MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULARCELULAR
I - MICROSCOPIAS
MMIICCRROOSSCCOOPPIIAASS
Início (1600):- Incorporação do microscópio aos estudos
anatômicos;- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a
visualização dos materiais biológicos
1663Robert Hooke
185217501689Marcello Malpighi
Marcello Malpighi(1628-1694)
(1689)
“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena,interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso
a nenhum médico”
Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil
Descrições sobre os capilares eram falsas
Anatomia comparada era irrelevante para medicina
Anatomia humana → só era útil para descrição
Introdução da microscopia à medicina
Estudo de capilares
Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto
Interação da luz com o espécime
Absorção
Refração dos
raios de luz
ou
Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve
Na formação da imagem aos Microscópios, dois fenômenos devem ser considerados: a
absorção e a refração
Interação da luz com o espécime
Microscópio
produção de imagens aumentadas de objetos não
visualizados à olho nú
Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia
1) De luz (ML) / óptico (comum) Modificado (variações) com propósitos especiais
Contraste de fase Invertido Polarização
Fluorescência2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
Fonte luminosa → luz branca(lâmpada com filamento de
tungstênio)
Óptica → lentesampliação condensação
Mecânica
Sistema de iluminação
Microscópio de luz comum / campo claro
Componentes:
Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Fonte de luz condensadora
objetivaocular
objetoImagem
I
Imagem II
F F FC C C
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
Trajeto da luz
Centralização do feixe de luz
“Iluminação de Köhler”
Iluminação perfeita
Menos ocorrência de aberrações e
irregularidades no trajeto luminoso
Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)
Projeta imagem real e invertida
Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x
Aumento final
4x = Vermelha10x = Amarela40x = Azul claro100x = Preta / branca
Objetiva
A = Ângulo de abertura da objetiva = Ângulo correspondente à metade de AAN = Abertura numéricaN = Índice de refração do meio de montagemsen = Fornecido pelo fabricante da lente
AN = 0,12 (4x)AN = 0,34 (10x)AN = 0,60 (40x)AN = acima de 1 (100x)
AN = n.senα
Abertura numérico
Bom microscópio:
1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com
detalhes mínimos”
2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser
individualizados na imagem final”
> > PR < LRPR < LR
Poder de Resolução X Limite de Resolução
ou
Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do
objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( >
PR)
Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio
Planos de cortes
Imagem microscópio = bidimensional Objeto de estudo = tridimensional
Planos de cortes
Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração
Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação
Objetiva de menor aumento (panorâmica)
Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina
Iluminação de Köehler
Objetivas de aumentos maiores
Sequência de passos
Observação: imagem → invertida
Microscopia de LuzMicroscopia convencionalMicroscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste interferencialMicroscopia de campo escuroMicroscopia de polarizaçãoMicroscopia de fluorescênciaMicroscopia confocal a laser
Microscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica de transmissãoMicroscopia eletrônica de alta voltagemMicroscopia eletrônica de varredura
Outros tipos de microscópioMicroscopia de tunelamento quânticoMicroscopia de força atômicaMicroespectrofotometria
Tipos de Microscópios
Princípios da Difração da LuzAnéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950)Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase)
Retardo ópticoe
Refração da luz
Microscopia de Contraste de fase
Microscopia de Contraste de fase
Análise do material biológico sem coloração prévia:
1.Culturas de células2. Exames parasitológicos3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios)4. Sangue5. Protozoários de ambientes aquáticos6.Algas 7. Bactérias
Diferenças de índices de refração
Sem coloração
BactériasCultura de células: neurônios
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material com coloração prévia
Prismas ópticos posicionados no caminho da luz
Microscopia de Contraste Interferencial
Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Contraste com o meio em que se encontra o material
Microscopia de Contraste Interferencial
Defasagem dos comprimentos de onda
Microscopia de Normarski
Microscopia de Contraste Interferencial
Gera uma “deformação” na imagemPermite contraste interferencial
Aumentando o relevo das superfícies do material
analisado
Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares
Algas
Escamas
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Cultura Celular: macrófago Ácaro
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Com coloração fluorescente
Sem coloração
Com coloração
Diferenças de índices
de refração
Cores de interferênci
a
Campo escuro
2 Filtros / Prismas:1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador
2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular
Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada
(PLP) Observação: Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de vibração em todos os planos
Microscopia de Polarização
2º
1º
Microscopia de Polarização
1º
2º
PLP
Microscopia de Polarização
Anisotropias Ópticas
Fenômenos de ordem espectral
Dicroísmo(1 filtro
polarizador)
Birrefringência(2 filtros polarizadores
cruzados perpendiculares)
Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)
Microscopia de Polarização
Birrefringência ocorre
Componentes macromoleculares birrefringentes
Anisotrópicos (brilho colorido ou não)
Cruzamos perpendicularmente os 2
filtros (polarizador e analisador)
Realçados
Outros componentes
Isotrópicos (não refrigentes) Indistintos em fundo escuro
1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular)3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente4. Análise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Aplicações da Microscopia de Polarização
Tecido ósseo
Grãos de Amido
Aplicações da Microscopia de Polarização
Birrefringência pode ser
intensificada por corantes
Exemplos: Colágeno
- Xylidine Ponceau- Picro-sirius
Cromatina / Matriz Extracelular- Azul de toluidina
(ordem e agregação molecular )
Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas
Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras
colágenas
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada
Aplicações da Microscopia de Polarização
Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante /
amarelo)
Microscopia de Luz Polarizada
Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade
Medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência)
