18 0,42 30
9 0,12 0,48 30
10 0,06 0,54 30
11 0 0,600 30
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 89
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.1 Incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas
poliméricas
Primeiramente, foram testadas individualmente as quantidades de
0,03 e 0,09 g dos PQs hidrofóbicos nas micelas listadas na Tabela II. 1. No
entanto, através dos resultados foi possível observar que conforme a
quantidade do Pluronic P123 aumentava independentemente da quantidade
dos PQs ocorria à formação de diversas partículas suspensas. As soluções
micelares contendo o Pluronic F127 associado ao Pluronic P123 foram
excitadas em uma lâmpada UV no comprimento de 365 nm e através das
mesmas foi possível visualmente observar a formação de pequenos pontos
suspensos de coloração verde, que podem ser os PQs com superfície
hidrofóbica. Provavelmente, o uso do Pluronic P123 revestiu as
nanopartículas de forma com que as mesmas ficassem suspensas. Este tipo
de resultado, no caso deste trabalho, dificultou a utilização das mesmas. Por
isso, optou-se pela utilização somente do Pluronic F127 e do Pluronic F68.
A incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas formadas pelo
Pluronic F127 e F68 foram feitas nas quantidades de 0,03; 0,05; 0,09 e
0,20 g. As micelas contendo as três primeiras quantidades dos PQs
apresentaram um aspecto levemente turvo, as quais foram filtradas
facilmente em filtro de 0,45 μm. Ao contrário das micelas contendo a última
concentração, as quais exibiram um aspecto muito mais turvo e que após o
processo de filtração apresentaram sob a lâmpada UV uma emissão
luminescente quase que extinta. Este resultado indica que está quantidade
foi demasiada, não sendo possível a solubilização dos PQs na porção
hidrofóbica dos copolímeros, mantendo-se suspensos e posteriormente
retidos nos filtros. Desse modo, optou-se pela escolha das quantidades de
0,03; 0,05 e 0,09 g, mantendo fixa a quantidade de 0,06g dos copolímeros. A
Tabela II. 2 mostra o nome das amostras, o tipo do copolímero, assim como o
tipo de PQ hidrofóbico e a quantidade de cada um.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 90
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Tabela II. 2– Identificação das amostras e do tipo de copolímero utilizado,
assim como o PQ hidrofóbico utilizado e a quantidade de cada um.
Nome da Amostra Copolímero
utilizado
PQ hidrofóbico
utilizado
Quantidade de PQ
hidrofóbico
utilizada
F68 HTMS (1) Pluronic F68 ZnO HTMS 0,03 g
F68 HTMS (2) Pluronic F68 ZnO HTMS 0,05 g
F68 HTMS (3) Pluronic F68 ZnO HTMS 0,09 g
F68 HTMS/AO (1) Pluronic F68 ZnO HTMS/AO 0,03 g
F68 HTMS/AO (2) Pluronic F68 ZnO HTMS/AO 0,05 g
F68 HTMS/AO (3) Pluronic F68 ZnO HTMS/AO 0,09 g
F127 HTMS (1) Pluronic F127 ZnO HTMS 0,03 g
F127 HTMS (2) Pluronic F127 ZnO HTMS 0,05 g
F127 HTMS (3) Pluronic F127 ZnO HTMS 0,09 g
F127 HTMS/AO (1) Pluronic F127 ZnO HTMS/AO 0,03 g
F127 HTMS/AO (2) Pluronic F127 ZnO HTMS/AO 0,05 g
F127 HTMS/AO (3) Pluronic F127 ZnO HTMS/AO 0,09 g
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 91
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.2 Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível
(UV-Vis)
As dispersões do PQs hidrofóbicos incorporados nas micelas
poliméricas citadas na Tabela II. 2 foram analisadas pelo espectro de
absorção UV-Vis, apresentando um valor em ≈ 360 nm para todas as
amostras. Este resultado mostra que a incorporação dos PQs hidrofóbicos nas
micelas não afetou no tamanho dos mesmos e serão demonstrados a seguir
pela Figura II. 2 (a, b, c, d)
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 92
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Figura II.2. Espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)
das micelas poliméricas formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e Pluronic F127 (c,
d).
II) 2.1.3 Estudo de Estabilidade das micelas poliméricas
contendo os PQs através da técnica UV-vis
O estudo de estabilidade dos PQs hidrofóbicos incorporados nas
micelas poliméricas foi realizado através da técnica de espectroscopia de
absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis). Com esta técnica foi possível
avaliar parâmetros relacionados ao pico excitônico das NPs de ZnO mesmo
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 93
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
incorporados nas micelas e serão mostrados a seguir pela Figura II. 3 (a, b, c,
d) e com os resultados observamos uma estabilidade tanto luminescente
quanto de tamanho desses PQs por um período de 30 dias.
Figura II.3. Estudo de estabilidade por período um de 30 dias, utilizando a
técnica de espectroscopia de absorção na região ultravioleta visível (UV-Vis)
das micelas poliméricas formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e Pluronic F127 (c,
d).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 94
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.4 Luminescência (PL)
A caracterização luminescente das micelas poliméricas contendo os
PQs hidrofóbicos também foi feita pelos espectros de excitação (PLE) e de
emissão (PL). Os espectros de PLE para todas as amostras apresentaram picos
principais em ≈ 350 nm. Este resultado é diferente daqueles apresentados
para os pós dos PQs hidrofóbicos, os quais ficaram em ≈ 365 nm. Através do
valor de PL excitamos as amostras e obtivemos os espectros de PL, os quais
apresentaram um valor médio em ≈ 550 nm, região de emissão da cor verde.
Com os resultados confirmamos que a intensidade luminescente foi
aumentando conforme aumentou a quantidade de PQs e estão representadas
pela Figura II. 4 (a, b, c ,d).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 95
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Figura II.4. Espectros de excitação (PLE) e emissão (PL) das micelas
formadas pelo Pluronic F68 (a, b) e pelo Pluronic F127 (c, d).
