Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.00_OUT.2016
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Instruções de Uso
XGEN MULTI SEPSE CHIP HS24
Kit MULTIPLEX para detecção de patógenos causadores de SEPSE e genes de
resistência através de PCR e hibridização reversa
1. USO PRETENDIDO
O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é um teste qualitativo in vitro que detecta
simultaneamente a presença de ácido nucleico bacteriano e fúngico, além dos
principais genes de resistência a antibióticos em amostras de hemoculturas
positivas e swabs retais, sem a necessidade da extração de DNA. Atua como
auxílio para a avaliação de infecções de mais de 36 espécies que levam a
quadros de SEPSE como: Staphylococcus Coagulase Negativa, Staphylococcus
aureus, Streptococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
agalactiae, Listeria monocytogenes, Enterococcus spp., Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Neisseria meningitidis,
Stenotrophomonas maltophilia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia
marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e Proteus spp, Candida albicans,
Candida spp., e 20 marcadores de genes de resistência a antibióticos: meticilina
(mecA), dois genes para resistência à vancomicina (vanA e vanB), dois para a
resistência aos antibióticos β-lactamase (blaSHV, blaCTX-M) e quinze genes
para a resistência ao carbapenemase (kpc, sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm,
ndm, sim, imp, oxa23, oxa24, oxa48, oxa51 e oxa58).
Patógenos Alvo
Staphylococcus Coagulase-Negativa Streptococcus spp.
Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes
16S rDNA
Enterococcus spp. Acinetobacter baumannii
Neisseria meningitidis Stenotrophomonas maltophilia
Escherichia coli Serratia marcescens Enterobacteriaceae
Proteus spp.
Staphylococcus aureus nuc
Streptococcus pneumoniae cpsA
Pseudomonas aeruginosa ecfX
Klebsiella pneumoniae khe
Candida spp. Candida albicans
18S-5.8S ITS rDNA
O kit foi otimizado para uso nos aparelhos HybriSpot 12 (HS12) e HybriSpot
24 (HS24) Vitro Group®.
PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO.
ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o
HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12,
verificar a Instrução de Uso “KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12”.
2. INTRODUÇÃO
A SEPSE é uma disfunção orgânica potencialmente fatal causada por
uma resposta imune desregulada a uma infecção. Normalmente causada por
bactérias, fungos, vírus ou protozoários. Pode estar relacionada a qualquer foco
infeccioso, como pneumonia, infecção intra-abdominal e urinária.
Importante causa de morbidade e mortalidade, principalmente em hospitais
e Unidades de Terapia Intensiva (UTI), pacientes pediátricos e particularmente
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em pacientes debilitados. Além do aumento de incidência de infecções
nosocomiais, a proporção de patógenos multirresistentes também vem
crescendo. As taxas de resistência antimicrobiana entre patógenos estão
aumentando principalmente entre organismos gram-negativos (Pseudomonas
aeruginosa, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae).
Devido à alta morbimortalidade da SEPSE, é imprescindível sua rápida
identificação. Suas manifestações podem ser confundidas com as de outros
processos não infecciosos ou podem, em muitos casos, passar despercebidas.
Estudos mostram que a rápida identificação da SEPSE associada à terapêutica
adequada, pode trazer resultados favoráveis para o paciente. Para identificação
da SEPSE, deve-se levar em conta um fator de extrema importância: o tempo. O
uso de antimicrobianos específicos na primeira hora, logo após o diagnóstico,
contribui para a sobrevivência do paciente.
3. PRINCÍPIO DO TESTE
O princípio do ensaio é baseado em uma metodologia que envolve
simultaneamente a amplificação multiplex de diferentes bactérias, fungos e
marcadores de genes de resistência a antibióticos por Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) seguido de hibridização reversa (Dot Blot) com sondas
específicas imobilizadas em um chip composto por membrana de nylon
(tecnologia Flow Chip). O processo de hibridização permite a ligação dos
produtos de PCR biotinilados às sondas complementares presentes no chip e o
sinal de hibridização é desenvolvido por uma reação colorimétrica
imunoenzimática (estreptavidina-fosfatase alcalina e cromógeno NBT-BCIP).
A reação substrato-cromógeno gera um precipitado de coloração roxo
escuro na posição em que o fragmento amplificado hibridiza com a sonda
específica e este sinal é automaticamente capturado e analisado pelo software
do equipamento.