Diagnósticos patológicos
Material biológicos
Estabelecimento ordem molecular
Fases da vida celular
Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto
A luz se dispersa
Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)
Microscopia de Campo Escuro
É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelular (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen
Microscopia de campo escuro da bactéria
Leptospira spp
Aplicações da Microscopia de Campo Escuro
Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz em
um determinado comprimento de
onda e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos
mais baixos
Microscopia de Fluorescência
Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão
Fluorescência natural:Existem componentes celulares ou moleculares
naturalmente fluorescentes
ClorofilaLignina de parede
vegetalElastina
Colágeno
A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas
vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)
Outros componentes:Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos
→ emitem brilho contra fundo escuro
Alaranjado de acridina
(fluorocromo)
Células do testículo de triatomíneos
(barbeiro)Divisão celular
RNA - vermelho
DNA - verde
1. Sistema óptico interage com pouca luz:
Luz de mercúrio de alta pressão2. Sistemas de filtros para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem)Fonte de luz → Fótons → Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) → Objeto → Emite luz fluorescente → Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) → Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem)
b. Filtro de barragemOcular
a. Filtro de excitação
Fonte de luz
Objetiva
Microscopia de Fluorescência
Microscopia de Fluorescência
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência
Fluorocromos:Alaranjado de acridina
EosinaDAPI
RodaminaFluoresceina
Emitem brilho contrafundo escuro
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
Outras aplicações da Microscopia de Fluorescência
Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica
Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas
Imunocitoquímica
Hibridação “in situ” (FISH)
Aplicações da Microscopia de Fluorescência
1987 - Disponível mundialmente
O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência → Utiliza laser como fonte de luz
Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados)
Reconstrução do objeto tridimensionalmente → Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)
Microscopia confocal a laser
Aplicações da Microscopia confocal a laser1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional
2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular
Células em apoptose: condrócitos
Células em prófase
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Protozoário
Macrófago
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Grãos de Pólen
Divisão celular / Fuso mitótico
Aplicações da Microscopia confocal a laser
Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons
Semelhantes a fótons num
sistema de vácuoPrimeiros experimentos: Década de 1920 → Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas)
1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do olho humano
Microscopia eletrônica
Ernst August Friedrich Ruska
(1906-1988)
Principais diferenças
Fonte Luz (porção inferior)
Elétrons (porção superior)
Lentes Vidro EletromagnéticasLentes de aumento (principal)
Objetivas e oculares Eletromagnéticas
Suporte para amostra
Lâmina de vidro Grade de metal (telinha)Cobre ou
níquelLimite de resolução
0,2 µ 0,0002 µ
Formação da imagem
Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação
Microscópio eletrônicode transmissão (MET)
Microscópio de luz (ML)
Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica
Questões importantes: Ampliação e Resolução
Microscopia eletrônica
O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento
ondulatório semelhante aos fótons de luz
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Microscópio eletrônico
de transmissão (MET)
Microscópio eletrônicode varredura(MEV)
Formação da imagem ao Microscópio eletrônico:Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora → Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) → Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem ampliada → Anteparo fluorescente / monitor
Fixação
Desidratação
Inclusão
Cortes
Contrastação commetais pesados
Principais etapas da preparação das amostras para MET
Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etcObservação:
Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados
Imagem final ao MET
Coloração negativa: vírus Tecido muscular
Hepátócito: Complexo de
Golgi
CílioCélulas epiteliais
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais:
- Vermes- Insetos- Células livres (animais/vegetais)- Embriões- Fragmentos geológicos
Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Scanning Electron Microscopy (SEM)
Guelras de um peixe
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Preparação das amostras
Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio)
Desidratação
Secagem (“ponto crítico”)
Evaporação com ouro na superfície a ser analisada
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Title: “An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Descrição de estruturas subcelulares (µ)Ex.: Citoesqueleto
Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares- Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV)- Permite estudos de corte grossos- Reconstrução tridimensional
Microscopia Eletrônica de Alata Voltagem ou Alta Aceleração
Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia
Microscopia de Tunelamento Quântico
Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å Percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel” Agulha sobre um átomo → corrente ↑ Agulha sobre os espaços entre os átomos → corrente ↓ Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à superfície de vales e montanhas
Microscopia de Tunelamento Quântico
1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) =
ESTURUTRA ATÔMICA
Molécula de miosina Cromossomos
Microscopia de Tunelamento Quântico
É semelhante ao Microscópio de Tunelamento QuânticoDiferença: - Microespelho - Feixe de “laser” sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície
Aplicações: - Imagens em solução - Sequências de reações químicas / modificações ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas
Microscopia de Força Atômica
Microscopia de Força Atômica
Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força
atómica
Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força
atómica
Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica.
A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo.
Reportagem publicada no dia 10/09/2007
Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien ChenVencedor do “Science as Art Contest” de 2008
Scanning electron Microscopy – imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado
Fim