II) 2.1.5 Rendimento quântico (quantum yield QY)
A razão do número de fótons emitidos pelo número de fótons
absorvidos foi analisada através do rendimento quântico das micelas em
comparação com a Rodamina 6G. Para realização desta analise foi necessário
primeiramente nivelar as amostras em uma mesma absorbância através da
espectroscopia de absorção no UV-vis. Após esta etapa através dos valores
relativos à intersecção das amostras com a rodamina 6G, que foi de 344 nm,
excitamos as amostras através do Fluorímetro SPEX F2121 e obtivemos os
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 96
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
espectros de emissão (PL). De acordo, com o método descrito por Demas e
Crosby e através da Equação (II) (descrita anteriormente) calculamos o QY
das amostras analisadas.
Com os resultados verificamos que as amostras contendo o PQ ZnO
HTMS/AO apresentaram um maior QY, assim como as micelas formadas pelo
Pluronic F127. Este resultado pode ter ocorrido pelo fato da região
hidrofóbica do Pluronic F68 ser menor (POE152-POP28-POE152) em relação
ao Pluronic F127 (POE106-POP70-POE106). Esta característica provavelmente
influenciou o processo de incorporação dos PQs na região hidrofóbica, ou
seja, o excesso dos PQs pode ter sido removido do restante da solução
micelar através do processo de filtração, proporcionando uma diminuição na
luminescência dos mesmos. A Tabela II. 3. Apresenta os valores de QY das
amostras selecionadas
Tabela II. 3 – Valores de QY das amostras selecionadas.
Amostra
QY (%)
F68 HTMS/AO (3)
F68 HTMS (3)
F127 HTMS/AO (3)
F127 HTMS (3)
6,9 %
5,5 %
8,9 %
6,3 %
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 97
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.6 Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
A técnica de DLS fornece diversas informações relacionadas à
variação do espalhamento de luz causado pelo movimento Browniano das
partículas em suspensão. Em geral, a luz espalhada com intensidades
diferentes é captada por um sinal e após isso ocorre o processamento dos
dados, os quais são enviados para um software que realiza os cálculos
fornecendo os valores de distribuição, tamanho médio e pdi. Conforme
mostrado a seguir pela Figura II. 5 (a, b, c, d) observamos que as micelas
formadas pelo Pluronic F68 apresentaram tamanhos menores quando
comparada as micelas formadas pelo Pluronic F127. Através dos gráficos de
distribuição de tamanho também constatamos a formação de sistemas
micelares relativamente homogêneo, pois há presença de outras populações
de partículas. Os valores de pdi mostram a formação de sistemas com uma
dispersão moderada, tendo em vista que o valor varia entre 0 a 1 e quanto
menor, mais monodispersa e, consequentemente, menos heterogênea é a
amostra (Malvern, 2004). Também foi possível avaliar o potencial Zeta das
micelas, os quais apresentaram valores negativos, mostrando que a
superfície dessas partículas está negativamente carregada em meio aquoso,
esses valores assim como os valores do tamanho e de pdi, serão listados a
seguir pela Tabela II. 4.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 98
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Figura II.5. Distribuição do tamanho das micelas poliméricas; (a) Micela
Pluronic F68 HTMS_AO; (b) Micela Pluronic F68 HTMS, (c) Micela Pluronic
F127 HTMS_AO e (d) Micela Pluronic F127 HTMS.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 99
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Tabela II. 4 – Tamanho, pdi e potencial zeta das amostras selecionadas.
Amostra
Tamanho (nm)
PDI Potencial Zeta (mV)
F68 HTMS/AO (3)
177,87(±) 2,3329
0,1433 (±) 0,0058 -12,43 (±) 3,22
F68 HTMS (3) 174,47 (±)1,1146 0,153 (±) 0,0167 -10,37 (±) 1,56
F127 HTMS/AO (3) 201,7 (±) 2,971 0,2317(±) 0,0085 -17,58 (±) 2,4
F127 HTMS (3) 249,47 (±)5,7343 0,1553 (±) 0,0052 - 15, 17 (±) 1,73
Ainda através da técnica de DLS estabelecemos um estudo de
estabilidade, verificando parâmetros relacionados ao tamanho e pdi das
micelas. Através dos resultados observamos que as mesmas apresentaram
durante o período de 30 dias, uma ótima estabilidade tanto de tamanho
quanto de pdi e os valores serão listados a seguir nas Tabelas II. 5; II. 6; II. 7
e II. 8. Este resultado facilita o uso dessas amostras em aplicações futuras
que serão mostradas ainda neste trabalho, como por exemplo, estudo da
internalização celular.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 100
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Tabela II. 5 – Estabilidade da amostra F68 HTMS/AO (3)
Amostra
Tamanho (nm)
PDI
F68 HTMS/AO (3) (dia 0)
177,87 (±) 2,3329
0,1433 (±) 0,0058
F68 HTMS/AO (3) (dia 1) 227,2 (±) 1,8991 0,153 (±) 0,0167
F68 HTMS/AO (3) (dia 7) 178,20 (±) 3,1496 0,173 (±) 0,023
F68 HTMS/AO (3) (dia 15) 176,8 (±) 2,1924 0,1483 (±) 0,0077
F68 HTMS/AO (3) (dia 30) 176,9 (±) 1,2083 0,1743 (±) 0,0133
Tabela II. 6 - Estabilidade da amostra F68 HTMS (3).
Amostra
Tamanho (nm)
PDI
F68 HTMS(3) (dia 0)
227,2 (±) 1,8991
0,153 (±) 0,0167
F68 HTMS(3) (dia 1) 223,23 (±) 1,5173 0,1693 (±) 0,0168
F68 HTMS(3) (dia 7) 229,31 (±) 2,197 0,1747 (±) 0,009
F68 HTMS(3) (dia 15) 226,37 (±) 0,661 0,1623 (±) 0,0041
F68 HTMS(3) (dia 30) 225,47 (±) 2,4984 0,1717 (±) 0,0088
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 101
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Tabela II. 7 – Estabilidade da amostra F127 HTMS/AO (3).
