UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE EGF, INIBIDORES E
REGULADORES DO CICLO CELULAR EM LESÕES
PROLIFERATIVAS DA PRÓSTATA CANINA
Mariana Batista Rodrigues Faleiro
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura
GOIÂNIA
2014
ii
MARIANA BATISTA RODRIGUES FALEIRO
EXPRESSÃO DE RECEPTORES DE EGF, INIBIDORES E
REGULADORES DO CICLO CELULAR EM LESÕES
PROLIFERATIVAS DA PRÓSTATA CANINA
Tese apresentada junto ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal da Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Goiás
para obtenção do título de Doutorem Ciência
Animal.
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Linha de Pesquisa:
Patobiologia animal, experimental e comparada
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura-EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno (EVZ / UFG)
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo (EVZ / UFG)
GOIÂNIA
2014
iii
MARIANA BATISTA RODRIGUES FALEIRO
Tese defendida e aprovada em 14/11/2014 pela banca examinadora constituída pelos
professores:
iv
Dedico este trabalho:
A vocês que abriram mão de momentos de convívio, que sofreram com a ausência quando o
dever do estudo chamava;
A vocês que muitas vezes receberam-me com silenciosa mágoa ou muda revolta quer pela
ausência, quer por saudade ou impaciência;
A vocês que agora vêem com alívio este fim de etapa e que, por mais que não queiram
demonstrar, estão mais felizes do que eu;
Pois amaram suficientemente para aplaudir, chorar, tolerar e encorajar.
Essa vitória é nossa.
Marido, Pai, Mãe, Irmão, Sogra, Sogro, Cunhada, Cunhado...
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter dado meu anjo da guarda e meu mentor, que me auxiliaram dando
força maior que me impulsiona e guia, fazendo chegar até aqui e ainda a seguir em frente por
qualquer que seja o caminho.
Ao meu companheiro, meu ídolo, meu modelo, Neylon Teixeira Faleiro, que vem
me acompanhando nos último quatorze anos, sendo fonte inesgotável e incessante de
compreensão, atenção, amor e carinho. Sempre presente, paciente e disposto a ensinar.
Em especial agradeço a minha mãe, Eunice Batista da Silva Rodrigues,por seu
exemplo de luta, vida e superação. E ao meu Pai, Rivalino Rodrigues, que mesmo longe se faz
presente em minhas orações.
Ao meu irmão, Bruno Batista Rodrigues, por ser amigo companheiro, braço
direito, mesmo sendo tão perfeccionista e certinho.
As minhas meninas Teka, Kika e Mila e o menino Tupi, por serem minha fonte
inspiradora e carregadores de energias. Companheiros fiéis e presentes nos bons e maus
momentos.
Agradeço a minha orientadora, amiga, mãe verdadeira, Veridiana Maria Brianezi
Dignani de Moura, por ter tido fé em mim, apoiado e confiado nas minhas loucuras pela
biologia molecular.
Ao Dr. Rafael Malagoli, Carlos Ferreira Nascimento, Suely Nonogaki e demais
funcionários do hospital do câncer A.C. Camargo, São Paulo, pela ajuda e acolhida.
Àprofessora Rosália Santos Amorim Jesuíno,por ter me acolhido não só no seu
laboratório, mas também em sua vida. Quando tudo parecia escuro, sem luz, eis que surge
com a lanterna ao fim do túnel e fez tangível grande parte deste projeto tornandosonho em
realidade.
Aos novos amigos,Lorena Cintra Cardoso, Saulo Siqueirae Marcelo Ramada, por
terem aberto as portas do conhecimento e passeado comigo pelo mundo da PCR e do gel de
agarose.
Aos professores, funcionários e alunos do laboratório de Biotecnologia de
Fungos,laboratório de Enzimologia e laboratório de Engenharia Genética doInstituto de
Ciências Biológicas II da Universidade Federal de Goiás, pelo carisma e excelente recepção a
mim conferidos.
vi
Ao comitê de orientação, composto pelos professores doutores Adilson Donizeti
Damasceno e Eugênio Gonçalves de Araújo, pela co-orientação e auxílio na formação
profissional.
Aos professores do Setor de Patologia Animal da EVZ/UFG, doutores Ana Paula
Iglesias Santin, Eugênio Gonçalves de Araújo, Luiz Augusto Batista Brito, Moema Pacheco
Chediak Matos e Regiani Nascimento Gagno Pôrto, que quando deveriam ser simplesmente
professores foram mestres, quando deveriam ser simplesmente mestres foram amigos e em
sua amizade me compreenderam e incentivaram a seguir o caminho. Meu maior
agradecimento e o meu profundo respeito que sempre serão poucos diante do muito que me
foi oferecido.
As amigas irmãs Caroline Rocha de Oliveira Lima, Léa Resende Moura e Denise
Caroline Toledo, pela amizade e auxílio durante o curso.
Aos alunos, amigos, irmãos companheiros de toda hora do Setor de Patologia
Animal da EVZ/UFG, Aline Maria Vasconcelos Lima, Danilo Rezende e Silva e Paula Lima
Magalhães, pela grande colaboração e amizade.
ÀEscola de Veterinária e Zootecnia da UFG, que se tornou minha segunda casa
nesses últimos anos e me preparou profissionalmente, conferindo-me conhecimentos
necessários a tão sonhada pós-graduação.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG e ao seu corpo
docente, que mais do que ensinar um ofício ensinou-me uma filosofia de vida.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) e à
Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES)pela bolsa cedida,
permitindo que me dedicasseexclusivamente ao desenvolvimento deste trabalho.
Aos demais professores, funcionários e alunos da EVZ/UFG.
Meu especial agradecimento àqueles que tornaram tudo isso possível,os animais.
A todos aqueles que em algum momento fizeram parte da minha vida.
MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS.
vii
“Lentamente, os cromossomas adquirem a sua apresentação peculiar, em forma de
pontoalçabastonetebengala, e a evolução que lhes diz respeito na cariocinese, desde a
prófase à telófase, merece a melhor atenção dos Construtores Divinos, que através do centro
celular mantêm a junção das forças físicas e espirituais, ponto esse em que se verifica o
impulso mental, de natureza eletromagnética, pelo qual se opera o movimento dos
cromossomas, na direção do equador para os pólos da célula, cunhando as leis da
hereditariedade e da afinidade que se vão exercer, dispondo nos cromatídeos, em forma de
granulações perfeitamente identificáveis entre o leptptênio e o paquitênio, os genes ou fatores
da hereditariedade, que, no transcurso dos séculos, são fixados em número e valores
diferentes para cada espécie.”
André Luiz
(Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)
Evolução em dois mundos (1959)
viii
“A cada um é dadosegundo suas Obras!”
Mateus 16:27
ix
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS.................................................................................................. xiv
LISTA DE QUADROS ................................................................................................. xv
LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................... xvi
RESUMO ..................................................................................................................... xix
ABSTRACT .................................................................................................................. xx
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS ............................................................ 1
1.1. Morfofisiologia e enfermidades da próstata canina ................................................ 1
1.1.1. Hiperplasia prostática benigna (HPB) .................................................................. 2
1.1.2. Atrofia inflamatória proliferativa (PIA) .............................................................. 3
1.1.3. Neoplasia intraepitelial prostática (PIN) .............................................................. 7
1.1.4. Carcinoma prostático (PC) ................................................................................... 9
1.2. Carcinogênese ......................................................................................................... 12
1.3. Ciclo e crescimento celular .................................................................................... 13
1.4. Fatores de crescimento ........................................................................................... 16
1.5. Receptores de Fator de Crescimento Epidérmico - EGFR/Her1 e Her2/c-
erbB-2 ............................................................................................................................ 17
1.6. Inibidores de ciclina dependente de quinase - p21, p27 e p53 .............................. 22
1.7. Ciclina D1 (CD1) .................................................................................................... 27
1.8. Proteínas c-myc ...................................................................................................... 29
2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 30
3. Referências ................................................................................................................ 31
CAPÍTULO 2 – EGF receptors expression in canine prostate with proliferative
inflammatory atrophy and carcinoma ......................................................................... 43
ABSTRACT .................................................................................................................. 43
RESUMO ...................................................................................................................... 44
INTRODUCTION......................................................................................................... 45
MATERIAL AND METHODS .................................................................................... 46
RESULTS ...................................................................................................................... 50
DISCUSSION ................................................................................................................ 54
CONCLUSIONS ........................................................................................................... 55
REFERENCES ............................................................................................................. 55
x
CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with prostatic
inflammatory atrophy and carcinoma ......................................................................... 60
ABSTRACT .................................................................................................................. 60
RESUMO ...................................................................................................................... 61
INTRODUCTION......................................................................................................... 62
MATERIAL AND METHODS .................................................................................... 63
RESULTS ...................................................................................................................... 66
DISCUSSION ................................................................................................................ 71
CONCLUSIONS ........................................................................................................... 73
REFERENCES ............................................................................................................. 73
CAPÍTULO 4 – Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate
with proliferative lesions ............................................................................................... 79
ABSTRACT .................................................................................................................. 79
RESUMO ...................................................................................................................... 80
INTRODUCTION......................................................................................................... 81
MATERIAL AND METHODS .................................................................................... 82
RESULTS ...................................................................................................................... 83
DISCUSSION ................................................................................................................ 90
CONCLUSIONS ........................................................................................................... 92
REFERENCES ............................................................................................................. 92
CAPÍTULO 5 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 98
ANEXO A .....................................................................................................................100
APÊNDICE A................................................................................................................101
xi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Figura 1
A) Vista ventral da cavidade pélvica canina. 1) Bexiga urinária; 2) próstata;
3) reto; 4) uretra. B) Fotomicrografia da histomorfologia normal da próstata
canina. Glândula túbulo-alveolar ramificada (ácinos), recobertas por epitélio
colunar simples (seta preta). Lúmen glandular (asterisco), estroma de
sustentação fibromuscular (seta amarela) e célula basal (seta verde). HE,
200x...................................................................................................................
01
Figura 2
Fotomicrografia da próstata canina com HPB cística. Evidenciação de ácinos
acentuadamente dilatados (asterisco vermelho), irregulares e proliferação
estromal adjacente (asterisco preto). HE, 200x.................................................
03
Figura 3
Fotomicrografia de próstata canina com foco de atrofia inflamatória
proliferativa (PIA). A) PIA com infiltrado inflamatório mononuclear
intersticial (asterisco) e atipias epiteliais com mais de uma camada de células
epiteliais (seta), citoplasma marcadamente reduzido, núcleos aumentados e
nucléolos evidentes (PIA-moderada), HE, 400x; B) Atrofia acinar, dupla
camada de células epiteliais (seta) e infiltrado inflamatório mononuclear
intersticial (asterisco) (PIA-acentuada), HE, 200x............................................
06
Figura 4
Fotomicrografia de próstata canina com foco de PIN. Epitélio acinar
estratificado e displásico, com variação do tamanho nuclear, nucléolo
evidente e perda de diferenciação citoplasmática (seta). HE, 400x...................
09
Figura 5 Fotomicrografia de carcinoma prostático canino. Áreas de proliferação celular
com atipias e perda da conformação acinar. HE, 400x.......................................
11
Figura 6 Representação esquemática das fases da carcinogênese. Iniciação, promoção,
progressão e manifestação...................................................................................
13
Figura 7
Ciclo celular. A) Representação gráfica esquemática do ciclo celular com as
fases G0, G1, S, G2 e M, e os pontos de checagem do ciclo (setas
vermelhas). B) As fases da mitose. Interfase, prófase, metáfase, anáfase e
telófase...............................................................................................................
14
Figura 8
O número de células de um tecido pode ser alterado pelo aumento ou
diminuição da taxa de recrutamento das células tronco, pela morte celular
por apoptose ou por alterações nas taxas de proliferação ou
diferenciação......................................................................................................
15
Figura 9
Receptores da família do EGF (EGFR, Her2, Her3, Her4) apresentando sítio
de ligação extracelular, porção transmembrana e domínio da tirosina quinase
intracelular...........................................................................................................
19
Figura 10
Representação esquemática do ciclo celular com as fases G0, G1, G2 e M, e
ação de proteínas estimuladoras (ciclinas e cdk’s), inibidoras (p21, p27, p57,
p16, p15, p18 e p19), e de controle do ciclo (c-myc). TGF-β induz a
produção dos inibidores.....................................................................................
23
Figura 11
Representação gráfica da atividade dos complexos Cdk/ciclina durante o
ciclo celular. A largura das faixas coloridas é aproximadamente proporcional
à atividade dos complexos indicados.................................................................
28
xii
CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostates with proliferative
inflammatory atrophy and carcinoma
Figura 1 Immunostaining intensity of EGFR and Her2 antibodies in canine prostatic
tissue………………………………………………………...……….…………
48
Figure 2
EGFR immunostaining membrane through cytoplasm (arrow). A) Human
placenta. Positive control with 3+ immunostaining score (200X); B) Canine
PC tissue with 1+score (400X); C) Normal canine prostatic tissue with 1+
score (400X); D) Canine prostatic tissue with PIA and 2+labeling score
(200X). IHC, DAB with H&E counterstain…….................................................
51
Figura 3
Her2 immunostaining membrane through cytoplasm (arrow). A) Human
mammary carcinoma. Positive control with 3+ immunostaining intensity
score (400X); B) Canine PC tissue with 3+score (400X); C) Normal canine
prostatic tissue with 0- score (200X); D) Canine prostatic tissue with PIA and
2+ labeling score (400X); IHC, DAB with H&E counterstain...…….…….…..
51
Figura 4
Agarose gel images showing amplification products of β-actin, ErbB1 and
ErbB2 genes from canine prostatic tissue. A) RT-PCR for β-actin expression
as samples positive control. All samples amplified. B) RT-PCR for
ErbB1.Prostatic samples N3, N4, PIA2, all PC, and MC amplified. C) RT-
PCR for ErbB2. Prostatic samples PIA2, PIA3, all PC and MC amplified.
MW = Molecular weight (GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo
scientific, CA, USA, #SM1331); MC= canine mammary carcinoma (ErbB1
and ErbB2 positive control); N=Canine normal prostatic tissue; PIA=Canine
proliferative inflammatory atrophy; PC=Canine prostatic carcinoma…………
53
CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with prostatic
inflammatory atrophy and carcinoma
Figura 1
Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining
(arrow). A) Canine PC tissue with score three for labeling intensity and four
for number of labeled cells for p21. 400X. B) Human colon carcinoma; p21
positive control with score two for labeling intensity and four for number of
labeled cells. 400X. C) Canine PIA tissue with score three for labeling
intensity and four for number of labeled cells for p27. 200x. D) Human colon
carcinoma; p27 positive control with score three for labeling intensity and
four for number of labeled cells. 400X E) Canine PC tissue with score three
for labeling intensity and four for number of labeled cells for p53. 200X. F)
Human mammary carcinoma; p53 positive control with score three for
labeling intensity and three for number of labeled cells. 200X. IHC, DAB
with H&E counterstain.……………………….………...…...………………..
67
Figura 2
Images from agarose gels showing the amplification products of ACTG1 (β-
actin), CDKN1A, CDKN1B and TP53 genes from canine prostatic tissue.
(A) RT-PCR for β-actin expression (positive control). (B) RT-PCR for
CDKN1A. Prostatic samples PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. (C)
RT-PCR for CDKN1B. Prostatic samples PC7, PC8, PC9 and MC amplified.
(D) RT-PCR for TP53. Prostatic samples PIA1, PIA2, PIA3, PC1, PC2, PC3,
PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. MW = Molecular weight
(Gene Ruler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA,
#SM1331); MC= canine mammary carcinoma (CDKN1A, CDKN1B and
xiii
TP53 positive control); N=Normal tissue; PIA= Canine proliferative
inflammatory atrophy; PC= Canine prostatic carcinoma……………………...
69
Figura 3
Fold expression levels of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal,
PIA and PC normalized by β-actin. Values>1.6 were considered
overexpression and values<0.4 were considered decrease of gene
expression..………………………………………………..…………….…….
70
CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate with
proliferative lesions
Figura 1
Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining
(arrow). A) Canine PIN tissue with score three for labeling intensity and four
for number of labeled cells for p21. 200x. B) Human colon carcinoma.
Positive control for p21 with scores two for labeling intensity and four for
number of labeled cells. 400x. C) Normal canine prostatic tissue with one for
labeling intensity and one for number of labeled cells for p21 (400X) D)
Canine PIN with score two for labeling intensity and two for number of
labeled cells for p27. 200x. E) Human colon carcinoma. Positive control of
p27 with score three for labeling intensity and four for number of labeled
cells. 400X. F) Canine PIA with score three for labeling intensity and four
for number of labeled cells for p53. 400X. G) Mammary carcinoma. Positive
control of p53 with score three for labeling intensity and three for number of
labeled cells. 200X. H) Normal canine prostatic tissue with 0- score for p-53
(400X). IHC, DAB, counterstained with H&E………………………….……...
84
Figura 2
Immunohistochemistry photomicrography on nuclear through cytoplasmic
and membrane immunostaining.A) Canine PIN tissue with score one for
labeling intensity and three for number of labeled cells of cytoplasmic cyclin
D1 (arrow) (400X). B) Canine lymph node. Positive control of cytoplasmic
cyclin D1 (arrow) with score two for labeling intensity and two for number
of labeled cells. (400X) C) Normal canine prostatic tissue with 0- score for
cyclin D1 (200X) D) Canine PC tissue with score three for labeling intensity
and four for number of labeled cells for nuclear through cytoplasmic c-myc
(arrow). (400X) E) Canine lymph node. Positive control of nuclear through
cytoplasmic c-myc (arrow), with score two for labeling intensity and four for
number of labeled cells. (200X) F) Normal canine prostatic tissue with score
three for labeling intensity and four for number of labeled cells for c-myc
(arrow). (200X). IHC 400x. DAB with H&E counterstain. ………….…….…
85
xiv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostates with proliferative
inflammatory atrophy and carcinoma
Tabela 1 Labeling intensity scores of EGFR and Her2 antibodies in normal
prostate tissue and with PIA and PC ……………………………………..
50
Tabela 2 Means of comparison between EGFR and Her2 immunostaining
intensity in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC…..….....
52
Tabela 3
Comparison results of EGFR and Her2 immunostaining scores by
immunohistochemistry (IHC) and ErbB1 and ErbB2 detection by RT-
PCR in normal canine prostatic tissue and with PIA and PC…………....
53
CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with prostatic
inflammatory atrophy and carcinoma
Tabela 1
Number of cases sorted by scores applied to variable number of labeled
cells and intensity of labeling to p21, p27, and p53 antibodies in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC.……………………………
66
Tabela 2
Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding
number of stained cells and intensity of staining in canine normal
prostatic tissue, PIA and PC.………..……………………...….……...…..
69
Tabela 3
Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding
number of stained cells and intensity of staining in canine normal
prostatic tissue, PIA and PC..…………..……………..……………….….
71
CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate with
proliferative lesions
Tabela 1
Distribution of cases according to the scores applied to variable number
of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, p53, ciclyn D1 and
c-myc antibodies in normal prostate tissues and with BPH, PIA, PIN and
PC.…………...……………………………………………………………
86
Tabela 2
Means of comparison between p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc
immunostaining regarding the number of stained cells and intensity of
staining cells in canine normal prostatic tissue and with BPH, PIA, PIN
and PC.……………...………………………...…………………………..
87
Tabela 3
Means of correlation between antibodies expression regarding the
number of stained cells and intensity of staining of the normal canine prostate and with BPH, PIA, PIN and PC………………………………..
89
xv
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Quadro 1 Fatores de crescimento, células de origem, sítios alvo e suas funções no
tecido prostático normal e neoplásico.........................................................
17
Quadro 2 Fatores de crescimento que ativam (+) a família de receptores
EGFR..........................................................................................................