4. COMPONENTES PCR
O formato padrão do kit contém reagente e chip para 24 ou 48 testes.
COMPONENTES CONTEÚDO Volume
24 Testes Volume
48 Testes
Primers 1 SPS
Solução de Primers biotinilados para
detecção de Staphylococcus Coagulase Negativo,
Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes,
Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii, Neisseria meningitidis, Stenotrophomonas maltophilia,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, espécies de Enterobacteriaceae e
Proteus spp, Candida albicans, Candida spp, e os genes mecA,
vanA, vanB, blaSHV, blaCTX-M e Controle Interno (CI).
950 µL 2 x 950 µL
Primers 2 SPS
Solução de Primers biotinilados para
detecção de genes de resistência para carbapenemicos como kpc,
sme, nmc/imi, ges, vim, gim, spm, ndm, sim, imp, oxa23, oxa24,
oxa48, oxa51, oxa58 e Controle exógeno.
950 µL 2 x 950 µL
EZ SPS Enzima DNA Polimerase Hot Start 24 µL 2 x 24 µL
UDG SPS Enzima Uracila DNA Glicosilase 34 µL 2 x 34 µL
* Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem.
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5. COMPONENTES DE HIBRIDIZAÇÃO
COMPONENTES CONTEÚDO Volume
24 Testes Volume
48 Testes
Reagente A Solução de Hibridização 60 mL 115 mL
Reagente B Solução de Parada de Reação 10 mL 18 mL
Reagente C Estreptavidina-Fosfatase
Alcalina 10 mL 18 mL
Reagente D Tampão de lavagem I 35 mL 70 mL
Reagente E1 Substrato 14 mL 20 mL
Reagente E2 Cromógeno 14 mL 20 mL
Reagente E Frasco vazio para preparo do
Reagente E (E1 + E2) - -
Reagente F Tampão de Lavagem II 18 mL 35 mL
Chip SPS Chip SEPSE 24 unidades 2 x 24
unidades
6. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Reagentes de PCR: Os componentes do kit devem ser armazenados na
embalagem original. Armazenar a temperatura de -20°C. Decongelar os
componentes em gelo antes do uso. Os reagentes são estáveis até a data de
vencimento indicada no rótulo. Evitar o congelamento e o descongelamento
dos reagentes por mais de cinco vezes, pois pode reduzir a sensibilidade do
ensaio. Para evitar o congelamento e descongelamento repetidas vezes é
recomendado adicionar a cada Primers (1 e 2) a EZ e a UDG, e
subsequentemente aliquotar as misturas (36 µL/alíquota) em microtubos de
PCR 0,2 mL e armazenar a -20°C em período máximo 3 de meses.
Reagentes de Hibridização: Os componentes do kit devem ser armazenados
entre 2°C a 8°C. Não congelar. Os reagentes e o chip são estáveis até a data de
vencimento indicada no rótulo. A solução de desenvolvimento (Reagente E)
deve ser preparada somente antes do uso. A Solução de Hibridização (Reagente
A) deve ser levada a 51°C antes do uso e os outros reagentes devem ser
utilizados a temperatura ambiente (20°C a 25°C).
7. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS
Reagentes para purificação de DNA (se necessário);
Micropipetas calibradas (0,5 µL < volume < 1000 µL);
Microcentrífuga;
Banho Maria (51°C);
Equipamento para Hibridização HybriSpot 24 e software HybriSoft;
Racks para microtubos;
Rack termostável (4°C) para tubos/placas de PCR;
Ponteiras estéreis com e sem filtro;
Microtubos 1,5 - 2,0 mL livres de nucleases;
Strips/Microtubos/Microplacas de PCR HS24;
Luvas descartáveis sem talco;
Termociclador;
Agitador tipo vortex ou similar.
8. AVISOS E PRECAUÇÕES
1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e
devidamente treinado.
2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado na manipulação
de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de
amplificação de PCR.
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3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar
equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve
ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de
biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.
4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados
contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com
a Norma Regulamentadora 32.
5. O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar
contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar.
6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado.
7. Após o recebimento, armazenar o kit de PCR a -20°C, em um freezer ou
câmara fria com temperatura controlada e o kit de hibridização em geladeira de
2 a 8°C.
8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits.
Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não
sejam trocados.
9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis
pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para
iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit.
10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras
descartáveis e trocando-as após cada amostra.
11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando
ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma.
12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta
externa.
13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as
amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de
Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor.