Amostra
Tamanho (nm)
PDI
F127 HTMS/AO (3) (dia 0)
201,7 (±) 2,971
0,2317(±) 0,0085
F127 HTMS/AO (3) (dia 1) 195,7 (±) 1,4855 0,2533 (±) 0,0167
F127 HTMS/AO (3) (dia 7) 205,9 (±) 3,4881 0,2543 (±) 0,0038
F127 HTMS/AO (3) (dia 15) 199,27 (±) 2,2066 0,2431 (±) 0,009
F127 HTMS/AO (3) (dia 30) 192,91 (±) 1,8184 0,2303 (±) 0,0071
Tabela II. 8 – Estabilidade da amostra F127 HTMS (3).
Amostra
Tamanho (nm)
PDI
F127 HTMS (3) (dia 0) 249,47 (±) 5,7343
0,1553 (±) 0,0052
F127 HTMS (3) (dia 1) 247,11 (±) 2,0607 0,1573 (±) 0,0079
F127 HTMS (3) (dia 7) 249,77 (±) 4,7401 0,1507 (±) 0,0021
F127 HTMS (3) (dia 15) 247,77 (±) 1,3695 0,1447 (±) 0,0069
F127 HTMS (3) (dia 30) 246,63 (±) 3,628 0,1433 (±) 0,0129
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 102
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.6 Avaliação do potencial citotóxico das micelas
poliméricas contendo os PQs hidrofóbicos
A avaliação citotóxica das micelas foi feita através do ensaio de
MTT. Para isso, cultivamos as linhagens celulares HaCat e HepG2. A primeira
é uma linhagem imortalizada de queratinócitos humanos com alto poder
proliferativo e vem sendo muito utilizada nos últimos anos como modelo
celular em diversos estudos, incluindo a citotoxicidade de PQs (Zheng et al.,
2011; Pathakoti et al., 2013; Ando et al., 2016) e de micelas poliméricas
(Pathakoti et al., 2013; Lee et al., 2015; Neuberg et al., 2015). As células
HaCat também são muito conhecidas por mimetizarem ambientes in vivo,
pois possuem uma alta capacidade de crescimento em meios de culturas
tradicionais, além de apresentarem um fenótipo próximo ao normal
(Boukamp et al., 1988; Deyrieux e Wilson, 2007; Pathakoti et al., 2013;
Tyagi et al., 2015). Já a linhagem de HepG2 são células de hepatoma
humano, metabolicamente ativas, usualmente empregadas em vários
estudos, por serem capazes de simular a função hepática de um organismo in
vitro.(Miret, De Groene e Klaffke, 2006). Um estudo realizado por Peng et
al., (2013) avaliou a citotoxicidade e a viabilidade celular dos PQs de
CdSe/ZnS através da linhagem HepG2. Os resultados demostraram que não
houve citotoxicidade desses PQs nas concentrações entre 10 – 100 nM e de
acordo com o MTT, a inexistência de toxicidade pode ser atribuída a
formação de uma camada de PEG em torno do shell de ZnS.
A Figura II.6 apresenta os gráficos de viabilidade celular do ensaio
de MTT para as linhagens de células HaCat (a, c) e HepG2 (b, e). Através dos
gráficos foi possível identificar o índice de citotoxicidade (IC50) que significa
a concentração em porcentagem das soluções micelares que induz 50% de
lise ou morte celular. Sendo assim, o IC50 referente à linhagem celular
HaCat foi de 20-26,6% para as soluções micelares formadas pelo Pluronic F68
e de 13,3-20% para as soluções micelares formadas pelo F127.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 103
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Já o IC50 referente à linhagem celular HepG2 foi de 20-26,6% para
a solução micelar F68 HTMS/AO; 13,3-20% para F68 HTMS e F127 HTMS/AO; e
6,6-13,3% para a solução micelar F127 HTMS. Através dos gráficos de
viabilidade celular referente à linhagem HepG2 também notamos que as
porcentagens inicias tanto das micelas formadas pelo Pluronic F68 quanto
F127, apresentaram um aumento na viabilidade celular, ou seja, a
quantidade de células presentes nos poços da microplaca tratados com as
soluções foi maior que o número de células presentes nos poços controle.
Este resultado pode estar relacionado com um aumento na atividade
metabólica desta linhagem de células.
No geral, também observamos que os resultados de citotoxicidade
das soluções micelares podem estar relacionados com o tamanho das
mesmas, tendo em vista que as micelas de tamanhos maiores apresentaram
uma atividade citotóxica em menores porcentagens.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 104
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Figura II. 6. Ensaio de citotoxicidade em células HaCaT (a, c) e em células
HepG2 (b, e) Nos gráficos o eixo y corresponde a porcentagem de células
vivas após contato com as amostras e o eixo x representa a porcentagem (%)
de micelas poliméricas utilizadas no ensaio de MTT. Os dados referem-se à
média de três experimentos independentes (Média ± erro padrão).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 105
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 2.1.7 Estudo da internalização celular das micelas poliméricas
através da citometria de fluxo
A citometria de fluxo vem sendo muito utilizada por se tratar de
uma técnica dinâmica em que as células passam por um sistema de excitação
e detecção. À medida que as células passam pelo sistema de fluxo é possível
excita-las através dos filtros e se estiverem marcadas com fluoróforos
emitem luz, podendo assim ser quantificadas (Ichinose, 1991), conforme
mostra a Figura II.7.