20
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTG1 - Gene que decodifica proteína da Beta actina
AKT - Quinase PI-3 dependente da serina tireonina quinase
AR - Receptor de andrógeno
ARF - Alternate reading frame
Bcl-2 - Proteína do Gene B-cell lymphoma/leukemia-2
bFGF- Fator de crescimento básico do fibroblasto
BLAST - Basic Local Alignment Search Tool
BPH - Benign Prostatic Hyperplasia
BSA - Bovine serum Albumin - Albumina serica bovina
BTC - Betacellulin
CCND1 - Gene que codifica protein ciclina D1
CD1 - Ciclina D1
Cdk - Ciclina dependente quinase
CdkI - Inibidor de Ciclina dependente quinase
CDKN1A - Inibidor de Ciclina dependente quinase 1A gene (gene do p21)
CDKN1B - Inibidor de Ciclina dependente quinase 1B gene (gene do p27)
cDNA - Fita Complementar do Àcido Desoxirribonucleico
c-erbB-2 - Mesmo que Her-2: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 2
c-erbB-3 - Mesmo que Her-3: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 3
c-erbB-4 - Mesmo que Her-4: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 4
Cip/Kip - Familia ciclina dependente quinase
CIP1 - Cdk-interacting protein 1
CLN - Gene neuronal ceroid lipofuscinosis que codifica proteínas semelhantes a ciclina
CMT-U229 - Linhagem de cultura de células de cancer de mama - Tumor misto benigno
c-MYC - Proto oncogene Myelocytomatosis
c-myc – Proteína produto do Proto oncogene Myelocytomatosis
COX-2 - Cicloxigenase-2
CP - Carcinoma prostático
CSC - Cancer stem cell like
DAB - Diaminobenzidine
dATP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Adenina
dCTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Citosina
DEPC - Dietilpirocarbonate
dGTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Guanina
DNA – Àcido Desoxirribonucleico
dNTP - 2´-deoxynucleoside 5`-triphosphate - Conjunto de Adenina, Citosina, Guanina e
Tiamina
dTTP - 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate - Tiamina
DU145 - linhagem de cultura de células de PChumano
DuPro - Linhagem de cultura de célula de PC andrógeno independentes
E2F - Proteína de regulação gênica - fator de transcrição
E-box - Enhancer Box
EGF - Fator de crescimento epidérmico
EGFR - Receptor do Fator de Crescimento Epidermico
ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPR - Epiregulin
ErbB1-Gene do EGFR ou Her1: Erythroblasticleucemia viral oncogene homologo 1
ErbB2-Gene do Her2ou c-erbB-2: Erythroblastic leucemia viral oncogenes homologo 2
ErbB3-Gene do Her3 ouc-erbB-3: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 3
xvii
ErbB4-Gene do Her4 ou c-erbB-4: Erythroblastic leucemia viral oncogene homologo 4
ERK - Proteína quinase regulada extracelularmente
FC - Fator de Crescimento
FC - Fold Change - Utilizado para identificar diferença significativa na expressão gênica
FFPE - formalin-fixed-paraffin-embedded
FGF - Fator de Crescimento Fibroblástico
FGFR - Receptor do Fator de Crescimento Fibroblástico
Fw - Forward
G0 - Fase de quiescência (Gap 0)
G1 - Fase de intérfase (Gap 1)
G2 - Fase de intérfase (Gap 2)
GA - Agarose gel electrophoresis – Gel de agarose
GSTP-1 - Glutathione S-transferase pi 1
HB-EFG - Heparina EGF
HB-EGFR - fator de crescimento epitelial ligador de heparina,
HE - Hematoxylina and Eosina
Her-1 - Proteína codificada pelo gene ErB1
Her-2 - Proteína codificada pelo gene ErbB2
Her-3 - Proteína codificada pelo gene ErbB3
Her-4 - Proteína codificada pelo gene ErbB4
HGPIN - Neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau
HPB - Hiperplasia prostática benigna
IGF1R - Receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 1
IGF2R - Receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 2
IGF-I - Fator de crescimento semelhante a insulina
IHQ - Imunohistoquímica
INCA - Instituto nacional de câncer
INK4 - Inibidor de CDK4
IRF1 - Interferon regulatory factor 1
KGF - fator de crescimento queratinócito
Ki-67 - Proteína nuclear responsável pela proliferação celular
KIP - Kinase inhibitor protein (inibidor de proteína quinase)
LGPIN - Neoplasia intra-epitelial prostática de baixo grau
LH-RH - Hormônio hipotalâmico
LNCaP - Linhagem de cultura de célula de PC andrógeno dependentes
M - Fase Mitótica
MAPK - Proteína quinase ativadora de mitose
MC - Mammary carcinoma
MCF-7 - Linhagem de cultura de célula de câncer de mama
Mdm - protein murine double minutes 2
MDM2 - Gene que codifica a proteína murine double minutes
MEC - Matriz extracelular
MEK - Mitogenactivated protein kinase
MgCl2 - Cloreto de Magnésio
mRNA - Mesmo que RNAm (Ácido ribonucléico mensageiro) na versão inglês
MSeA- Àcidocompostos de seléniode segunda geração do metil selénio, agente anti-câncer
N -Tecido normal
NaN3- sodium azide
NGR1 - Neuregulinas 1
NGR2 - Neuregulinas 2
xviii
NKX3.1 - NK3 homeobox 1 é: homeobox-containing transcription factor 1
NOS-2 - Óxido nítrico sintase 2
OSH - Ovariohisterectomia
P114 - Linhagem de cultura de célula de carcinoma mamário anaplásico primário
P15 - Proteina de 15 kDa, p15
P16 - Proteina de 16 kDa, p16
p21 - Proteina de 21 kDa, p21
p27 - Proteina de 27 kDa, p27
p53 - Proteina de 53 kDa, p53
p63 - Proteina de 63 kDa, p63
pb - Pares de bases
PBS - Phosphatebuffered saline
PC - Prostate carcinoma-Carcinoma prostático
PCR - Polymerase chain reaction - Reação de cadeia de polimerase
PDGF - Fator de crescimento plaquetário
PDGFα - Receptor Fator de crescimento plaquetário alfa
PI3K- fosfatidil inositol 3,4,5 quinase
PIA - Atrofia inflamatória proliferativa
PIN - Neoplasia intra-epitelial prostática
Ponto R - Ponto de restrição
pRB - proteína do gene retinoblastoma
PSA - Antígeno prostático específico
PTEN - Phosphataseand tensin homolog deleted from chromosome 10
RAD51 - RecA recombinase
RAS - proteínas G monoméricas
Rev - reverse
RNA - Ácido ribonucléico
RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro
RNase - Enzima que cliva / hidrolisa RNA
RT - Reverse transcription - Transcriptase Reversa
RT-PCR - Reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa
RT-qPCR - Real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction
S - Fase de síntese do ciclo celular
T2–3 N1–3 M0 - Estadiamento tumoral: Tamanho, Localização próxima em linfonodos pélvico
mais não metástase a distância
Taq - Thermus aquaticus – DNA polimerase
TGF-α - Fator de crescimento transformador alfa
TGF-β - Fator de crescimento transformador beta
TIMP-1 - Inibidor tecidual de metaloproteinase -1
TIMP-2 - Inibidor tecidual de metaloproteinase 2
TMA - Tissue microarray - Micro arranjo Tecidual
TP53 - Gene que codifica Tumour Protein 53
TVT - Tumor Venéreo Transmissível
UFG - Universidade Federal de Goiás
uPAR - Receptor de ativador de plasminogênio tipo uroquinase
VEGF - fator de crescimento vascular endotelial
WAF1 - wild type p53 activated factor 1
WM - Weight Molecular - peso Molecular
ZO2 occludens - Membro da Membranaassociadaguanilato/quinaseproteína homóloga a
família -MAGUK (Membrane-associated guanylate kinases)
xix
RESUMO
Algumas lesões displásicas da próstata, como a atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e a
neoplasia intraepitelial prostática (PIN), são proliferativas, consideradas pré-malignas e
podem evoluir para carcinoma prostático (PC). Outras, como a hiperplasia prostática benigna
(HPB), apesar de proliferativas, não possuem relação com malignidade. Sendo o PC humano
uma das neoplasias que mais matam, e o cão aúnica espécie animal que apresenta a
enfermidade com características semelhantes, esta tem sido utilizada como modelo para o
estudo do câncer de próstata. Assim, com o intuito de melhor compreender os mecanismos
moleculares envolvidos na regulação do ciclo celular e evolução das lesões proliferativas na
próstata canina, este estudo teve por objetivo avaliar a expressão gênica de ErbB1, ErbB2,
CDKN1A, CDKN1B e TP53,e imunomarcação deEGFR (Her1), Her2 (c-erbB-2), p21, p27 e
p53 em próstatas com PIA e PC. Também foi avaliada a imunomarcação de p21, p27, p53, c-
myc e cyclin D1 em próstatas com HPB, PIA, PIN e PC. Para tal, foram obtidas de um bloco
de microarranjo tecidual (TMA) 106 amostras de tecido prostático canino, sendo 15 normais,
16com HBP, 30com PIA,20com PIN, e25com PC. As técnicas de RT-PCR e RT-qPCR foram
empregadas na avaliação da expressão gênica, assim como a técnica de imunoistoquímica foi
utilizada para verificar o imunofenótipo das lesões prostáticas. Quanto aos receptores
EGFReHer2 foi observado que esses atuam naslesões de PIAePCcanino, com ação importante
do receptor Her2, sugerindoqueessesestão envolvidosna carcinogênese e no
desenvolvimentotumoral da prostata canina.Em relação aos inibidores do ciclo celular
councluiu-se que quando superexpressos em próstatas com PIA e PC, p21 e p27 controlam a
proliferação celular, atuando comofator protetivo na evolução da PIA para PC, e no
desenvolviemento do PC, mesmo quando da alteração de p53. Na avaliação da
imunoexpressão dos reguladores do ciclo celular (p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc) em
próstatas caninas com lesões proliferativas foi constatado que os carcinomas possivelmente
apresentam baixo potencial de crescimento quando da superexpressãop21 ep27, menor
subexpressão de ciclina D1e expressão inalterada de c-myc, mesmo na presença de p53 tipo
mutante. Ainda, considerando o imunofenótipo semelhante nas glândulas com PIA, PIN e PC
no que se refere aos reguladores daprogressão do ciclo celular, reforça o potencial pré-
maligno da PIA e PIN na próstata canina.
Palavras-chave:carcinoma prostático, FFPE, PIA,PIN, imunoistoquímica, RT-PCR.
xx
ABSTRACT
Somedysplastic lesionsof prostate, such as proliferativeinflammatoryatrophy (PIA) and
prostatic intraepithelial neoplastic(PIN) are proliferative,consideredpremalignant andcan
progress toprostatic carcinoma (PC). Others, such asbenign prostatichyperplasia(BPH) are
proliferative, butare not related tomalignancy.The humanPC is the one ofcancers that more
kill,and dog`sthe onlyanimal species thatpresentsadiseasewith similarcharacteristics, thishas
been usedas a modelfor studyof prostatecancer. Thus, in order tobetter understandthe
molecular mechanisms involvedin repairand cell cycleevolution ofproliferative
lesionsincanine prostate, this study aimed to evaluatethe gene expression ofErbB1, ErbB2,
CDKN1A, CDKN1BandTP53andimmunostaining ofEGFR(Her1), Her2(c-erbB-2), p21,
p27and p53 inprostateswithPIAandPC. Also was evaluatedtheimmunostaining ofp21, p27,
p53, c-myc andcyclinD1inprostateswith BPH, PIA, PINandPC. For this purpose,wereobtained
from atissue microarray (TMA)block, 106samplesofcanineprostate tissue, which 15 normal,
16with BPH, 30 withPIA, 20 with PIN, and 25with CP. The RT-PCR andRT-qPCR
techniques wereused to evaluategene expression, as well as immunohistochemistrywas used
to determinetheimmunophenotypeofprostatic lesions.As forEGFRand Her2has beenobserved
that thesereceptorsactin canine lesions withPIA and with PCan importantaction ofHer2,
suggesting that theyare involvedin carcinogenesisandtumor development in canineprostate.
Regarding to cellcycleinhibitor concludethat whenoverexpressedin canine
prostateswithPIAandPC, p21andp27control cellproliferation, acting as a protective factorin
the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the presence of altereted
p53.In assessing ofimmunostaining ofcell cycle regulators(p21, p27, p53, cyclinD1andc-myc)
in canineprostateswithproliferative lesionswas observedthatcarcinomas probably have
lowgrowth potentialwhenoverexpressed of p21andp27, reduced expression of cyclinD1and
unalteredexpression ofc-myc, even in the presence ofmutant p53type.Further,considering
thesimilarimmunophenotypein canine glands with PIA, PINandPC considered the
regulatorsofcell cycle progression, it is reinforce the pre-malignant potential of PIA andPINin
the canineprostate.
Keywords:FFPE, immunohistochemistry, PIA, PIN, prostatic carcinoma, RT-PCR.
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1.1.Morfofisiologia e enfermidades da próstata canina
No cão, a próstata representa a única glândula sexual acessória, compondo-se por
órgão retroperitonial músculo-glandular, ovóide e bilobulado, que circunda a uretra
proximal1. Localiza-se caudal à bexiga, ventral ao reto e dorsal à sínfise púbica
1,2, podendo
variar de posição a depender da idade, distensão da bexiga e enfermidades envolvendo a
glândula3 (Figura 1A). Sua principal função é a produção do líquido prostático, que atua como
meio de transporte, proteção e nutrição para os espermatozóides durante a ejaculação5. Além
disso, auxilia no metabolismo da testosterona em diidrotestosterona3.
A próstata canina possui dois lobos, separados por um septo medial de tecido
fibroso1,2
. Esses lobos subdividem-se em lóbulos, contendo glândulas túbulo-alveolares
ramificadas (ácinos), recobertas por epitélio colunar simples5, sustentadas por delicado
estroma e que se estendem desde sua abertura no ducto uretral até a cápsula fibromuscular
prostática, a qual limita e protege o parênquima glandular1,6
. O epitélio glandular prostático é
composto por dois tipos celulares, as células epiteliais secretoras colunares altas e as células
epiteliaisda camada basal, estas localizadas ao longo da membrana basal. O estroma consiste
de fibroblastos e células musculares lisas, envoltos em colágeno, com vasos sanguíneos e
nervos3,6
(Figura 1B).
FIGURA 1 - A) Vista ventral da cavidade pélvica canina. 1) Bexiga urinária; 2) próstata; 3) reto; 4)
uretra. B) Fotomicrografia da histomorfologia normal da próstata canina. Glândula
túbulo-alveolar ramificada (ácinos), recobertas por epitélio colunar simples (seta preta). Lúmen glandular (asterisco), estroma de sustentação fibromuscular (seta amarela) e
célula basal (seta verde). HE, 200x.
Fonte: Faleiro7,8
1 2
3
4
A B
2
As doenças prostáticas representam um problema comum em cães adultos e
idosos, semelhante ao que ocorre na próstata do homem9-11
. Dentre as enfermidades que
acometem a prostáta dos cães, destacam-se a hiperplasia prostática benigna12
(HPB), as
prostatites3,4
, as lesões displásicas12
e o carcinoma prostático (PC)6,14-17
. Quanto às lesões
displásicas da próstata, consideradas pré-malignas, destacam-se a neoplasia intraepitelial
prostática (PIN)15,18
e a atrofia inflamatória proliferativa (PIA)13,16
.
A caracterização diagnóstica das prostatopatias caninas é um constante desafio,
uma vez que a similaridade dos sinais nas diferentes enfermidades e a substancial
possibilidade de ocorrência concomitante de duas ou mais alterações limitam diagnósticos
precisos, somado ao fato da inexistência de testes bioquímicos apropriados para a espécie,
como biomarcadores de detecção precoce de enfermidades como HPB e câncer. Ressalte-se
que à exceção da prostatite aguda, cães com doenças prostáticas são
comumenteassintomáticos3,5,19
.
Similaridades em relação à ocorrência natural e influência hormonal no
desenvolvimento das afecções prostáticas, principalmente HPB17
, PIN18
, PIA13
e PC6, têm
feito do cão modelo experimental para o estudo de algumas dessas prostatopatias na glândula
humana10,11,17,18
, contribuindo para o conhecimento médico e médico-veterinário acerca das
doenças prostáticas nessas espécies. Considerando essas similaridades e o contexto do estudo,
apresentam-se a seguir as enfermidades relacionadas aos objetivos desta pesquisa.
1.1.1. Hiperplasia prostática benigna (HPB)
A hiperplasia prostática benigna (HPB) é a prostatopatia mais comum no cão20
eestá associada ao envelhecimento e a desequilíbrios hormonais envolvendo a testosterona, a
diidrotestosterona (DHT) e o estrogênio3,12,17
. A HPB no cão envolve preferencialmente o
componente epitelial e ocorre de forma difusa19,21
, enquanto no homem costuma ser estromal
e nodular20
. Apesar disso, o cão é a única espécie não humana que desenvolve HPB
espontaneamente, o que reforça sua utilização como modelo experimental para essa doença
no homem20,22
.
Em decorrência do desequilíbrio entre andrógenos prostáticos, há alteração da
interação entre estroma e epitélio, havendo resposta das células epiteliais aos fatores de
crescimento produzidos pelas células estromais. Observa-se tanto aumento no número de
células (hiperplasia), quanto aumento no tamanho das mesmas (hipertrofia)19
. Essa alteração
resulta em descontrole na proliferação, migração e morte celular, sendo um dos fatores que
3
contribuem para o desenvolvimento da HPB20
. Quanto ao padrão histológico da HPB canina
há dois tipos bem caracterizados, a hiperplasia glandular, com proliferação das células
secretoras; e hiperplasia complexa, com hiperplasia glandular intercalada a focos de atrofia.
Neste último, há proliferação dos elementos estromais em associação a áreas atróficas ou de
ácinos dilatados, císticos e preenchidos por material eosinofílico12,20,21
(Figura 2).
FIGURA 2 - Fotomicrografia da próstata canina com
HPB cística. Evidenciação deácinos
acentuadamente dilatados (asterisco vermelho), irregulares e proliferação
estromal adjacente (asterisco preto).
HE, 200x.
Fonte: Faleiro8
Embora a HPB possa ocorrer concomitantemente a lesões potencialmente pré-
malignas, como a PIN e PIA, e malignas, como o PC22,23
, é improvável que a HPB represente
lesão pré-neoplásica24
.
1.1.2.Atrofia inflamatória proliferativa (PIA)
O termo atrofia inflamatória proliferativa, do inglês proliferative inflammatory
atrophy (PIA), foi proposto para designar focos de epitélio glandular proliferativo com o
aspecto morfológico de atrofia focal simples e inflamação concomitante24
. A atrofia da
próstata é identificada pela redução no volume glandular e estroma pré-existentes, sendo
caracterizada em dois padrões, difuso e focal. A forma difusa resulta da diminuição de
andrógenos circulantes e envolve a próstata como um todo, de maneira relativamente
uniforme. Ao contrário, a atrofia focal não se relaciona unicamente à diminuição de
andrógenos circulantes e ocorre como áreas de epitélio atrófico intercaladas com áreas de
epitélio de aspecto normal e são proliferativas, sendo que a ampla maioria associa-se à
4
inflamação, de maneira que essas lesões podem se originar em um cenário de estresse
oxidativo aumentado, possivelmente derivado das células inflamatórias próximas24-26
.
A inflamação é sugerida como fator etiológico capaz de incitar a carcinogênese
por causar dano celular e no genoma, promover a substituição celular e criar um
microambiente rico em radicais livres tóxicos, ácido aracdônico, proteases, citocinas e fatores
de crescimento que elevam a replicação celular, antiapoptóticos e a angiogênese27,28
. Portanto,
no que refere à carcinogênese, a inflamação pode atuar como agente iniciador, via efeitos
genotóxicos, ou como agente promotor, via efeitos citotóxicos29
. Ainda, segundo Nonomura
et al.30
e Sfanos e De Marzo26
, a inflamação crônica em tecidos benignos prediz o
desenvolvimento de câncer de alto grau (com escore de Gleason entre 7-10).
Sugar31
e Tomas et al.14
sugerem que na PIA ocorre equilíbrio entre proliferação e
perda celular por mecanismos que não os apoptóticos, uma vez que nessas lesões há
proliferação, mas não há perda celular por apoptose, e mesmo assim não há crescimento em
volume. Ainda, acreditam em injúria celular direta e que as células lesadas caem no lúmen
glandular e são eliminadas no ejaculado ou capturadas por macrófagos. Além disso, inferem
que o epitélio em regeneração suprima a morte celular programada, ao menos
temporariamente, para substituir as células perdidas, fato que poderia explicar a expressão
aumentada de B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) nas células secretoras da PIA, resultando
em níveis muito baixos de apoptose e embasando o conceito de que a PIA é uma lesão
regenerativa. Ainda, os fatores de crescimento poderiam estar sendo liberados tanto pelas
células epiteliais lesadas quanto pelas células inflamatórias presentes.
Há vários critérios para que se considere uma lesão pré-maligna, como a relação
epidemiológica, a presença anterior ao câncer, assemelhanças morfológicas e a proximidade
ou equivalência às suas características de malignidade32
. A PIN é considerada a lesão
precursora mais provável do carcinoma prostático invasivo por atender a tais critérios32
.
Apesar da PIA também ser apresentada como lesão prostática pré-maligna, destaca-se que
Anton et al.34
e Billis e Magna35
, não encontraram associações entre a atrofia prostática e
câncer. Já Wang et al.36
observaram que 70% das lesões de PIN e 28% das de PC eram
margeadas por PIA. Com isso, concluíram sobre a evidência direta entre as lesões e
mostraram transições morfológicas entre PIA e PIN, e PIA e PC na próstata humana. Além
disso, muitos focos de PIA compartilham alterações fenotípicas, genotípicas e moleculares
com PIN e PC, podendo esses focos compor o principal alvo de transformação neoplásica33-37
.
Putzi e De Marzo38
avaliaram a relação entre PIA, PIN e adenocarcinoma
prostático em humanos e observaram concomitância entre PIA e PIN, PIA e PC, e PIN e PC,
5
sendo as combinações de topografia variada, observando-se desde lesões adjacentes a
distantes. Dessa forma, os autores acreditam que embora não caracterize regra, a PIA pode
representar um precursor da PIN e/ou do PC, embora assumam que a relação topográfica não
seja prova definitiva dessa proposta. Enfatizam ainda que nem todas as lesões de PIN ou
pequenas lesões de PC estão associadas à atrofia, assim como nem todas as lesões atróficas
são precursoras de PIN ou PC.
Segundo Palapattu et al.27
, a PIA compreende resposta das células epiteliais
prostáticas normais a um microambiente de estresse, e regiões individuais de PIA que são
inábeis em debelar o dano oxidativo ao genoma podem progredir para PIN ou PC. Assim, as
células epiteliais da PIA são possíveis alvos de transformação neoplásica, passando ou não
por PIN, o que significa dizer que dão origem ao PC indireta ou diretamente. Contudo, alguns
tumores parecem se desenvolver diretamente da PIN enquanto outros ocorrem sem evidência
de lesões precursoras36,37
.
Em cães, alguns autores estudaram a relação da PIA com a evolução do
PC13,15,16,39,40
. Di Santis41
caracterizou morfologicamente e imunofenotipicamente a PIA e a
PIN, validando o potencial pré-maligno dessas lesões na próstata do cão. Rodrigues et
al.15
embora não tenham examinado o aspecto proliferativo da PIA, encontraram
imunomarcação para cicloxigenase-2 (COX-2) e fator de crescimento transformador beta
(TGF-β) em quantidade intermediária entre o tecido normal e o PC, concluindo tratar-se de
lesão pré-neopásica, já que o aumento na expressão desses reguladores de atividades celulares
é observado em processos neoplásicos.
Toledo et al.13
, com base nos critérios de De Marzo et al.25
e Di Santis41
,
propuseram a subdivisão da PIA canina de acordo com o grau de inflamação adjacente aos
focos atróficos, sendo discreta, quando há poucas células inflamatórias e estas são esparsas
em sua maioria; moderada, quando há agregados de células inflamatórias sem destruição
tecidual ou formação de folículos ou nódulos linfoides (Figura 3A); e acentuada, quando da
presença de agregados confluentes de células inflamatórias com destruição tecidual ou
formação de folículos ou nódulos linfoides (Figura 3B).
6
FIGURA 3 - Fotomicrografia de próstata canina com foco de atrofia inflamatória proliferativa
(PIA). A)PIA cominfiltrado inflamatório mononuclear intersticial (asterisco) e
atipias epiteliais com mais de uma camada de células epiteliais (seta), citoplasma marcadamente reduzido, núcleos aumentados e nucléolos evidentes (PIA-moderada),
HE, 400x; B) Atrofia acinar, dupla camada de células epiteliais (seta) e infiltrado
inflamatório mononuclear intersticial (asterisco) (PIA-acentuada), HE, 200x. Fonte: Toledo et al.
13
Croce et al.40
avaliaram a expressão imunoistoquímica de óxido nítrico sintase 2
(NOS-2), COX-2, p53 e Glutathione S-transferase pi 1 (GSTP-1) em focos de PIA e PC
canino e concluíram que o aumento na expressão de NOS-2, COX-2 relaciona-se ao estresse
oxidativo, muitas vezes gerado pelo infiltrado inflamatório, podendo o epitélio prostático ser
foco de alteração genética e transformação neoplásica. Ainda, a expressão aumentada do
GSTP-1 poderia conferir certa proteção ao dano oxidativo ao tecido prostático.
Faleiro et al.16
avaliaram a expressão imunoistoquímica das metaloproteinases de
matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e receptor de ativador de plasminogênio tipo uroquinase
(uPAR) na próstata canina com PIA e concluíram que a inflamação influencia positivamente a
atividade dessas enzimas. Com isso, ocorre maior atividade proteolítica na matriz extracelular
(MEC), possivelmente contribuindo para a remodelação e o processo de invasão tumoral e
metástase. Essa idéia é reforçada nos achados de Toledo42
, que observou maior expressão de
inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1) no tecido prostático com PIA, PIN e PC e
menor expressão de TIMP-2, demonstrando o desequilíbrio dessas proteínas nos focos de
PIA, o que contribui com a remodelação tecidual e possível grau de invasão tumoral e
metástase.
Rodrigues et al.15
ao analisar a expressão gênica de COX-2 e estudar ascélulas da
camada basal pela marcação imunoistoquímica de p63 na PIA e no PC canino,
observarammaior expressão gênica de COX-2 no estroma em relação às células epiteliais, e
A B
7
aumento da proliferação e redução daapoptose das células secretoras na PIA e no PC. O
mesmo ocorreu com as célulasbasais na PIA, que apresentaram maior índice proliferativo e
menor taxa de apoptose.Ainda, sendo a expressão de COX-2 na PIA maior no compartimento
estromal, revela o importante papel dessa enzima na carcinogênese prostática canina.
Fonseca-Alves et al.39
analisaram por imunoistoquímica a expressão de c-myc,
NKX3.1,E-caderina e p63no tecido prostático canino com HPB, PIA e PC, e observaram que
a expressão de c-myc eleva-se nos casos de PC e PIA em comparação ao tecido prostático
normal. A proteína NKX3.1 apresentou-se reduzida em 94,75% dos casos de PC e em 100%
dos de PIA em comparação ao tecido normal. Ainda, a expressão de E-caderina apresentou
menor expressão nos tecidos com PC em relação aos com PIA e normal, bem como a
expressão de p63 foi maior em PC e PIA do que no tecido normal. Dessa forma, demonstram
que a carcinogênese do tecido prostático canino pode estar relacionada com a proliferação de
células basais, ganho de função de c-MYC e perda da expressão da proteína NKX3.1 e E-
caderina, bem como potencial envolvimento das células basais no desenvolvimento da PIA
para PC.
1.1.3.Neoplasia intraepitelial prostática (PIN)
Inicialmente, o termo displasia foi utilizado para designar alterações não usuais no
epitélio glandular prostático e diferenciá-las de lesões inquestionavelmente benignas e de
proliferações verdadeiramente neoplásicas, e abrangia várias alterações, como as de natureza
atrófica, inflamatória e metaplásica, além de hiperplasias atípicas glandulares e intraductais43
.
Em 1986, Mcneal e Bostwick44
propuseram que a displasia intraductal na próstata humana
poderia representar uma lesão pré-maligna, constituindo-se no precursor biológico direto do
PC. O termo neoplasia intraepitelial prostática (PIN) foi proposto por Bostwick e Brawer43
e
endossado consensualmente por Drago et al.45
, com o intuito de substituir termos sinônimos
como displasia intraductal, hiperplasia atípica acinar, hiperplasia com alterações malignas,
marcada atipia e displasia ductoacinar, unificando a terminologia PIN para designar as
alterações displásicas intraepiteliais da próstata humana46
.
A PIN é observada em mais de 85% dos casos de PC e em 43% de forma contígua
às lesões prostáticas benignas da próstata humana44,46
, sendo que estudos acerca do
comportamento biológico dessa lesão comprovaram seu aspecto pré-maligno43-47
.
