Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa
Viana –
Exames realizados na área de Genética Médica
Universidade Federal do PiauíCampus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina IProfessora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
• Genética MédicaBiologia Molecular
Citogenética
Genética Médica no Brasil
Aplicações• Testes genéticos pré-natais,• Testes de pacientes sintomáticos;• Testes de indivíduos assintomáticos;• Com risco potencial de desenvolver
mutações.
Introdução
Distúrbios genéticos
Cromossômico Estruturais
Numéricas
Gênico
Deleção Adição
InversãoTranslocação
Distúrbios genéticos
A nível cromossômico
Estruturais
Numéricas
Exames laboratoriais referentes à:
Cariotipagem
CariotipagemPasso I
• Colheita – punção venosa,
• Cultivo;
• Adição de agentes estimulantes da mitose in vitro;
• Inibir a mitose em metáfase;
• Ruptura da célula e do núcleo celular;
• Coloração e visualização em lâmina.
Passo II• Cromossomos organizados pelo tamanho e posição do centrômero
→Acrocêntricos - NORs
→Submetacêntricos
→Metacêntricos
Técnicas de coloração do cariótipo
• Bandeamentos G
• Bandeamento Q
• Bandeamento R
• Bandeamento C
• Bandeamento de alta resolução (pró-metafásico)
• Cariotipagem espectral (SKY)
• Células nucleadas,• Amostras sangue periférico, sangue fetal, líquido
amniótico;• Pareamento dos cromossomos homólogos;• Rápido, fácil e baixo custo;• Permite a contagem do número de cromossomos;• Permite avaliar a qualidade dos preparados
cromossômicos.
Coloração convencional
Técnica mais usada; tratamento com tripsina (desnaturante proteico) e coloração com Giemsa
Cada par de cromossomas cora segundo um padrão de bandas clara e escuras (bandas G)
Coloração com quinacrina mostarda (ou outros semelhantes); observação ao microscópio de fluorescência
Cromossomas coram segundo um padrão de bandas brilhantes e opacas (bandas Q = bandas G)
Desnaturação térmica e salina seguida de coloração com Giemsa ou flurocromo( Acridina)
Bandas escuras e claras (bandas R) estão invertidas relativamente ao bandeamento G e Q
Bandeamento G
Bandeamento Q
Bandeamento R
Síndrome de Down
Bandeamento G
Bandeamento Q
Bandeamento R
• Coloração que contém heterocromatina constitutiva ;
• Partes: centrômeros e partes dos cromossomos e braços longos dos cromossomos 1,9,16 e Y.
Bandeamento C
Procedimentos especiais
Infertilidade
Síndrome de DiGeorge
• Usado com técnicas de bandeamentos G ou R,• Estágios iniciais da mitose, prófase e pró –
metáfase;• Útil principalmente para microdeleções
cromossômicas -anomalias estruturais ;• Revelam mais bandas que os métodos que usam
a fase Metáfase.
Bandeamento de alta resolução
Cariotipagem espectral (SKY)
• Cromossomos de uma
célula de uma só vez,
• Cores fluorescentes;
• 24 diferentes espectros
fluorescentes sendo o 23
ª e 24ª para o
cromossomo X e Y;
• Coloração genômica total ;
• Sistema de computador
para análise de imagem.
ATAXIA
O que essas técnicas nos permitem diagnosticar?
→Euploidia múltiplo exato do conjunto cromossômico
(tetraploidia)
→Aneuploidia qualquer outro número que não seja
múltiplo do conjunto genômico (monossomia , trissomia)
• Síndrome de Down (trissomia do 21)
• Síndrome de Edward (trissomia do 18)
• Síndrome de Patau (trissomia do 13)
• Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo
X)
Translocações recíprocas – troca de segmentos entre cromossomos
Distúrbios genéticos A nível gênico
Deleção Adição
InversãoTransição
Exames laboratoriais referentes à:
FISH - hibridização in situ por fluorescência
• Preparação de sondas específicas de DNA.• Kits pelos laboratórios de citogenética.
• Preparação das sondas:
→ Método direto→ Método indireto
• Preparação dos cromossomos.
• Preparação das lâminas.
• Desnaturação da sonda e do DNA cromossômico → aquecimento em solução de formamida (70C).
• Leucemia Mieloide Crônica (LMC)→ Cromossomo Filadélfia
FISH - Aplicações
FISH - Aplicações• Síndrome Cri-du-chat Microdeleção
Detecção de aneuploidias – Trissomia do 21
PCR Extração e purificação do DNA
1. Tampão de extração (EDTA, SDS em pH básico),
2. Adicionar Proteinase K;
3. Adicionar RNAse;
4. Adicionar Fenol;
6. Adicionar Clorofórmio/ álcool isoamílico;
8. Adicionar Acetado de Na 3M e etanol gelado.
• DNA molde,
• Primers (delimitam a sequência a ser
amplificada);
• DNA polimerase (Taq polimerase);
• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
• Tampão contendo pH de ação da DNA
polimerase;
• Cloreto de magnésio (íons Mg2+).