Figura II. 7. Esquema de um citômetro de fluxo.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 106
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Sendo assim, apresentamos aqui um método “in vitro” que visa à
quantificação da internalização celular das micelas poliméricas contendo os
PQs hidrofóbicos como marcador. A aplicação da citometria na detecção de
células marcadas por PQs é algo recente, estudos têm mostrado que essa
técnica vem ganhando destaque, principalmente quando comparada à
microscopia de fluorescência, que não consegue quantificar de forma precisa
o número de células fluorescentes (Gao e Nie, 2004; Hahn, Keng e Krauss,
2008; Lee, Kim e Park, 2010; Markovic et al., 2012; Duan et al., 2013; Chen,
G. et al., 2015; Huang et al., 2015) Segundo Hahn, Keng e Krauss, (2008),
existem alguns desvantagens no uso de corantes orgânicos ou de proteínas
fluorescentes na citometria de fluxo e que pode ser superadas através da
substituição destes fluoróforos por PQs. Isto porque os PQs possuem um
amplo espectro de absorção, não estando limitados a fontes de excitação
específica. Sendo assim, os resultados mostraram o potencial dos PQs de
CdSe/ZnS quando comparado com o tradicional isotiocianato de fluoresceína
(FITC), que é um marcador fluorescente verde. De acordo com os autores, os
PQs de CdSe/ZnS possuem uma maior intensidade luminescente,
proporcionando maior precisão na detecção de uma mistura de células
bacterianas, comprovando assim as vantagens dos uso PQs na citometria de
fluxo.
Resumidamente, a técnica de citometria baseia-se na contagem
total de células numa suspensão homogeneizada, em vez da contagem
manual sobre um microscópio de fluorescência. Em nosso estudo, o número
total de células contendo as micelas internalizadas foi estimado através da
fluorescência dos PQs. A porcentagem das micelas F127 HTMS/AO e F127
HTMS a ser utilizada foi determinada em função do IC50, sendo 6,6% para
ambas as amostras. Apesar dessas micelas apresentaram uma atividade
citotóxica em menores porcentagens, as mesmas possuem uma maior
luminescência em comparação com as micelas formadas pelo Pluronic F68.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 107
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Com isso, a Figura II.8 mostra os histogramas em citometria de fluxo da
micela F127 HTMS (a) e da micela F127 AO/HTMS (b).
Figura II.8. Histogramas em citometria de fluxo da micela F127 HTMS (a) e
da micela F127 HTMS/AO. Nos gráficos o eixo y corresponde ao número de
células analisadas em função da dispersão lateral de luz (“side scatter” ou
SS), já o eixo x representa a dispersão da luz a partir da fonte de excitação
no mesmo eixo que o feixe, ou seja, “forward scatter” ou FS.
Apesar da baixa porcentagem de internalização celular em
linhagens do tipo HepG2, sendo 2,16% para a micela F127 HTMS/AO e de
1,56% para a micela F127 HTMS. Estes resultados representam de certa
forma um potencial a ser explorado em relação ao sistema, incluindo
modificações na síntese dos PQs tornando-os mais luminescentes,
característica que diminui o limite de detecção e também a fixação de
moléculas sinalizadoras ao redor das micelas poliméricas, facilitando assim
sua internalização celular em células específicas. Com isso, a Figura II.9
resume um esquema da internalização celular das micelas poliméricas
contendo os PQs hidrofóbicos como marcador.
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 108
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
Figura II.9. Esquema da internalização celular das micelas poliméricas
contendo os PQs hidrofóbicos como marcador, sendo os PQs hidrofóbicos
presentes em nosso estudo (a), localização dos PQs no núcleo micelar (b),
excitação em 350 nm/ emissão em 550 nm, região do verde (c) e
internalização celular (d).
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 109
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
II) 3 CONCLUSÕES
Através dos resultados aqui apresentados, concluímos que a
incorporação dos PQs hidrofóbicos nas micelas poliméricas foi realizada com
sucesso. Este fato pode ser observado através dos espectros de absorção no
UV-vis e também pelos espectros de excitação (PLE) e de emissão (PL). Já
com a técnica de DLS avaliamos parâmetros relacionados ao tamanho,
distribuição e pdi das micelas e que foram qualificadas com o estudo de
estabilidade.
Através dos resultados também concluímos a importância do
tamanho da cadeia hidrofóbica dos copolímeros utilizados. Visto que, as
micelas formadas pelo Pluronic F127, por possuírem uma maior cadeia,
apresentaram um melhor rendimento quântico (QY) em relação às micelas
formadas pelo Pluornic F68. Está característica pode ter influenciado no
processo de incorporação dos PQs na região hidrofóbica, ou seja, o excesso
dos PQs não solubilizados nesta região pode ter sido removido do restante da
solução micelar através do processo de filtração, proporcionando uma
diminuição na luminescência dos mesmos.
A avaliação do potencial citotóxico das micelas, apresentou uma
boa viabilidade celular para as linhagens de HaCat e HepG2 principalmente,
para as micelas formadas pelo Pluronic F68. Este resultado pode estar
relacionado com o tamanho das mesmas, tendo em vista que as micelas de
tamanhos maiores apresentaram uma atividade citotóxica em menores
porcentagens. Já a quantificação das células em que houve a internalização
das micelas foi feita através da citometria de fluxo. Os resultados mostraram
a capacidade desta técnica em detectar o número de células fluorescentes.
Apesar da baixa porcentagem de internalização celular, os resultados
representam de certa forma um potencial a ser explorado em relação ao
sistema, incluindo modificações na síntese dos PQs tornando-os mais
luminescentes, característica que diminui o limite de detecção e também a
fixação de moléculas sinalizadoras ao redor das micelas, facilitando assim
Capítulo II _______________________________________________________________________________________ 110
Nathalia Cristina Rissi
____________________________________________________________________
sua internalização em células especificas de determinados tipos de câncer.
Sendo assim, concluímos com os resultados encontrados neste Capítulo, o
potencial destes sistemas micelares em atuarem futuramente como agentes
diagnósticos e também no desenvolvimento futuro de sistemas teranósticos.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________112
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABOULAICH, A. et al. Physicochemical properties and cellular toxicity of
(poly) aminoalkoxysilanes-functionalized ZnO quantum dots.
Nanotechnology, v. 23, n. 33, p. 335101, 2012. ISSN 0957-4484.
ADAMS, M. L.; KWON, G. S. Relative aggregation state and hemolytic activity
of amphotericin B encapsulated by poly (ethylene oxide)-block–poly (N-
hexyl-l-aspartamide)-acyl conjugate micelles: effects of acyl chain length.
Journal of controlled release, v. 87, n. 1, p. 23-32, 2003. ISSN 0168-3659.