Os mecanismos de proliferação e diferenciação celular estão alterados na PIN,
pois são observadas células basais atípicas, com potencial proliferativo, migrando para o
compartimento secretor, enquanto no tecido normal ou hiperplásico a capacidade proliferativa
8
é restrita à camada basal15,41
. Com a indiferenciação celular, tende a ocorrer perda gradativa
das células basais, facilitando a extensão da lesão para o estroma e sua transformação em
carcinoma invasivo, com aumento da atividade proliferativa, neovascularização, instabilidade
genética e variação na quantidade de DNA44,46
.
Histologicamente, a PIN consiste de alterações nos ductos ou ácinos, geralmente
multifocais. A lesão pode ser de baixo grau (LGPIN) ou de alto grau (HGPIN). Focos de
LGPIN caracterizam-se por ductos ou ácinos com epitélio hipercelular, condensado e
irregular, com marcada variação do tamanho nuclear. Núcleos alongados, hipercromáticos e
pequenos nucléolos podem estar presentes. A HGPIN é semelhante à LGPIN, porém a alta
celularidade e a estratificação celular são mais evidentes e a variação do volume nuclear entre
as células é menor, pois a maioria possui núcleo aumentado. Nucléolo proeminente e
frequentemente múltiplo é uma característica da HGPIN. Além disso, a membrana basal do
epitélio da próstata humana apresenta-se íntegra e a lesão apresenta crescimento lento46
(Figura 4).
O primeiro relato mencionando PIN em cães descreve a presença da lesão em 19
(66%) de 29 glândulas com diagnóstico de adenocarcinoma18
. As características histológicas
da PIN na próstata canina são similares àquelas descritas na glândula humana48
, a exceção da
continuidade da camada de células basais, a qual no cão é naturalmente descontínua18
.
Assim como Waters e Bostwick48
, que observaram incidência de 55% de PIN em
cães idosos e não castrados sem que apresentassem evidências clínicas de câncer, Di Santis41
observou 12,5% de PIN canina nas mesmas condições. No entanto, Aquilina et al.49
observaram PIN em 72% dos animais com PC. Os autores consideraram a frequente
associação entre PIN e adenocarcinoma um forte indicativo de que a PIN compreenda lesão
pré-maligna. Apesar da incidência da lesão ter sido baixa nos animais sem câncer prostático,
os mesmos acreditam que a lesão possa ter sido subestimada pelo fato de se ter avaliado
apenas uma amostra do tecido prostáticodesses animais. Ainda segundo esses autores48,49
, a
prevalência da PIN em cães e humanos é influenciada pela idade e por andrógenos
testiculares, constituindo a única espécie não humana em que a PIN se desenvolve
espontaneamente.
9
FIGURA 4 - Fotomicrografia de próstata canina com foco de PIN.
Epitélio acinar estratificado e displásico, com variação do
tamanho nuclear, nucléolo evidente e perda de diferenciação citoplasmática (seta). HE, 400x.
Fonte: Faleiro 8
A PIN nas próstatas canina e humana apresenta-se de forma semelhante no que
diz respeito à morfologia e associação com o câncer46,48
. Assim, a próstata canina é apontada
como modelo para a determinação dos fatores que regulam a aparente progressão do epitélio
benigno para PIN, e deste para o carcinoma invasivo18,48
.
1.1.4. Carcinoma prostático(PC)
As neoplasias da próstata canina são comumente epiteliais malignas, de estrutura
glandular ou acinar50
, sendo o adenocarcinoma e o carcinoma indiferenciado os tipos
histológicos mais comuns50,51
. Nos cães, os PC são raros, de baixa prevalência e relatados
com maior frequência em animais adultos e idosos21,52
, oposto ao que ocorre no homem, para
o qual o PC é a forma mais comum de câncer e a segunda causa de óbito entre os homens10,11
.
Vale destacar que a lesão é extremamente rara em qualquer outra espécie animal52,53
.
A maioria dos PC no homem e no cão apresenta padrão intra-alveolar e
morfologia heterogênea, variando de pequenos focos de células relativamente bem
diferenciadas a camadas de células anaplásicas, lembrando carcinoma de células renais claras
ou carcinoma de células transicionais52,54
(Figura 5). Em associação aos focos de PC canino é
possível encontrar focos de HBP, dilatação glandular e inflamação supurativa ou
linfoplasmocitária significativa3. Os PC no homem são classificados de acordo com o sistema
10
de Gleason, em que escores são atribuídos aos tumores com base na diferenciação
arquitetônica, padrões de crescimento em relação ao estroma e atipias nucleares das células
em amostras coradas em HE, tornando o sistema um bom indicador da progressão e evolução
clínica da doença55
.Padrões semelhantes aos observados no sistema Gleason foram
encontrados nas neoplasias da glândula canina, mas sem significado prognóstico, restringindo
sua utilização na rotina diagnóstica6.
Acredita-se que o PC na espécie humana tem início em lesões pré-malignas, a
exemplo das displasias, em que as células sofrem alterações substanciais, diferem-se das
normais e adquirem características proliferativas e de dominância sobre as células
adjacentes56
. Nesse contexto, postula-se que a fase inicial do PC corresponda à PIN de alto
grau25,43,47
, encontrada em 82% dos PC invasivos e em 43% das glândulas de homens acima
de 50 anos sem sinais de câncer44
. No cão, a ocorrência da PIN de alto grau com PC
concomitante foi relatada entre 30-72% dos casos49,57
. Em contraste, na ausência de PC, a PIN
foi encontrada em 3% dos casos por Madewell et al.57
e não relatada por Aquilina et al.49
.
É sabido que o PC no homem está associado a mutações em genes prostáticos
susceptíveis, como TP53 e ErbB2, juntamente a defeitos somáticos em genes como NKX3.1,
C-MYC, ErbB1, PTEN, CCND1, CDKN1B, CDKN1A e o gene receptor de andrógeno58
(AR). Já em cães, pouco se conhece sobre a patogênese molecular e origem dos PC91
. De
acordo com Leroy e Northrup52
, não foram identificadas mutações somáticas predispondo os
cães ao maior risco para o desenvolvimento de PC, masWinkler et al.59
afirmam que há
anormalidades cromossômicas no PC canino. Entretanto, Ganem et al.60
destacam que não se
pode afirmar se essas anormalidades cromossômicas no PC humano ou canino são causa ou
consequência da transformação neoplásica.
Fatores endógenos e exógenos têm sido considerados predisponentes ao risco do
desenvolvimento do PC humano, incluindo histórico familiar, raça, idade e fatores
nutricionais8,52
, o que não se extrapola aos cães e dificulta a identificação das alterações
genéticas associadas ao processo52
. Devido à natureza agressiva da neoplasia e da falta de um
teste de identificação de cães com PC em estágio inicial, metástases são observadas em
aproximadamente 80% dos casos e localizadas preferencialmente nos linfonodos pélvicos,
ilíacos internos e externos, até corpos vertebrais, sistema esquelético e pulmões11,52,61
.
No cão considera-se espontânea a etiologia do PC, mas não há dúvidas quanto ao
envolvimento hormonal62
. Johnston et al.1 relataram que a depleção andrógena pós-
orquiectomia resulta em involução de lesões proliferativas prostáticas benignas, mas não de
PC. Nesse sentido, Bell et al.63
estudaram o comportamento biológico do PC em cães
11
castrados e não castrados. Observaram metástases em 89% dos animais e curiosamente as
lesões pulmonares prevaleceram nos cães orquiectomizados. Além disso, o tipo histológico
observado com maior frequência foi o adenocarcinoma pouco diferenciado. Por isso, sugere-
se que o PC seja mais agressivo nos cães castrados, mesmo considerando que os não castrados
são mais susceptíveis a doenças prostáticas63,64
.
Para Teske et al.61
, a castração favorece a progressão do processo neoplásico. Já
Mahapokai et al.65
descreveram que o aumento no número de células basais na próstata de
animais castrados sugere que os PC mais agressivos possam ter origem nessas células, visto
que as mesmas são andrógeno-independentes, sobrevivem e proliferam ativamente na
ausência desses hormônios. Interessante que Garnick66
também apresenta a possibilidade da
vasectomia aumentar o risco de PC na espécie humana. Já Swinney67
apresentou duas
hipóteses de etiologia para a PC em cães orquiectomizados: 1) as células envolvidas no tumor
são hormônio-independentes; 2) as neoplasias sofrem influências de hormônios
extratesticulares, como os produzidos na adrenal.
FIGURA 5 - Fotomicrografia de carcinoma prostático canino. Áreas de
proliferação celular com atipias e perda da conformação
acinar. HE, 400x.
Fonte: Faleiro8
Para Pylkkänen et al.68
, diferenças significativas entre o PC humano e canino,
como baixa incidência, longo período de latência e grau de resposta hormonal descartam o
12
cão como modelo prático para a carcinogênese prostática humana. Contudo, Waters e
Bostwick18
, Madewellet al.57
, Lai et al.6,Leroy e Northrup
52, Anidjar et al.
10 e Keller et al.
11
apontaram semelhanças relevantes entre as espécies, incluindo desenvolvimento embrionário,
anatomia macroscópica e microscópica, desenvolvimento em idade avançada, concomitância
com focos de PIN, localização anatômica e propensão para metástases ósseas que, segundo os
autores, fazem do cão modelo experimental adequado para o estudo do PC humano.
1.2.Carcinogênese
Os processos neoplásicos sejam benignos ou malignos ocorrem em decorrência de
alterações nos genes, cujas mutações podem ser de origem hereditária ou adquiridas pelas
células somáticas69,70
. Os eventos moleculares envolvidos na gênese neoplásica são os
mesmos entre as diferentes espécies animais, e geralmente resultam de mudança do estado
celular a partir do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas, que desorganizam os
eventos celulares normais68
.
De acordo com Clark71
, o processo neoplásico é considerado uma forma aberrante
de vida, de enorme complexidade pelo ponto de vista evolutivo, não sendo explicável única e
exclusivamente por suas modificações no material genético celular. Segundo Solomon et al.72
,
um neoplasma é decorrente de uma série progressiva de alterações gênicas irreversíveis que
ocorrem em um único clone celular, como resultado de uma série de fatores, incluindo
alterações nos oncogenes sob a ação de fatores de crescimento, assim como nos genes
supressores tumorais. É necessário ainda ocorrer fixação da lesão e conversão gênica após a
replicação do DNA e a divisão celular, o que compreende a primeira etapa (iniciação) de um
evento complexo,de quatro fases, conhecido como carcinogênese ou gênese neoplásica69,70
.
Na fase subsequente, a promoção, acontece diferenciação celular entre célula
normal e neoplásica pela capacidade de escape aos mecanismos homeostáticos do organismo,
favorecendo uma proliferação desorganizada e descontrolada, só cessada quando a neoplasia
já não consegue mais realizar o metabolismo apenas por difusão. Se continuar crescendo, as
células ao centro morrerão por necrose ou apoptose. Acredita-se que microtumores nesse
estágio possam sobreviver em estado dormente, em que o número de células que proliferam
se equivaleria ao das que morrem69,70
.
Para continuar a progredir e se manifestar, na terceira e quarta fases da gênese, a
célula neoplásica precisa induzir a produção de fatores pró-angiogênicos capazes de estimular
as células endoteliais dos vasos sanguíneos adjacentes a degradar sua lâmina basal e migrar
13
em sua direção. Isso confere ao tumor maior potencial invasivo e consequentemente maior
potencial metastático70,72
(Figura 6).
FIGURA 6 - Representação esquemática das fases da carcinogênese. Iniciação, promoção,
progressão e manifestação.
Fonte: Adaptado de INCA73.
Diante disso, alterações na expressão de proto-oncogenes e genes supressores
tumorais desempenham papel-chave na gênese neoplásica. A disfunção na produção de seus
produtos protéicos leva à regulação anormal das vias de sinalização que controlam o ciclo
celular, a apoptose, a estabilidade genética, a diferenciação celular e as reações de
morfogênese. Alterações nesses importantes processos fisiológicos são responsáveis tanto
pelas etapas iniciais de transformação das células neoplásicas, quanto pela determinação da
progressão do tumor, resultando no desenvolvimento de tumores malignos72
.
Uma das características mais importantes das células malignas é a capacidade de
proliferação, ou seja, a célula normal perde o controle da sua própria divisão, rompendo assim
uma série de barreiras fisiológicas, os pontos de controle ou checagem do ciclo celular, para
tornar-secancerosa71,72
.
1.3.Ciclo e crescimento celular
O ciclo celular é composto de uma sequência ordenada de fases, incluindo G0,
G1, S, G2 e M. Em G0, a célula atinge sua diferenciação terminal e está quiescente. Quando
estimulada a proliferar, esta entra em gap 1(G1 ou primeiro intervalo), período em que
aumenta de tamanho e prepara as proteínas de que necessita para a síntese de DNA. Em G1, a
célula é susceptível às condições do microambiente, que pode parar a divisão em condição
desfavorável. No entanto, se ultrapassar o ponto de restrição (ponto R), a divisão celular
ocorrerá independente dessas condições. Na fase subsequente, de síntese (fase S), ocorre a
síntese de DNA, que será replicado na fase gap 2 (G2 ou segundo intervalo). No início de G2
14
há outro ponto de controle importante, em que será verificada a qualidade do DNA replicado.
Na fase mitótica (M), os cromossomos se condensam na prófase, na metáfase se alinham ao
centro da célula pela ligação ao centrômero, na anáfase separam e migram para os pólos
opostos do fuso e, na telófase, as células se dividem e o DNA duplicado será dividido
igualmente dentre as duas células filhas. Em caso de anormalidades na divisão dos
cromossomos, a mitose é interrompida70,72,76-78
(Figura 7).
FIGURA 7 -Ciclo celular. A) Representação gráfica esquemática do ciclo celular
com as fases G0, G1, S, G2 e M, e os pontos de checagem do ciclo (setas vermelhas). B) As fases da mitose. Interfase, prófase,
metáfase, anáfase e telófase.
Fonte: http://homepage.mac.com/enognog/checkpoint.htm
Nessa sequência ordenada de fases há quatro pontos de verificação que garantem
que uma fase não se inicie antes do término da anterior, bem como confirmam o êxito dos
eventos moleculares de cada fase. Assim, o primeiro ponto de checagem ocorre ao final de
G1; o segundo na fase S, impedindo a célula de avançar no ciclo antes que o DNA complete
sua duplicação; o terceiro ocorre ao final de G2, com a principal função de conferência da
integridade do DNA; e o quarto ponto ocorre em M, mais precisamente na anáfase,
verificando o correto funcionamento do fuso mitótico e associação às fibras dos mesmos, para
que a divisão celular aconteça corretamente72,76,77
.
Esses eventos são controlados pela expressão coordenada do gene da
proteínaretinoblastoma (pRB), e pela interação entre as ciclinas e as quinases dependentes da
15
ciclina (CDK), e as proteínas inibidoras de CDK (CDKIs)70,75,77
. Essas são, portanto,
responsáveis por regular a atividade de um amplo número de proteínas que implicam na
duplicação do DNA e na mitose, com a fosforilação das mesmas em sítios reguladores
específicos, ativando algumas e inibindo outras, mas coordenando-lhes as atividades76,77
.
O crescimento e a diferenciação celular são processos essenciais para os seres
vivos, pois a proliferação das células é necessária para que ocorra a embriogênese, o
crescimento e o funcionamento adequado de diversos tecidos adultos75,76
. Dessa forma, a
população celular é controlada por sinais do microambiente, que podem estimular ou inibir a
sua proliferação. Um excesso de estimuladores ou a deficiência de inibidores levam a célula a
proliferar, entretanto, em casos neoplásicos essa proliferação se dá de forma descontrolada70
.
O principal foco da investigação sobre a proliferação celular tem sido o
entendimento dos mecanismos que regulam o estado proliferativo, trabalho que remete à
identificação dos fatores e dos respectivos receptores de crescimento, bem como das vias de
transdução de sinais e transcrição que permitem as células iniciar e manter o ciclo celular78
.
Em um tecido adulto, o tamanho da população celular é determinado pelo balanço
entre proliferação, diferenciação celular e morte por apoptose70,76
(Figura 8). Entre as
alterações promovidas pelas células neoplásicas, encontram-se as anormalidades na resposta
celular a fatores de crescimento e seus receptores que promovem a proliferação celular, que
inibem apoptose e habilitam células cancerosas a disseminar e a estimular a angiogênese70,75
.
FIGURA 8 - O número de células de um tecido pode ser alterado
pelo aumento ou diminuição da taxa de recrutamento
das células tronco, pela morte celular por apoptose
ou por alterações nas taxas de proliferação ou diferenciação.
Fonte: Adaptado de McGavineZachary70
.
16
A síntese de proteínas é a manifestação de um gene. Por isso, genes que codificam
proteínas que são sintetizadas em um evento de divisão celular normal são denominados
proto-oncogenes, e sua principal função é induzir ou estimular a progressão do ciclo. Quando
esses genes sofrem mutações são chamados oncogenes, cuja ação permitirá ganho de função à
célula mutante, conferindo a esta vantagens de crescimento e desenvolvimento sobre as
células normais. Há ainda genes conhecidos como supressores tumorais ou antioncogenes,
que possuem ação de proteção ou são bloqueadores do ciclo celular, que quando sofrem
mutações perdem a capacidade de realizar suas funções e acabam por permitir a proliferação
celular descontrolada75-78
. Esses genes codificam proteínas que estão envolvidas na inibição
da proliferação celular e que são cruciais para o desenvolvimento e diferenciação celulares79
.
1.4. Fatores de crescimento
Os fatores de crescimento são um conjunto de substâncias, a maioria de natureza
protéica, que juntamente com hormônios e neurotransmissores desempenham importante
função na comunicação intercelular70,78
. Em baixas concentrações, atuam em células alvo in
vivo ou in vitro como mitógenos, isolados ou sinergicamente a outros fatores, por meio da
interação primária com receptores específicos da superfície celular. Fosforilam e ativam uma
cascata de sinais que culmina em ativação de um ou vários genes (transdução de sinal). A
função dos fatores de crescimento é regulada por diferentes mecanismos que controlam a
ativação do gene do fator de crescimento por mecanismos regulatórios em nível transcricional
e da traducional e a modulação da emissão do sinal pelo receptor70,76,78
.
Os fatores de crescimento atuam por três mecanismos, autócrino, parácrino e
endócrino. No primeiro, uma mesma célula produz e responde ao fator de crescimento. No
segundo, uma célula recebe a ação do fator de crescimento produzido por uma célula
adjacente. No terceiro, o fator de crescimento é secretado por uma célula, transportado pela
circulação e age em células distantes76,78
.
Dentre os fatores de crescimento de interesse na gênese do PC destacam-se: fator
de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento transformador alfa e beta (TGF-α;
TGF-β), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento de
queratinócito (KGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento
plaquetário (PDGF) e fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)81
(Quadro 1).
17
QUADRO 1 - Fatores de crescimento, células de origem, sítios alvo e suas funções no tecido
prostático normal e neoplásico
FC Célula origem Sítios alvo Papel napróstata
normal
Papel no PC
EGF Superfície
luminal do
tecido epitelial
EGFR na superfície do
tecido epitelial baso
lateral
Regula o
crescimento
Superexpressão em
metástase e invasão
tumoral
TGF-α Estroma EGFR na superfície de células epiteliais
basolaterais
Regulação do crescimento
Superexpressão nas células epiteliais
TGF- β Estroma e
músculo esquelético
TβRI e TβRII na
superfície das células epiteliais
Induz apoptose,
controla crescimento celular
via bFGF
Superexpressão no PC
IGF-I Estroma IGF1R na superfície da
célula epitelial, sequestrado e degradado
por IGF2R
Promove
crescimento e diferenciação
celular
Expressão epitelial e
níveis séricos aumentados
FGF Estroma bFGF receptor em
células estromais no tecido normal e presente
nas células epiteliais no
PC
Regulação do
crescimento
Superexpresso em
metástase e promove angiogênese
KGF Estroma e epitelial
FGFR2 receptorna célula epitelial
Mediador da ativação
androgênica
Produção epitelial com progressão
independente de
andrógenos
PDGF Estroma e epitelial no PC
PDGFα receptor em células epiteliais no PC
Baixa expressão Aumento da expressão dos receptores no PC
VEGF Epitelial Células endoteliais Não definido Expressão aumentada
no PC
PC - carcinoma prostático Fonte: Adaptado de Hellawell e Brewster
80.
1.5. Receptores de fator de crescimento epidérmico -EGFR/Her1 e Her2/c-erbB-2
O fator de crescimento epidérmico (EGF) é um membro da família dos fatores de
crescimento (FC) que compartilha o mesmo receptor, o receptor de fator de crescimento
epidérmico (EGFR), com o fator de crescimento transformador alfa (TGF- α). É detectado em
praticamente todo o organismo, principalmente saliva, secreções mamárias, prostáticas, da
vesícula seminal e na urina, na qual se encontra em alta concentração82-84
.
O eixo EGF, composto pelos fatores de crescimento EGF e TGF-α, seus
receptores (EGFR), receptores de andrógenos (AR), testosterona, hormônio hipotalâmico
(LH-RH) e antígeno prostático específico (PSA), é considerado uma das formas de ativação
não androgênica dos receptores androgênicos nas alterações prostáticas malignas, sendo esse
eixo relacionado à progressão do PC. Nesse âmbito, a mediação da atividade mitogênica dos
ligantes EGF e TGF-α, utilizando vias de ativação parácrina e autócrina, é feita pelos
18
receptores EGFR e AR, por modulação do LH-RH ou da testosterona e por ação direta do
EGF em ambos os receptores, mesmo em meio ausente de andrógenos, no qual o PSA
representa importante protease do EGFR84
.
Na próstata, o EGF é produzido no tecido normal, na HPB e no PC82,84,86
, sendo
que, para Pina et al.82
, não há relação entre níveis séricos de EGF e carga tumoral ou escala
de Gleason. Embora no PC o EGF circulante se manifeste com hiperprodução autóloga em
aproximadamente 50% dos casos, provavelmente o seu principal papel será o da atividade
autócrina, não só na diferenciação neuroendócrina, como também no estímulo migratório
celular do câncer em fase androgênica. Contudo, a baixa imunorreatividade de EGFR está
associada a prognóstico favorável em pacientes com câncer de próstata86
.
A família do EGFR, um receptor tirosina-quinase, desempenha papel importante
na determinação da linhagem celular, na morfogênese de vários órgãos e na sobrevivência das
células no adulto. A superexpressão contribui para a tumorigênese, induzindo as células a
proliferar e resistir a apoptose81-88
. A família compreende os receptores EGFR ou Her1, Her2
ou c-erbB-2, Her3 ou c-erbB-3 e Her4 ou c-erbB-4, codificados pelos genes ErbB
(erythroblastic leukemia viral oncogene homolog) 1, ErbB2, ErbB3 e ErbB4,respectivamente.
As proteínas produzidas pelos membros dessa família possuem em comum estrutura
composta de domínio de ligação extracelular, este constituído por quatro subdomínios (L1,
CR1, L2 e CR2 - I, II, III, IV), dispostos em repetição de duas unidades e separados por
resíduos ricos em cisteína; um segmento lipofílico transmembrana; e área citoplasmática com
domínio de atividade tirosina-quinase, a qual possui locais de auto fosforilação para regulação
em cauda c-terminal85,87-89
(Figura 9).
O receptor EGFRpossuiestrutura que compreendedomíniode ligação extracelular,
domínio hidrofóbico transmembrânico edomínio intracelularcom domínio de tirosina-quinase
para a transdução desinal. Ao ser ativado pela ligação com o EGF ou TGF-α, promove sua
dimerização ou a heterodimerização comoutro membrodafamíliaerbB. Issoleva àativaçãoda
tirosina-quinase associadaao receptoreresulta em uma cascata de sinalização de efeitos
diversos, incluindo migração de células, maturação, diferenciação, metástase,
angiogêneseeinibição daapoptose85,89,90-93
. O receptor EGFR pode estar superexpresso em
uma variedade detumores sólidos,incluindo cancer de mama, cabeçaepescoço, pulmão e
próstata90
, sendo, nesse caso, associado à estadio avançado, prognóstico ruim e resistência à
quimioterapia, hormonioterapia e radioterapia92-94
.
19
FIGURA 9 - Receptores da família do EGF (EGFR, Her2, Her3,
Her4) apresentando sítio de ligação extracelular,
porção transmembrana e domínio da tirosina quinase intracelular.
