9/18/2012
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Os princípios e o uso de LC-MS em laboratórios de análises
orgânicas
Setembro 2012
Rosy Simas
QO427
Espectrometria de Massas
9/18/2012
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QUÍMICA ORGÂNICA
Defeito de Massa
12C 12.0000
13C 13.0034
14C 14.0032
Nenhum átomo (c/ exceção do 12C) tem massa inteira
Diferença é chamada de defeito de massa
● Nomina - Massa arredondada em 1 u:
H = 1, C = 12, Cl = 35
●Média – Massa média dos isótopos:
H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532
●Mono isotópica - Massa do isótopo mais abundante:
H = 1.0078, C = 12.000, Cl = 34.9688
Resolução Unitária x Alta Resolução
249 249.0700 249.0580 249.1479
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+
(a)(a) (b)(b)
m/zm/z m/zm/z
249 249.0700 249.0580 249.1479
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+
(a)(a) (b)(b)
m/zm/z m/zm/z
0000 249 249.0700 249.0580 249.1479
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+
(a)(a) (b)(b)
m/zm/z m/zm/z
249 249.0700 249.0580 249.1479
C20H9+
C19H7N+
C13H19N3O2+ C20H9+ C19H7N+ C13H19N3O2+
(a)(a) (b)(b)
m/zm/z m/zm/z
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A importância da Altíssima Resolução
m/z
Medido Calculado 445.00485 445.00481
445.01297 445.01291
445.01741 445.01738
445.07954 445.07939 445.08487 445.08469
445.08764 445.08750
445.09214 445.09197
445.09580 445.09560 445.10024 445.10007
445.10472 445.10454
445.10809 445.10791
445.14587 445.14611
445.16525 445.16545
445.16979 445.16992
445.17799 445.17803
445.18258 445.18250
m/z
445.20 445.16 445.12 445.08 445.04 445.00
1
2
3
* *
4
*
5
6
7
8 9
11
*
12 13
*
14 15 16
*
1. C27H11NS3
2. C28H12S3 3. C28H13S3
4. C31H13N2S
5. C33H15S
6. C32H14NS
7. C32H15NS
8. C32H15S
9. C33H16S
10. C33H17S
11. C30H21S2 12. C33H19N5S4
13. C33H20N2
14. C33H21N2
15. C34H22N
16. C34H23N
8
Vantagens da Altíssima Resolução
N
N S
C23H47
S
459.3865
459.3899
459.2960
H12/C 93.9 mDa 5,000
SH4/C3 3.4 mDa 135,000
C2H3/13CN 17.0 mDa 27,000
O/CH4 36.4 mDa 13,000
m2- m1 C30H53NS
C33H49N
C20H41
C31H41NS
C16H33
459.3695 13CC31H46N2
13CC17H37
N
N
459.3501 C32H45NO
C13H27
N O
Sistema de Vácuo
Introdução
de amostra
Fonte de íons
Analisador
Detector Processador
de dados
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Modos de inserção de amostra
Fontes de ionização
a- EI (Electron Ionization”)
b- CI (“Chemical Ionization”)
c- APCI (“Atmospheric Pressure Chemical Ionization”)
d- APPI (“Atmospheric Pressure Photo-Ionization”)
e- ESI (“Electrospray Ionization”)
f- MALDI (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”)
g- DESI (“Desorption Electrospray”)
h – DART (Direct Analysis in real Time”)
i- EASI (Easy Ambiente Sonic-Spray Ionization)
API: ESI x APCI x APPI
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Ionização à Pressão Atmosférica (API):
API
Analisadores de
Massas
MS e MS/MS
Introdução
de amostra
Vácuo
Detector
LC Interface
MS
The happy “marriage”of the bird (MS) and the fish (LC analyte)
ESI (“Electrospray Ionization”):
ESI – Electrospray Ionization
John Fenn 1989 (Nobel 2002)
Compostos Polares e Pesados
Can Elephants fly ?
■ Processo de transferência de íons em solução para a fase gasosa, introduzida
por Yamashita e Fenn em 1984.