AKIMOV, A. V.; NEUKIRCH, A. J.; PREZHDO, O. V. Theoretical insights into
photoinduced charge transfer and catalysis at oxide interfaces. Chemical
reviews, v. 113, n. 6, p. 4496-4565, 2013. ISSN 0009-2665.
ALDEEK, F. et al. Enhanced photostability from CdSe (S)/ZnO core/shell
quantum dots and their use in biolabeling. European Journal of Inorganic
Chemistry, v. 2011, n. 6, p. 794-801, 2011. ISSN 1099-0682.
ALLEN, C.; MAYSINGER, D.; EISENBERG, A. Nano-engineering block copolymer
aggregates for drug delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 16,
n. 1, p. 3-27, 1999. ISSN 0927-7765.
ANDO, M. et al. Cytotoxicity of CdSe-based quantum dots incorporated in
glass nanoparticles evaluated using human keratinocyte HaCaT cells.
Bioscience, biotechnology, and biochemistry, v. 80, n. 1, p. 210-213,
2016. ISSN 0916-8451.
BAE, Y. et al. Multifunctional polymeric micelles with folate-mediated
cancer cell targeting and pH-triggered drug releasing properties for active
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________113
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
intracellular drug delivery. Molecular BioSystems, v. 1, n. 3, p. 242-250,
2005.
BAGALKOT, V. et al. Quantum dot-aptamer conjugates for synchronous
cancer imaging, therapy, and sensing of drug delivery based on bi-
fluorescence resonance energy transfer. Nano letters, v. 7, n. 10, p. 3065-
3070, 2007. ISSN 1530-6984.
BERA, D. et al. Quantum dots and their multimodal applications: a review.
Materials, v. 3, n. 4, p. 2260-2345, 2010.
BOUKAMP, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized
aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of cell biology, v. 106,
n. 3, p. 761-771, 1988. ISSN 0021-9525.
BRINKER, C. J.; SCHERER, G. W. Sol-gel science, 1990. The physics and
chemistry of sol–gel processing, 1990.
______. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel processing.
Academic press, 2013. ISBN 0080571034.
BRUS, L. E. A simple model for the ionization potential, electron affinity,
and aqueous redox potentials of small semiconductor crystallites. The
Journal of chemical physics, v. 79, n. 11, p. 5566-5571, 1983. ISSN 0021-
9606.
CAETANO, B. L. et al. In situ and simultaneous UV− vis/SAXS and UV−
vis/XAFS time-resolved monitoring of ZnO quantum dots formation and
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________114
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
growth. The Journal of Physical Chemistry C, v. 115, n. 11, p. 4404-4412,
2011. ISSN 1932-7447.
CAI, Y. et al. Synthesis, characterization and anti-cancer activity of Pluronic
F68–curcumin conjugate micelles. Drug delivery, p. 1-9, 2015. ISSN 1071-
7544.
CARRILLO-CARRIÓN, C. et al. Quantum dots luminescence enhancement due
to illumination with UV/Vis light. Chemical Communications, n. 35, p. 5214-
5226, 2009.
CHAKRAVARTHY, K. V. et al. Doxorubicin-conjugated quantum dots to target
alveolar macrophages and inflammation. Nanomedicine: Nanotechnology,
Biology and Medicine, v. 7, n. 1, p. 88-96, 2011. ISSN 1549-9634.
CHEN, G. et al. Transformation of Cell‐Derived Microparticles into Quantum‐
Dot‐Labeled Nanovectors for Antitumor siRNA Delivery. Angewandte Chemie
International Edition, v. 54, n. 3, p. 1036-1040, 2015. ISSN 1521-3773.
CHEN, J. et al. The synthesis and modification of CdTe/CdS core shell
quantum dots. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy, v. 151, p. 506-509, 2015. ISSN 1386-1425.
CHOUCAIR, A.; EISENBERG, A. Control of amphiphilic block copolymer
morphologies using solution conditions. The European Physical Journal E, v.
10, n. 1, p. 37-44, 2003. ISSN 1292-8941.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________115
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
DABBOUSI, B. O. et al. (CdSe) ZnS core-shell quantum dots: synthesis and
characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. The
Journal of Physical Chemistry B, v. 101, n. 46, p. 9463-9475, 1997. ISSN
1520-6106.
DEMAS, J. N.; CROSBY, G. A. Measurement of photoluminescence quantum
yields-Review. Journal of Physical Chemistry, v. 75, n. 8, p. 991, 1971.
ISSN 0022-3654.
DEYRIEUX, A. F.; WILSON, V. G. In vitro culture conditions to study
keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology, v.
54, n. 2, p. 77-83, 2007. ISSN 0920-9069.
DING, H. et al. Non-invasive tumor detection in small animals using novel
functional Pluronic nanomicelles conjugated with anti-mesothelin antibody.
Nanoscale, v. 3, n. 4, p. 1813-1822, 2011.
DUAN, N. et al. A dual-color flow cytometry protocol for the simultaneous
detection of Vibrio parahaemolyticus and Salmonella typhimurium using
aptamer conjugated quantum dots as labels. Analytica chimica acta, v. 804,
p. 151-158, 2013. ISSN 0003-2670.
DUBERTRET, B. et al. In vivo imaging of quantum dots encapsulated in
phospholipid micelles. Science, v. 298, n. 5599, p. 1759-1762, 2002. ISSN
0036-8075.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________116
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
FRASCO, M. F.; CHANIOTAKIS, N. Bioconjugated quantum dots as fluorescent
probes for bioanalytical applications. Analytical and bioanalytical
chemistry, v. 396, n. 1, p. 229-240, 2010. ISSN 1618-2642.
FU, Y.-S. et al. Stable aqueous dispersion of ZnO quantum dots with strong
blue emission via simple solution route. Journal of the American Chemical
Society, v. 129, n. 51, p. 16029-16033, 2007. ISSN 0002-7863.
GAO, X. et al. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor
quantum dots. Nature biotechnology, v. 22, n. 8, p. 969-976, 2004. ISSN
1087-0156.
