QFL1201
Química Analítica Instrumental – Diurno
1º Semestre 2019
24 de maio
Luís Moreira GonçalvesBSc, MD, PhD
Introdução às Técnicas de Separação
0.5
1.0
1.5
Espectros de absorção de diferentes substâncias
460 nm
Detetor
Coluna
Sin
al
tempo
Михаил Семенович ЦветMikhail Semenovich Tswett
LS Ettre, M.S. Tswett and the Invention of Chromatography, LC-GC Eur Set (2003) 1-7
Asti, 1872
Geneve/Lausanne, 1872-1896
São Petersburgo/Kazan/Varsóvia/Tartu/Voronezh, 1896-1917
Tswett - significa cor
58 artigos, sem co-autores
MS Tswett, Trudy Varshavskogo Obshchestva Estestvoispytatelei Otdelenie Biologii, 14 (1905) 20–39
kroma [cor]
+
graphein [escrever]
1903
http://www.cromatografialiquida.com.br/claetswett.htm
Termos usados em cromatografiaFase estacionária – imobilizada em coluna ou superfície plana
Fase móvel – movimenta-se através da fase estacionária levando os analitos (gás, líquido ou fluído supercrítico)
Eluição – processo no qual os solutos são transportados através da fase estacionária pela fase móvel
Eluato – o que sai da coluna
Eluente – é o solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através da fase estacionária
Cromatograma – é o registro gráfico da função da concentração (sinal) pelo tempo ou volume de eluição
https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/chemical-processes/separations-purifications/a/principles-of-chromatography
Mecanismos de Separação
fase fasemóvel (líq./gas.) estacionária
Adsorção
Mecanismos de separação(físicos)
Cromatografia de adsorção
FE(sólida)
Analito(soluto)
fase fasemóvel estacionária
Partição (absorção)
Cromatografia de partição
Coluna capilar
Solutona fase líquida
ligada
Mecanismos de separação(físicos)
Absorção vs. Adsorção
+
+
fase fasemóvel estacionária
Troca iônica
+
+
-SO3- -N(CH3)3+
Cromatografia de troca iônica
-COO- -NH3+
Mecanismos de separação(químicos)
fase fasemóvel estacionária
Bioafinidade
Cromatografia de afinidade
Mecanismos de separação(químicos)
fase fasemóvel estacionária
Exclusão
Cromatografia de exclusão
Mecanismos de separação(mecânicos)
‘Ler’ um Cromatograma
Quais informações podemos tirar do cromatograma?
(tR)B
tempo
(tR)A
Sina
l
A B Cinjeção
(tR’)A
tM = tempo morto ou tempo de retenção da fase móveltR = tempo de retençãotR’ = tempo de retenção do analito na fase estacionária
tR
tM
Tempo/Volume
Sina
lTempo ou volume de retenção
VR’ = VR - VM
VR = x tR
tR’ = tR - tMtR’
VM = volume mortoVR = volume de retenção
= vazão da fase móvel (ml/min)VR’ = volume de retenção do analito na fase estacionária
tR
tM
Tempo
Sina
lFator de capacidade (k)
(Fator de Retenção)
k' = =tR-tM
tM
tR’tM
Usado para comparar as velocidades de migração dos solutos na coluna
k ideais de ~1 a 5 (k > 20 tempo de eluição é considerado longo)
(tR)B
tempo
(tR)A
Sina
l
A B Cinjeção
(tR’)B(tR’)A
=
Fator de separação ()(Fator de seletividade ou Retenção relativa)
Quanto maior maior a separação entre dois componentes.
γ(tR)B(tR)A
=
(tR)B
tempo
(tR)A
Sina
l
A B Cinjeção
KB
KA
kB
kA
(tR’)B(tR’)A
= ==
Usado para calcular o poder de resolução de uma coluna ( > 1)
Relação entre () (k) (K)
Rs = 0,50 Rs = 0,75
Rs = 1,00 Rs = 1,50
Resolução (Rs)
1,26%
1,00%
8,9%
Não é
normal!
Normal! > 20% Normal!