14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e
utilizar sala dedicada para o manuseio.
15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os
componentes de PCR no gelo ou em reservatório refrigerado.
16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira
unidirecional, começando na área de extração (quando aplicável) e passando
para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras,
equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram
realizadas.
17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos
componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas
automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada.
18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados,
de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e
substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor.
19. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras)
devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de
acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais.
20. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das
amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com
hipoclorito, e em seguida, com água.
9. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES
O ensaio deve ser utilizado com amostras diluídas de hemocultura positiva e
swabs retais de origem humana. Recomenda-se que as amostras de
hemocultura fiquem armazenadas a -20°C por até uma semana.
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OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras
deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários
para a finalidade pretendida são atendidos.
10. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS
Reagentes de PCR
Soluções prontas para uso. Antes de utilizar, homogeneizar em agitador tipo
vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no
fundo do tubo.
A fim de evitar repetidos descongelamentos, recomenda-se aliquotar os
Primers 1 e 2 SPS com as enzimas EZ SPS e UDG SPS, de acordo com a tabela do
item 13. Fracionar em 36 µL/alíquota e armazenar por no máximo 3 meses.
Nota: O descongelamento de todos os componentes deve ser realizado no
gelo.
Reagentes A, B, C, D e F (Hibridização)
Reagentes prontos para uso.
Reagente E (Hibridização)
A solução é fornecida em dois reagentes (Reagente E1 e E2) que devem ser
misturados numa proporção de 1:1. Preparar a solução de acordo com a
quantidade de amostras que serão processadas, antes da sua utilização, no
frasco “E”. Após cada uso, limpar o frasco “E” com água destilada para evitar
acúmulo de precipitados em utilizações consecutivas.
Seguir a tabela de acordo com o item – Reação de Hibridização/
Hibridização – tópico 2.
Chip (Hibridização)
Os chips são de uso único e devem ser manuseados com luvas.
Nunca tocar a membrana do chip. Para o manuseio, tocar somente na
lateral do chip.
11. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O
KIT
1. Micropipetas
As micropipetas devem ser calibradas para distribuir o volume correto
necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações
das partes que podem acidentalmente entrarem em contato com a amostra.
Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de
mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%.
2. Termociclador
O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é direcionado para uso em combinação para
qualquer termociclador convencional.
3. HybriSpot 24
O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para uso nos aparelhos
HybriSpot 12 (HS12) e Hybrispot 24 (HS24) Vitro Group®.
ATENÇÃO: Esta Instrução de Uso é destinada para orientar o uso com o
HybriSpot 24. Para utilização do protocolo com o equipamento HybriSpot 12,
verificar a Instrução de Uso “KIT XGEN MULTI SEPSE CHIP HS12”.
12. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES
1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da
caixa.
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2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por
partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de
transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa.
3. Ligar os equipamentos (termociclador e HybriSpot) e verificar as
configurações. Ter cuidado para usar o protocolo de ensaio correto.
4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo
fabricante para a correta configuração dos termocicladores e HybriSpot.
5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume
necessário.
6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso.
7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao
supervisor.
13. PROTOCOLO PARA O EQUIPAMENTO HS24
PREPARO DA AMOSTRA
O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP foi otimizado para o uso com amostras
diretas de hemoculturas positivas e swabs retais.
Hemocultura
1. Diluir a hemocultura no formato 1:10 ou 1:100 em água estéril ou soro
fisiológico. A diluição irá depender da taxa de crescimento bacteriano
no sangue de cultura. Para amostras pediátricas é recomendada a
diluição da hemocultura em 1:200 a 1:500.
2. Caso a amostra de hemocultura não seja usada no momento, poderá
ser congelada em uma temperatura de -20°C por até 1 semana.
3. Utilizar 4 µL desta solução para a PCR.
Swab Retal
1. Cortar/quebrar a ponta do swab que contém a amostra coletada em
um microtubo de 1,5 mL;
2. Adicionar 0,5 mL de água estéril ou soro fisiológico;
3. Agitar por alguns segundos em vortex;
4. Realizar diluição da suspenção em 1:10 com água estéril ou soro
fisiológico para reduzir a quantidade de possíveis inibidores;
5. Utilizar 4 µL desta solução para a PCR.
Nota: Caso seja identificada a presença de inibidores, recomendamos
a purificação da suspenção inicial pelo método de extração.