Formação do spray em ESI positivo:
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ESI: Vantagens
•Utilizado para qualquer íon formado
em solução (±);
•Confirmação de massa molecular;
•Determinação de altas massas
moleculares;
•Compostos voláteis ou não voláteis;
•Analítos iônicos e polares ;
•Baixa temperatura/baixa
fragmentação;
•Boa sensibilidade;
•Fluxos variam de nL/min a 1 mL/min.
Desvatagens
•Melhor performance em fluxos baixo;
•Deve formar íons em solução;
•Supressão iônica em condições de
alta salinidade;
•Pode-se formar adutos iônicos;
•Usuários devem c onhecer química
de soluções (equilíbrio ácido-base,
reações redox…);
•Compostos desconhecidos devem ser
analisados nos modos positivo e
negativo.
APCI (“Atmospheric Pressure Chemical
Ionization”): T ~ 400-600 oC
Íons positivos Íons negativos
Corrente na Corona 0.5-3 µA 1-5 µA
Voltagem na Corona 1-4 kV 1-4 kV
Probe de APCI:
Probe Movement
Corona Needle
Vaporizer
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APCI:
Vantagens
• Informação de massa molecular;
• Fonte robusta;
• Ionização muito eficiente;
• Compatível com altos fluxos de LC
2.0 mL/min;
Desvantagens
• Pode ocorrer degradação térmica;
• Ruído químico em massas baixas;
• Técnica não apropriada para
compostos de massa molecular com
relação m/z maior que 2000;
APPI (“Atmospheric Pressure Photo-
Ionization”)
APPI:
Vantagens
Compostos não polares;
Mínima fragmentação;
Não apresenta sinal para o
solvente ;
Mínimo efeito de competição por
carga.
Desvantagens
Difícil otimização;
Dependente da estabilidade
dopante;
Necessário sistema de exaustão.
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Analisadores
Magnéticos-Eletrostáticos (BE)
Quadrupolos (Qq)
Íon-Traps 3D e Íon-Traps Lineares (QIT)
Tempos de Vôo (TOF)
Orbitraps
Ressonância Ciclotrônica de Íons (ICR)
Analisadores :
Quadrupolo
TOF Ion trap
A importância do modo de ionização
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Noções em
Quantificação por
LC-MS/MS
Cromatografia
em papel
TLC
HPLC
LC-MS
- Extração
- Velocidade de análise
- Limites detecção/quantificação
- Escopo de matriz
Quantificação HPLC: Realidade Atual
Preparo da Amostra
Concentração do analito de interesse e tipo de matriz:
Concentração do Analito: Porcentagem ? ppm? ppb? traços ?
Ultratraços ?...
• Matriz: Orgânica (animal ou vegetal) ?
• Matriz : Inorgânica ?
• Matriz : Mista ?
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HPLC CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Injetor
Bomba
Solvente
Coluna
Registrador
Detector
HPLC SELETIVIDADE
Capacidade de distinguir e não quantificar a substância dentro da análise.
= 16-4 = 12 = 1,5
12-4 8
= 20-4 = 16 = 2,0
12-4 8
4 12 20 16 Tempo
HPLC
EFICIÊNCIA
Baixa eficiência
Alta eficiência
Tempo tR(A) tR(B) 0
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HPLC SIMETRIA
Comportamento da população de moléculas
a b
10 %
S10 = b
a
HPLC RESOLUÇÃO
R = t = t = 2 t
< W > WA + WB WA + WB
2
tR(A)
tR(B)
t
A B
Tempo
WA WB
Pratos teóricos:
Número indicativo da
performance da coluna. É a
medida da largura do pico em
relação ao seu tempo de
retenção. É o parâmetro que
mais precisamente define a
qualidade de um sistema
cromatográfico
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HPLC EFEITO DA TEMPERATURA SOBRE A SEPARAÇÂO
40 ºC
65 ºC
0 5 10 (min)
Reservatório de fase móvel e
preparo
Filtrar
sempre
Fase móvel: solvente
• Alto grau de pureza
• Dissolver a amostra sem decompor seus
componentes;
• Ter polaridade e viscosidade adequada
• Ser compatível com o detector
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Fase móvel- água
Bombas de alta pressão Eluição
Fluxo constante = max. 400 bar ou 5800 psi
Isocrático = mesma composição de
FM
Gradiente = composição varia com
eluição;
Injetor Manual e
Automático
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Colunas Cromatográficas
• Pré- colunas - proteção
• Preparativas- > 10 mm
• Convencional – 2-5 mm
• Microbore – 1-2 mm
• Capilar – 0.075-1 mm
Condicionamento e limpeza de
coluna cromatográficas
• Coluna nova = mínimo 12 horas
• Coluna de uso ocasional = 2 horas
• Limpeza = 2 horas
Seqüência lógica de solventes
Fase estacionária
quimicamente ligada
• Fase normal (silica, amino, diol, ciano e nitro)
FEP=FMA
• Fase reversa ( Nalquil C18-C4, fenil)
FEA=FMP
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Fase Móvel: • Normal= hexano, diclorometano (isopropanol,
acetato de etila)
• Reversa= metanol,acetonitrila, THF (água e tampão)
Silanol e pH de 2 a 8
Detectores
• Absorção: UV-VIS e DAD
• Índice de refração
• Fluorescência
• Eletroquímico
• MS????