Fonte: Adaptado de Ciardello e Tortora144
.
Segundo Nicholson et al.54
e CiardielloeTortora90
, o EGFRpodeseravaliadode
várias formas, sendo a imunoistoquímica (IHQ) a melhor e mais comum técnica utilizada para
essa avaliação. O método da PCR para detectar DNA proporciona informações sobrea
amplificação, deleçãooumutaçãodo gene. No entanto, nãoreflete a quantidade deproteína
produzida. Ainda, a técnica de PCR utilizada para avaliaros níveis de mRNA pode resultar em
problemasde degradação econtaminação do RNA.
Os receptores Her2e Her3funcionam como co-receptores, pois Her3 possui
domínio quinase inativo, que se ativa ao ligar com Her2, o qual não possui ligante específico
para ser ativado e, para isso, utiliza outros membros da família (EGFR, Her3 ou Her4)95
.
Yarden e Sliwkowski96
ressaltaram que homodímerossão menosmitogênicos em
comparação aos heterodímeros, e assim possuem baixa atividade detransformação. Dessa
forma, o Her2 por ser preferencialmente heterodímero e possuir maior atividade de tirosina-
quinase tende a ser mais potente e gerar sinais intracelulares intensos, o que confere maior
potencial mitogênico. Portanto, níveis deoutrosreceptores da famíliaErbB, em particular Her2,
pode afetar significativamente asinalizaçãodo EGFRno câncer em humanos. Ainda, para Daly
et al.97
e Pal e Pegram 98
, o Her2é o par de eleição aos demais membros da família no
processo de heterodimerização. Isso ocorre devido à sua conformação estrutural, que promove
a exposição permanente dos domínios de dimerização99
.
Os ligantes para a família EGFR incluem EGF, amphiregulin e TGF-α, os quais
se ligam preferencialmente ao EGFR, enquanto betacellulin (BTC), heparina EGF (HB-EFG)
20
e epiregulin (EPR) ligam-se ao EGFR e Her4. Neuregulinas 1 (NGR1) e 2 (NGR2) ligam-se
preferencialmente a Her3 e Her4, e NGR3 e NGR4 somente a Her489,100
(Quadro 2). Assim, a
formação do complexo para a ativação do Her2 ocorre pela sua união com um fator de
crescimento, por meio de um ligante, quando é desencadeada sua função tirosina-quinase e
autofosforilação da tirosina. Isso desencadeia uma série de eventos em cascata, resultado da
transmissão de sinais através da membrana celular e do citoplasma até o núcleo, onde ocorre
ativação gênica, estimulação da mitose, bloqueio da apoptose e estimulação da
neoangiogênese tumoral100
.
QUADRO 2 - Fatores de crescimento que ativam (+) a família de
receptores EGFR.
Fonte: Adaptado de Linggi e Carpenter
100.
Embora a IHQ constitua a técnica comumente utilizada para avaliaros níveis
protéicos de EGFR no tecido, compreende método estritamentequalitativo, sem sistemade
pontuação validado, de interpretação subjetiva e que avalia apenas a presença e não a
atividade da proteína. Além disso,mostrauma imagemestática, não funcionaldoestadocelular,
quando écada vez maisevidenteque o EGFR épartedeumsistemaaltamentedinâmico,
ondealteraçõessignificativas podem ocorreremcurtos períodos detempo. Assim, para uma
abordagem dinâmica da funcionalidade deEGFRse faz necessária a avaliação conjunta dos
níveis da proteína pela expressão de seu RNAm utilizando a técnica de PCR.No entanto, pode
ser simplistaconsiderar a IHQcomo o único fator ao fracasso da correlação entre EGFR e
prognósticoou eficácia de tratamento,deve-se considerar auniãocom aexpressão de Her289
.
O receptor Her2pode ter sua expressão aumentada no processo de transformação e
progressão tumoral, sendo que a redução de p27, um inibidor de ciclinas, pode induzir
superexpressão desse receptor100
. Ainda, o aumento de Her2e a redução de EGFR estão
21
relacionados à carcinogênese prostática101
. A expressão de Her2é regulada por fatores de
crescimento e sua transformação a oncogene ocorre geralmente por amplificação gênica,
originando síntese protéica elevada. Quando o gene HER-2 é superexpresso, a concentração
protéicaéde dez a 100 vezes maior do que no epitélio normal, porém sem que ocorra alteração
estrutural da proteína100
, ou seja, o gene está superexpresso na ausência de mutação gênica.
Geralmente, os carcinomas com expressão positiva para Her2 apresentam alto
grau de indiferenciação histológica, alta taxa de proliferação, baixa expressão de bcl-2 e dos
receptores de estrógeno e progesterona103
. O aumento na expressão de Her2 relaciona-se à
maior agressividade dos carcinomas em estágio inicial ou avançado, podendo ser indicador de
prognóstico de recidivas e de estimativa da sobrevida103
. Ainda, segundo Gutierrez e
Schiff104
, tumores que expressam Her2 possuem maior percentagem de aneuploidia, maior
propensão de metástase e resistência à terapia endócrina.
Em veterinária, a expressão deEGFRjá foidetectada nos tumoresmamários105,106
,
cerebrais primários107
, carcinomas nasais108
, carcinomas de pulmão109
, e gástricos110
. A
superexpressão de Her2 foi relatada entre8,3%168
e 40%173
das neoplasias mamárias
caninas105,106
, e em 61% dos tumores gástricos em cães110
. Entretanto, não há relatos acerca da
expressão desses receptores na próstata canina. Ressalte-se que EGFR e Her2 são
biologicamente semelhantes nas espécies canina e humana, com 80% de homologia quanto
aos genes que codificam as proteínas111
.
Beselga112
em um estudo com tumores mamários de cadela comparou a
imunoexpressão de Her2 utilizando anticorpos de diferentes clones (CB11, 4B5, TAB250 e
SP3) e observou que apenas aqueles que reconhecem o domínio intracelular (CB11 e 4B5)
detectam o receptor Her2nos tecidos neoplásicos de mama canina. Ainda, o autor não
observou correlação positiva entre a superexpressão de Her2 e o grau de malignidade ou o
tipo histológico. Já Hus et al.175
observaram que cadelas com tumor de mama Her2 negativo
apresentaram menor taxa de sobrevivência em um período de dois anos. Segundo os autores,
não se conhece a razão da diferença observada entre as espécies canina e humana no que diz
respeito a superexpressão de Her2 e sua relação com agressividade tumoral a sobrevida. Os
autores complementam que os resultados sugerem queHer2desempenha papel naformação de
tumormamáriocanino,mas a agressividade tumoral pode não estar diretamenteassociada a
superexpressão de Her2.
Hsu et al.113
também observaram associação significativa entre superexpressão de
Her2 eovariosalpingohisterectomia (OSH). Os tumores de cadelassubmetidas aOHSantes ou
nomomento da retirada dotumor apresentaram maior propensão à superexpressão de Her2 em
22
comparação àqueles tumores provenientes de cadelas não submetidas a OSH. Também não
observaram correlação entre expressão tumoral de Her2 e peso corporal, estágio e tamanho do
tumor, glândula afetada, número de tumores, classificação histológica, infiltração linfática,
metástases à distância e morte. Já Dutraetal.114
, utilizando 48 amostras de tumor de mama
canino maligno e 22de tumorbenigno observaram superexpressão de Her2em35,4% das
amostras malignas, sendo as amostras benignas negativas para Her2. Os autores também
encontraramcorrelação positiva entreHer2epleomorfismonuclear, contagem de mitosee
diferenciação histológica, oposto relatado por Hsuetal.113
eBeselga112
, sugerindo que a
expressão de Her2está associada a crescimento e divisão celular nos tumores mamários
caninos. Ao final, os autores concluiram quanto a estreita relação entre morfologia e
imunofenótipo nos tumores mamários das cadelas, a exemplo do que ocorre nos tumores
mamários da mulher.
1.6. Inibidores de ciclina dependente de quinase - p21, p27 e p53
O ciclo celular é regulado por um grupo de inibidores de ciclina dependentes de
quinase (CdkI) que inibem a produção de Cdk. Duas famílias de CdkI são descritas de acordo
com seu mecanismo de ação, a família dos inibidores de Cdk4 (INK4), que compreende as
proteínas p16INK4A
, p15INK4B
, p18INK4C
e p19INK4D
(ou p14ARF
), responsáveis por inibir os
complexos Cdk4/ciclina D1 e Cdk6/ciclina D1 na transição G1-S; e a família dos Cdk-
interacting protein 1/inibidor de proteína quinase (CIP/KIP), que compreende as proteínas
p21WAF1/CIP1
, p27KIP1
e p57KIP2
, que atuam inibindo a atividade de múltiplos complexos Cdk1-
Cdk2-Cdk4-Cdk6/ciclina D176,115
(Figura 10).
23
FIGURA 10 - Representação esquemática do ciclo celular com as fases G0,
G1, G2 e M,e ação de proteínas estimuladoras (ciclinas e cdk’s),inibidoras(p21, p27,p57, p16, p15,p18 e p19), e de
controle do ciclo (c-myc).TGF-β induz a produção dos
inibidores. Fonte: adaptado de Ward
74.
O inibidor de ciclina dependente de quinase1A(CDKN1A) é o genequecodifica a
proteína p21, a qual se associa a mecanismosde parada do ciclo celular entre as fases G1-S, a
reparo do DNA, a mecanismos antiapoptóticos116
, a proliferação e diferenciação celular com
indução à senescência e mecanismo de proteção contra transformações malignas115-118
. A
função da p21, mediada pela proteína p53, relaciona-se a sua concentração, já que em baixos
níveis de p21 ocorre efeito estimulante aos complexos Cdk4/ciclina D1115-120
. A ausência de
p21 leva a um déficit na capacidade de parada do ciclo celular em G1, em resposta aos danos
no DNA. No entanto, o aumento da expressãodep21nãoestá necessariamente ligado àparada
do crescimento, tendo em vista que esta desempenha papelduplo, atuando como inibidor e
estimulador da atividadede ciclina/Cdk117
. Aredução ouausênciadep21temsidomostradaem
culturas celulares detumoressemp53,ouque contenham uma forma mutanteafuncionaldo
geneTP53119
e do gene que codifica aproteína fosfatase tensina homologa (PTEN)121
, uma vez
que a expressão da proteína p21 reflete o estado funcional da proteína p53119-122
.
Mutações somáticas no gene CDKN1A foram descritas em PC123
, mas não
correlacionada sua expressão ao grau histológico, estágio clínico ou prognóstico do câncer,
seja de forma isolada ou combinada a p53124
. Além disso, estudostêm revelado que
adiminuição da expressãoda proteínap21é frequente no cãncergástrico, da vesícula biliar, do
colorretal, e carcinomasdo endométrio em humanos124,125
. Já nos cães a redução de expressão
24
da p21 foi observada em melanomas125
, tumores de mama205
, de terceira pálpebra127
e
renais128
, mas ainda não se conhece quanto à expressão de p21 na próstata desses animais.
De acordo com Li et al.124
, ap21quando fosforilada por AKT tende a ser estável,
sendo observada comumente no núcleo celular117
. No entanto, há relatos de
localizaçãocitoplasmáticade p21 resultante da ativaçãodeAKTcomHer2
esubsequentefosforilaçãode p21118
. A p21 quando acumulada no citoplasma contribui para o
crescimento ativo egera resistência da célula a apoptose118,125
. Ainda, Lin et al.124
ao avaliar
p21 ePTEN por meio da imunoistoquímicamostraramrelação inversamente proporcionalentre
a expressãodePTENelocalização citoplasmáticade p21, reiterando sua ação antiapoptose124
e
implicando em comportamento mais agressivo do tumor e pior prognóstico118,124,130
. No
entanto, temsidodescritoque a proteína PTEN inibe a degradaçãode p53 mediada por Mdm-
2133
, por isso épossívelqueoaumento observadonos níveis dep21 seja mediado pela proteína
p53 ouMdm-2, oupor mecanismo independente dep53134
.
Segundo Majid et al.134
, a expressão aumentada de p21 pode significar bom
prognóstico, uma vez que em testes utilizando modelos animais e o potente agente terapêutico
anticâncer inibidor de tirosina quinase, genisteína, foi observado aumento da expressão do
gene CDKN1A, codificador de p21, com concomitante declínio de ciclinas em cultura de
células prostáticas andrógeno dependentes (LNCaP) e independentes (DuPro).
TambémWangetal.74
, emestudocom o agente anticâncer ácido metilselénico (MSeA) sobre
cultura de células de PChumano (DU145),relataramaumento significativodonívelde RNAm
parap21 ep27, e redução de RNAm para ciclina D1(CD1)apóstratamento com MSeAdurante
24horas. Ainda, esse aumento foi maioremais rápidopara o RNAm de p21 (3horas) em
comparação ao RNAm dep27 (12horas). Segundo os autores, essesdados
sustentamqueoaumentodep21 ep27remetema bomprognóstico, easdiferenças noespaço de
tempodep21 ep27sugeremque a indução dep21seria maisimportante do que a de
p27paraaparada do ciclo celular em G1124,125
.
Aaltomaaetal.135
relataram o oposto, quep21está significativamente relacionado
aprognóstico desfavorável. Concluíram quea expressão da proteínap21associa-se à
proliferação celulare à sobrevida do paciente com PC. Ainda, segundo Huang et al.123
, a p21
pode ter participação na patogênese da HPB, pois uma alteração no gene CDKN1A pode
causar desequilíbrio entre a proliferação de células epiteliais e do estroma da próstata e falha
da apoptose, contribuindo para o acúmulo de células característico da HPB. No entanto, vale
ressaltar que as alterações relacionadas à expressão p21 nem sempre têm origem em mutação
do CDKN1A, podendo também ocorrer alterações epigenéticas, ou seja, aquelas que
25
envolvem metilação, acetilação e aumento ou modificação de histonas, já que CDKN1A é
frequentemente silenciado por metilação no PC humano, reduzindo a síntese de p21. Da
mesma forma, é possível que ocorra aumento na síntese de p21 quando da ativação do
mecanismo de modificação de histonas136
.
O inibidor de ciclina dependentede quinase1B(CDKN1B) é o genequecodifica a
proteína p27, membro dafamíliaCIP/KIP, que atua de forma a inibir a proliferação celularea
carcinogênese136,137
. Contrariamente à p21, que parece ser uma CdkI universal, já que atua
sobre diferentes complexos Cdk/ciclina, a p27 exerce função de modulação inibitória apenas
sobre o complexo Cdk2/ciclina E, o que resulta em bloqueio da entrada da célula na fase S.
Ressalte-se que essa função inibitória do p27 só é possível a partir de sua ligação aos
receptores de TGF-β113,115
. Portanto, a ausência de sinalização de TGF-β contribui para a
proliferação celular anormal e para a malignidade117
Segundo Coqueret138
, aredução da expressão dep27 sugere prognóstico
desfavorável, tendo em vista que em sua ausência ocorre manutenção da célula no ciclo
celular. Essa redução de expressão de p27 tem sido observada em várias neoplasias, incluindo
as da próstata. Yang et al.135
e De Marzo et al.26
observaram menor expressão de p27 em
lesões como HPB, PIN e PC, concluindo que isso contribui para a alta taxa de mitose nessas
lesões proliferativas. Também Wangetal.139
observaram expressãoelevada dep27 em células
normais, comlesões hiperplásicasmuito precoceseem células com PIN e concluíram que o
aumento da expressãodep27 contribui para a prevençãoe inibe aprogressão das lesõesde
PINparaPCinvasivo. Da mesma forma, Majumderetal.140
e DiCristofanoet al.141
observaram
elevada expressão dep27emlesões de PIN experimentalmente induzidas em camundongos.
Tayloretal.142
completaram que na redução ou ausência de expressão de p27 a PIN possui
maior potencial de progressão edesenvolvimento de um fenótipo mais agressivo.
Wang et al.139
demonstraram que o epitélio nas lesões de PIA possui suas próprias
características moleculares, com fenótipo intermediário entre o das células basais e luminais,
isto é, expressa fatores de crescimento que podem aumentar a atividade de proliferação e
regular a expressão de p27, podendo, dessa forma, servir como marcador de evolução tumoral
e prognóstica75,26
.
Em tumores mamários de cadelas, Klopfleisch et al.143
observaram redução da
imunoexpressão de p27, já que as amostras de epitélio mamário normal apresentaram maior
expressão dessa proteína em comparação às amostras de tecido mamário com adenomas e
carcinomas. Em outro estudo de neoplasias mamárias em cadelas, Klopfleische
Gruber126
tambémrelataramredução significativadonível deexpressão de RNAm dep27em40%
26
dos adenomas, 90% de adenocarcinomase80% dasmetástases nos nódulos linfáticos
regionais,quandocomparado àglândulamamárianão neoplásica. Os autores concluíram que o
controle do ciclocelular via p27 é falho na maioria dos tumores mamários caninos e ainda que
essa redução representa papel importante na evolução do processo tumoral, apesar de não
terem observado diferençasignificativa na expressão de p27 entretumoresmamários
benignosemalignos. Isso limita a utilização dessa proteína como marcador de malignidade
para os tumores mamários caninos, mas não descarta o envolvimento da mesma na regulação
do crescimento tumoral79
.
O produto do gene TP53, a proteína p53, é considerada a guardiã do genoma, a
chave reguladora, pois é responsável por regular grande parte dos processos celulares,
incluindo o ciclo celular, reparo do DNA, estabilização do genoma, morte celular
programada, diferenciação, senescência e angiogênese144
. Em condições normais a proteína
p53, conhecida como p53 tipo selvagem, possui meia-vida curta, sendo degradada
imediatamente após o término de sua função. Assim, é sabido que mutações no gene TP53
resultam em falha da proteção celular, desestabilização do genoma e permite a produção de
proteína p53 afuncional, que se acumula na célula e é eliminada lentamente, o que permite
sua detecção nuclear pela técnica da IHQ76
.
O ciclo celular prossegue normalmente sob a vigilância passiva de p53 em níveis
baixos. Quando um erro ocorre na transcrição do DNA, esta interrompe o ciclo na fase S para
a atuação dos mecanismos de reparação, ou seja, os níveis de p53 se elevam e há indução da
expressão de p21, que impedirá a ligação Cdk-ciclina. Consequentemente, pRB não será
fosforilada, impedindo assim a liberação do fator de transcrição (E2F), com parada do ciclo
na fase S. Nesse momento, a célula pode promover reparo do DNA e seguir no ciclo ou
acionar eventos apoptóticos para que ocorra a destruição da célula danificada70,115,122
.
A ação da p53 é inibida quando da ligação à proteína murine double minutes
(Mdm2), impedindo-a de reativar a transcrição da proteína p21. No entanto, o gene que
codifica a proteína Mdm2, gene MDM2, é ativado por transcrição pela p53, evitando o
excesso funcional da mesma. Em células tumorais, os níveis de Mdm2 estão aumentados e há
o decréscimo na concentração de p53117
, mas também pode haver mutação do gene TP53,
seguida de ausência de expressão da proteína p53. Nesses casos, as células com danos no
DNA escapam do reparo ou do processo de apoptose, dando início a um clone
maligno115,122,145,146
.
Entre as neoplasias humanas, o TP53 é considerado o gene mais comumente
alterado146
. Nos animais, alterações nogene TP53foram identificados em vários tipos de
27
tumor, como de tiroide147
, papilomaoral148
, mamário149-150
, osteossarcoma151
, adenomada
glândula hepatoide152
, linfoma153
e próstata55,154
.
Segundo Stricker et al.155
, Cheng et al.156
, Leite et al. 157
e Tsujimoto et al.158
, em
humanos com PIN e PC quanto maior a expressão da p53 maior a probabilidade de
progressão da doença devido a índices proliferativos mais elevados e a um fenótipo mais
agressivo. Ainda, de acordo com Stricker et al.155
, nos casos de carcinoma prostático humano
em que a expressão da p53 foi pouco expressiva o câncer não progredia. Ressalte-se que a
avaliação imunoistoquímica da proteína p53 não deve ser considerada isoladamente na
determinação do prognóstico das alterações prostáticas de caráter maligno, considerando que
devido a meia-vida curta da proteína, é possível reação cruzada entre as formas selvagem e
mutante, como demonstrado por Wang et al.47
.
Na próstata canina, a expressão de p53 foi relatada em alguns trabalhos, mas com
resultados antagônicos. Di Santis58
não detectou a expressão de p53 nas afecções da próstata
canina. De outra parte, Croce et al.55
verificaram sua expressão tanto no tecido prostático
normal quanto com PC, e ainda nas lesões proliferativas e atípicas da próstata canina, sendo
que 95% das amostras de PIA e PC apresentavam-se intensamente marcadas quando
comparadas às amostras de tecido normal. Embora não tenham observado imunomarcação de
p53 no tecido prostático normal, Faleiro e De Moura 154
obtiveram resultados semelhantes aos
de Croce et al.55
, já que observaram imunomarcação de p53 em amostras de próstata canina
com PIA, PIN e PC. Nesse estudo, os autores argumentaram que a elevada expressão de p53
constatada nos casos de PIA se justifica em decorrência do microambiente inflamatório, fator
importante na promoção da alteração da p53. Ainda, segundo Wang et al.47
, a p53 mutante é
frequentemente detectada em tecidos com inflamação crônica, incluindo colangioepatites,
gastrites e colites, assim como Tsujimoto et al.158
também referiram a expressão de p53 na
atrofia inflamatória pós-atrófica da próstata humana.
1.7. Ciclina D1 (CD1)
As ciclinas, produtos do gene CLN (neuronal ceroid lipofuscinosis), são enzimas
reguladoras das subunidades das ciclinas dependentes de quinase (Cdk). Diferentes ciclinas se
associam a diferentes Cdk, podendo associar-se a mais de uma Cdk nas diferentes fases do
ciclo celular. Esse grupo de enzimas, por sua vez, fosforila uma série de substratos-chave que
permitirão a progressão de uma fase à outra do ciclo75-77,159
. Em G0 não há expressão de
ciclinas nem de Cdk. Em G1 há expressão dos complexos Cdk4/ciclina D1 e Cdk6/ciclina D1
e, ao passo que se aproxima o ponto de restrição, ocorre aumento do complexo Cdk2/ciclina
28
E. Já em S há expressão de Cdk2/ciclina A e, em G2, de Cdk1/ciclina B e Cdk1/ciclina A, que
se intensifica em M75-77,161
(Figura 11).
FIGURA 11 - Representação gráfica da atividade dos
complexos Cdk/ciclina durante o ciclo
celular. A largura das faixas coloridas é
aproximadamente proporcional à atividade dos complexos indicados.
Fonte: Lodish et al.76
.
Na fase G1, a CD1 representa um ponto crítico de regulação e, por isso, alterações
na sua expressão estão relacionadas à tumorigênese e à progressão tumoral de diferentes tipos
neoplásicos, incluindo os prostáticos. Ainda, em muitos casos há correlação entre essa
alteração e a expressão e regulação esteróide, com aumento de receptores de andrógenos77,162
.
Dessa forma, a avaliação da expressão da CD1 pode fornecer informações de prognóstico,
tendo em vista que maior expressão foi observada em lesões indiferenciadas e avançadas135
.
Quanto às outras ciclinas, pouco se conhece acerca do seu papel na carcinogênese
prostática77
.
O geneda CD1, CCND1, é reguladoem nívelde transcriçãopela interação entre a
proteínas guanilato quinase (ZO-2), E-box, e c-myc, e recrutamento de histonas
desacetiladas159,160
, sendo essa transcrição reprimida pelas proteínas fosfatase tensina
homologa (PTEN)162
e p53163
. Segundo Tapia et al.159
, a expressão aumentada de ZO-2 é
capaz de induzir a redução da expressão de CD1 em células epiteliais e, dessa forma, há
redução na proliferação celular, com bloqueio na fase G0/G1 do ciclo celular e manutenção
da taxa de apoptose.
A CD1éimportante na regulaçãodociclo celular e estudos em modelos animais
sugerem que essa enzima pode atuar como oncogene de predileção, pois a superexpressão de
CD1 nas células mamárias de camundongos transgênicos levou ao desenvolvimento de
29
hiperplasia e neoplasia164
. Oncogene de predileção é um termo utilizado para descrever o
fenômeno em que a superatividade de determinado oncogene é requisito para que as células
neoplásicas sobrevivam e proliferem. Assim, oncogenes de predileção são alvos para o
desenvolvimento de drogas que possam bloquear seus efeitos sobre as células neoplásicas,
mas sem afetar a viabilidade de células normais163
.
