Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1:
Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243
Professor: Rodrigo Almeida
Objectivos
2 DQB-Licenciatura em Bioquímica
•Introdução à espectroscopia vibracional no infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR):
•Aplicação à análise estrutural de proteínas.
•Introdução às medidas fluorimétricas:
•Espectros de excitação e emissão;
•Introdução à fluorescência de proteínas:
•O triptofano como composto modelo;
•Aplicação ao estudo da estrutura e dinâmica de proteínas em
solução;
FTIR (I)
3 DQB-Licenciatura em Bioquímica
• É um tipo de espectroscopia de absorção a qual usa a região
do infravermelho do espectro electromagnético da radiação emitida
pelas substâncias;
• Baseia-se no facto das ligações químicas dos compostos possuírem
frequências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis
de energia da molécula (níveis vibracionais).
• As frequências de vibração dependem:
• da geometria molecular;
• das massas dos átomos.
FTIR (II)
4 DQB-Licenciatura em Bioquímica
• As ligações podem vibrar de seis modos:
• Se a molécula receber radiação eletromagnética com a mesma energia
de uma dessas vibrações, então a luz será absorvida.
Estiramento
Simétrico
Estiramento
Assimétrico
Tesoura Torção
Balanço Rotação
Procedimento (FTIR)
5 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Pastilha com
mioglobina em KBr
Pastilha com
γ-globulina em KBr
Pastilha com KBr Branco
Espectros de FTIR – Análise
conformacional
6 DQB-Licenciatura em Bioquímica
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
Determinação da
estrutura
secundária das
proteínas
Espectros de FTIR - Mioglobina
7 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Banda Amida II
1542,78 cm-1 – 84,9% T
Banda Amida I
1656,56 cm-1 – 82,12% T
Banda Amida A
3301,55 cm-1 – 87,46% T
3311,19 cm-1 – 87,53% T
CO2
(interferente)
Análise estrutural - Mioglobina
8 DQB-Licenciatura em Bioquímica
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary
Structures
Banda Amida I
1656,56 cm-1 – 82,12% T
Estrutura secundária
predominante: hélice α
Comparação com a literatura -
Mioglobina
9 DQB-Licenciatura em Bioquímica
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
Espectros de FTIR – γ-Globulina
10 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Banda Amida I
1643,06 cm-1 – 21,89% T Banda Amida III
1238,08 cm-1 – 54,81% T
Banda Amida A
3288,05 cm-1 – 26,03% T
Banda Amida B
3085,56 cm-1 – 39,12% T
Banda Amida II
1536,99 cm-1 – 27,16% T
Análise estrutural - γ-Globulina
11 DQB-Licenciatura em Bioquímica
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary
Structures
Banda Amida I
1643,06 cm-1 – 21,89% T
Estrutura secundária
predominante: folha β
Comparação com a literatura
- γ-Globulina
12 DQB-Licenciatura em Bioquímica
KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures
Espectroscopia de Fluorescência
13 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Espectroscopia de Fluorescência: tipo de espectroscopia electromagnética
que analisa a fluorescência de uma amostra.
Ocorre devido à presença de moléculas aromáticas.