DICAS: o que não fazer em HPLC • Lavar sistema tampão com orgânico puro
• Injetar amostra que precipita na FM
• Usar ácidos inorgânicos no sistema
• Deixar a bomba trabalhar seca
• Vedar conexões com fita teflon
• Deixar o equipamento parado com
tampão
• Perder a paciência
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Full Scan ou TIC
Single ion Monitoring (SIM)
Fonte Detector
Q1
Fonte Detector
Q1
Fonte Detector
Q1
Fonte
Q1
TIC SIM
Modos de varredura – Q:
Multiple reaction monitoring
Fonte Detector
Q1 q2 Q3
O que interessa neste modo de varredura
é o cromatograma.
MRM
SIM:
3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
29Jan_33 2: SIR of 8 Channels ES+ 411
5.91e4
29Jan_36 2: SIR of 8 Channels ES+ 411
5.65e4
29Jan_35 2: SIR of 8 Channels ES+ 411
1.07e5
29Jan_32 2: SIR of 8 Channels ES+ 411
8.72e4
29Jan_34 2: SIR of 8 Channels ES+ 411
3.14e4
Nicosulfuron, SIM
Tomate
Abacate
Limão
Uva passa
Farinha
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4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
29Jan_27 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182
7.95e3
29Jan_30 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182
1.05e4
29Jan_29 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182
5.27e3
29Jan_26 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182
8.36e3
29Jan_28 2: MRM of 8 Channels ES+ 411 > 182
8.64e3
MRM:
Nicosulfuron, MRM
Tomate
Abacate
Limão
Uva passa
Farinha
Comparando…
Modo de Ionização;
Coluna:
•Diâmetro e Fluxo
•Bombeamento
Fase Móvel: Pode afetar tanto a cromatografia
como o processo de ionização.
Fatores importantes
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APCI : 0.2 - 2 mL/min -
Não é necessário utilizar split.
ESI : 1 - 300 µL/min
Indicado até 1 mL/min.
Geralmente utiliza-se split para
fluxos mais elevados de tal forma
que apenas 250 L/min seja
enviado ao espectrômetro de
massas.
Fluxo de LC para MS
O diâmetro interno da coluna analítica depende do
fluxo de LC
Fluxo Coluna I.D.
0.5 - 2 mL/min 3.9 - 4.6 mm I.D.
0.1 - 0.3 mL/min 2 - 2.1 mm I.D.
40 - 50 µL/min 1 mm I.D.
< 10 µL/min Colunas capilares
Fluxo em LC:
Solventes e aditivos :
Solventes
Água
Acetonitrila
Metanol
Isopropanol
Aditivos
Ácido Acético
Ácido Fórmico
Hidróxido de Amônia
Acetato de Amônia*
Formato de amônia*
(* = Podem ser utilizados como tampão. As
concentrações não devem exceder
10 mM.)
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n-Hexano
n-Heptano
Éter etílico
Clorofórmio
Cloreto de metileno
Tetrahidrofurano
Diclorometano
Dioxano
Acetato de etila
Acetonitrila
n-Propanol
Etanol
Metanol
Adsorção Ordem crescente
de força de eluição
Solventes:
•Substâncias agregadas à fase móvel, em pequena quantidade, para
desativação dos sítios de alta reatividade da sílica;
•Tempos de retenção mais estáveis, melhor capacidade de carga na
coluna, maior eficiência e menos cauda;
•A adição de Trietilamina (ou aminas de uma forma geral) na fase
móvel, diminui o encaudamento de analitos básicos, da mesma forma, a
adição de ácido acético (ou ácidos orgânicos de uma forma geral)
beneficia a análise de substâncias ácidas.