ACD1é uma proteínainstável e de meia-vida curta, sendo que seu acúmulo induz
arápida progressãodociclo celular da fase G1 paraS. A CD1 também atua em conjunto com a
proteína RecA recombinase (RAD51), ativando vias de reparo de DNA, com redução de sua
expressão nessas situações, embora isso não necessariamente implique em redução da
proliferação de células prostáticas neoplásicas161
, o que sugere que a CD1 não é a única
envolvida no processo de proliferação neoplásica. Entretanto, muitos autores relataram a
relação entre superexpressão de CD1 e proliferação de vários tipos de câncer em
humanos164,165
.
1.8. Proteínas c-myc
Outro importante elemento relacionado à regulação do ciclo celular é o oncogene
C-MYC, que codifica as proteínas myc1 ou p67 e myc2 ou p64, ou simplesmente proteínas c-
myc165,166
. Essas proteínas suprimem a transcrição de genes como o CDKN1A (transcritor da
proteína p21) e CDKN1B (transcritor da proteína p27) e ativam a transcrição das proteínas
Cdk2, Cdk4 e pRB, com consequente liberação de E2F e superação do efeito inibitório do
TGF-β sobre o ciclo celular, culminando com a passagem da fase G1 para S75,115,167
. Assim,
participa de forma direta e indireta nos processos associados à transformação e metabolismo
celulares, apoptose e instabilidade genômica52,75,165,167-169
.
A ativação inapropriada do C-MYC pode contribuir para o desenvolvimento
neoplásico por diferentes mecanismos, incluindo translocaçãocromossômica, amplificação
gênica einserção do generetroviral165,166
.Outrosestudossugeriramque as proteínas c-myc
estimulamaproduçãomitocondrialderadicais livres, o que comprometeo DNA, causando
instabilidade genômica. No entanto, não são consideradasessenciaispara mecanismos que
envolvem metástase165,168,169
.
Sendo ogene C-MYC um elemento-chave no processo de tumorigênese, já foi
observado em váriostipos de câncer, incluindo osmamários165,169-174
e prostáticos em
humanos175,176
e cães39
, bem como palpebrais em cães127
, osteossarcomas caninos 265
, tumor
venéreo transmissível canino177
, mamários em ratas170
e prostáticos em camundongos179
.
30
De acordo comSong etal.180
, Iwataetal.181
e Kohetal.175
, a proteína c-myc está
elevadaem87% dos casosPC humano esignificativamente aumentada em relação ao tecido
prostático normal e não neoplásico. Ainda, segundo Qianetal.168
e Kohetal.175
, a c-myc está
associada ao grau de diferenciação e estágio avançado do tumor, sendo observada nos casos
de PC com escore de Gleason maior que cinco e naqueles com metástases, caracterizando pior
prognóstico115,184
.
Fonseca-Alves etal.39
relataram maior positividade de c-myc na prostáta canina
com PIA e PCem comparaçãoàquelas normais, sendo observada imunoexpressão aumentada
nas amostras de PIA. Os autores completaram que a proteína c-myc é normalmente
expressanocitoplasmadas célulasepiteliais da próstata com PC equeestá associada à perdado
gene NKX3.1, um gene supressor detumor, e da proteína de junção E-caderina. Entretanto,
também descrevem imunomarcação nuclear de c-myc em algunscasosde PC concomitante a
focos dePIN, o que já havia sido relatado por Gureletal.182
eProwatkeetal.183
.
Ellwood-Yen etal.184
, Iwataetal.181
, Kohet
al.175
eNakagawaeYamanaka185
hipotetizaram que oaumento daexpressão de c-myc no
PChumanopromovea proliferação e diferenciaçãode células tumorais,emespecial das
célulasbasais, bem como alterações na viaapoptótica, uma vez que a superexpressãonuclearde
c-myc correlaciona-se a PINe sua transiçãopara PC.Civennietal.176
estudaram a expressão do
gene C-MYC em uma subpopulação de células neoplásicas semelhantes a células tronco (CSC
- cancer stem cell like) e observaram redução das CSCem resposta ao silenciamento desse
gene, concluindo que na ausência de ação do C-MYC ocorre ativaçãodos mecanismos
desenescência e redução do potencial tumorigênico e metastático. Os autores estudaram ainda
a expressão de C-MYC em diferentes tipos tumorais e obtiveram o mesmo silenciamento
gênico nos casos de PC. Entretanto, concluíram que a relação entre redução de proliferação
celular e silenciamento do C-MYC não compreende mecanismo único envolvido no
crescimento tumoral, tendo em vista que também foi observada proliferação de células
quando do C-MYC silenciado.
2. Objetivos
Com o intuito de melhor compreender os mecanismos celulares envolvidos em
lesões proliferativas da próstata canina, este trabalho teve por objetivo avaliar a expressão
gênica de ErbB1, ErbB2, CDKN1A, CDKN1B e TP53, e a imunomarcação de EGFR, Her2,
p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc no tecido prostático canino normal e com HPB, PIA, PIN e
PC.Para a avaliação da expressão gênica foram utilizadas as técnicasRT-PCR e RT-
31
qPCRcomRNAm de amostras próstata canina parafinizada e para a imunomarcação a técnica
de imunoistoquímica em lâminas demicroarranjo tecidual.
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“O corpo herda naturalmente do corpo, segundo as disposições da mente que se ajusta a
outras mentes, nos circuitos da afinidade, cabendo, pois, ao homem responsável
reconhecer que a hereditariedade relativa, mas compulsória lhe talhará o corpo físico de
que necessita (...) unidades de força psicossomática que atuam no citoplasma,
projetando sobre as células e, consequentemente, sobre o corpo os estados da mente...”
André Luiz (Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)
Evolução em dois mundos (1959)
43
CAPÍTULO 2 - EGF receptors expression in canine prostate with
proliferative inflammatory atrophy and carcinoma
ABSTRACT
In this study, gene expression of ErbB1 and ErbB2 and immunostaining of EGFR (Her1) and
Her2 (c-erbB-2) were evaluated to verify if those receptors are involved in canine
premalignant and malignant prostatic lesions, proliferative inflammatory atrophy (PIA) and
carcinoma (PC). From 70 prostatic samples obtained, 15 were considered normal, 30 had PIA
and 25 PC. Regarding EGFR immunostaining intensity there was no difference between
normal prostatic tissue and PIA or PC. In contrast, in relation to immunostainig intensity for
Her2, differences between normal prostatic tissue and with PIA and PC, and also between
PIA and PC, were recorded. There was no correlation between EGFR and Her2
immunostaining. RT-PCR was performed in sixteen samples of canine prostatic formalin-
fixed paraffin embedded tissue (FFPE), four of which were considered normal, three had PIA
and nine PC. ErbB1 gene product was detected in two normal samples, in one with PIA, and
in all samples with PC. ErbB2 mRNA was recorded in two canine samples with PIA, in all
with PC, but not detected in normal prostatic tissue. It was concluded that EGFR and Her2
play an important role in canine PIA and early lesions of canine PC, particularly Her2,
suggesting that those receptors may be involved in canine prostatic carcinogenesis and
tumoral development.
Key words: c-erbB-2, growth factor receptor, Her1, PIA, RT-PCR.
44
Expressão de receptores EGF na próstata canina com atrofia inflamatória
proliferativa e carcinoma
RESUMO
Neste estudo a expressão gênica de ErbB1 e ErbB2 e a imunomarcação de EGFR (Her1) e
Her2 (c-erbB-2) foram avaliadas com o objetivo de verificar quanto ao envolvimento desses
receptores nas lesões pré malignas e malignas da próstata canina,como a atrofia proliferativa
inflamatória (PIA) e o carcinoma prostático (PC). Foram obtidas 70 amostras de próstata
canina, sendo 15 normais, 30 com PIA e 25 com PC. Em relação àintensidade de
imunomarcação de membrana para EGFR, não houve diferença estatística entre os tecidos
prostáticos normais e com PIA e PC. Em relação a Her2, observou-se diferença estatística de
imunomarcação entre o tecido prostático normal e aqueles com PIA e PC e entre os com PIA
e PC. Não houve correlação de imunoexpressão de EGFR e Her2. Foram utilizadas dezesseis
amostras de cDNA de próstata canina FFPE para a realização da RT-PCR, sendo quatro
normais, três com PIA e nove com PC. O gene ErbB1 foi detectado em duas amostras
normais, uma de PIA e em todas as amostras de PC. O gene ErbB2 foi detectado em duas
amostras de PIA e em todas as amostras de PC, não sendo detectado no tecido prostático
normal. Concluiu-se que o EGFRe Her2atuam nas lesões de PIA e PC, com ação importante
do receptor Her2, sugerindo que esses receptores estão envolvidos na carcinogênese e no
desenvolvimento tumoral da próstata canina.
Palavra chave: c-erbB2, Her1, PIA, receptor de fator de crescimento,RT-PCR.
45
INTRODUCTION
The canine prostate has been extensively studied due to similarities to human
gland regarding natural occurrence of diseases and hormonal influence in their development,
as in prostatic carcinoma1-3
(PC). Dysplastic lesions of the human prostate, such as prostatic
intraepithelial neoplasia (PIN), may be considered premalignant due to morphological
similarities to cancer or potentially carcinogenicfactorsinvolvement4. Proliferative
inflammatory atrophy (PIA) is another lesion that has been investigated to determine its
premalignant potential5.In dogs, Rodrigues et al.
6 reported PIA in canine prostate and Toledo
et al.7 described its histological aspects.
Dogs are the only animals besides humans that develop spontaneous PC with high
frequency1. The canine PC model is used to study molecular mechanisms of carcinogenesis
and potential therapies, pathogenesis, development, angiogenesis, and tumoral
progression2,3
.Amongmanychanges introduced by neoplastic cells, abnormalities in cellular
response to the growth factors and their receptors promote cell proliferation, apoptosis
inhibition and ability of cancer cells to spread and angiogenesis stimulation8.
Growth factor activity is regulated by different mechanisms that control growth
factor gene activation and signal output modulation by receptors9.In this context, ErbB
receptors, particularly EGFR (Her1) and Her2 (c-ErbB-2), have been implicated in the
development and progression of PC10
. The ErbB family is a group of tyrosine kinase
receptors, comprised by EGFR or Her1, Her2 or c-erbB-2, Her3 or c-erbB-3, and Her4 or c-
erbB-4. They are coded by ErbB (erythroblastic leukemia viral oncogene homolog) 1, ErbB2,
ErbB3 and ErbB4, respectively, and also are widely expressed in epithelial tissues where they
play crucial roles in regulation of cell differentiation, proliferation and survival11,12
.
EGFR has an extracellular ligand-binding domain, a transmembrane domain and
an intracellular domain with tyrosine kinase activity for signal transduction. The domains are
activated by binding with epidermal growth factor (EGF) or transforming growth factor alfa
(TGF-α), resulting in dimerization with Her1 or heterodimerization with other ErbB member.
This leads to receptor-linked tyrosine kinase activation and results in a signaling cascade that
produces effects including cell migration, maturation, differentiation, metastasis, angiogenesis
and inhibition of apoptosis11,13-15
. EGFR is expressed or overexpressed in solid tumors
including breast, head and neck, non-small cell lung and PC. Also, it has been associated with
advanced tumor stage, poor prognosis, and resistance to chemotherapy, hormone therapy and
radiation11,16
.
46
Furthermore Yarden and Sliwkowski17
enhance that homodimers are less
mitogenic than heterodimers, and have low transformation activity. Thus, Her2 are
heterodimer preferably, have more tyrosine kinase activity tends to be more potent
andgenerate intracellular signals more intense, which gives increased mitogenic potential.
Therefore, levels of the other ErbB family receptors, especially HER2, can significantly affect
the EGFR signaling in human`s cancer. For Daly et al.18
and Pal and Pegram19
, Her2 is the
election pair to the other members of the family in heterodimerization process. This is due to
its structural form, which promotes permanent exhibition of domain dimerização20
.
Her2 and Her3 receptors work as co-receptors, since Her2 has a kinase domain
that is activated when bound to Her3. Also, Her2 does not require a specific binder to be
activated; therefore, it may bind to another ErbB family member21
. Her2 overexpression has
been reported in a range of 20-70% in human PC14,22,23
.In contrast, other studies also report
almost no Her2 expression24
, and even expression in 90% of samples of human PC25
.
In domestic animals, EGFR immunostaininghas been reported in canine breast
tumors26,27
, primary brain tumors24
, nasal carcinomas29
, lung carcinomas30
, and gastric
tumors31
. Likewise, Her2 cases overexpression was reported in 19-35% of canine mammary
tumors32,33
, and in 57.9% of canine gastric neoplasms31
. However, there are no reports
regarding both EGFR and Her2 receptors expression in canine prostate. Therefore, in order to
clarify molecular mechanisms involving those receptors in canine premalignant and malignant
prostatic tissue, RNA detection of ErbB1 and ErbB2, and immunostaining of EGFR and Her2
were evaluated in the prostate of dogs with PIA and PC.
MATERIAL AND METHODS
The samples were derived from the necropsied animal´s on pathology service of
the School of Veterinary Medicine and Animal Science of the Federal University of Goiás
(UFG), Goiânia, Goiás, Brazil, registered from 2008 to 2012. The research was approved by
committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010.Three-µm-sections were
obtained from formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) tissue blocks and stained with
hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation was
used to identify normal, PIA7 and PC
34prostates. All prostatic samples were obtained from
with pure or mixed-breed adult dogs and normal prostatic tissues were harvested from dogs
with no lesions in the gland.
Prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria described
by Rubin et al.35
. From the previous defined areas in histomorphological evaluation, tissue
47
cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on a
recipient paraffin block, in duplicate, using the tissue microarray (Beencher Instruments®
,
Silver Spring, USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on
charged slides (Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to
use, Germany - Dako 9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.
Immunohistochemistry was performed in TMA slides, in duplicate, which were
deparaffinized, rehydratated and washed in distilled water. Endogenous peroxidase and non-
specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min (for EGFR
and c-erbB-2), protein block (Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C
(EGFR), and milk powder 10% (Molico®, Brazil - 10g/100 mL distilled in water) incubation
for 1h at 37ºC (c-erbB-2). EGFR antigen retrieval was performed with 10mM pre-heated
citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in a pressure cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina,
Brazil). Novocastratm
mouse monoclonal antibody anti-human EGFR (Leica, Newcastle, UK,
#NCL-L-EGFR-384), clone EGFR-25 was diluted at 1:50 and incubated overnight at 4°C in a
wet chamber. C-erbB-2 antigen retrieval was carried out in a water bath at 96ºC for 40min,
with 10 mM of pre-heated citrate buffer, pH 6.0. Polyclonal rabbit anti-human c-erbB-2
oncoprotein (Dako, Carpinteria, CA, USA, #A0485) was diluted at 1:200 and applied
overnight at 4°C in a wet chamber. A polymer kit (New Link Max Polymer, UK, #RE7260-K)
was used to incubate sections with polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal
detection. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin, washed, dehydrated,
cleared, cover slipped, and examined by light microscopy.
Samples from human placenta for EGFR and human mammary carcinoma for c-
erbB-2 were used as positive control. For negative control, primary antibody was replaced by
pH 7.4 PBS buffer. The intensity of EGFR and c-erbB-2 reactivity was scored following
adapted criteria from Bilous et al.36
, including 0- (negative, no staining), 1+ (mild, weak
membrane staining in <10% of cells), 2+ (moderate, weak to moderate incomplete membrane
staining in >10% of cells), and 3+ (intense, strongly positive with strong complete membrane
staining in >10% of cells) (Figure 1). Samples scored as 0 and 1+ were assigned as normal
expression (or negative), and those scored as 2+ and 3+ were considered overexpressed for
EGFR and Her2.
48
Intensity Score
Negative (0-) Mild (1+) Moderate (2+) Intense (3+)
FIGURE 1 - Immunostaining intensity of EGFR and Her2 antibodies in canine
prostatic tissue
Before working with RNA, the microtome, the entire lab bench, pipettors, and
sectioning equipment were cleaned with an RNase decontamination solution (Ambion®
RNaseZap®
Solution, Life Technologies, CA, USA, #AM9780). Also, RNase-free pipette tips
were used. The analysis were performed in duplicate using 20 sections with 12 μm from each
paraffin block, which were placed into 1.5 mL sterilized polypropylene micro tubes. The
tubes were kept at -20°C until deparaffinization, digestion and RNA extraction.
The RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life technologies, CA, USA,
#AM1975) was used to extract total nucleic acids (RNA and DNA) from all FFPE tissues
sample that were used in the TMA. Twelve-μm-sections were deparaffinized using xylene
and ethanol washes followed by protein digestion with protease K, incubation in water bath
for 16h at 50°C, and 15min at 80°C. Sequentially, RNA isolation and purification samples
were treated with DNase mix for 30min followed by washing and finishing with the elution.
The solution containing the nucleic acid (RNA) was stored at -20°C until proceeding the
cDNA synthesis using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®
: CA, USA,
#4387406).
After purification of RNA, the yield and quality was measured by NanoVue™
Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, UK - 28-9301-69 AC). The yield was estimated by
UV absorbance at 260 nm and quality for rate between A260/A280, using samples higher
than 1.70. Likewise, presence of RNA was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis on
PowerPacTM
Basic Power Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) and the images of gels
were obtained by Gel DocTM
EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270).
The High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®: CA, USA,
#4387406) was used for reverse transcription (RT) of total RNA to single-stranded cDNA
using a reaction size of 20 µL. All the RT reaction was prepared on ice and in duplicate. In a
0.6 mL micro centrifuge tube was added 10 µL of 2✕ RT buffer, 1.0 µL of 20✕ RT enzyme
100µm 100µm 50µm 50µm
49
mix, 2µg of each sample, and nuclease-free water until complete 20 µL. This solution was
incubated at Thermal Cycler T100TM
(Bio Rad, CA, USA, #186-1096) at 37°C for 60min,
followed by 95°C for 5min, and storage at -20°C until proceeding the RT-PCR reaction.
The polymerase chain reaction (PCR) was performed in duplicate for cDNA
amplification of ErbB1 - (GenBank: AY527212.1) - Canis lupus familiaris epidermal growth
factor receptor (EGFR), locus chromosome 18; ErbB2 (GenBank: AB008451.1) – C. l.
familiaris ErbB2 - erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, locus chromosome 9;
and beta-actin, (canine housekeeping gene - GenBank: AF021873.2) - C. l. familiaris actin,
gamma 1 (ACTG1) locus chromosome 9. PCR amplified gene fragments with 149pb, 157pb,
and 151pb respectively.
In each PCR micro tube, we inserted 100 ng of DNA; 1x of 10X PCR buffer (200
mM Tris-HCl pH 8.4, 500 Mm KCl); 2.5 mM of Magnesium Chloride (MgCl2 - 50 mM); 0.2
mM of 2´-deoxynucleoside 5`-triphosphate (100 mM dNTP set, PCR grade - dATP, dCTP,
dGTP, dTTP- Invitrogen by life TechnologiesTM
CA, USA, #10297-018); 0.4 mM of each
oligonucleotide primer [EGFR Forward (Fw): CCAAGATCCCATCCATT - reverse (Rev):
CTCGACAAGCTCTCTTT; Her2 Fw: AGTGCTGGATGATAGAC, Rev:
AGTAGTGAACGGTAGAAG; β-actin, Fw: TGGAATCATGCGGTATC, Rev:
GGCTGTGATTTCCTTCT]; 1U of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase recombinant
(Invitrogen CA, USA, #11615-010); and Diethylpyrocarbonate (DEPC) treated until complete
25 µL of solution. Followed conditions at Thermal Cycler T100TM
(Bio Rad, CA, USA, #186-
1096): 95ºC for 5min; 95ºC for 1min; 58ºC for 30s; 72ºC for 1min and 72ºC for 5min;
repeated 50 times. Electrophoresis in 1% Ultra PureTM
agarose gel (Invitrogen, CA, USA,
#16500-100) with 0.5 µg/mL of Ultra PureTM
10mg/ml ethidium bromide (EtBr, Invitrogen,
CA, USA, #15585011) was performed in duplicate by 1h of running in 80 V on PowerPacTM
Basic Power Supply (Bio Rad, CA, USA, #164-5050) with GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder
(Thermo scientific, CA, USA, #SM1331). The RT-PCR amplified products were visualized
on Gel DocTM
EZ System (Bio Rad, CA, USA, #170-8270). The ErbB1, ErbB2 and β-actin
primers were obtained from Primer Quest Advanced tool (www.idtdna.com). The
oligonucleotides were synthesized by Eurofins MWG Operon, and diluted with nuclease free
water at concentration according to manufacturer’s directions.
Chi-square, Kruskal-Wallis and descriptive data were used to compare the scores
of intensity positive cells. Association between EGFR and Her2 expression in normal
prostatic tissue with PIA and PC was achieved by Spearman test. It was used SPSS (IBM
Corp. Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM
50
Corp.) and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing,
Vienna, Austria). All values were in rank and were considered with 5% of significance level.
RESULTS
From the TMA slide, 15 (21.43%) samples of normal tissue, 30 (42.86%) of PIA,
and 25 (35.71%) of PC were obtained and scored according intensity of immunostaining to
EGFR and Her2 (Table 1).
The immunostaining was present in the membrane going through cytoplasm, is
shown in Figures 2 and Figure 3. Even using human antibodies, the results from this study are
reliable since Singer et al.37
demonstrated by BLAST alignments that canine ErbB1 and
ErbB2 are homologues in 91% and 92%, respectively, with the equivalent human
homologues, and identities of 95% for both molecules with the human counterparts. They
conclude that both targets indicated almost perfect evolutionary conservation which makes
canine cancer an excellent method suited for proof-of-concept studies in clinical comparative
oncology settings, especially for research working on the ErbB-family37
.
TABLE 1- Labeling intensity scores of EGFR and Her2 antibodies in
normal prostate tissue and with PIA and PC.
EGFR
Normal
(n=15)
PIA
(n=30)
PC
(n=25)
Labeling Intensity
0- Negative 20% (3) 6.67% (2) 24% (6)
1+ (Mild) 53.33% (8) 56.67% (17) 44% (11)
2+(Moderate) 26.67% (4) 33.33% (10) 28% (7)
3+(Intense) 0% (0) 3.33% (1) 4% (1)
Her2
Labeling Intensity
0- Negative 87.7% (13) 13.33% (4) 0% (0)
1+(Mild) 13.3% (2) 26.67% (8) 16% (4)
2+(Moderate) 0% (0) 23.33% (7) 12% (3)
3+(Intense) 0% (0) 36.67% (11) 72% (18)
51
FIGURE 2 - EGFR immunostainingmembrane through cytoplasm (arrow). A) Human
placenta. Positive control with 3+ immunostainingscore(200X); B) Canine
PC tissue with 1+score(400X); C) Normal canine prostatic tissue with 1+ score (400X); D) Canine prostatic tissue with PIA and 2+labeling score
(200X). IHC, DAB with H&E counterstain.
FIGURE 3 - Her2 immunostainingmembrane through cytoplasm (arrow). A) Human
mammary carcinoma. Positive control with 3+ immunostaining intensity score (400X); B) Canine PC tissue with 3+score(400X); C) Normal canine
prostatic tissue with 0- score (200X); D) Canine prostatic tissue with PIA
and 2+ labeling score (400X); IHC, DAB with H&E counterstain.
A B
C D
A B
D C
52
Regarding EGFR immunostaining intensity, there was no difference between
normal prostate and PIA and PC (p<0.05). In contrast, difference was noticed in Her2
immunostaining intensity between normal prostatic tissue and with PIA and PC, and between
PIA and PC (p<0.05) (Table 2). When comparing immunostaining intensity of EGFR and
Her2, there was no difference between normal prostatic tissue and with PIA and PC (p<0.05).
TABLE 2 - Means of comparison between EGFR and Her2 immunostaining intensity in canine normal
prostatic tissue and with PIA and PC.
Diagnoses Rank of Staining Intensity
EGFR Her2
Normal (n=15) 45.20a
17.33a
PIA (n=30) 55.86a
56.66b
PC (n=25) 47.12a
74.18c
Similar letters in the same column are not different by Kruskal-Wallis test (p>0.05).
From 70 samples, sixteen cDNA samples of canine prostatic tissue with rate
between A260/A280 higher than 1.70, were obtained to perform RT-PCR, being four (25%)
normal tissue, three (18.75%) with PIA, and nine (56.25%) with PC.