A extração de swab retal foi validada para as seguintes marcas:
NucliSENS®easyMag® (bioMérieux S.A.);
MagNa Pure (Roche);
Chelex® (Bio-rad).
OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com amostras de swab
em outros kits de extração, deverá ser realizada a validação para confirmar
que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos.
REAÇÃO MULTIPLEX PCR
O preparo das Mix de PCR podem ser realizadas uma única vez ao abrir
o kit ou em cada uso do produto.
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.00_OUT.2016
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Para preparo da Mix no primeiro uso:
1. Descongelar no gelo os reagentes para a reação: Primers 1 SPS,
Primers 2 SPS, EZ SPS e UDG SPS;
2. Aliquotar os Primers 1 SPS com EZ SPS e a UDG SPS (Mix 1), de acordo
com a tabela abaixo. Realizar o mesmo procedimento para a Mix 2
(Primers 2 SPS + EZ SPS + UDG SPS).
Componente Preparo da Mix 1 Preparo da Mix 2
Primers 1 SPS 950 µl -
Primers 2 SPS - 950 µl
EZ SPS 10,8 µl 10,8 µl
UDG SPS 16,2 µl 16,2 µl
3. Homogeneizar por inversão e centrifugar brevemente;
4. Fracionar as misturas em 36 µL/alíquota em 24 microtubos para PCR
de 0,2 mL e congelar a -20°C.
AVISO: O protocolo descrito neste manual é indicado para utilização em
conjunto com o equipamento HybriSpot 24 da VitroGroup®, por isso,
recomenda-se utilizar Microplacas de PCR com código de barras, Microtubos de
PCR em Strip, tampa para Microtubo em Strip e filme adesivo para Strip (Ref.
MAD-003900P-HS24) do próprio fabricante do equipamento.
Utilização de Mix aliquotada
1. Descongelar uma alíquota do preparo da Mix 1 e outra de Mix 2 por
amostra que for ser testada;
2. Adicionar 4 µL do preparo da amostra em cada microtubo 0,2 mL;
3. Prosseguir com o protocolo de PCR.
Para preparo da Mix no momento do uso
1. Caso os dois Mix sejam preparadas para uso imediato, realizar o
preparo de acordo com a tabela abaixo:
Componente Preparo de Mix 1
(Volume por
amostra)
Preparo de Mix 2
(Volume por
amostra)
Primers 1 SPS 35 µl -
Primers 2 SPS - 35 µl
EZ SPS 0,4 µl 0,4 µl
UDG SPS 0,6 µl 0,6 µl
Amostra 4 µl 4 µl
IMPORTANTE: Todo o processo deve ser realizado em gelo ou rack
termostável para evitar a degradação das Enzimas.
2. Distribuir 36 µL do Mix 1 e do Mix 2 em microplaca PCR ou
strips/microtubos de PCR 0,2 mL por amostra testada;
3. Adicionar 4 µL de preparo da amostra em cada Mix;
4. Colocar todos os microtubos/microplaca de PCR em um termociclador
para a reação de amplificação. O termociclador deve ser programado
conforme abaixo:
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.00_OUT.2016
8
1 ciclo 25°C 10 min.
1 ciclo 94°C 5 min.
40 ciclos
94°C 30 s
55°C 45 s
72°C 1 min.
1 ciclo 72°C 7 min.
8°C ∞
Nota: manter os produtos de PCR entre 8 a 10°C assim que a reação
estiver finalizada. As amostras poderão ser hibridizadas
imediatamente ou armazenadas em um freezer de Pós-PCR entre 8°C e
10°C por 1 ou 2 dias. Caso haja necessidade de manter o produto de
PCR por intervalo de tempo maior, armazenar em temperatura de -
20°C.
REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO
Nota: todo processo de hibridização, captura de imagens e relatório dos resultados ocorrerá no equipamento HS24 e software HybriSpot.
1. Desnaturar o produto de PCR em termocicador a 95°C por 10 minutos;
2. Preparar o Reagente “E” misturando os Reagentes E1 e E2 de acordo
com a tabela abaixo:
Vol (µL)/1 teste
Vol (µL)/4 testes
Vol (µL)/8 testes
Vol (µL)/12 testes
Vol (µL)/16 testes
Vol (µL)/20 testes
Vol (µL)/24 testes
E1 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000
E2 1.200 1.800 2.300 3.000 3.800 4.200 5.000
3. Posicionar os chips no HS24.
Nota: utilizar um chip por amostra e posicioná-los de maneira que a primeira fileira inicialmente seja preenchida; só após estar completa, preencher a segunda fileira e posteriormente a terceira; dessa forma, otimiza-se a utilização dos canais de vácuo.