Componentes básicos necessários para
realização de uma reação de PCR:
Desnaturação
Hibridização dos primes
Extensão
A técnica da PCR
Cuidados especiais nas reações de PCR
• A alta sensibilidade.• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser
amplificada por PCR.• Inclusão de controles em cada experimento.
Possíveis fontes de contaminação da PCR
Amostras biológicas Ponteiras plásticas
Métodos de coleta de amostras
Tubos de reagentes/vidraria
Pessoal do laboratório Reagentes
Ambiente do laboratório/ ar condicionado
Tubos de centrífuga/ centrífuga
Gelo/ nitrogênio líquido Termociclador/ banho-maria/ bloco de aquecimento
Homogenizador de tecidos Transiluminador
RT-PCRComponentes básicos para a realização de uma RT‐PCR
• Transcriptase reversa,
• DNA polimerase;
• Taq polimerase;
• dNTPs;
• Primers;
• Íons Mg2+.
1ª Etapa (37° C)
Transcriptase reversa, DNA polimerase, primers, dNTPs
2ª Etapa (ciclos de 94°, 60°, 72° C)
Taq polimerase, dNTPs, Primers, Íons Mg2+
Eletroforese
• Preparação do gel,
• Aplicação da amostra no gel e separação por
eletroforese.
Procedimentos de Eletroforese
Preparação do gel solidificação Tampão TBE
Remover o pente
Aplicar a amostraLigar a fonte
Transiluminador
Eletroforese• Estudos da relação patógeno-hospedeiro,
• Determinação do peso molecular de proteínas;
• Caracterização de moléculas de ácidos nucléicos;
• DNA recombinante, sequenciamento de
nucleotídeos;
• Mapeamento de fragmentos de restrição;
• Amplificação de DNA.
Aplicações da PCR e Eletroforese
de DNA→ Diagnóstico pré‐natal.• Diagnóstico pré‐natal e detecção de portadores da distrofia
muscular Duchenne envolvendo a triagem de deleções e
duplicações usando a reação em cadeia da polimerase (PCR)
multiplex. O paciente 1 não tem as bandas E e F, deleção dos
éxons 45 ‐ 48. O paciente 2 não tem as bandas f e h e o paciente 3
não tem a banda d.
•PCR ‐ RFLP – polimorfismo de fragmentos de restrição (Análise de mutações)
Aplicações da PCR e Eletroforese de
DNA
→ Diagnóstico de hemoglobina S (HbS).
• Mutação no códon (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI ; assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.
Southern Blot• É um método de análise de ácidos nucleicos que
permitem mapear fragmentos de DNA de interesse
em uma coleção de fragmentos que é o nosso
genoma.
• Indicado para diagnóstico de doenças e na
identificação de pessoas.
• A metodologia permite a detecção de genes
inteiros ou grande parte deles, assim como
inserções e deleções.
Doença Tipo de mutação Teste
Síndrome do X frágil
Expansão de trinucleotídeos (CGG) na região promotora do gene
FMR1
PCR associado à Southern blot
Distrofia de Becker e
Duchenne
Mutações do tipo deleção e duplicação no gene da
distrofia (DMD).
PCR e Souther blot para detecção de
deleções
Southern BlotDNA digerido por uma enzima de restrição
Separação dos fragmentos em gel de
agarose
Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose
Membrana com os fragmentos transferidos
Hibridização com sonda marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
Northern Blot
• Análise do RNA,
• Desnaturação antes da Eletroforese em gel com
adição de formaldeído;
• Depois da eletroforese o RNA é transferido para
um filtro incubado com uma sonda desnaturada,
marcada que hibridiza o RNA específico;
• Exposição do filtro ao raio X.
Separação dos fragmentos em gel de
agarose
Transferência dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose
Membrana com os fragmentos transferidos
Hibridização com sonda marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
Purificação do RNA
Northern Blot
Dot blotTrata-se de uma metodologia que permite
detectar biomoléculas. É uma simplificação da metodologia de Southern blot, northern blot e westhern blot.• Moléculas não são separadas por eletroforese,
• Aplicadas diretamente a um suporte sólido como
um ponto (dot);
• A membrana é submetida ao processo de
desnaturação é hibridizada com a sonda de
interesse. Indicações Em casos em que a mutação investigada é
prevalente na população investigada, ou seja, a mutação de uma base ou um pequeno número de bases é responsável por uma fração significativa de casos da doença naquela população.
Westhern BlotTambém conhecido como protein blotting ou
immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente.
A genética médica e o futuro
Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo – Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa
Viana –
Obrigada pela atenção!!!
Universidade Federal do PiauíCampus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina IProfessora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
Referências Bibliográficas
• BAMOHAD, J. G. Genética Médica. Elsevier. 2010. capítulo
6. Citogenética Clínica: A base cromossômica da doença
humana.
• NASSBAUM, et al. Tompson & Tompson. Guanabara
Koogan. 2002. Capítulo 9. Fundamentos de citogenética.
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