Modificadores:
6.00 7.00 8.00 9.00Time0
100
%
Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3) F1365
2.30e6
7.56
6.00 7.00 8.00 9.00Time6
100
%
Raylo_1_007 Sm (Mn, 2x3) F1365
2.19e67.52
Efeito do ácido fórmico :
Sem aditivos
Somente água
e acetonitrila
0.03%
Ácido
fórmico
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•Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)
•Detergentes (supressão iônica)
•Ácidos inorgânicos (Sulfúrico, fosfórico, etc.)
Solventes e tampões não utilizados
Fragmentação na fonte
+ + + +
Voltagem do cone elevada
Íons produzidos por ESI ou APcI
Fragmentos
gerados por colisão
e íons não
fragmentados
N2
N2 N2
Íons que são acelerados pela voltagem do cone colidem com moléculas de nitrogênio
+ +
+
+
Fragmentação induzida pela voltagem do cone
Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340m/z0
100
%
0
100
%
0
100
%
Etalon 10 220 (12.126) 3: Scan ES+ 2.81e4214.36
96.03
89.34
174.16103.44 131.73
110.23125.55
145.55 163.16205.39
196.16186.21
241.40
279.43263.34 304.36 327.08 337.74 348.20
Etalon 10 221 (12.162) 2: Scan ES+ 4.19e4241.39
214.33
205.30155.4798.15 138.52113.54 174.02 196.20 223.16 282.41264.53249.44 291.95 303.39 330.71312.82 343.97
Etalon 10 221 (12.144) 1: Scan ES+ 3.82e4241.39
130.8197.28 108.28 151.06 223.14171.00 195.59183.04 205.32 234.36 282.41264.47253.29 292.58 310.62 325.69 345.85
Efeito da voltagem no espectro de MS:
20 V
40 V
60 V
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Experimentos de infusão para definir o método de ionização e otimizar
as condições de MS para a sensibilidade e seletividade necessária;
Otimização de valores da energia do cone para cada íon precursor;
Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem
monitorados em MRM e otimização da energia de colisão para cada transição;
Desenvolvimento do método de LC;
Otimização das etapas de extração e preparação da amostra. Estudos
de recuperação e efeito de matriz;
Criação do método para processamento de dados e quantificação.
Etapas do desenvolvimento:
partículas de 1.7µm
Separações mais rápidas
2-5x
Maior resolução
Separação de metabólitos
Redução nos efeitos de matriz
Maior sensibilidade
LOQ 3x mais baixo
UPLC versus HPLC MS
Validação de métodos analíticos
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Validação: A Resolução para...
Complexidade da Amostra
Teor do Analito
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BROMATOLOGIA (VIA ÚMIDA: TITULAÇÃO, GRAVIMETRIA, KJELDHAL)
KARL FISCHER, ANCON, PHMETRO, POLARIMETRO
ESPECTRO UV/VIS, LECO, NIR
AAS,
ICP-OES, HPLC, GC, HGAAS, GFAAS
ICP-MS,RMN, MS
ppmporcentagem (%) ppb/ppt nano (ng) / pico(pg) / fento(fg)
ANÁLISE INSTRUMENTAL
Tipo de Análise
Lógica em validação
Equipamentos e materiais: calibrados
Analistas: qualificados e treinados Utilizar substâncias químicas de referência oficiais espécie com estabilidade e
natureza confiáveis, para análises
quantitativas e qualitativas, permite comparação entre as espécies analisadas,
além de ser parâmetro de exatidão;
Antes de Validar...
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• Aplicabilidade
• Faixa de trabalho
• Linearidade
• Faixa linear de trabalho
• Sensibilidade
• Limite de detecção
• Limite de determinação/quantificação
• Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade)
• Exatidão/Taxa de recuperação
• Seletividade
• Robustez
FIGURAS DE MÉRITO
Frases de Albert Einstein
1879-1955 - Cientista
Obrigada a todos !!!!!
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