4. Após a desnaturação no termociclador, deixar as amostras no gelo/rack termostável ou no termociclador a 4°C por, pelo menos, 2 minutos;
5. Programar o equipamento seguindo as instruções incluídas no manual do usuário fornecido com o equipamento.
Controles
O chip do Kit XGEN MULTI SEPSE CHIP possui diversos controles para
monitorar os resultados e todas as sondas são duplicadas para garantir a
confiabilidade nos resultados. O controle de hibridização (B) possui cinco
repetições em ordem que permite a orientação adequada para interpretação
do software.
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.00_OUT.2016
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14.INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
14.1. Identificação dos Alvos no Chip
Sonda Controle Sinal Positivo
5 x B Controle de
Hibridização
Indica que o processo de hibridização
funcionou corretamente.
2 x CI
Controle de
Amplificação Exógeno
Indica que a reação de PCR funcionou
corretamente.
Caso um dos sinais de CI seja negativo,
pode indicar a presença de inibidores
de PCR. Neste caso, verificar a
qualidade do processo e das amostras
utilizadas.
2 x BG
Controle de
Amplificação Interno
(β-globina)
Indica que a amplificação funcionou
corretamente e a amostra clínica
contém DNA humano.
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B
C
D
E
F
G
H
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10
.
Patógeno/Gene de
Resistência
Sonda Posição no Chip
Streptococcus pneumoniae SPNEU 1F-6J
Stenotrophomonas maltophilia SMALTO 1H – 6D
Candida spp. CAND 1I – 6E
Acinetobacter baumannii ABAU 2B – 7F
Serratia marcescens SMAR/KLEB 2C – 7 G
Klebsiella pneumoniae SMAR/KLEB 2C – 7G -3D – 8I
Klebsiella pneumoniae KLEB 3D – 8I
Streptococcus agalactiae SAGAL 2D – 7H
Staphilococcus Coagulase
Negativo STAPHYL 2E – 7I
Staphylococcus aureus SA 2F – 7J
Escherichia coli* ECOLI 2G-7A
Enterobacteria ENTEROB 2H – 7B
Candida albicans CALB 2J – 7D
Listeria monocytogenes LIS 3A-8F
Enterococcus ENTEROC 3B-8G
Pseudomonas aeruginosa PAER 3C-8H
Streptococcus spp. STREP 3E- 8J
Neisseria meningitidis NEIS 3F-8K
Proteus spp. PROT/MOR 3G-8E
Morganella morganii PROT/MOR 3G-8E-2H-7B
Meticilina resistente - Gene mecA mecA 3I-8C
Vancomicina resistente – Gene
vanA vanA 3J-8B
Vancomicina resistente – Gene
vanB vanB 3K-8A
Carbapenemase Classe A KPC kpc 4A-9E
Carbapenemase Classe A SME sme 4B-9G
Carbapenemase Classe A NMC/IMI nmc/imi 4C-9H
Β-LACTAMASE SHV blaSHV 4E-9J
Β-LACTAMASE de Amplo espectro
CTX-M blaCTX 4F-9K
B CI BG
Posição no Chip 1A – 1B – 2K –
6F- 10A 1C- 6G 1D – 6H
Resultados
Negativos
1A – 1B – 2K –
6F- 10A 1C- 6G 1D – 6H
Resultados Não
Validos
(Inibidores de
PCR)
1A – 1B – 2K –
6F- 10A -- --
Resultados
Negativos
(Ausência de Controles do ensaio
DNA)
1A – 1B – 2K –
6F- 10A 1C- 6G --
Falha de
Hibridização -- -- --
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Carbapenemase Classe A GES ges 4G-9B
Carbapenemase Classe B VIM vim 4H-9C
Carbapenemase Classe B GIM gim 4I-9D
Carbapenemase Classe B SPM spm 5A-9E
Carbapenemase Classe B NDM ndm 5B-10G
Carbapenemase Classe B SIM sim 5C-10H
Carbapenemase Classe B IMP3 imp 5D-10I
Carbapenemase Classe D OXA23 oxa23 5G-10B
Carbapenemase Classe D OXA24 oxa24 5H-10C
Carbapenemase Classe D OXA48 oxa48 5I-10D
Carbapenemase Classe D OXA51 oxa51 5J-10E
Carbapenemase Classe D OXA58 oxa58 5K-10F
Nota: O Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP não é capaz de distinguir Escherichia coli de
Shigella spp. Quando o paciente estiver sob suspeita clínica de sepse e o
resultado for positivo para Escherichia coli, a possível infecção por Shigella spp
deve ser considerada.