A commercial kit for extraction enabled us to obtain DNA and RNA from FFPE
canine prostate tissue with good enough quality and quantity to perform the RT-PCR test
successfully. Isolating nucleic acids from tissues in sufficient amount, purity and integrity is
an essential step in the practice of molecular biology. The quantity, purity and integrity of
nucleic acid extracted depend on time of pre-fixation, and time and temperature used in FFPE
process38,39
. Thus, extracting RNA with good quality and quantity is a feasible and valuable
tool in diagnostic routine and retrospective studies40,41
.
The ErbB1 gene mRNA was detected in two normal, one PIA and in all PC
samples. ErbB2 mRNA was detected in PIA2, PIA3, and all PC, but no in normal prostatic
tissue samples (Figure 4). A parallel of EGFR and Her2 immunostaining by IHC and ErbB1
and ErbB2 detection by RT-PCR is shown in Table 3.
53
FIGURE 4 - Agarose gel images showing amplification products of β-actin, ErbB1 and ErbB2
genes from canine prostatic tissue. A) RT-PCR for β-actin expression as samples
positive control. All samples amplified. B) RT-PCR for ErbB1.Prostatic samples
N3, N4, PIA2, all PC, and MC amplified. C) RT-PCR for ErbB2. Prostatic samples PIA2, PIA3, all PC and MC amplified. MW = Molecular weight (GeneRuler 1Kb
Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA, #SM1331); MC= canine
mammary carcinoma (ErbB1 and ErbB2 positive control); N=Canine normal
prostatic tissue; PIA=Canine proliferative inflammatory atrophy; PC=Canine prostatic carcinoma.
TABLE 3- Comparison results of EGFR and Her2 immunostaining scores by immunohistochemistry (IHC) and ErbB1 and ErbB2
detection by RT-PCR in normal canine prostatic tissue and with
PIA and PC.
Samples IHC RT-PCR
EGFR Her2 ErbB1 ErbB2
N1 0 (-) 0 (-) - -
N2 1 (-) 0 (-) - -
N3 2 (+) 1 (-) + -
N4 1 (-) 0 (-) + -
PIA1 1 (-) 1 (-) - -
PIA2 2 (+) 2 (+) + +
PIA3 1 (-) 2 (+) - +
PC1 1 (-) 2 (+) + +
PC2 2 (+) 2 (+) + +
PC3 1 (-) 3 (+) + +
PC4 2 (+) 3 (+) + +
PC5 1 (-) 2 (+) + +
PC6 0 (-) 3 (+) + +
PC7 1 (0) 2 (+) + +
PC8 2 (+) 3 (+) + +
PC9 2 (+) 2 (+) + +
MC 3 (+) 3 (+) + +
MC=canine mammary carcinoma; N=canine normal prostatic tissue;
PIA=canine proliferative inflammatory atrophy; PC=canine prostatic
carcinoma; 0,1,2,3 IHC scores; + positive; - negative.
54
DISCUSSION
It was observed immunostaining of EGFR in 80% of canine normal prostatic
tissue, and also detected ErbB1 mRNA in 50% of canine normal prostatic tissue by RT-PCR.
It is according to Carlsson et al.15
, Peraldo-Neia et al.42
and Gama et al.43
that reported EGFR
expression in normal tissues such as liver, digestive tract, human prostate and canine
mammary tissue. However, Terragni et al.31
have reported no expression of EGFR in canine
normal gastric epithelium, similar to observed here in 20% of canine normal prostatic tissue.
In this study, 36.6% of prostates with PIA and 32% with canine PC presented
EGFR immunostaining. Similar results were reported by Carlsson et al.15
in a study with
human PC and lymph node metastasis, observing EGFR immunostaining in roughly41% of
primary tumors and in one case of metastasis. In contrast, Schlomm et al.44
observed EGFR
immunostaining in 17.5% of human prostates with PC. In this context, Carlsson et al.15
suggest that EGFR could have an important role in initial lesions of PC and it would be
negligible in tumors of stage advanced.
Thus, since in this study there was no difference of EGFR immunostaining
between prostate with PIA and PC, it is possible that EGFR play a role in pre-malignant and
early lesions of canine prostate. Corroborating that idea, Di Palma et al.45
and Matsubayashi
and Yoshihara46
reported ErbB1 amplification and EGFR overexpression in early events of
carcinogenesis in tumors of human salivary glands. Also, Bertagnolli et al.47
have studied
EGFR in canine mammary tumors and concluded that EGFR expression may contribute to
malignant epithelial transformation. Those authors also has been referring that EGFR is
associated with increased tumor proliferative activity, angiogenesis and metastatic potential,
working as a predictive factor in these neoplasms.
Her2immunostaining was observed in two samples of canine normal prostatic
tissues, also it was scored as 1+, considered here as negative. These results are accordingly to
Terragni et al.31
that have not observed Her2 expression in non-neoplastic canine gastric
mucosa. However, Carlsson et al.15
reported that Her2immunostaining may occur in normal
tissues. Also, the IHC results concerning Her2were coherent with those obtained in RT-PCR
technique, since there was expression of ErbB2 in normal prostatic tissue.
Canine prostates with PC presented 84% of Her2 overlabeling and 100% ErbB2
expression. In human PC Her2overexpression is reported in 20-70% of PC samples14,22,23
and
was associated to high Gleason score44,48
, tumor recurrence and cancer advanced stage44
.
However, Liu et al.24
reported no expression of Her2in primary human PC. On the other hand,
Carles et al.25
reported Her2 expression in up to 90% of PC cases, and Carlsson et al.15
, when
55
studying human PC and lymph node metastases, observed nearly 33% Her2 immunostaining
in primary tumors and 66.6% in metastases. Those authors reported higher frequency of
Her2overexpression in human PC cases with metastases when compared to cases where PC
was confined to the prostate, and have suggested up regulation of Her2in metastases. Based
on this, our results would indicate the canine PC as having great potential of aggressively as
mentioned by Leroy & Northrup2. However, even without evaluation for canine PC
metastasis, it is likely that Her2 may have a single role in canine prostate tissue regarding PC
evolution and metastasis, since canine PC is less frequent and with later onset if compared
with PC in humans. Perchance, mechanisms of Her2 interaction with inhibitors proteins
involved in cell cycle, such as p21 and p27, are more efficient in canine prostatic tissue than
in human gland.
In this study, Her2 overlabeling and ErbB2 expression were found in 60% and
66% of canine prostates with PIA, respectively, confirming the proliferative pattern of this
prostatic disease and supporting its pre-malignant potential2,4
. Terragni et al.31
observed that
Her2 was more expressed in dysplastic areas of canine benign gastric tumors, suggesting its
potential relevance in pre-malignant lesions. It is a relevant remark that Her2 immunostaining
was significantly weaker in canine prostates with PIA than those with PC. Also, ErbB2
mRNA was less detected in prostates with PIA than PC. Taken together, the results are
suggestive that Her2 growth factor receptor plays an important role in canine prostatic
carcinogenesis and tumoral development.
CONCLUSIONS
EGFR and Her2 are expressed in canine PIA and early lesions of canine PC,
particularly Her2, which was overexpressed, pointing to the involvement of these receptors in
canine prostatic carcinogenesis and tumoral development. Considering these findings, the
next step would be exploring the association of EGFR and Her2 action and tumoral disease
evolution, metastasis, and prognosis.
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“Eis porque, interpretando os cromossomas à guisa de caracteres em que a mente inscreve,
nos corpúsculos celulares que a servem, as disposições e os significados dos seus
próprios destinos, caracteres que sãoconstituídos pelos genes, como as linhas são
formadas de pontos.”
André Luiz (Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)
Evolução em dois mundos (1959)
60
CAPÍTULO 3 - Cell cycle inhibitors expression in canine prostate with
prostatic inflammatory atrophy and carcinoma
ABSTRACT
Gene expression of CDKN1A, CDKN1B, and TP53, and immunostaining of p21, p27 and
p53 were evaluated to verify the role of these cell cycle inhibitors in canine prostates with
proliferative inflammatory atrophy (PIA) and prostatic carcinoma (PC). From 70 prostatic
samples obtained, 15 were considered normal, 30 had PIA and 25 PC. Regarding the number
of p27 and p53 labeled cells, difference between normal and PIA and PC was observed, as
well as between PIA and PC for p53. Immunostaining intensities of p21, p27 and p53 were
different when comparing normal tissues to PIA and PC. Sixteen cDNA samples of canine
prostatic FFPE tissue were subjected to RT-PCR and RT-qPCR, four considered normal
tissue, three diagnosed as PIA, and nine as PC. CDKN1A mRNA was detected in four PC
cases by RT-PCR, and it was overexpressed when compared to normal by RT-qPCR, in one
PIA and six PC samples. CDKN1B mRNA was detected in three PC cases by RT-PCR and it
was overexpressed in three PC and decreased in one PC case. TP53 mRNA, detected in all
canine prostates with PIA and PC, was also overexpressed in one gland with PIA and three
with PC. It was conclude that when overexpressed in canine prostate with premalignant and
malignant lesions, p21 and p27 play role controlling cell proliferation, most likely working as
a protective factor in the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the
presence of altered p53. Thus, the next step would be verifying these cell cycle proteins in
canine PC with metastasis.
Key words: p21, p27, p53, PIA, RT-qPCR.
61
Expressão de inibidores do ciclo celular na próstata canina com atrofia
inflamatória proliferativa e carcinoma
RESUMO
A expressão gênica de CDKN1A, CDKN1B e TP53, e imunoexpressão de p21, p27 e p53
foram avaliados, a fim de verificar o papel desses inibidores do ciclo celular na próstata
canina com atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e carcinoma prostático (PC).Foram obtidos
um total de 70 amostras de próstata canina, sendo 15 de tecido normal, 30 de PIA e 25 de PC.
Quanto ao número de células imunomarcadas foi observado diferença entre normal, PIA e PC
para p27 e p53, também para p53 houve diferença entre PIA e PC. Para a intensidade de
imunomarcação houve diferença entre os tecidos normais e com PIA e PC para p21, p27 e
p53. Foram obtidas dezesseis amostras de cDNA a partir de tecido FFPE de próstata canina
para realização da RT-PCR e RT-qPCR, sendo quatro tecidos normais, três com PIA, e nove
com o PC. O gene CDKN1A foi detectado em quatro das PC por RT-PCR, e pela RT-qPCR
este estava super expresso em uma PIA e em seis PC quando comparado com o tecido
prostático normal. O CDKN1B foi detectado em três PC por RT-PCR e pela RT-qPCR estava
super expresso em três PC e reduzido em um PC. O TP53 foi detectado em todas as próstatas
caninas com PIA e PC por RT-PCR, sendo também superexpresso em uma glândula com PIA
e em três com PC. Concluiu-se que p21 e p27 quando superexpressas na próstata canina com
lesões pré-malignas e malignasdesmpenham ação no controle da
proliferaçãocelular,possivelmenteatuando como fator de proteção na evolução da PIA para
PC, e no desenvolvimento do PC, mesmo na presença de p53 alterada. Assim, o próximo
passo seria avaliar essas proteínas do ciclo celular em casos de PC canino com metástase.
Palavra chave: p21, p27, p53, PIA, RT-qPCR.
62
INTRODUCTION
The canine prostate has similarities with the human gland regarding occurrence of
benign and malignant diseases as benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostatic carcinoma
(PC)1,2
. Proliferative inflammatory atrophy (PIA) is also a human prostate lesion with
premalignant potential and involvement in carcinogenesis of PC3,4
. In dogs, Rodrigues et
al.5have mentioned PIA in canine prostate and Toledo et al.
6 described its histological aspects.
The proliferation of eukaryotic cells is controlled at specific points in the cell
cycle, particularly at G1-S and G2-M transitions, and regulated by interaction of cyclins and
cyclin-dependent kinases (Cdk) and their inhibitors (CdkI`s). The major step in malignant
transformation in tumors is the loss of cell cycle control. Knowing how regulators work is a
key step to understand malignant transformations that occur in tumor types7-10
.
Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A) gene encodes the p21 protein,
which has been implicated in mechanisms of cell-cycle arrest from G1-S phase through
different steps that allow cell DNA repair or apoptosis11-12
. Those tasks are performed by
cyclin A/cyclin dependent kinase 2 (Cdk2) and cyclin D/Cdk4 complexes13
. Increased
expression of CDKN1A is not necessarily linked to cell growth blocking, since p21 protein
may have dual a function, inhibiting cyclin/Cdk activity and also acting as positive modulator
of cyclin/CDK complex formation12
. Furthermore, studies have revealed decreased expression
of p21 associated with poor prognostic in human tumors, including gastric, colorectal,
prostatic, and endometrial carcinomas14-16
.
The p27 protein is encoded by cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (CDKN1B)
gene. This protein has been implicated in cell-cycle blocking mechanisms in S phase. It is
regulated by extracellular stimuli, like transforming growth factor beta (TGF-β)17-19
. Yang et
al.20
and De Marzo et al.21
observed decreased expression of p27 in lesions such as BPH, PIN
and PC, contributing to the high rate of mitosis in these proliferative lesions. Also,
Fredersdorf et al.22
and Tan et al.23
refer that the loss of p27 protein is a negative prognostic
factor for human breast cancer.
An important protein controlling the cell cycle is p53, well known as the
"guardian" of the genome. If an error in DNA transcription occurs, p53 stops cell cycle and
promote repair mechanisms or triggers apoptotic events leading to cell death. The p53 protein
stimulates p21, which has regulatory functions and blocks the cell cycle progression24,25
. In
normal cells, wild-type p53 has a short half-life and does not accumulate in the tissue at
detectable levels. Mutations or deletions of TP53 gene may lead to altered production of p53
protein, which fails to perform its function and accumulates in the nucleus, when is possible
63
to be detected it by immunohistochemistry19,24
. The p53 immunostaining in canine prostate
has been reported as increased in PIA and PC26
, but its role in canine prostatic tissue with
proliferative lesions is not yet clear. Thus, in order to further understand the molecular
mechanisms of cell cycle blocking in canine premalignant and malignant prostatic tissue,
CDKN1A, CDKN1B, and TP53 mRNA expression and immunostaining of p21, p27 and p53
were evaluated in canine prostate with PIA and PC.
MATERIAL AND METHODS
The samples were derived from the necropsied animal´s on pathology service of
the School of Veterinary Medicine and Animal Science of the Federal University of Goiás
(UFG), Goiânia, Goiás, Brazil, registered from 2008 to 2012. The research was approved by
committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010.Three-µm-sections were
obtained from formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) tissue blocks and stained with
hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation was
used to identify normal, PIA6 and PC
27prostates. All prostatic samples were obtained from
with pure or mixed-breed adult dogs and normal prostatic tissues were harvested from dogs
with no lesions in the gland.
Prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria described
by Rubinet al.28
. From the previous defined areas in histomorphological evaluation, tissue
cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on a
recipient paraffin block, in duplicate, using the tissue microarray (Beencher Instruments®,
Silver Spring, USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on
charged slides (Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to
use, Germany, Dako #9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.
Immunohistochemistry was performed in TMA slides, in duplicate, which were
deparaffinized, rehydratated and washed in distilled water. Endogenous peroxidase and non-
specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min, protein block
(Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C. Antigen retrieval for p21, p27
and p53 was performed with 10 mM pre-heated citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in a pressure
cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina, Brazil). Mouse monoclonal anti-human
p21WAF1/Cip1
clone SX118 (Dako, Carpinteria, CA, USA, #M7202), monoclonal mouse anti-
Human p27Kip1
clone SX53G8 (Dako Carpinteria, CA, USA, #M7203), and monoclonal
mouse p53 clone 5G176 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, #sc-71785) were diluted at
1:50, 1:200, and 1:500 respectively and incubated overnight, at 4°C in wet chamber. A
64
polymer kit (NovoLink Max Polymer, UK, #RE7260-K) was used to incubate sections with
polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal detection. Sections were
counterstained with Mayer's hematoxylin, washed, dehydrated, cleared, cover slipped, and
examined by light microscopy.
Sample from human colon carcinoma were used as positive control for p21 and
p27, and human mammary carcinoma for p53. For negative control, primary antibody was
replaced by pH 7.4 PBS buffer. The intensity of p21, p27, and p53 reactivity was scored as:
0=negative, 1=mild, 2=moderate, and 3=intense. The number of stained cells to p21, p27, and
p53 was scored as: 0=negative, 1=1-25%, 2=26-50%, 3=51-75% and 4=76-100%.
Before working with RNA, the microtome, the entire lab bench, pipettors, and
sectioning equipment were cleaned with an RNase decontamination solution (Ambion®
RNaseZap®
Solution, Life Technologies, CA, USA, #AM9780). Also, RNase-free pipette tips
were used. The analysis were performed in duplicate using 20 sections with 12 μm from each
paraffin block, which were placed into 1.5 mL sterilized polypropylene microtubes. The tubes
were kept at -20°C until deparaffinization, digestion and RNA extraction.
The RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit (Life technologies, CA, USA,
#AM1975) was used to extract total nucleic acids (RNA and DNA) from all FFPE tissues
sample that were used in the TMA. Twelve-μm-sections were deparaffinized using xylene and
ethanol washes followed by protein digestion with protease K, incubation in water bath for
16h at 50°C, and 15min at 80°C. Next, RNA isolation and purification samples were treated
with DNase mix for 30min followed by washing and finishing with the elution. The solution
containing the nucleic acid (RNA) was stored at -20°C until proceeding the cDNA synthesis
using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®
: CA, USA, #4387406).
After purification of RNA, the yield and quality was measure by NanoVue™ Plus
Spectrophotometer (GE Healthcare, UK - 28-9301-69 AC). The yield was estimated by UV
absorbance at 260 nm and quality for rate between A260/A280, using samples higher than
1.70. Likewise, confirmed by 1% agarose gel electrophoresis on PowerPacTM
Basic Power
Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) and the images of gels were obtained by Gel DocTM
EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270).
The High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems®: CA, USA,
#4387406) was used for reverse transcription (RT) of total RNA to single-stranded cDNA
using a reaction size of 20 µL. All the RT reaction was prepared on ice and in duplicate. In a
0.6 mL micro centrifuge tube was added 10 µL of 2✕ RT buffer, 1.0 µL of 20✕ RT enzyme
mix, 2 µg of each sample, and nuclease-free water until complete 20 µL. This solution was
65
incubated at Thermal Cycler T100TM
(Bio Rad, CA, USA, #186-1096) at 37°C for 60min,
followed by 95°C for 5min, and storage at -20°C until proceeding the RT-PCR reaction.
The polymerase chain reaction (PCR) was performed in duplicate for cDNA
amplification of p21 (GenBank: AJ830019.1) - Canis l. familiaris cyclin-dependent kinase
inhibitor 1A (CDKN1A) locus chromosome 12; p27(GenBank: NM001002957.1) - C. l.
familiaris cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (CDKN1B) locus chromosome 27; p53
(GenBank: NM_001003210.1) - C. l. familiaris tumor protein p53 (TP53) locus chromosome
5; and β-actin, (canine housekeeping gene - GenBank: AF021873.2) - C. l. familiaris actin,
gamma 1 (ACTG1) locus chromosome 9. These genes amplify fragments with 88 pb, 124 pb,
118 pb, 151 pb, respectively.
In each PCR microtube, we inserted 100 ng of DNA; 1x of 10X PCR buffer (200
mM Tris-HCl pH 8.4, 500 Mm KCl); 2.5 mM of Magnesium Chloride (MgCl2 -50 mM); 0.2
mM of 2´- deoxynucleoside 5`- triphosphate (100 mM dNTP set, PCR grade - dATP, dCTP,
dGTP, dTTP - Invitrogen by life TechnologiesTM
CA, USA, #10297-018); 0.4 mM of each
oligonucleotides primer [p21 Forward (Fw): ACCTCTCAGGGCCGAAAAC, reverse (Rev):
TAGGGCTTCCTCTTGGAGAA; p27 Fw: CAGAGGACACACACTTGGTAGA Rev:
TCTTTTGTTTTGAGGAGAGGAA; p53, Fw: CGCAAAAGAAGAAGCCACTA, Rev:
TCCACTCTGGGCATCCTT; β-actin, Fw: TGGAATCATGCGGTATC Rev:
GGCTGTGATTTCCTTCT] 1U of Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase recombinant
(Invitrogen CA, USA, #11615-010) and Diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water until
complete 25 µL of solution. Followed conditions at Thermal Cycler T100TM
(Bio Rad CA,
USA, #186-1096): 95ºC for 5min; 95ºC for 1min; 58ºC for 30s; 72ºC for 1min and 72ºC for
5min; repeated 50 times. Electrophoresis in 1% Ultra PureTM
agarose gel (Invitrogen CA,
USA,#16500-100) with 0.5 µg/mL of Ultra PureTM
10mg/ml ethidium bromide (EtBr,
Invitrogen CA, USA, #15585011) was performed in duplicate by 1h of running in 80 V on
PowerPacTM
Basic Power Supply (Bio-Rad, CA, USA, #164-5050) with Gene Ruler 1Kb Plus
DNA Ladder (Thermo scientific, CA, USA, #SM1331). The RT-PCR-amplified products
were visualized in a Gel DocTM
EZ System (Bio-Rad, CA, USA, #170-8270). The CDKN1A,
CDKN1B and TP53 primers were obtained from Klopfleisch and Gruber29
, and β-actin
primers were obtained from Primer Quest Advanced tool (www.idtdna.com). The
oligonucleotides were synthesized by Eurofins MWG Operon, and diluted with nuclease free
water at concentration according to manufacturer’s directions.
The cDNA samples underwent real-time quantitative reverse-transcription
polymerase chain reaction (RT-qPCR) to evaluate CDKN1A, CDKN1B and TP53 gene
66
expression. β-actin reference canine gene was used as positive control. The reactions and data
analyses were performed in iQ5 real-time PCR system (Bio-Rad, CA, USA, #170-9780). The
20 µl total reactions were carried out in a 96-well polypropylene plates (iQTM
- 96 well PCR
plates, Bio-Rad, CA, USA, #223-9441) containing 10 µl of MAXIMA®
SYBR-green
Fluorescein qPCR Master mix 2x (Thermo Scientific, Fermentas, CA, USA, #K0241), 500
nM of each primer (forward and reverse are the same used at RT-PCR), 100 ng of synthesized
cDNA template, and nuclease free water. All plates were covered with optical sealing tape
(Microseal® Adhesive seals Bio-Rad, CA, USA, #MSB-1001).
RT-qPCR cycling conditions were 10min at 95ºC, followed by 40 cycles of 30s at
95ºC, 1min at 58ºC, and 30s at 72ºC. The plates contained triplicates of each cDNA sample
and β-actin gene as internal reference to normalize the amount of total cDNA. Specificity of
amplified products was confirmed by melting curve analyses. The expression level of the
genes was calculated from the threshold cycle according to the 2-ΔΔCT
method by Livak and
Schmittgen30
in iQ5 real-time PCR software (Bio-Rad, CA, USA, #170-9780).
The Chi-square, Kruskal-Wallis, and descriptive data were used to compare the
scores of percentage of positive cells and their intensity. For all data we used SPSS (IBM
Corp. Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM
Corp.) and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing,
Vienna, Austria). All values were considered with 5% of significance level.
RESULTS
From the TMA slide, 15 (21.43%) samples of normal tissue, 30 (42.86%) with
PIA and 25 (35.71%) with PC were obtained and scored according to the number of stained
cells and immunostaining intensity of p21, p27 and p53 (Table 1). The nuclear
immunostainingfor p21, p27, and p53 is shown in Figure 1.
The number of p21 stained cells in normal prostatic tissue was neither different
from those with PIA and PC, nor between PIA and PC. Immunostaining intensity was
different between normal prostatic tissue and PIA and normal compared to PC, but not
between PIA and PC. The number of p27 stained cells and immunostaining intensity was
different between normal prostatic tissue and PIA and between normal and PC, but not
between PIA and PC. The number of p53 stained cells was different between normal prostatic
tissue and PIA and PC, as well as between prostates with PIA and PC. According to
Immunostaining intensity of p53 was difference between normal prostatic tissue and PIA and
PC, but not between PIA and PC (p< 0.05) (Table 2).
TABLE 1 –Number of cases sorted by scores applied to variable number of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, and p53 antibodies
in canine normal prostatic tissue and with PIA and PC.
