VICTOR NETTO MAIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
RECIFE
2010
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
VICTOR NETTO MAIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo
em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina
Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de
Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do
grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria
Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra
Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro
RECIFE - PE
2010
2
Ficha catalograacutefica
M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926
3
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por
VICTOR NETTO MAIA
Aprovada em 30 de agosto de 2010
BANCA EXAMINADORA
Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE
Orientadora
Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE
Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva
Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)
4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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SEVEROCK Avaliaccedilatildeo da adiccedilatildeo de cisteiacutena no secircmen resfriado para inseminaccedilatildeo
em suiacuteno Disponiacutevel em httpbibliotecauniversianethtml_burafichaparamsid
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SOBREIRA NETO JA Avaliaccedilatildeo in vitro e in vivo do secircmen equumlino diluiacutedo em
aacutegua de coco em poacute (ACP105) e refrigerada a 5 Cordm Dissertaccedilatildeo de mestrado-
Universidade de BrasiacuteliaFaculdade de Agronomia e Medicina Veterinaacuteria 2008
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53
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diluiacutedo em aacutegua de coco estabilizada e com BTS Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo
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ZEGINIADOU T PAPADIMAS J MANTALENAKIS S Acrosome reaction
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2000
ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and
infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000
54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
VICTOR NETTO MAIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo
em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina
Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de
Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do
grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria
Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra
Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro
RECIFE - PE
2010
2
Ficha catalograacutefica
M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926
3
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por
VICTOR NETTO MAIA
Aprovada em 30 de agosto de 2010
BANCA EXAMINADORA
Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE
Orientadora
Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE
Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva
Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)
4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
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59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
VICTOR NETTO MAIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo
em Ciecircncia Veterinaacuteria do Departamento de Medicina
Veterinaacuteria da Universidade Federal Rural de
Pernambuco como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do
grau de Mestre em Ciecircncia Veterinaacuteria
Orientadora Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa Guerra
Co-orientador Profordm Drordm Gustavo Ferrer Carneiro
RECIFE - PE
2010
2
Ficha catalograacutefica
M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926
3
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por
VICTOR NETTO MAIA
Aprovada em 30 de agosto de 2010
BANCA EXAMINADORA
Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE
Orientadora
Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE
Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva
Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)
4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
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refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
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refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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2
Ficha catalograacutefica
M217e Maia Victor Netto Efeito do diluente (Botu-secircmen reg e ACP reg) e da adiccedilatildeo de antioxidante (glutationa peroxidase e cisteiacutena) na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerado de equumlinos Victor Netto Maia ndash 2010 61 p il Orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncia Veterinaacuteria) ndash Universidade Federal Rural de Pernambuco Departamento de Medicina Veterinaacuteria Recife 2010 Referecircncias 1 Antioxidantes 2 Secircmen 3Glutationa peroxidase 4 Equumlino 5 Cisteiacutena 6 Secircmen refrigerado I Guerra Maria Madalena Pessoa orientadora II Tiacutetulo CDD 63608926
3
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por
VICTOR NETTO MAIA
Aprovada em 30 de agosto de 2010
BANCA EXAMINADORA
Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE
Orientadora
Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE
Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva
Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)
4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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3
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROacute-REITORIA DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIA VETERINAacuteRIA
EFEITO DO DILUENTE (BOTU-SEcircMENreg E ACP-105reg) E DA
ADICcedilAtildeO DE ANTIOXIDANTES (GLUTATIONA PEROXIDASE E
CISTEIacuteNA) NA VIABILIDADE DE ESPERMATOZOIDES
REFRIGERADOS DE EQUINOS
Dissertaccedilatildeo de Mestrado elaborada e defendida por
VICTOR NETTO MAIA
Aprovada em 30 de agosto de 2010
BANCA EXAMINADORA
Profordf Drordf Maria Madalena Pessoa GuerraUFRPE
Orientadora
Profa Dra Eacuterika Christina Santos OliveiraUFRPE
Prof Dr Karen Mascaro Gonccedilalves da Silva
Dra Zoraide Fernandes Coleto (suplente)
4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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4
A Deus a toda minha famiacutelia e amigos em especial meu
pai minha matildee e minha esposa Todos que formam o
ANDROLAB e minha orientadora a professora
Madalena por terem acreditado confiado e me ajudado
incondicionalmente
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me concedido o dom da vida a oportunidade e o
privileacutegio do estudo Pelas inuacutemeras becircnccedilatildeos a mim concedidas diariamente e aos
vaacuterios ldquoanjosrdquo que ELE coloca e colocou junto de mim em toda a minha caminhada
A toda minha famiacutelia em especial meu pai Mauriacutecio e minha matildee Dolores
que sempre me apoiaram e nunca mediram esforccedilos para me ajudar a realizar todos os
meus sonhos inclusive por muitas vezes abrindo matildeo de seus proacuteprios sonhos em
funccedilatildeo dos meus Aos meus irmatildeos Daniel e Juliana e aos meus cunhados que com
toda certeza estatildeo sempre torcendo por mim
A Karinna minha esposa amiga companheira e agora matildee de meu mais novo
amor Mariah Que sempre me deu forccedilas para conseguir ir em frente
Ao vaacuterios professores que contribuiacuteram na minha formaccedilatildeo os quais jamais
esquecerei
Aos meus amigos e soacutecios no Centro de Equinos de Pernambuco-CEPE