14.2 Análise dos Resultados
1. Quando uma amostra é positiva para S.pneumoniae, duas sondas
diferentes podem ser positivas, SPNEU: específica para S.pneumoniae e
STREP: genérica para o gênero Streptococcus. Porém, não se pode
descartar a possibilidade de co-infecção com Streptococcus spp. de
diferentes espécies.
2. Quando uma amostra é positiva para S.agalactiae, duas sondas podem
ser positivas, SGAL: específica para S.agalactiae e STREP: genérica para
o gênero Streptococcus. Porém, não se pode descartar a possibilidade
de co-infecção com Streptococcus spp. de diferentes espécies.
3. Quando uma amostra é positiva para S.aureus, duas sondas diferentes
podem ser detectadas na membrana SA: específica para S.aureus e
STHAPHYL: genérica para o gênero Staphylococcus. Porém, não se pode
descartar a possibilidade de co-infecção com o Staphylococcus
Coagulase Negativo.
4. Quando uma amostra for positiva apenas para a sonda STAPHYL,
somente mecA, ou para as duas sondas a interpretação deve ser
Staphylococcus Coagulase Negativo.
5. O gene de resistência Oxa51 tem sido detectado até agora no
A.baumannii, E.coli e P.aeruginosa. O Acinetobacter baumannii contém
o gene de resistência Oxa51 cromossomicamente, enquanto na E.coli e
P.aeruginosa está presente como DNA plasmidial. Quando uma
amostra é positiva para A.baumannii, duas sondas devem ser positivas
no Chip, ABAU e Oxa51. No entanto, algumas mutações na região 16S
do A.baumannii foram descritas, que correspondem à região onde a
sonda ABAU está localizada. Portanto, se for observado apenas o sinal
positivo para Oxa51, sem qualquer sinal de sondas específicas para
A.baumannii, E.coli ou P.aeruginosa pode corresponder a uma mutação
da região 16S da A.acinetobacter. Neste caso é recomendado identificar
o patógeno por um método secundário.
6. Quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens
ou Morganella morganii duas sondas diferentes serão positivadas no
Chip:
a) A sonda específica para cada bactéria (KLEB, ECOLI, SMAR/KLEB,
PROT/MOR);
b) Sonda genérica pra Enterobacteriaceae (ENTEROB);
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017
12
Uma vez que a sonda Enterobacteriaceae foi validada para detectar
outras Enterobactérias como Citrobacter, Salmonella, K.oxytoca e
Enterobacter, uma possível co-infecção com diferentes Enterobactérias
diferentes de K.pneumoniae, E.coli, S.marcescens ou Morganella
morganii não pode ser excluído.
7. A sonda PROT/MOR pode detectar Proteus mirabilis e Morganella
morganii. Em uma amostra com infecção única com qualquer um
destes dois patógenos, a distinção pode ser feita porque a Morganella
morganii também é detectada pela sonda ENTEROB, enquanto a
Proteus mirabillis não é. No entanto, não há como distinguir Morganella
morganii de amostras que apresentam co-infecção com Proteus e outra
Enterobactéria.
8. A sonda SMAR/KLEB pode detectar K.pneumoniae e S.marcescens. Em
uma amostra com infecção única com qualquer um destes dois
patógenos, a distinção pode ser realizada porque o K.pneumoniae
também terá sinal positivado para a sonda específica KLEB, enquanto a
S.marcescens terá sinal positivado apenas para a sonda SMAR/KLEB. No
entanto, não se pode distinguir K.pneumoniae a partir de uma amostra
que apresenta uma co-infecção com K.pneumoniae e S.marcescens.
9. SHV-1 é uma β-lactamase de baixo espectro encontrado com maior
frequência (até 80 a 90%) em Klebsiella pneumoniae. Por esta razão,
quando a amostra for positiva para K.pneumoniae, normalmente o
gene SHV também será detectado. Neste caso a presença do gene não
corresponde necessariamente a uma evidência fenotípica de produção
de β-lactamase.