< 0,01%Não é
normal!
Resolução (Rs)
wb1 wb2
tR1
tR2
Rs =tR
Wb
Wb1 + Wb2
2=Wb
Medida da largura da banda
ponto deinflexão
Sina
l
Tempo ou volumeinjeçãot=0
Rs 0,59 tR
W1/2
=Rs tR
Wb
=
Mais teoria...
Teoria dos pratos
prato teórico
“estágio” de equilíbrio
A
A
K = [A]E/[A]M
[A]E
K =[A]M
[A]E
[A]M
isoterma de distribuição
cromatografia linear
Coeficiente de partição (K)(Constante de Distribuição)
Amóvel Aestacionária
K permanece invariável por um amplo intervalo de concentração, portanto [A]E é proporcional a [A]M
Número de pratos (teóricos), N
Coluna mais eficiente
tR
wb
N
H = NL
Maior tR implica maior tempo de análise
N = número de pratos teóricosL = comprimento da colunaH = altura de prato
Eficiência da Coluna Cromatográfica
σ2
LH = Pode ser expresso pela variância (σ2) da largura do sinal de pico
(geralmente uma gaussiana) por unidade de comprimento da coluna.
Pode ser expresso pelo tempo de retenção de uma dada substância ao passar pela coluna e a largura da base do pico. Relação entre H e N
LH
N = LL
= σ2
L2
= (W/4)2
CG H ~ 0,1-1 mmHPLC H ~ 10 m
Eletroforese CapilarEC H < 1 m
Ainda mais teoria...
Alargamento de bandacoluna
Causas do alargamento
⚫problemas na injeção⚫ coluna/fase móvel⚫detector
Alargamento de banda reflete a perda de eficiência da coluna.
Variáveis que afetam a eficiência da coluna
Velocidade linear da fase móvel: u = L(cm)/tM(s)
Coeficiente de difusão do soluto na fase móvel: DM (cm2/s)
Coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária: DE (cm2/s)
Fator de retenção: k’ = tR’/tM
Diâmetro das partículas (colunas recheadas): dp (cm)
Espessura da camada de líquido da fase estacionária (coluna capilar): df (cm)
H = A + B/u + Cu
caminhosmúltiplos difusão
longitudinaltempo deequilíbrio
Teoria do alargamento de bandaEquação de van Deemter
A = 2 l dPl = constante que depende do tipo de empacotamentodp = diâmetro da partícula
u = velocidade linear
H = A + B/u + Cu
caminhosmúltiplos difusão
longitudinal
tempo deequilíbrio
Equação de van Deemter
B = 2 g DM
g = constante T viscosidade e u B/u
B = é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel u = velocidade linear do eluente
Na difusão as espécies migram de uma região mais concentradapara mais diluída.
Velocidade de migração é proporcional a diferença de conc.entre as regiões e ao coeficiente de difusão das espécies.
Efeito significativo na CG e de menor importância na CL
Equação de van DeemterB/u = termo de difusão longitudinal
to
t1
Efeito da difusão longitudinal
H = A + B/u + Cu
caminhosmúltiplos difusão
longitudinaltempo deequilíbrio
Equação de van Deemtertermo de
transferênciade massa
fase móvel
faseestacionária
eluição
H = A + B/u + Cu
caminhosmúltiplos difusão
longitudinaltempo deequilíbrio
Equação de van Deemtertermo de
transferênciade massa
Fase estacionária
interface
Fase móvel
Perfil de concentraçãono equilíbrio
Perfil de concentraçãoreal
H
u (ml/min)
Equação de van DeemterH = A + B/u + Cu
A + B/u + Cu
cromatografiagasosa
cromatografialíquida
Equação de van Deemter
Bandas assimétricas
sobrecarga
formaçãode cauda
Resolução em função das condições(equação de Purnell)
N ( α – 1 ) k’BRs =
4 α 1 + k’B
eficiência separação retenção
aumenta α
aumenta N
t0
inicialA B
Resumo dos parâmetros cromatográficos
Relação entreResolução, N, k’ e
www.iq.usp.br/lmgoncalves
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