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Isolamento e identificação de
microorganismos
Patrícia Albuquerque de Andrade
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Diversidade Microbiana
Microorganismos estão presentes emcomunidades nos mais diversos
ambientes
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Análises de Comunidades
microbianas
Menos de 1% de todas as espécies
de microorganismos existentes são
cultiváveis Desenvolvimento de técnicas de
isolamento e caracterização
Técnicas de enriquecimento A caracterização aprofundada de um
organismos depende do seu cultivo
em culturas puras.
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Isolamento e Identificação de
microorganismos Isolamento
◦ Técnicas de assepsia◦ Cultura pura◦ Técnicas de
enriquecimento◦ Coleta, transporte e
armazenamento dasamostras
◦ Técnicas deisolamento◦ Seleção do meio de
cultura
Identificação
◦ Características decultivo
◦ Morfologia◦ Características
antigênicas◦ Características
patogênicas
◦ Característicasbioquímicas◦ Características
genéticas
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Técnicas de Esterilidade ou
Assepsia
Conjunto de medidas para prevenir
contaminação durante a manipulação de
culturas e meios de cultura estéreis
Fonte: Brock Biology of Microorganisms
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Técnicas de Esterilidade ou
Assepsia
Estabelecer uma área detrabalho
Remover tudo o que nãofor necessário
Limpar a área de trabalhocom um desinfetante antesde começar a trabalhar
Pipetas e garrafas devemestar estéreis
Organizar tudo o que vocêprecisa (frascos, pipetas,pipetador, etc)
Lavar as mãos
Usar luvas e trocá-las comfrequência.
Adaptado de “ At the Bench: a laboratory navigator ”, Kathy Baker, 2005
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Câmara de biossegurança (fluxolaminar)
Luz UV
Filtro HEPAFluxo laminar
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Coleta e Processamento da
Amostra
O sucesso da identificação depende de comoa amostra é coletada, manuseada earmazenada
Evitar contaminação◦ Uso de recipientes estéreis
◦ Técnica de amostragem
◦ Ex. Coleta de amostras da garganta e nasofaringe
não devem tocar a bochecha, a língua ou saliva Após a coleta a amostra deve ser rapidamente
levada ao laboratório e armazenadaapropriadamente (ex. Refrigerada)
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Cultura Pura
Uma cultura contendo um únicomicroorganismo.
http://www.temple.edu/dentistry/admissions/course_descriptions.html
Brock Biology of Microorganisms,
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Isolamento de Culturas Puras
Por que isolar/identificar um
microorganismo ?
Que tipo de organismo você pretendeisolar?
◦ Definir a estratégia de isolamento
◦ Definir que tipo de meio de cultura
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Técnicas de Isolamento
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Plaqueamento de Culturas
Semeadura em superfície
Semeadura em profundidade
Adaptado de Brock Biology of Microorganisms
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Plaqueamento de Culturas
Semeadura por esgotamento:obtenção de colônias isoladas
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Seleção do meio de cultura
Fatores que influenciam a escolha do meio
de cultura
◦ A origem do material a ser analisado
◦ A espécie que se imagina estar presente na
amostra
◦ As necessidades nutricionais dos organismos
Identificação de uma população mista:
◦ Semeadura em diversos meios e condições para
obtenção do crescimento da maior parte das
espécies contidas na amostra.
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Meios Seletivos/Diferenciais
Ágar Verde Brilhate contendo lactose,
sacarose e indicador de pH
Salmonella
E. coli
http://www.microbelibrary.org
Ágar MacConkey(fermentação de
lactose)
E. colic
Serratia marcescens
Não inoculado
Meio MSA (MannitolSalt Agar)
Fermentação demanitol
Staphylococcus. aureus
Staphylococcus epidermidis
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Meios enriquecidos
Placa de Ágar sangue:
contendo bactérias dagarganta humana
Meio enriquecido/diferencial
Ágar chocolate: contém sanguecozido. Usado para oisolamento de N. gonorrhoeae.
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Meios Para Fungos
uma mistura simples contendoglicose, uma fonte de nitrogênioinorgânico ou orgânico e alguns
minerais. Em geral esses meios têm uma
concentração maior de açúcar (4%) eum pH menor (3,8 a 5,6)
Uso de antibióticos para inibircrescimento bacteriano
Ex. Sabouraud, YPD
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Meios para crescimento de Fungos
Meio Sabouraud – fungos ambientais
Meio ágar sangueHistoplasma capsulatum
Meio YPD (yeast peptone dextrose)
Saccharomyces cerevisiae(True and Lindquist, Nature 407, 477-483
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Identificação de Microorganismos
Como identificar espécimes desconhecidos? Por quê?