GAO, X.; NIE, S. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high
brightness and uniformity: rapid readout using flow cytometry. Analytical
chemistry, v. 76, n. 8, p. 2406-2410, 2004. ISSN 0003-2700.
GHASEMI, Y.; PEYMANI, P.; AFIFI, S. Quantum dot: magic nanoparticle for
imaging, detection and targeting. Acta Bio Medica Atenei Parmensis, v. 80,
n. 2, p. 156-165, 2009. ISSN 0392-4203.
GULIA, S.; KAKKAR, R. ZnO quantum dots for biomedical applications. Adv.
Mat. Lett, v. 4, n. 12, p. 876-887, 2013.
HAHN, M. A.; KENG, P. C.; KRAUSS, T. D. Flow cytometric analysis to detect
pathogens in bacterial cell mixtures using semiconductor quantum dots.
Analytical chemistry, v. 80, n. 3, p. 864-872, 2008. ISSN 0003-2700.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________117
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
HAMAGUCHI, T. et al. NK105, a paclitaxel-incorporating micellar
nanoparticle formulation, can extend in vivo antitumour activity and reduce
the neurotoxicity of paclitaxel. British journal of cancer, v. 92, n. 7, p.
1240-1246, 2005. ISSN 0007-0920.
HAMMER, N. I.; EMRICK, T.; BARNES, M. D. Quantum dots coordinated with
conjugated organic ligands: new nanomaterials with novel photophysics.
Nanoscale Research Letters, v. 2, n. 6, p. 282-290, 2007. ISSN 1931-7573.
HE, L. et al. Highly luminescent and biocompatible near-infrared core–shell
CdSeTe/CdS/C quantum dots for probe labeling tumor cells. Talanta, v. 146,
p. 209-215, 2016. ISSN 0039-9140.
HEZINGER, A. F. E.; TEßMAR, J.; GÖPFERICH, A. Polymer coating of quantum
dots–a powerful tool toward diagnostics and sensorics. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 68, n. 1, p. 138-152, 2008. ISSN
0939-6411.
HO, Y.-P.; LEONG, K. W. Quantum dot-based theranostics. Nanoscale, v. 2,
n. 1, p. 60-68, 2010.
HUANG, C.-L. et al. Application of paramagnetic graphene quantum dots as
a platform for simultaneous dual-modality bioimaging and tumor-targeted
drug delivery. Journal of Materials Chemistry B, v. 3, n. 4, p. 651-664,
2015.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________118
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
ICHINOSE, N. Fluorometric analysis in biomedical chemistry: trends and
techniques including HPLC applications. Wiley-Interscience, 1991. ISBN
0471522589.
INNOCENZI, P. et al. Sol-gel reactions of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
in a highly basic aqueous solution. Dalton Transactions, n. 42, p. 9146-9152,
2009.
IOANNOU, D.; GRIFFIN, D. K. Nanotechnology and molecular cytogenetics:
the future has not yet arrived. Nano reviews, v. 1, 2010.
JANA, N. R.; EARHART, C.; YING, J. Y. Synthesis of water-soluble and
functionalized nanoparticles by silica coating. Chemistry of Materials, v. 19,
n. 21, p. 5074-5082, 2007. ISSN 0897-4756.
JANA, N. R. et al. Controlled photostability of luminescent nanocrystalline
ZnO solution for selective detection of aldehydes. Chemical
Communications, n. 14, p. 1406-1408, 2007.
JANOTTI, A.; VAN DE WALLE, C. G. Fundamentals of zinc oxide as a
semiconductor. Reports on Progress in Physics, v. 72, n. 12, p. 126501,
2009. ISSN 0034-4885.
JIMENEZ-GONZALEZ, A. E.; URUETA, J. A. S.; SUAREZ-PARRA, R. Optical and
electrical characteristics of aluminum-doped ZnO thin films prepared by
solgel technique. Journal of crystal growth, v. 192, n. 3, p. 430-438, 1998.
ISSN 0022-0248.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________119
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
KABANOV, A. V.; BATRAKOVA, E. V.; MILLER, D. W. Pluronic® block
copolymers as modulators of drug efflux transporter activity in the blood–
brain barrier. Advanced drug delivery reviews, v. 55, n. 1, p. 151-164,
2003. ISSN 0169-409X.
KIM, S. et al. Type-II quantum dots: CdTe/CdSe (core/shell) and CdSe/ZnTe
(core/shell) heterostructures. Journal of the American Chemical Society,
v. 125, n. 38, p. 11466-11467, 2003. ISSN 0002-7863.
KONESWARAN, M.; NARAYANASWAMY, R. Ultrasensitive detection of vitamin
B6 using functionalised CdS/ZnS core–shell quantum dots. Sensors and
Actuators B: Chemical, v. 210, p. 811-816, 2015. ISSN 0925-4005.
KUMAR, R. et al. In vitro evaluation of theranostic polymeric micelles for
imaging and drug delivery in cancer. Theranostics, v. 2, n. 7, p. 714, 2012.
KUMARI, K. et al. Effect of surface passivating ligand on structural and
optoelectronic properties of polymer: CdSe quantum dot composites.
Journal of Physics D: Applied Physics, v. 41, n. 23, p. 235409, 2008. ISSN
0022-3727.
LAW, W.-C. et al. Optically and magnetically doped organically modified
silica nanoparticles as efficient magnetically guided biomarkers for two-
photon imaging of live cancer cells†. The Journal of Physical Chemistry C,
v. 112, n. 21, p. 7972-7977, 2008. ISSN 1932-7447.
LEE, H.; KIM, I.-K.; PARK, T. G. Intracellular trafficking and unpacking of
siRNA/quantum dot-PEI complexes modified with and without cell
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________120
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
penetrating peptide: confocal and flow cytometric FRET analysis.
Bioconjugate chemistry, v. 21, n. 2, p. 289-295, 2010. ISSN 1043-1802.
LEE, R.-S. et al. Passive targeting of thermosensitive diblock copolymer
micelles to the lungs: synthesis and characterization of poly (N-
isopropylacrylamide)-block-poly (ε-caprolactone). Journal of
nanobiotechnology, v. 13, n. 1, p. 42, 2015. ISSN 1477-3155.