Number of Labeled Cells Scores (%) Intensity of Labeling Cells (%)
Diagnoses Antibodies 0 (0%) 1 (1-25%) 2 (26-50%) 3 (51-75%) 4 (76-100%) 0 Negative 1 (mild) 2 (moderate) 3 (intense)
Normal
N=15
p21 46.6% (7) 0% 26.67% (4) 20% (3) 6.67% (1) 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%
p27 46.67% (7) 6.67% (1) 33.33% (5) 13.33% (2) 0% 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%
p53 73.33% (11) 20% (3) 6.67% (1) 0% 0% 73.33% (11) 26.67% (4) 0% 0%
PIA
N=30
p21 13.33% (4) 6.67% (2) 13.33% (4) 40% (12) 26.67% (8) 13.33% (4) 56.67% (17) 23.33% (7) 6.67% (2)
p27 13.33% (4) 6.67% (2) 23.33% (7) 43.33% (13) 13.33% (4) 13.33% (4) 36.67% (11) 40% (12) 6.67% (2)
p53 6.67% (2) 0% 70% (21) 10% (3) 13.33% (4) 6.67% (2) 83.33% (25) 10% (3) 0%
Carcinoma
N=25
p21 24% (6) 8% (2) 8% (2) 12% (3) 48% (12) 24% (6) 24% (6) 12% (3) 40% (10)
p27 16% (4) 0% 24% (6) 20% (5) 40% (10) 16% (4) 24% (6) 20% (5) 40% (10)
p53 4% (1) 4% (1) 24% (6) 8% (2) 60% (15) 4% (1) 60% (15) 28% (7) 8% (2)
68
FIGURE 1 - Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining(arrow). A) Canine PC tissue with score three for labeling intensity and four for number of labeled
cells for p21. 400X. B) Human colon carcinoma; p21 positive control with score two for
labeling intensity and four for number of labeled cells.400X. C) Canine PIA tissue with
score three for labeling intensity and four for number of labeled cells for p27. 200x. D) Human colon carcinoma; p27 positive control with score three for labeling intensity and
four for number of labeled cells. 400X E) Canine PC tissue with score three for labeling
intensity and four for number of labeled cells for p53. 200X. F) Human mammary carcinoma; p53 positive control with score three for labeling intensity and three for
number of labeled cells. 200X. IHC, DAB with H&E counterstain.
69
TABLE2 -Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding
number of stained cells and intensity of staining in canine normal
prostatic tissue, PIA and PC.
Diagnoses N Rank of Number of Stained Cells Rank of Staining Intensity
p21 p27 p53 p21 p27 p53
Normal 15 46.3a 34.4
a 16.9
a 33.9
a 31.6
a 23.0
a
PIA 30 57.8a 60.1
b 54.6
b 55.8
b 60.4
b 55.7
b
Carcinoma 25 59.8a 67.4
b 75.2
c 64.3
b 68.6
b 68.2
b
Similar letters in the same column are not different by non parametric multiple
comparison test for paired contrasts the relative effects with Tukey correction.
(p value =<0.05).
Sixteen cDNA samples of canine prostatic tissue were obtained to perform RT-
PCR, being 4 (25%) normal tissue, 3 (18.75%) with PIA, and 9 (56.25%) with PC. CDKN1A
mRNA was detected in four of nine PC (4/9 - PC6, PC7, PC8, PC9) and CDKN1B mRNA in
three of nine PC (3/9 – PC7, PC8, PC9). TP53 gene expression was detected in all PIA and
PC samples, but not in normal prostatic tissue (Figure 2).
FIGURE 2 –Images from agarose gels showing the amplification products of ACTG1 (β-actin),
CDKN1A, CDKN1B and TP53 genes from canine prostatic tissue. (A) RT-PCR for β-
actin expression (positive control). (B) RT-PCR for CDKN1A. Prostatic samples PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. (C) RT-PCR for CDKN1B. Prostatic samples PC7,
PC8, PC9 and MC amplified. (D) RT-PCR for TP53. Prostatic samples PIA1, PIA2,
PIA3, PC1, PC2, PC3, PC4, PC5, PC6, PC7, PC8, PC9 and MC amplified. MW = Molecular weight (Gene Ruler 1Kb Plus DNA Ladder - Thermo scientific, CA, USA,
#SM1331); MC= canine mammary carcinoma (CDKN1A, CDKN1B and TP53 positive
control); N=Normal tissue; PIA= Canine proliferative inflammatory atrophy; PC=
Canine prostatic carcinoma.
70
The expression of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal prostate, with
PIA and PC was determined by RT-qPCR and fold change (FC) normalized with β-actin
expression from the same dog and with normal gland with T melt 84.8ºC. The CDKN1A was
overexpressed in seven of sixteen tissues investigated (PIA1, PC1, PC3, PC4, PC7, PC8 and
PC9) with FC>1.6 when compared to normal gland N1 to N4 and T melt 76.9ºC. The
CDKN1B was overexpressed in three of nine PC tumors (PC7, PC8, PC9) with FC>1.6, and it
was under expressed in one of nine PC (PC2) based on FC<0.4 and T melt 80.5ºC. Regarding
TP53, overexpression was present in five of sixteen prostatic samples (PIA1, PC4, PC6, PC8,
PC9) with FC>1.6, and decreased expression was observed in two of sixteen prostatic tissues
(PIA2, PC2) based on FC<0.4 and T melt 78.8ºC (Figure 3).
FIGURE 3 – Fold expression levels of CDKN1A, CDKN1B and TP53 in canine normal, PIA and PC
normalized by β-actin. Values>1.6 were considered overexpression and values<0.4
were considered decrease of gene expression.
A commercial kit for extraction enabled us to obtain DNA and RNA from FFPE
canine prostate tissue with good enough quality and quantity to perform the RT-PCR test
successfully. Isolating nucleic acids from tissues in sufficient amount, purity and integrity is
an essential step in the practice of molecular biology. The quantity, purity and integrity of
nucleic acid extracted depend on time of pre-fixation, and time and temperature used in FFPE
process31,32
. Thus, extracting RNA with good quality and quantity is a feasible and valuable
tool in diagnostic routine and retrospective studies33,34
.
71
Comparison of results referring to p21, p27 and p53 immunostaining by IHC and
CDKN1A, CDKN1B and TP53 detection by RT-PCR and expression by RT-qPCR are
described in Table 3.
TABLE 3 – Comparison between p21, p27, and p53 immunostaining regarding number of stained
cells and intensity of staining in canine normal prostatic tissue, PIA and PC
Samples IHC RT-PCR RT-qPCR
p21 p27 p53 CDKN1A CDKN1B TP53 CDKN1A CDKN1B TP53
N1 0 0 0 - - - R R R
N2 0 0 0 - - - R R R
N3 2/1 2/1 0 - - - R R R
N4 0 0 1/1 - - - R R R
PIA1 4/3 2/1 4/3 - - + O R O
PIA2 2/2 2/1 1/1 - - + R R D
PIA3 0 2/1 2/2 - - + R R R
PC1 4/3 4/3 2/2 - - + O R R
PC2 0 0 0 - - + R D D
PC3 4/3 4/3 2/2 - - + O R R
PC4 4/3 4/3 4/3 - - + O R O
PC5 2/1 3/2 2/3 - - + R R R
PC6 3/2 3/2 4/3 + - + R R O
PC7 4/3 4/3 3/2 + + + O O R
PC8 4/3 4/3 3/2 + + + O O O
PC9 4/3 4/3 4/3 + + + O O O
MC 4/3 4/3 4/2 + + + R R R
MC=canine mammary carcinoma; N=canine normal prostatic tissue; PIA=canine proliferative
inflammatory atrophy; PC=canine prostatic carcinoma; N/N= score of number of stained cells/
score of intensity of staining; R=regular expression; D=decreased expression; and O=overexpression
DISCUSSION
It was observed in this study that p21 immunostaining protein was overexpressed
in 40% of PC and 6.7% of PIA, and in normal tissue the expression was weak in 53.3% and
absent in 46.7%. Protein p21 play an important function in the cell cycle and its increased
expression may mean a crucial step in the cell growth blocking, inducing senescence or
apoptosis, a mechanism which seems to protect against malignant transformation35-38
. Thus,
loss of p21 expression has been associated with shorter survival in human with PC16
. Also,
according to Matsushima et al.39
, immunostaining of p21 was more likely to be expressed in
well-differentiated areas.
Also, there was difference between normal prostatic tissue with PIA and PC
regarding intensity of immunostaining, and there was no difference between groups
72
considering the number of stained cells. In this context, our results suggest that p21 could
work as a protective factor in canine PC progression, since in human PC p21 overexpression
is associated with good prognosis16
. Furthermore, even considering the possibility that canine
PC shows high aggressively when present2,40
, this tumor is not as common in canine prostate
as compared to the human prostate. It seems that canine PC has longer time development,
which could be linked to action of inhibitors as p21 and p27 during canine PC progression.
This hypothesis was mentioned before in canine prostate, but referring proteins from other
regulatory pathways as GSTP126
. Also, it seems that immunostaining intensity of p21 in
canine prostate tumors should be considered.
Klopfleisch and Gruber29
reported p21 overexpression in canine malignant
mammary tumors, but concluded that its increase alone did not avoid metastasis and an
explanation for that would be a loss of p21 function by missense mutations. On the other
hand, Wang et al.16
add that overexpression of p21 in human prostate may be associated with
poor prognostic due to CDKN1A instability, or its function may be altered indirectly by TGF-
β41
, PTEN deficiency36
, and TP53 mutated42-44
. Since p21 may play a double function, acting
as tumoral suppressor or oncogene12
depending on tumor type, and considering our results, it
seems that p21 could be involved in controlling cell proliferation in canine prostate with
proliferative lesions as observed in human breast cancer45
.
Taken together, the results from this research concerning p21 and p27 inhibitors
indicate that positive relation for their overexpression in canine proliferative prostatic tissue
could work by controlling cell proliferation. Similar to p21, p27 protein is an important cell
proliferation inhibitor46,47
, once increased levels of p27 result in cell cycle blocking in the S
phase19,48-51
. The p27 expression may be lost or decreased in human PC20,52-55
, a feature
associated with tumor cell undifferentiation, proliferation and poor prognostic 48,51,56,57
. In
contrast to p21, p27overexpression is mostly related to better prognosis, acting as a tumoral
suppressor58
. However, it seems important to evaluate these cell cycle inhibitors together,
since there are studies showing association of malignant progression and the presence of
negative relation between p21 (overexpressed) and p27 (underexpressed) expression in canine
mammary tumor29
, as well as malignant progression and positive relation between p21
(underexpressed) and p27 (underexpressed) expression in human tumors59
. In contrast, in
canine prostate with premalignant and malignant lesions the positive relation for p21 and p27
overexpression would be related to a good prognosis.
Another important protein in cell cycle control is the product of TP53 gene, the
p53 protein24,25
. In this study, the number of stained cells for p53 was significantly higher in
73
canine prostates with PC than with PIA. TP53 mRNA was detected by RT-PCR in all
prostates with PIA and PC, but TP53 overexpression by RT-qPCR was present in a higher
number of prostates with PC than with PIA. According to Quian et al.60
, Tsujimoto et al.61
,
and Stangelberger et al.44
, in human prostates with PIN and PC, the increased expression of
p53 has been associated ith high proliferative index and more aggressive phenotype. Since
accumulations of p53 in the presence of TP53 gene mutation are usual, our results indicate
that alterations related to p53 protein may start in canine prostates with PIA and later
accentuates in canine glands with PC, emphasizing its malignant potential as described before
in dogs26
and humans60,61
. This hypothesis is also supported by the fact that inflammatory
microenvironment in PIA promotes changes in TP53 gene, as mentioned by Wang et al.4 and
Tsujimoto et al.61
. Furthermore, according to Wang et al.4,p53 accumulations occur in the
presence of a TP53 gene mutation, especially in tissues with chronic inflammation, such as
cholangiohepatitis, gastritis and colitis. Tsujimoto et al.61
also detected TP53 overexpression
in human post-atrophic hyperplasia.
Taken together, our results have showed that is important evaluate different cell
pathways in order to better understand the carcinogenis and tumoral development steps in
different types of tissue and species, since one lesion in the organism may evolute by different
mechanisms with similar biological results26
. Based on that, it seems that in canine
premalignant and malignant prostate the overexpression of p21 and p27 plays controlling cell
proliferation and lesion progression even with the evidence of alterations involving p53.
CONCLUSIONS
It was concluded that when overexpressed in canine premalignant and malignant
prostate, p21 and p27 possible play role controlling cell proliferation, most likely working as
a protective factor in the evolution of PIA to PC, and in the PC development, even in the
presence of altered p53.Thus, the next step would be verifying these cell cycle proteins in
canine prostate with PC and metastasis.
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“Lembremo-nos de que o homem interior se renova sempre. A luta enriquece-o de
experiência, a dor aprimora-lhe as emoções e o sacrifício tempera-lhe o caráter. O
espírito encarnado sofre constantes transformações por fora, a fim de acrisolar-se e
engrandecer-se por dentro.”
André Luiz (Francisco Cândido Xavier e Waldo Vieira)
Evolução em dois mundos (1959)
79
CAPÍTULO 4 - Immunoexpression of cell cycle regulators in canine prostate
with proliferative lesions
ABSTRACT
In this study immunostaining of p21, p27, p53, cyclin D1, c-myc was evaluated in normal
canine prostate and with proliferative disorders to verify the interaction between these
regulators of cell cycle progression. From 106 samples of canine prostate obtained from a
TMA block, 15 were considered normal, 16 diagnosed as benign prostatic hyperplasia (BPH),
30 as proliferative inflammatory atrophy (PIA), 20 as prostatic intraepithelial neoplasia (PIN),
and 25 as prostatic carcinoma (PC). Difference in immunostaining of p21, p27, cyclin D1 and
p53 in acinar epithelium in relation to the prostate condition was observed. There was positive
correlation between p21 and p27 for number of stained cells and staining intensity in all
conditions and between c-myc and p53 in prostates with PIN. Considering the number of
labeled cells, there was positive correlation between p21 and p53 in the normal prostate. Also,
regarding the intensity of staining, there was positive correlation between p21 and p53 in
prostate tissue with PIN and between p27 and c-myc in prostates with PIA. Negative
correlation between c-myc and cyclin D1 was also found in the glands with PIN, considering
the number of labeled cells, and between p27 and c-myc in the prostates with PC for staining
intensity. In conclusion, the expression of p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc varies
according to type of proliferative lesion in canine prostate. Together, the results of this study
suggest low growth potential for canine PC in the presence of p21 and p27 overexpression,
cyclin D1seeming underexpression and regular expression of c-myc, also with the p53 mutant
type presence. Further, considering the similar immunophenotype presented by glands with
PIA, PIN and PC regarding these regulators of cell cycle progression, it is possible reaffirm
the premalignant potential of PIA and PIN in canine prostate.
Key words: c-myc, cyclin D1,benign prostatic hyperplasia, proliferative inflammatory
atrophy, prostatic intraepithelial neoplasia, prostatic carcinoma.
80
Imunoexpressão de reguladores do ciclo celular em próstatas caninas com
alterações proliferativas
RESUMO
Neste estudo a imunomarcação de p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc foi avaliada na próstata
canina normal e com desordens proliferativas para verificar quanto a interação desses
reguladores na progressão do ciclo celular. Um total de 106 amostras de próstata canina foi
obtido a partir de um bloco de TMA, sendo 15 normais, 16 hiperplasia prostática benigna
(HPB), 30 atrofia inflamatória proliferativa (PIA), 20 neoplasia intra-epitelial prostática
(PIN), e 25 carcinoma prostático (PC). Foi encontrada diferença na imunomarcação de p21,
p27, ciclina D1 e p53 no epitélio acinar em relação aos diagnósticos. Houve correlação
positiva entre p21 e p27 para as variáveis número de células marcadas e intensidade de
imunomarcação em todos os diagnósticos (normal, HPB, PIA, PIN e PC), e entre c-myc e p53
nas próstatas com PIN. De acordo com o número de células marcadas, houve correlação
positiva entre p21 e p53 na próstata normal. De acordo com a intensidade de imunomarcação
houve correlação positiva entre p21 e p53 no tecido prostático com PIN e entre p27 e c-myc
em próstatas com PIA. Foi observado também correlação negativa entre c-myc e ciclina D1
nas glândulas com PIN, considerando o número de células marcadas, e entre p27 e c-myc na
próstata com PC, para a variável intensidade de imunomarcação. Conclui-se quea expressão
de p21, p27, p53, ciclina D1 e c-myc variam na próstata canina de acordo com o tipo de lesão
proliferativa. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem baixo potencial de crescimento
dos carcinomas da próstata canina quando há superexpressão de p21 e de p27, aparente
subexpressão ciclina D1 e expressão normal de c-myc, mesmo na presença de p53 tipo
mutante. Ainda, considerando o imunofenótipo semelhante nas glândulas com PIA, PIN e PC
no que se refere aos reguladores da progressão do ciclo celular, reitera-se o potencial pré-
maligno da PIA e PIN na próstata canina.
Palavra chave:c-myc, ciclina D, hiperplasia prostática benigna, atrofia inflamatória
proliferativa, neoplasia intraepitelial prostática, carcinoma prostático.
81
INTRODUCTION
According to Brazilian National Institute of cancer (INCA)1, prostate cancer (PC)
is one of the largest cancer incidents among men in Brazil. There are estimated 68.800new
cases of PC in Brazil in 2014 year, these means 70.42 new cases per 100.000 human. Due to
similarities in natural occurrence and hormonal influence in development of benign prostatic
hyperplasia (BPH) and prostatic carcinoma (PC) between canine and human, canine prostate
have been studied as prostate carcinogenesis model2-4
. Furthermore, dysplastic lesions of
human prostate, such as prostatic intraepithelial neoplastic (PIN) and proliferative
inflammatory atrophy (PIA), are considered premalignant, because they show morphological
similarities to cancer and PIA commonly contain somatic mutations that are present in PIN
and PC3,5
.
The proliferation of cells is controlled at specific points in the cell cycle,
particularly at the G1-S and the G2-M transitions, with the evolvement of cyclins and cyclin-
dependent kinases (Cdk) and their inhibitors (CdkI`s). The major step in malignant
transformation in tumors is the uncontrolled cell cycle. Knowing the regulators is important to
understanding malignant transformations that occurred in tumor types6-9
.
One of the important proteins that control the cell cycle is the p53 protein, known
as guardianof genome, because if an error occurs in DNA transcription, it will stop the cell
cycle and action repair mechanisms or trigger apoptotic events, to death the cell. It occur by
stimulating p21 that has regulatory functions and blocks the cell cycle progression from G1-S
phase through different steps10,11
. Those protein p21 allow cell DNA repair, differentiation
and apoptosis12,13
. These tasks are performed by the interaction with cyclin A-cyclin
dependent kinase 2 (Cdk2), and cyclin D1-Cdk4 complexes14
. A reduction or a total absence
of p21 has been shown in tumors cell lines lacking p53 or containing a non-functional mutant
form of TP5315
.
Cyclin D1 (CD1) is positive regulator of G1 phase progression in the cell cycle,
binds to and activates the cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6, regulate phosphorylation
of the retinoblastoma gene (Rb) product, thereby activating E2F transcription factors16,17
. Also
the CD1 protein is down-regulated by c-myc factor18,19
. In dogs, CD1 protein is also
overexpressed in mammary carcinoma, squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma20-
22, but not in cutaneous mast cell tumors
23.
Another important cell cycle inhibitor it is p27 protein, that increasing levels
result in blocking cell cycle in S phase12,24,25
. Yang et al.26
and De Marzo et al.27
observed
lower expression of p27 in lesions such as BPH, PIN and PC, concluding that this contributes
82
to the high rate of mitosis in these proliferative lesions. Also, Fredersdorf et al.28
and Tan et
al.29
infer that loss of p27 protein is a negative prognostic factor for human breast cancer.
The c-myc has been suggested as a key element of carcinogenesis in different
tumor type, with direct and indirect participation in a regulation of cell cycle and apoptosis30-
32. Expression of c-myc has been found in many types of canine neoplasm, as transmissible
venereal tumors (TVT)33
, eyelid tumors32
, osteosarcomas34
, mammary tumors35
and canine
prostate36
. In canine prostate the expression of c-myc protein is elevated in tissues with PIA
and PC and has been associated with loss of the tumor suppressor proteins NKX3.1 and E-
cadherin36
. In order to verify the interaction between the regulators of cell cycle progression
in canine prostate with proliferative lesions, p21, p27, p53, ciclina D1 and c-
mycimmunostaining was evaluated in normal glands and with BPH, PIA, PIN and PC.
MATERIAL AND METHODS
The samples were derived from the necropsied animal´s on pathology service of
the School of Veterinary Medicine and Animal Science of the Federal University of Goiás
(UFG), Goiania, Brazil recorded from 2008 to 2012. The research was approved by
committee on publication ethics COPE/UFG number 353/2010. Three-µm-sections were
obtained from formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) tissue blocks and stained with
hematoxylin and eosin (HE) for microscopic examination. Histomorphological evaluation
included normal prostates and with BPH37
, PIA38
, PIN39
, and PC40
. All prostatic samples were
from adult dogs with pure or mixed breeds and normal prostatic tissues were from dogs with
no lesions in the gland.
The prostate tissue microarray (TMA) was carried out according to criteria
described by Rubin et al.41
. From the previous defined areas in histomorphological evaluation,
tissue cores with a dimension of 1.0 mm were taken from FFPE tissue samples and arrayed on
a recipient paraffin block using the tissue microarray (Beencher Instruments®, Silver Spring,
USA). Three-µm-sections were obtained from recipient block and distended on charged slides
(Starfrost White, Sakura Adhesion microscope slide with Cut Edges, ready to use, Germany -
Dako 9545-1) for HE staining and immunohistochemistry.
Immunohistochemistry was performed in duplicate, in TMA slides, which were
deparaffinized, rehydratated and washed in distilled water. Endogenous peroxidase and non-
specific protein were blocked with 3% hydrogen peroxide incubation for 20min, protein block
(Leica, Newcastle, UK, #RE7102) incubation for 5min at 37°C. For mouse monoclonal anti-
human p21WAF1/Cip1
clone SX118 (Dako, Carpinteria, CA, USA, #M7202), monoclonal mouse
83
anti-Human p27Kip1
clone SX53G8 (Dako Carpinteria, CA, USA, #M7203), monoclonal
mouse p53 clone 5G176 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, #sc-71785), monoclonal
mouse cyclin D1 clone A12 (Santa Cruz Biotechnology, Ca, USA, #sc-8396) and anti-Human
C-MYC Ab-2 clone 9E10.3 (Thermo Fisher Scientific, Neomarkes, #MS-139-P0).Antigen
retrieval was performed with 10 mM pre-heated citrate buffer, pH 6.0, for 3min, in pressure
cooker (Solar, Rapid Express, Tramontina, Brazil). The antibory was diluted at 1:50, 1:200,
1:500, 1:50, 1:50 respectively and incubated overnight, at 4°C, in wet chamber. Incubation
with polymer enzyme, chromogen and HRP substrate for signal detection were done using
reagents from polymer kit (New Link Max Polymer, United Kingdom, #RE7260-K) and
following manufacturer’s directions. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin,
washed, dehydrated, cleared, covers lipped, and examined by light microscopy.
Sample from human colon carcinoma for p21 and p27, human mammary
carcinoma for p53, and canine lymph node to cyclin D1 and c-myc were used as positive
control. For negative control the primary antibody was replaced by PBS buffer, pH 7.4. The
intensity of p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc reactivity was scored as: 0=negative, 1=mild,
2=moderate and 3=intense. Regarding the number of stained cells, the scores were:
0=negative, 1=1-25%, 2=26-50%, 3=51-75% and 4=76-100%.
The Chi-square, Kruskal-Wallis, nonparametric multiple comparison test for
paired contrasts the relative effects with Tukey correction, as well as descriptive data were
used to compare the scores of percentage of positive cells and their intensity. Association
between p21, p27, p53, cyclin D1and c-myc expression in normal prostatic tissue and with the
different lesions studied was achieved by Spearman test. For all it was used SPSS (IBM Corp.
Released 2010. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM Corp.)
and R (R Development Core Team (2008) R Foundation for Statistical Computing, Vienna,
Austria). All values were considered with 5% of significance level.
RESULTS
From TMA slide were obtained 15 (14.15%) were normal tissues, 16 (15.09%)
BPH, 30 (28.3%) PIA, 20 (18.87%) PIN, and 25 (23.58%) PC (Table 1).The immunostaining
was nuclear for p21, p27 and p53is shown in Figure 1, cytoplasmic for cyclin D1and nuclear
through cytoplasmic and membrane for c-mycis shown in Figure 2.