Principais métodos :
◦ Características de cultivo
◦ Características morfológicas
◦ Características antigênicas
◦ Características patogênicas
◦ Características bioquímicas
◦ Características genéticas
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Identificação de Bactérias
Organimos são
identicados através
de chaves
dicotômicas Análise dos
resultados de vários
testes
Normalmente feitossimultaneamente
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Características de Cultivo
Plaqueamento
Crescimento em meios enriquecidos,
seletivos, diferenciais, etc
Aerobiose, anaerobiose,
pH, temperatura
Crescimento rápido/lento
Floculação
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Métodos morfológicos
Observação da morfologia da Colônia◦ Textura, forma, pigmentação, velocidade de
crescimento, crescimento em meio líquido.
Observação ao microscópio◦ Morfologia da célula,
◦ Tamanho
◦
coloração simples ou diferencial◦ Presença de determinadas estruturas
(grânulos de armazenamento, endosporos,cápsula, flagelo, etc).
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Morfologia da colônia
Imagens da página
microbelibrary.org
é ó
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Microscopia
Microscopia de luz Microscopia eletrônica
De campo escuro
De contraste de fase
Fluorescência Confocal
Métodos Microscópicos
Métodos de coloração
Coloração simples;
Coloração diferencial (Gram,coloração álcool ácido resistente)
Coloração especial (coloração
negativa, para esporos, ou para
flagelos)
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Características Morfológicas
Morfologia microscópica
Tamanho e forma
◦ Rapidamente feita ao
microscópio (com ou semcoloração)
◦ Pode determinar se
amostra é de procariotos,
fungos ou protozoários
◦ Muitas vezes suficiente
para diagnóstico clínico
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Morfologia Microscópica
Agregados celulares◦ As células se aderem após a divisão
binária formando arranjos específicos
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Morfologia Microscópica
Coloração diferencial Coloração de Gram
◦ gram-positivas e gramnegativas
◦ Limita a identidade de ummicroorganismo
◦ Insuficiente para
identificaçãoisoladamente
◦ Ex. E. coli and Salmonella sãosemelhantes após a coloração
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Coloração de Gram
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Morfologia Microscópica
Corantes especiais◦ Nanquim para cápsula Ex. Cryptococcus neoformans
◦ Coloração ácido rápida – ácidos
graxos Ex. Mycobacterium
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Testes Bioquímicos
Crescimento em meios diferencias: na presençade um determinado substrato e testado para aprodução de um determinado produto
Fermentação de carboidratos, produção de ácidoou gás e hidrólise de gelatina, albumina ou amido
Em laboratórios de análises clínicas é comum ouso de ‘kits’ miniaturizados que podem detectar
múltiplas características
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Fermentação deCarboidratos
A fermentação é observadapela formação de ácido(mudança de cor do meio)
e produção de gás (bolha) Tubo de ensaio contendo
um tubo de Durham paracoletar as bolhas de gás
Amostras:1. Controle não inoculado
2. Amostra positiva paraácido e gás
3. Amostra positiva paracrescimento, mas semformação de gás ouácido.
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Testes Rápidos
ONPG (β galactosidase); ADH (arginine dihydrolase); LDC (lysine decarboxylase); ODC(ornithine decarboxylase); CIT (citrate utilization); H2S (hydrogen disulphide production);URE (urease); TDA ( tryptophan deaminase); IND (indole production); VP (Voges Proskauertest for acetoin); GEL ( gelatin liquefaction); the fermentation of glucose (GLU), mannitol(MAN), inositol (INO), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), sucrose (SAC); Melibiose (MEL),amygdalin (AMY), and arabinose (ARA); and OXI (oxidase).
positive
negative
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Diagnóstico sem cultura?
Alguns patógenos◦ Não podem ser isolados
◦ Crescem muito devagar
◦ Isolamento pode ser demorado ouimpossível
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Testes Imunológicos
Interação de um antígeno microbiano comum anticorpo
Testar a presença de um antígeno pode sermais fácil do que testar a presença domicroorganismo
Existem kits de laboratório para a
identificação de diversos microorganismos.
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Sorologia
Proteínas e polisacarídeos podemfuncionar como identificadores
Cápsula, glicocálice, flagelo, pili◦ Reação antígeno-anticorpos Ex. Detecção rápida de Streptococcus pyogenes
S l i
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Combina-se um
antisoro conhecido
com um
microorganismos
desconhecido
Exemplos:
◦ Aglutinação em
lâmina
◦ ELISA
Uso: HIV, sífilis,
Chagas, sarampo,
hepatite
Sorologia
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Métodos Genotípicos
Análises do material génético demicroorganimos – revolucionou aidentificação e classificação demicroorganismos
Incluem:◦ Amplificação de material genético por PCR
(RT-PCR, RAPD-PCR),
◦ Técnicas de hibridação
◦ Digestão com enzimas de restrição (RFLP)
Em alguns casos é a única maneira deidentificar-se um microorganismo
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Sumário
O isolamento e identificação demicroorganismos requer o uso
sistemático de diversas técnicas
microbiológicas, bioquímicas egenéticas
Importância no estudo de
microorganismos ambientais, indústriafarmacêutica, e de alimentos e no
tratamento de doenças infecciosas.
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