LI, S. et al. ZnO Nanocomposites Modified by Hydrophobic and Hydrophilic
Silanes with Dramatically Enhanced Tunable Fluorescence and Aqueous
Ultrastability toward Biological Imaging Applications. Scientific reports, v.
5, 2015.
LIU, L. et al. Multimodal imaging probes based on Gd-DOTA conjugated
quantum dot nanomicelles. Analyst, v. 136, n. 9, p. 1881-1886, 2011.
______. Bioconjugated pluronic triblock-copolymer micelle-encapsulated
quantum dots for targeted imaging of cancer: in vitro and in vivo studies.
Theranostics, v. 2, n. 7, p. 705, 2012.
MANAIA, E. B. et al. Surface modified Mg-doped ZnO QDs for biological
imaging. European Journal of Nanomedicine, v. 7, n. 2, p. 109-120, 2015.
ISSN 1662-596X.
MARKOVIC, Z. M. et al. Graphene quantum dots as autophagy-inducing
photodynamic agents. Biomaterials, v. 33, n. 29, p. 7084-7092, 2012. ISSN
0142-9612.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________121
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
MATSUMURA, Y. et al. Phase I clinical trial and pharmacokinetic evaluation
of NK911, a micelle-encapsulated doxorubicin. British journal of cancer, v.
91, n. 10, p. 1775-1781, 2004. ISSN 0007-0920.
MI, Y.; LIU, Y.; FENG, S.-S. Formulation of docetaxel by folic acid-conjugated
d-α-tocopheryl polyethylene glycol succinate 2000 (Vitamin E TPGS 2k)
micelles for targeted and synergistic chemotherapy. Biomaterials, v. 32, n.
16, p. 4058-4066, 2011. ISSN 0142-9612.
MIRET, S.; DE GROENE, E. M.; KLAFFKE, W. Comparison of in vitro assays of
cellular toxicity in the human hepatic cell line HepG2. Journal of
biomolecular screening, v. 11, n. 2, p. 184-193, 2006. ISSN 1087-0571.
MOGHADDAM, E. et al. Preparation of surface-modified ZnO quantum dots
through an ultrasound assisted sol–gel process. Applied Surface Science, v.
346, p. 111-114, 2015. ISSN 0169-4332.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of
immunological methods, v. 65, n. 1-2, p. 55-63, 1983. ISSN 0022-1759.
MOUSSODIA, R.-O. et al. Biocompatible and stable ZnO quantum dots
generated by functionalization with siloxane-core PAMAM dendrons. Journal
of Materials Chemistry, v. 20, n. 6, p. 1147-1155, 2010.
MOUSSODIA, R.-O.; BALAN, L.; SCHNEIDER, R. Synthesis and characterization
of water-soluble ZnO quantum dots prepared through PEG-siloxane coating.
New Journal of Chemistry, v. 32, n. 8, p. 1388-1393, 2008.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________122
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
NEDELIJKOVIC, J. M. et al. Synthesis and optical properties of quantum-
sized metal sulfide particles in aqueous solution. Journal of chemical
education, v. 70, n. 4, p. 342, 1993. ISSN 0021-9584.
NEUBERG, P. et al. Photopolymerized micelles of diacetylene amphiphile:
physical characterization and cell delivery properties. Chemical
Communications, v. 51, n. 58, p. 11595-11598, 2015.
PATHAKOTI, K. et al. In vitro cytotoxicity of CdSe/ZnS quantum dots with
different surface coatings to human keratinocytes HaCaT cells. Journal of
Environmental Sciences, v. 25, n. 1, p. 163-171, 2013. ISSN 1001-0742.
PENG, L. et al. Cellular uptake, elimination and toxicity of CdSe/ZnS
quantum dots in HepG2 cells. Biomaterials, v. 34, n. 37, p. 9545-9558,
2013. ISSN 0142-9612.
PESIKA, N. S. et al. Quenching of growth of ZnO nanoparticles by adsorption
of octanethiol. The Journal of Physical Chemistry B, v. 106, n. 28, p. 6985-
6990, 2002. ISSN 1520-6106.
PREZHDO, O. V. Photoinduced dynamics in semiconductor quantum dots:
insights from time-domain ab initio studies. Accounts of chemical research,
v. 42, n. 12, p. 2005-2016, 2009. ISSN 0001-4842.
PROSHCHENKO, V.; DAHNOVSKY, Y. Long-lived emission in Mn doped CdS,
ZnS, and ZnSe diluted magnetic semiconductor quantum dots. Chemical
Physics, v. 461, p. 58-62, 2015. ISSN 0301-0104.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________123
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
QIAN, L. et al. Stable and efficient quantum-dot light-emitting diodes based
on solution-processed multilayer structures. Nature photonics, v. 5, n. 9, p.
543-548, 2011. ISSN 1749-4885.
QIU, L. Y.; BAE, Y. H. Polymer architecture and drug delivery.
Pharmaceutical research, v. 23, n. 1, p. 1-30, 2006. ISSN 0724-8741.
QU, L.; PENG, Z. A.; PENG, X. Alternative routes toward high quality CdSe
nanocrystals. Nano Letters, v. 1, n. 6, p. 333-337, 2001. ISSN 1530-6984.
REISS, P.; PROTIERE, M.; LI, L. Core/shell semiconductor nanocrystals. small,
v. 5, n. 2, p. 154-168, 2009. ISSN 1613-6829.
ROSSETTI, R. et al. Size effects in the excited electronic states of small
colloidal CdS crystallites. SPIE milestone series, v. 180, p. 75-80, 2005.
ISSN 1050-0529.
SAHAI, A.; GOSWAMI, N. Probing the dominance of interstitial oxygen defects
in ZnO nanoparticles through structural and optical characterizations.
Ceramics International, v. 40, n. 9, p. 14569-14578, 2014. ISSN 0272-8842.
SAHU, A. et al. Encapsulation of curcumin in Pluronic block copolymer
micelles for drug delivery applications. Journal of biomaterials
applications, v. 25, n. 6, p. 619-639, 2011. ISSN 0885-3282.