10. Devido à elevada sensibilidade do método, um sinal fraco das sondas
para Enterobactéria e P.aeruginosa pode ser observada devido aos
vestígios de DNA microbiano da Taq DNA Polimerase. Outros sinais
fracos das sondas para Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. podem
aparecer devido a contaminações durante a manipulação da amostra.
Bacteremias normalmente são ocasionadas por um único patógeno. As
vezes é possível detectar dois ou três microrganismos em culturas de sangue,
nestes casos um destes organismos deve ser considerado como o agente
causador da infecção e os outros microrganismos devem ser associados com
possíveis contaminações durante a manipulação da amostra.
14. SENSIBILIDADE ANALÍTICA
O limite de detecção para cada patógeno foi calculado. A sensibilidade
analítica foi realizada utilizando diluições em série de DNA genômico de cada
cepa para os patógenos incluídos no painel contendo 10 ng de DNA genômico
humano. Cada amostra foi repetida entre 5 e 14 vezes para calcular a
sensibilidade, especificidade e intervalo de confiança. Todos os produtos de
PCR foram hibridizados com a plataforma hybriSpot. Os resultados foram
analisados com o software hybriSoft e um cut-off de 4 (intensidade cinza) foi
estabelecido para a positividade.
Patógeno Sonda GE/
reação
Positivo/
Testados
Sensibilida
de
Intervalo
de
Confiança
95%
Especif
icidade
Intervalo
de
Confiança
95%
S.
epidermidis
mecA 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,1%-
99,9%
mecA 100 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,1%-
99,9%
STAPHYL 10 10/14 71% 45,4%-
88,3%
100% 98,7%-
100%
STAPHYL 100 14/14 100% 78,5%- 100% 98,7%-
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017
13
100% 100%
S. aureus
SA 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,8%-
100%
SA 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,8%-
100%
STAPHYL 10 2/14 14% 4%-39,9% 100% 98,7%-
100%
STAPHYL 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,7%-
100%
S.
pneumoniae
SPNE 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,8%-
100%
SPNE 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,8%-
100%
STREP 10 13/14 93% 68,5%-
98,7%
96%* 93,1%-
97,7%
STREP 100 6/6 100% 61%-
100%
96%* 93,1%-
97,7%
S. agalactiae
SAGAL 50 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,8%-
100%
SAGAL 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,8%-
100%
L.
monocytoge
nes
LIS 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,6%-
100%
LIS 100 6/6 100% 61%- 100% 98,6%-
100% 100%
E. faecalis ENTEROC 10 2/14 14% 4%-39,9% 100% 98,6%-
100%
ENTEROC 100 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,6%-
100%
E. faecium
ENTEROC 50 4/6 67% 30%-
90,4%
100% 98,6%-
100%
ENTEROC 100 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,6%-
100%
P.
aeruginosa
PAER 10 14/14 100% 78,5%-
100%
97%** 94,3%-
98,3%
PAER 100 6/6 100% 61%-
100%
97%** 94,3%-
98,3%
A. baumannii ABAU 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,9%-
100%
ABAU 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,9%-
100%
N.
meningitidis
NEIS 100 8/10 80% 49%-
94,3%
100% 98,8%-
100%
NEIS 500 10/10 100% 74,2%-
100%
100% 98,8%-
100%
S.
maltophilia
SMALTO 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,8%-
100%
SMALTO 100 5/5 100% 56,5%- 100% 98,8%-
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017
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100% 100%
E. coli ECOLI 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,6%-
100%
ECOLI 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,6%-
100%
K.
pneumoniae
KLEB 10 12/14 86% 60,1%-
96%
100% 98,6%-
100%
KLEB 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,6%-
100%
S.
marcescens
SMAR/KL
EB
10 8/8 100% 67,6%-
100%
100% 98,8%-
100%
SMAR/KL
EB
100 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,8%-
100%
E. cloacae ENTEROB 10 14/14 100% 78,5%-
100%
97%** 94,3%-
98,5%
ENTEROB 100 6/6 100% 61%-
100%
97%** 94,3%-
98,5%
P. mirabilis PROT/M
OR
10 17/17 100% 81,6%-
100%
100% 98,8%-
100%
PROT/M
OR
100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,8%-
100%
C. albicans CALB 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,9%-
100%
CALB 100 6/6 100% 61%- 100% 98,9%-
100% 100%
CAND 10 14/14 100% 78,5%-
100%
100% 98,9%-
100%
CAND 100 6/6 100% 61%-
100%
100% 98,9%-
100%
* Os 96% de especificidade da sonda STREP podem ser devidos a
contaminação por vestígios de DNA de Streptococcus spp. durante a
manipulação de amostras de sangue ou reagentes e plásticos.