Moléculas no
estado excitado
Moléculas no
estado fundamental
Emissão de fotão
Principal fluoróforo das proteínas: indole dos resíduos de Trp
Aparelhos: Espectrofluorímetros
Trp
Indole
Procedimento (Fluorescência)
14 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Triptofano em tampão
Triptofano em etanol
λ = 350 nm
λ = 295 nm
Triptofano - Emissão
15 DQB-Licenciatura em Bioquímica
0
10 000 000
20 000 000
30 000 000
40 000 000
50 000 000
310 330 350 370 390 410 430 450Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
310 330 350 370 390 410 430 450
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(no
rmalizad
o)
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
Triptofano - Excitação
16 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-3E+08
-2E+08
-1E+08
0
100000000
200000000
250 260 270 280 290 300 310 320
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Excitação do Triptofano em Tampão e em
Etanol
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
-3
-2
-1
0
1
250 260 270 280 290 300 310 320
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(no
rmalizad
o)
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
Pico de
Raman
Excitação VS Emissão do Triptofano
17 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-3
-2
-1
0
1
250 260 270 280 290 300 310 320
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(no
rmalizad
o)
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Excitação em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
310 330 350 370 390 410 430 450
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(no
rmalizad
o)
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Emissão em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
Procedimento (Fluorescência)
18 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Mioglobina comercial (nativa)
Mioglobina em hidrocloreto de
guanidina (desnaturada)
λ = 330 nm
λ = 295 nm
Mioglobina - Emissão
19 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-10000000
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
310 330 350 370 390 410 430 450
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Mio Desnaturada
Mio
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
310 330 350 370 390 410 430 450
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(No
rmalizad
a)
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
Mio Desnaturada
Mio
Mioglobina - Excitação
20 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-5 000 000
0
5 000 000
10 000 000
15 000 000
20 000 000
25 000 000
30 000 000
250 260 270 280 290 300 310 320
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Mio Desnaturada
Mio
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
250 260 270 280 290 300 310
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(No
rmalizad
a)
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
Mio Desnaturada
Mio
Excitação VS Emissão Mioglobina
21 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
250 260 270 280 290 300 310
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(No
rmalizad
a)
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Excitação da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
Mio Desnaturada
Mio
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
310 330 350 370 390 410 430 450Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(No
rmalizad
a)
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
Mio Desnaturada
Mio
Emissão Mioglobina VS Triptofano
22 DQB-Licenciatura em Bioquímica
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
310 330 350 370 390 410 430 450
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(No
rmalizad
a)
Comprimento de Onda (nm)
Espectro de Emissão da Mioglobina (nativa e desnaturada)
– Normalizado
Mio Desnaturada
Mio
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
250 260 270 280 290 300 310 320
Inte
nsi
dad
e d
e F
luo
resc
ên
cia
(no
rmalizad
o)
Comprimento de onda (nm)
Espectro de Emissão do Triptofano em Tampão e em Etanol
(Normalizado)
Trp. Em Tampão
Trp. Em Etanol
Procedimento (Intensidade de
Fluorescência em função do pH)
23 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Soluções de mioglobina
(pH 3 – 8)
Medição da intensidade de
fluorescência
λem = 330 nm
λext = 295 nm
Medição do pH
24 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
Proteína: Mb comercial
25 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
26 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
Trp
His
27 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
Trp
His
Gráfico fornecido pela PL 3, cuja solução de Mb comercial foi filtrada.
28 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
Trp
His
Irace G, Balestrieri C, Parlato G, Servillo L, Colonna G. Biochemistry. 1981; 792-799
29 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Intensidade de Fluorescência
em função do pH
Espectro de emissão da Mb de coração de cavalo a pH 7,2
(curva de baixo) e a pH 4,5 (curva de cima).
Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-19237
Conclusão
30 DQB-Licenciatura em Bioquímica
Fluorescência
espectros de excitação e de emissão das amostras
intensidade de fluorescência da amostra
FTIR
espectro infravermelho da amostra
estrutura secundária da proteína
Espectroscopia de Fluorescência vs FTIR
Referências
31 DQB-Licenciatura em Bioquímica
• Atkins PW, de Paula J. “Physical Chemistry for the Life Sciences”. 2006.
Freeman/Oxford;
• Jilie KONG et al.” Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis
of Protein Secondary Structures”. Institute of Biochemistry and Cell Biology,
SIBS, CAS. China, 2007;
• Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-
19237;
• Warren Gallagher. “FTIR Analysis of Protein Structure”;
• Lakowicz JR. “Principles of Fluorescence Spectroscopy.” 2006. 3rd edition.
Springer, NY.
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