84
FIGURE 1 - Immunohistochemistry photomicrography on nuclear immunostaining(arrow). A)
Canine PIN tissue with score three for labeling intensity and four for number of
labeled cells for p21. 200x. B) Human colon carcinoma. Positive control for p21 with scores two for labeling intensity and four for number of labeled cells. 400x. C)
Normal canine prostatic tissue with one for labeling intensity and one for number
of labeled cells for p21 (400X) D) Canine PIN with score two for labeling intensity
and two for number of labeled cells for p27. 200x. E) Human colon carcinoma. Positive control of p27 with score three for labeling intensity and four for number
of labeled cells. 400X. F) Canine PIA with score three for labeling intensity and
A B
E F
G H
C D
85
four for number of labeled cells for p53. 400X. G) Mammary carcinoma. Positive
control of p53 with score three for labeling intensity and three for number of
labeled cells. 200X. H)Normal canine prostatic tissue with 0- score for p-53 (400X). IHC, DAB, counterstained with H&E.
FIGURE 2.Immunohistochemistry photomicrography on nuclearthrough cytoplasmic and membrane
immunostaining.A) Canine PIN tissue with score one for labeling intensity and three for number of labeled cells of cytoplasmic cyclin D1 (arrow)(400X). B) Canine lymph
node. Positive control of cytoplasmic cyclin D1 (arrow) with score two for labeling
intensity and two for number of labeled cells.(400X) C) Normal canine prostatic tissue with 0- score for cyclin D1 (200X) D) Canine PC tissue with score three for labeling
intensity and four for number of labeled cells for nuclear through cytoplasmic c-myc
(arrow).(400X) E) Canine lymph node. Positive control of nuclear through cytoplasmic
c-myc (arrow), with score two for labeling intensity and four for number of labeled cells.(200X) F) Normal canine prostatic tissue with scorethree for labeling intensity and
four for number of labeled cells for c-myc(arrow). (200X). IHC 400x. DAB with H&E
counterstain.
A B
C D
E F
TABLE 1 - Distribution of cases according to the scores applied to variable number of labeled cells and intensity of labeling to p21, p27, p53, ciclyn D1 and c-
myc antibodies in normal prostate tissues and with BPH, PIA, PIN and PC.
Number of Labeled Cells (%) Intensity of Labeling Cells (%)
Diagnoses Antibodies 0 (0%) 1 (1-25%) 2 (26-50%) 3 (51-75%) 4 (76-100%) 0 Negative 1 (mild) 2 (moderate) 3 (intense)
Normal N=15
p21 46.67% (7) 0% 26.67% (4) 20% (3) 6.67% (1) 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0% p27 46.67% (7) 6.67% (1) 33.33% (5) 13.33% (2) 0% 46.67% (7) 53.33% (8) 0% 0%
c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (15) 0% 33.33% (5) 66.67% (10) 0%
cyclin D1 100% (15) 0% 0% 0% 0% 100% (15) 0% 0% 0% p53 73.33% (11) 20% (3) 6.67% (1) 0% 0% 73.33% (11) 26.67% (4) 0% 0%
BPH
N=16
p21 62.5% (10) 6.25% (1) 12.5% (2) 18.75% (3) 0% 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0%
p27 62.5% (10) 12.5% (2) 18.75% (3) 6.25% (1) 0% 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0% c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (16) 0% 18.75% (3) 81.25% (13) 0%
cyclin D1 62.5% (10) 0% 6.25% (1) 6.25% (1) 25% (4) 62.5% (10) 37.5% (6) 0% 0%
p53 37.5% (6) 18.75% (3) 43.75% (7) 0% 0% 37.5% (6) 62.5% (10) 0% 0%
PIA N=30
p21 13.33% (4) 6.67% (2) 13.33% (4) 40% (12) 26.67% (8) 13.33% (4) 56.67% (17) 23.33% (7) 6.67% (2) p27 13.33% (4) 6.67% (2) 23.33% (7) 43.33% (13) 13.33% (4) 13.33% (4) 36.67% (11) 40% (12) 6.67% (2)
c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (30) 0% 6.67% (2) 73.33% (22) 20% (6)
cyclin D1 30% (9) 13.33% (4) 33.33% (10) 0% 23.33% (7) 30% (9) 60% (18) 6.67% (2) 3.33% (1) p53 6.67% (2) 0% 70% (21) 10% (3) 13.33% (4) 6.67% (2) 83.33% (25) 10% (3) 0%
PIN
N=20
p21 10% (2) 5% (1) 5% (1) 15% (3) 65% (13) 10% (2) 25% (5) 35% (7) 30% (6)
p27 15% (3) 5% (1) 20% (4) 40% (8) 20% (4) 15% (3) 35% (7) 35% (7) 15% (3) c-myc 0% 0% 0% 5% (1) 95% (19) 0% 20% (4) 75% (15) 5% (1)
cyclin D1 20% (4) 10% (2) 65% (13) 5% (1) 0% 20% (4) 80% (16) 0% 0%
p53 10% (2) 0% 15% (3) 40% (8) 35% (7) 10% (2) 50% (10) 35% (7) 5% (1)
Carcinoma N=25
p21 24% (6) 8% (2) 8% (2) 12% (3) 48% (12) 24% (6) 24% (6) 12% (3) 40% (10) p27 16% (4) 0% 24% (6) 20% (5) 40% (10) 16% (4) 24% (6) 20% (5) 40% (10)
c-myc 0% 0% 0% 0% 100% (25) 0% 32% (8) 44% (11) 24% (6)
cyclin D1 28% (7) 40% (10) 8% (2) 0% 24% (6) 28% (7) 60% (15) 12% (3) 0% p53 4% (1) 4% (1) 24% (6) 8% (2) 60% (15) 4% (1) 60% (15) 28% (7) 8% (2)
87
The number of stained cells to p21 in normal prostatic tissue was different
from those with PIN, as well as it was different in prostatic tissues with BPH from those
with PIA, PIN and PC. According to intensity of expression, there were differences in
normal prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in
prostatic tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 - Table 2).
The number of stained cells to p27 in normal prostatic tissue was different
from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in prostatic tissues with
BPH from those with PIA, PIN and PC. According to intensity of expression, there were
differences in normal prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it
was different in prostatic tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 -
Table 2).
The number of stained cells to p53 in normal prostatic tissue was different
from those with PIA, PIN and PC as well as it was different in prostatic tissues with
BPH from those with PIA, PIN and PC, and in prostatic tissues with PIA from those
with PC. According to intensity of expression, there were differences in normal
prostatic tissue from those with PIA, PIN and PC, as well as it was different in prostatic
tissues with BPH from those with PIA, PIN and PC (p<0.05 - Table 2).
The number of stained cells to cyclin D1 in normal prostatic tissue was
different from those with BPH, PIA, PIN and PC. According to intensity of expression,
there were differences in normal prostatic tissue from those with BPH, PIA, PIN and PC
(p<0.05 - Table 2).The number and the intensity of stained cells to c-myc antibody there
were no difference according to diagnoses (p<0.05 - Table 2).
TABLE 2 -Means of comparison between p21, p27, p53, cyclin D1 and c-myc immunostaining regarding the number of stained cells and intensity of staining cells in canine normal
prostatic tissue and with BPH, PIA, PIN and PC.
Diagnoses N
Rank of Number of Stained Cells Rank of Staining Intensity
p21 p27 c-
myc
cyclin
D1 p53 p21 p27
c-
myc
cyclin
D1 p53
Normal 15 36.3a
34.4a
54.0a
23.0a
16.9a
33.9a
31.6a
42.5a
21.5a
23.0a
BPH 16 28.0ab
26.4a
54.0a
49.1b
30.4a
28.3a
28.4a
49.3a
46.5b
38.4a
PIA 30 57.8ac
60.1b
54.5a
61.7b
54.6b
55.8b
60.4b
63.3a
61.4b
55.7b
PIN 20 72.5c
62.3b
55.4a
62.8b
70.8bc
71.4b
60.8b
50.8a
61.5b
66.9b
Carcinoma 25 59.8ac
67.4b
56.0a
57.3b
75.2c
64.3b
68.6b
53.2a
61.6b
68.2b
Similar letters in the same column are not different by nonparametric multiple comparison test
for paired contrasts the relative effects with Tukey correction. (p value - p<0.05).
88
There was strong positive correlation between p21 and p27 for both number
of stained cells and staining intensity for normal tissue and with BPH, PIA, PIN and PC.
There was positive correlation between p21 and p53 regarding to number of stained
cells in normal prostate tissue, and also the intensity of staining to PIN tissue. There
were positive correlation of staining intensity between p27 and c-myc in prostates with
PIA. Also, in prostates with PIN there is correlation between p53 and c-myc regarding
to intensity of staining cell (Table 3).
Furthermore, there was negative correlation between c-myc and cyclin D1
for prostate tissue with PIN regarding the number of stained cells. Considering staining
intensity, there was negative correlation between p27 and c-myc and between p21 and
c-myc for prostate with carcinoma. That means that high values of one variable are
associated the low values of the other variable (Table 3).
89
TABLE 3 - Means of correlation between antibodies expression regarding the number of stained cells and intensity of staining
of the normal canine prostate and with BPH, PIA, PIN and PC.
CORRELATION
between antibodies
Diagnoses
Normal BPH PIA PIN PC
R P R P R P R P R P N
um
ber
of
Sta
ined
Cel
ls
p21/p27 0.841 <0.001cr 0.992 <0.001
cr 0.527 0.043
cr 0.528 0.017
cr 0.587 0.002
cr
p21/cyclin D1 - - 0.173 0.681 -0.30 0.272 -0.329 0.157 0.273 0.187
p21/p53 0.518 0.048cr 0.378 0.356 -0.073 0.797 0.223 0.345 0.088 0.676
p27/cyclin D1 - - 0.201 0.634 0.170 0.545 -0.123 0.606 0.201 0.334
p27/p53 0.325 0.237 0.375 0.360 -0.019 0.947 0.090 0.705 0.265 0.200
c-Myc/cyclin D1 - - - - - - -0.446 0.049cr - -
c-Myc/p53 - - - - - - 0.379 0.009cr - -
cyclin D1/ p53 - - 0.344 0.404 0.022 0.938 -0.307 0.187 0.161 0.442
Sta
inin
g I
nte
nsi
ty
p21/p27 0.732 0.002cr 1.000 <0.001
cr 0.522 0.046
cr 0.429 0.050
cr 0.573 0.003
cr
p21/c-Myc -0.378 0.165 0.293 0.482 0.121 0.667 0.324 0.164 -0.404 0.045cr
p21/cyclin D1 - - 0.467 0.244 0.295 0.286 -0.057 0.813 0.061 0.772
p21/p53 0.262 0.346 0.447 0.267 0.250 0.369 0.445 0.050cr -0.056 0.789
p27/c-Myc -0.378 0.165 0.293 0.482 0.592 0.020cr -0.058 0.807 -0.586 0.002
cr
p27/cyclin D1 - - 0.467 0.244 0.407 0.132 -0.114 0.633 -0.039 0.852
p27/p53 0.262 0.346 0.447 0.267 0.150 0.594 0.200 0.397 0.090 0.669
c-Myc/cyclin D1 - - 0.293 0.482 0.058 0.837 0.100 0.674 0.064 0.762
c-Myc/p53 -0.213 0.446 -0.218 0.604 -0.069 0.806 0.593 0.006cr 0.145 0.488
cyclin D1/ p53 - - 0.447 0.267 0.282 0.309 0.083 0.728 0.124 0.554
R = Spearman´s correlation between the antibodies; P values followed by the letters cr represents the correlation between the
antibodies (p<0.05).
90
DISCUSSION
In this study p21 was overexpressed in 40% of PC, 30% in PIN and 6.7% of PIA.
Furthermore, Xiong et al.42
reported p21 overexpression in 100% of malignant mammary
tumors when compared to normal mammary gland in women. Thus, it seems that malignant
tissue shows high expression of p21, which would work as a pathway to control cell
proliferation in those tissues. Increased expression of p21 may lead a crucial part in growth
arrest, inducing senescence or apoptosis, a mechanism which seems to protect against
malignant transformation43-45
. According to Majid et al.44
, increased levels of p21 indicate
good prognosis. So, the p21 overexpression observed in canine PC could mean tumors more
controlled in terms of proliferation and growing.
Almost prostates with BHP were p21 negative and those ones positives to p21
showed mild immunostaining, which could contribute to the typical cell proliferation
associated with this condition in the canine prostate. According to Huang et al.45
, prostatic
tissue with BPH may express p21 due to an alteration in CDKN1A (p21 gene). It could cause
an imbalance between cell proliferation and apoptosis in the prostatic tissue,resulting in a
continuous cell cycle,which influences the cell proliferation andinvolves the pathogenesis of
BPH45
.
It was observed p53 expression in normal canine prostate, in proliferative lesions
and a higher expression in PC, as reported by Fernandez e Thomson25
and by Croce et al.46
.
There were differences between PIA and PC, but not between PC and PIN regarding the
number of stained cells. These results suggest that alterations related with p53 protein start in
canine prostate with PIA and become accentuated in canine glands with PIN and PC,
reinforcing malignant potential of PIN as described before in dogs46
, and humans47-49
.
According to Quian et al.47
, Tsujimoto et al.48
and Stangelberger et al.49
, the high expression
of p53 in human PC and PIN has been associated with progression of disease due to higher
proliferative indices and more aggressive phenotype.
Prostate with PIA, PIN and PC showed higher immunostaining of p27 when
compared to BPH and normal tissue. The opposite was reported by Yang et al.26
and De
Marzo et al.27
in human prostate with PIN and PC, whichshowed lower expression of p27.
Once loss or decrease of p27 protein has been associated with cancer cell undifferentiation,
proliferation and poor prognostic50-53
, it is prompt to think that p27 would be working as a
product of one suppressor gene (CDKN1B) in canine prostate tissues with premalignant and
malignant lesions. Reinforcing this hypothesis, Trotman et al.54
have observed 100% of
prostate tumors in p27-deficient mices. Wang et al.53
reported thatoverexpression of p27 in
91
prostate with PIN may contribute to preventing and inhibitingthe progression of PIN to
invasive PC. Either, Wang et al.53
affirm that both p27 and p53 function should be checkedin
the progression of PIN to invasive cancer in order to prognosis establishment.
In canine prostate we observed cyclin D1 (CD1) immunostaining only in tissues
with lesions (BPH, PIA, PIN, PC). Moreover, the CD1 expression though almost mild it was
more frequent in prostates with PIA, PIN and PC if compared to BPH. CD1 protein is a
positive regulator of G1-S phase progression in the cell cycle. It binds to and activates the
cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk616,17,20,55
, and the low expression of CD1 is
significantly associated with high expression of p21 protein13,43,56,57
. Also according to
Jirawatnotai et al.58
, CD1 may play a positive role in DNA damage repair. Thus, the
seeminglower expression of CD1 in association with high p21 expression could mean the
slowing of cell cycle and it mild expression could represent the repairing of DNA damagedin
the prostatic tissue with proliferative lesion.
Interestingly, even with no differences regarding c-myc immunostainingaccording
to diagnosis, c-myc immunostaining was found in all normal prostates and with PIA, PIN, and
PC, PIA and PIN. However, it was cytoplasmic or nuclear depending on diagnosis, being
cytoplasmic in normal and with BPH prostates, and cytoplasmic and/or nuclear in glands with
PIA, PIN and PC. It was also observed that even in low frequence, the immunostaining
became stronger from PIA to PIN and from this to PC and also if compared to normal prostate
and with BPH. It was similar to Fonseca-Alves et al.36
that have reported c-myc
immunostaining in canine normal prostate and with PIA and PC having concomitant PIN foci.
They also observed cytoplasmic and nuclear immunostaining,but with nuclear staining only
few prostates with PC. Although the cytoplasmic immunostaining of c-myc is reported36,59
, its
importance at this location is controversial, since Koh et al.60
affirm that almost c-myc
functions are besed on its known nuclear action. So, considering our results for nuclear
immunostaining of c-myc it seems that lesions of PIA and PIN really have any malignant
potencial and the canine PC could be less aggressive, since the increased c-myc expression in
the human PC is related totumor cell proliferation, indifferentiation of basal cells and changes
in the apoptotic pathway60,61
. To Koh et al.60
, Gurel et al.61
and Dang62
c-myc is
overexpressed at early and late stages of development of PC and many others human cancers.
It was observed correlation between p21 and p27 in all tissues (normal, BPH,
PIA, PIN and PC) regarding the number and intensity of immunostaining in canine prostates,
but not between p21, p27 and cyclin D1 and c-myc. In this context, Wang et al.57
reported that
when p21 and p27 levels are increased and cyclin D1 decreased, good prognosis is indicated.
92
Likewise, Majid et al.44
reported increase of p21 and p27 protein with decrease of several
types of cyclin (A2, B2, E1 and E2), but not with cyclin D1. Thus, herein our results suggests
that even with no correlation between all those proteins, the positive relation between p21 and
p27 overexpression and decreasing of CD1 seems to be controlling the cell proliferation in
canine prostates with proliferative disorders, mainly in PC, which could explain the low
incidence of canine PC in comparison with this tumor in human glands.
There was positive correlation between immunostaining of p21 and p53 in canine
prostatic normal tissues, but no in prostates with proliferative lesions, except in glands with
PIN regarding intensity of staining. It confirms that the expressions of p21and p53 are
associated, with both playing role together in the cell pathway where p53 induces p21in
normal tissues10-15
. Thus, this known cellular mechanism of control and repair would be
absent in those canine prostates with PIA and PC, enabling the cell growing, since areduction
or absence of p21 has been shown in cell lines of tumors with lacking of p53 or containing a
non-functional mutant form of TP5315,49
. However, it seems that even in the presence of p53
mutant, p21 is induced and keeps its action controlling cell growing, which could justify the
low development of PC in canine prostate. In prostates with PIA the inflammatory
environment could be changing those proteins expression and other p21 pathways would be
arresting the cell proliferation. In this context, Yan et al.63
indentified p21 induction
independent of p53 expression in several cell types of tumors, including human breast cancer
cells and the canine kidney cell line. Also, in human PC,Matsushima et al.64
reported that PC
with p53+/p21
- phenotype showed poorer prognosis compared with those p53
+/p21
+,and that
combination could predict the patient survival more accurately than p53 immunostaining
alone, turning p21 a useful tool for interpretation of p53 IHC results.
CONCLUSIONS
The results suggest low growth potential for canine PC in the presence of p21 and
p27 overexpression, cyclin D1 seeming low expression and regular expression of c-myc, also
with the p53 mutant type presence. The similar cell cycle progression regulators
immunostaining profile presented by glands with PIA, PIN and PC, corroborate the pre-
malignant potential of PIA and PIN in canine prostate.
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“As leis da genética encontram-se presididas por numerosos agentes psíquicos que a ciência
da Terra está longe de formular...”
Emmanuel (Francisco Cândido Xavier)
O consolador (pergunta nº 35) ano 1940
CAPÍTULO 5 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na realização desta tese foi possível observar que há controvérsia acerca do
potencial de malignidade da PIA na próstata canina, sendo que este quadro vem se
modificando. Os relatos em periódicos que descrevem a PIA no cão, bem como sua relação
com tecidos adjacentes e concomitância com outras lesões proliferativas como HPB, PIN e
PC, apesar de escassos, vem aumentando. No entanto, essas lesões ainda constituem
grande desafio à pesquisa do câncer ao entendimento das alterações genéticas e
epigenéticas associadas à oncogênese, que contribuem para as alterações celulares e
biológicas que podem ser reconhecidas como malignas. Genes intimamente envolvidos na
regulação da proliferação celular são conhecidos por alterarem-se em todos os casos.
Frente a esse desafio, o objetivo principal deste trabalho foi estudar proteínas
envolvidas no ciclo celular, com o intuito de melhor entender os possíveis mecanismos de
escape do controle do ciclo e assim verificar o potencial pré-maligno da PIA e maligno do
PC na espécie canina.
Nesse sentido, foi possível observar a expressão de p21, p27, p53, ciclina D1,
c-myc, EGFR e Her2 na próstata canina e inferir que essas proteínas participam de forma
direta ou indireta no processo de desenvolvimento do carcinoma na próstata dos cães, bem
como da PIA. Ainda, analisados em conjunto, os resultados direcionam à conclusão de que
o carcinoma da próstata canina apresenta baixo potencial de progressão, o que justifica a
baixa frequência de casos observada na clínica veterinária, somado ao fato de que, mesmo
quando presente, as metástases não se desenvolvem de forma imediata. Esse perfil
imunofenotípico voltado a um baixo potencial de progressão também justificaria o
interessante fato de se ter encontrado inúmeros focos de PIN e PC na próstata de cães que
não apresentavam sinais macroscópicos de tumor. Isto faz questionar quanto ao que se diz
raro na literatura. O que é raro, o desenvolvimento ou o diagnóstico dessas lesões na
próstata canina? Ainda, porque tantos focos de PC constatados na próstata dos cães de
Goiânia? Qual o fator predisponente nessa região do país que contribui para a presença
expressiva do carcinoma na próstata do cão?
Na espécie humana, o emprego dessas proteínas como marcadores tumorais
vem sendo amplamente estudado e muitos já são utilizados na rotina diagnóstica e
prognóstica do câncer humano, como é o caso do Her2 para neoplasias mamárias. No cão
não foi possível correlacionar a expressão dessas proteínas com a evolução da doença,
evidência clínica do tumor e prognóstico.
99
Diante do elevado número de amostras obtidas foi possível otimizar o estudo
com o uso do bloco de TMA, conferindo grande economia de reagentes e tempo, além de
proporcionar a uniformização na realização das reações. Somado a isso, a compilação das
amostras em uma única lâmina facilita a interpretação comparativa dos casos, com
possibilidade de repetição das reações em múltiplos níveis do bloco, o que confere melhor
representação das lesões em comparação ao corte original. Ainda, seu uso simplifica o
trabalho das linhas de pesquisa, já que as amostras podem ser utilizadas em mais de um
projeto.
O avanço das pesquisas, com o advento de novas técnicas e a disponibilidade
de reagentes comerciais tornou possível a extração de material biológico proveniente de
material parafinizado, a exemplo de RNA e DNA em quantidade e qualidade, viabilizando
a realização das técnicas de RT-PCR e RT-qPCR neste estudo. Isso também possibilita a
realização de estudos retrospectivos envolvendo material de arquivo, aumentando a
quantidade de material a ser estudado.
Identificando bons marcadores de diagnóstico, prognóstico e tratamento será
possível estabelecer terapias precoces e efetivas para o tratamento do câncer prostático.
Nesse sentido, o estudo da expressão de p21, p27, p53, ciclina D1, c-myc, EGFR e Her2
em próstatas caninas com PIN, PIA e PC permitiram-nos adicionar novos dados ao
conhecimento dos eventos biológicos que desencadeiam o câncer prostático no cão e
reforçou o conceito de que o cão é o melhor modelo experimental para a verificação desses
eventos na próstata humana.
100
ANEXO A
Tabela contendo a quantidade e pureza do DNA e RNA (razão
A260/280)extraído das 16 amostras de próstata parafina.
Sample Diagnoses DNA RNA
A260/A280 ng/ul A260/A280 ng/ul
1 – N1
Normal
1.893 106.0 1.758 182.4
2 - N2 1.988 313.0 1.798 78.4
3 - N3 1.806 149.0 1.837 76.4
4 - N4 1.985 260.0 1.960 58.8
5- PIA 1
PIA
1.985 260.0 1.971 67.8
6 – PIA 2 2.007 697.5 1.953 82.8
7 - PIA 3 1.847 318.0 1.973 60.3
8 – PC 1
PC
1.944 190.5 2.057 57.6
9 - PC 2 1.983 229.0 1.858 84.0
10 – PC3 1.888 497.5 2.130 59.7
11 – PC 4 1.942 506.0 1.976 76.8
12 - PC 5 1.977 207.5 1.851 124.4
13 – PC 6 1.904 227.5 1.923 70.0
14 – PC 7 1.931 309.0 1.851 672.0
15 – PC 8 1.925 412.0 1.753 127.6
16 - PC 9 1.884 574.5 1.781 74.8
17 – MC 1 MC 1.926 586.5 1.888 377.6
MC: Mammary carcinoma.
101
APÊNDICE A
Relatório do comitê de ética: protocolo 353/10
102
103