** Os 97% de especificidade para as sondas PAER e ENTEROB decorrem da
presença de DNA microbiano contaminante em preparações comerciais de
DNA-polimeresas termostáticas. Em geral, pensa-se que algum passo (s) na
purificação, ou reagente adicionado à enzima, são as fontes dessa
contaminação bacteriana. Os alinhamentos de sequências de DNA de três
polimerases Taq mostram DNA bacteriano contaminante: espécies de
Pseudomonas, Serratia marcescens e outras "fitobactérias", Escherichia coli,
Salmonella e Shigella.
15. SOLUÇÕES DE PROBLEMAS
PROBLEMA CAUSA SOLUÇÃO
Ausência de Sinal no
Controle de
Hibridização
1-Falha no protocolo de
hibridização;
2-Reagentes fora do
prazo de validade ou
que não foram
devidamente
armazenados;
3- Sondas no Chip,
destruídas por restos
1-Verificar se todos os
reagentes foram
adicionados
corretamente durante o
processo de
hibridização.
Verificar a performance
do equipamento
HybriSpot 24 e repetir o
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017
15
de reagentes
contaminantes nos
poços.
ensaio.
2-Verificar a data de
validade e condições de
armazenamento dos
reagentes e do Chip, e
repetir o ensaio.
3-Caso a
descontaminação da
área de trabalho tenha
sido realizada com água
sanitária, o DNA pode
ter sido degradado.
Limpar a bancada com
água destilada e repetir
o ensaio.
Detecção de Sinal em
Controles Negativos Contaminação na fase
de pré-PCR ou pós-PCR.
Limpar as áreas de
trabalho e repetir o
ensaio.
Ausência de Sinal do
Controle Interno
1-Problemas na
amplificação de PCR;
2-Presença de
inibidores de PCR na
amostra.
1-Verificar se o
termociclador está
programado
corretamente. Verificar
se a reação de PCR foi
preparada
corretamente e repetir
o ensaio;
Ausência de sinal do
Controle Endógeno
1-Quantidade
insuficiente de DNA na
1-Repetir o ensaio
utilizado uma
amostra clínica;
2-Presença de
inibidores de PCR na
amostra.
quantidade maior de
amostra ou diminuindo
a diluição inicial. No
entanto, não utilizar
diluições menores que
1:10 para culturas de
sangue.
Presença de
precipitados
cromogênicos no Chip
após o protocolo de
hibridização
1- O Reagente E (E1 +
E2) não ter sido
preparado próximo de
sua utilização;
2-O frasco do reagente
E pode conter resíduos
de protocolos
anteriores.
1-Preparar o Reagente
E pouco antes de seu
uso e repetir o ensaio.
2-Limpar o frasco do
Reagente E após cada
uso com água destilada
para evitar o acúmulo
de reagente. Repetir o
ensaio.
Sinal fraco de
Hibridização
1-Reagentes de PCR
e/ou Hibridização fora
do prazo de validade ou
que não foram
devidamente
armazenados. Repetir o
ensaio;
2-O produto de PCR
não foi devidamente
desnaturado antes da
hibridização;
3-Baixa concentração
ou qualidade do DNA
1- Verificar se todos os
reagentes foram
adicionados
corretamente durante o
processo de
hibridização e repetir o
ensaio;
2-Verificar o processo
de hibridização e a
performance do
equipamento HybriSoft
12. Repetir o ensaio;
3-Aumentar a
Instrução de Uso_XG-MULTI-SEPSE_HS24_Rv.01_JUL.2017
16
da amostra. quantidade de amostra
ou DNA para a PCR.
16. GARANTIA DA QUALIDADE
A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela
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GARANTIA
O produto Kit MULTIPLEX SEPSE CHIP é garantido pela Mobius contra
defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações
em contrário a constar da proposta.
A garantia abrange defeitos de produção.
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Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia,
conservação ou armazenagem inadequada.
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Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação.
17. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
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18. REGISTRO ANVISA
80502070052
19. RESPONSÁVEL TÉCNICA
Flávia Rosenstein Schiel
CRBio-07 34.360/07-D
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