SAMIR, T. M. et al. Quantum dots: heralding a brighter future for clinical
diagnostics. Nanomedicine, v. 7, n. 11, p. 1755-1769, 2012. ISSN 1743-5889.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________124
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
SHARMA, A. et al. Effect of surface groups on the luminescence property of
ZnO nanoparticles synthesized by sol–gel route. Surface Science, v. 606, n.
3, p. L13-L17, 2012. ISSN 0039-6028.
SMITH, A. M. et al. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and
cellular imaging. Advanced drug delivery reviews, v. 60, n. 11, p. 1226-
1240, 2008. ISSN 0169-409X.
SPANHEL, L.; ANDERSON, M. A. Semiconductor clusters in the sol-gel process:
quantized aggregation, gelation, and crystal growth in concentrated zinc
oxide colloids. Journal of the American Chemical Society, v. 113, n. 8, p.
2826-2833, 1991. ISSN 0002-7863.
SUDIMACK, J.; LEE, R. J. Targeted drug delivery via the folate receptor.
Advanced drug delivery reviews, v. 41, n. 2, p. 147-162, 2000. ISSN 0169-
409X.
TALAPIN, D. V. et al. Highly luminescent monodisperse CdSe and CdSe/ZnS
nanocrystals synthesized in a hexadecylamine-trioctylphosphine oxide-
trioctylphospine mixture. Nano letters, v. 1, n. 4, p. 207-211, 2001. ISSN
1530-6984.
TOKUMOTO, M. S. et al. SAXS study of the kinetics of formation of ZnO
colloidal suspensions. Journal of non-crystalline solids, v. 247, n. 1, p. 176-
182, 1999. ISSN 0022-3093.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________125
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
TYAGI, N. et al. Development and characterization of a novel in vitro
progression model for UVB-induced skin carcinogenesis. Scientific reports, v.
5, 2015.
VASUDEVAN, D. et al. Core–shell quantum dots: Properties and applications.
Journal of Alloys and Compounds, v. 636, p. 395-404, 2015. ISSN 0925-
8388.
WANG, C.; GAO, X.; SU, X. In vitro and in vivo imaging with quantum dots.
Analytical and bioanalytical chemistry, v. 397, n. 4, p. 1397-1415, 2010.
ISSN 1618-2642.
WANG, L. et al. Water-soluble ZnO–Au nanocomposite-based probe for
enhanced protein detection in a SPR biosensor system. Journal of colloid
and interface science, v. 351, n. 2, p. 392-397, 2010. ISSN 0021-9797.
WANG, Y.; ZHANG, Y.; ZHANG, W. First-principles study of the halide-
passivation effects on the electronic structures of CdSe quantum dots. RSC
Advances, v. 4, n. 37, p. 19302-19309, 2014.
WEI, Z. et al. Paclitaxel-loaded Pluronic P123/F127 mixed polymeric
micelles: formulation, optimization and in vitro characterization.
International journal of pharmaceutics, v. 376, n. 1, p. 176-185, 2009.
ISSN 0378-5173.
WEISSLEDER, R. et al. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent
attachment of small molecules. Nature biotechnology, v. 23, n. 11, p. 1418-
1423, 2005. ISSN 1087-0156.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________126
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
WU, X. et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other
cellular targets with semiconductor quantum dots. Nature biotechnology, v.
21, n. 1, p. 41-46, 2003. ISSN 1087-0156.
WU, Y. L. et al. Surface modification of ZnO nanocrystals. Applied Surface
Science, v. 253, n. 12, p. 5473-5479, 2007. ISSN 0169-4332.
XIAO, J. et al. Effect of ZnO# ZnS QDs heterojunctures on the stilbenes–
plasma proteins interactions. Molecular BioSystems, v. 7, n. 8, p. 2452-
2458, 2011.
XIONG, G.; PAL, U.; SERRANO, J. G. Correlations among size, defects, and
photoluminescence in ZnO nanoparticles. Journal of Applied Physics, v.
101, n. 2, p. 024317, 2007. ISSN 0021-8979.
YU, W. W. et al. Experimental determination of the extinction coefficient of
CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals. Chemistry of Materials, v. 15, n. 14, p.
2854-2860, 2003. ISSN 0897-4756.
YUAN, Q.; HEIN, S.; MISRA, R. D. K. New generation of chitosan-encapsulated
ZnO quantum dots loaded with drug: synthesis, characterization and in vitro
drug delivery response. Acta biomaterialia, v. 6, n. 7, p. 2732-2739, 2010.
ISSN 1742-7061.
ZHANG, J. et al. Cd-doped ZnO quantum dots-based immunoassay for the
quantitative determination of bisphenol A. Chemosphere, v. 95, p. 105-110,
2014. ISSN 0045-6535.
Referências Bibliográficas __________________________________________________________________________________127
Nathalia Cristina Rissi
_____________________________________________________________________________
ZHANG, L.; YU, K.; EISENBERG, A. Ion-induced morphological changes in"
crew-cut" aggregates of amphiphilic block copolymers. Science, v. 272, n.
5269, p. 1777, 1996. ISSN 0036-8075.
ZHANG, W. et al. Multifunctional Pluronic P123/F127 mixed polymeric
micelles loaded with paclitaxel for the treatment of multidrug resistant
tumors. Biomaterials, v. 32, n. 11, p. 2894-2906, 2011. ISSN 0142-9612.
ZHANG, Y. et al. Evodiamine induces tumor cell death through different
pathways: apoptosis and necrosis. Acta Pharmacol Sin, v. 25, n. 1, p. 83-89,
2004.
ZHAO, D. et al. Luminescent ZnO quantum dots for sensitive and selective
detection of dopamine. Talanta, v. 107, p. 133-139, 2013. ISSN 0039-9140.
ÖZGÜR, Ü. et al. A comprehensive review of ZnO materials and devices.
Journal of applied physics, v. 98, n. 4, p. 041301, 2005. ISSN 0021-8979.
Top Related