Eduardo Andrade Lima Oswaldo Gomes Neto e tambeacutem ao meu co-orientador Prof
Dr Gustavo Ferrer Carneiro pela amizade confianccedila respeito e apoio
Agrave professora e orientadora Maria Madalena Pessoa Guerra com a qual tenho
aprendido e me surpreendido cada vez mais Aleacutem dos conhecimentos cientiacuteficos ela
tornou-se para mim um exemplo de profissional e de ser humano capaz de se
desprender de si em prol do proacuteximo Professora MEU MUITO OBRIGADO
Aos teacutecnicos e funcionaacuterios Alcir Joana Dordf Sonia e Marquinhos pelo carinho
e atenccedilatildeo
Aos companheiros do ANDROLAB Adriana Aacutelvaro Clara Diogo Filipe
Moraes Kaline Lawrence Liacutegia Pedro Profordf Eacuterica e em especial Sildivane que eacute
meu anjo da guarda a Ellen que sempre se preocupou em me ajudar a Andreacute Mariano
(bdquoO Corruptordquo) pela amizade e paciecircncia e a Felipe Costa que foi meu parceiro
fundamental no experimento A todos devo minha eterna gratidatildeo
A todos que formam o Haras Vida Boa ldquopalcordquo deste experimento
Agrave equipe da ACP Biotecnologia em especial ao professor Dr Joseacute Ferreira
Nunes e a Cristiane Salgueiro pelo apoio e fornecimento do ACP-105
6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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6
ldquoO caminho no qual a crianccedila siga e conheccedila em sua
infacircncia nem na velhice o deixaraacuterdquo
(D Helder Cacircmara)
7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
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refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
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refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
Porcentual
CFDA Diacetato de carboxifluoresceiacutena
CTC Clortetraciclina
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
FITC-PNA Fluorescein isothiocyanate-conjugated aglutin
GSH Glutationa reduzida
GPx Gutationa peroxidase
GSSG Glutationa oxidada
H2O2 Peroacutexido de hidrogecircnio
IA Inseminaccedilatildeo artificial
iAC Integridade do acrossoma
iMP Integridade de membrana plasmaacutetica
JC-1 55‟66‟-tetracloro-11‟33‟-tetraetilbenzimidazolil-carbocianine iodide
M Molar
MP Motilidade progressiva
O2 oxigecircnio molecular
OH˙ Radical hidroxila
IP Iodeto de propiacutedeo
PMM Potencial de membrana mitocondrial
PNA Arachis hypogaea agglutinin
PSA Pisum sativum agglutinin
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
ROS Espeacutecies reativas ao oxigecircnio
SOD Superoacutexido dismutase
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
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Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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8
LISTA DE TABELAS
Paacutegina
Tabela 1 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
54
Tabela 2 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
55
Tabela 3 - Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
56
Tabela 4 ndash
Tabela 5 ndash
Tabela 6 ndash
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-
105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes
incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana
mitocondrial () de espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-
Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou
Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC
(T36h)
Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen
de equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias antioxidantes
57
58
59
9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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9
Tabela 1 - Valores meacutedios de motilidade total vigor
alto porcentual de
membrana
mitocondrial
(aPMM) integridade
de membrana (IM) e
integridade de
acrossoma de
espermatozoides
equinos apoacutes a
refrigeraccedilatildeo com e
sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
54
Tabela 2 - Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre
variaacuteveis do secircmen de equinos antes e apoacutes
a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de
substacircncias
antioxidantes
55
Tabela 3 - Valores com a meacutedia geral e o desvio
padratildeo da motilidade total em funccedilatildeo dos
tempos avaliados (T0 T12h T24h e T36h)
para cada grupo
testado
57
10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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10
LISTA DE FIGURAS
Paacutegina
Figura 1 - Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em
funccedilatildeo dos tempos avaliados dos paracircmetros de
motilidade vigor integridade de membrana (IM)
integridade de acrossoma (IAC) e alto potencial de
membrana mitocondrial (APMM) de espermatozoides
equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo adicionados ou natildeo
com diferentes antioxidantes
60
11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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11
RESUMO
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios estudos
vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores da preservaccedilatildeo e
manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua deposiccedilatildeo no
trato reprodutivo da fecircmea O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito dos diluentes
(Botu-Secircmenreg e ACP-105reg) e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos refrigerados Foram utilizados
quatro reprodutores da raccedila Mangalarga Marchador os quais foram submetidos a
colheitas de secircmen com vagina artificial e uma fecircmea como manequim Apoacutes colheita
as amostras de secircmen de cada garanhatildeo foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg A seguir a fraccedilatildeo de cada diluidor foi fracionada para constituir os grupos
experimentais G1 = Botu-Secircmenreg (sem antioxidante) G2 = ACP-105reg (sem
antioxidante) G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg +
5U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg
+ 5mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5U de Glutationa Peroxidase + 5mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen do tipo Botutainerreg As amostras de secircmen foram
submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total vigor integridade de membrana
integridade de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial imediatamente apoacutes a
chegada ao Laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0) assim como apoacutes 12 (T12h)
24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC
Palavras-chave ACP-105reg Botu-Secircmenreg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
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refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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12
ABSTRACT
In equine chilled semen is the most used in the IAs Therefore several studies have
been conducted in order to obtain better results in preserving and maintaining the
viability of sperm cells until the time of his deposition in the female reproductive tract
The objective was to study the effect of diluents (Botu-Semen reg and ACP-105 reg) and
the addition of the antioxidants cysteine and glutathione peroxidase in the viability of
equine spermatozoa cooled We used four players Mangalarga Marchador which were
subjected to semen collection with an artificial vagina and as a female mannequin After
harvest samples of semen from each stallion were evaluated and diluted semen-Botu reg
or ACP-105 reg Then the fraction of each extender was fractionated to form the
experimental groups G1 = Botu reg-Semen (no antioxidant) G2 = ACP-105 reg (without
antioxidant) G3 = Botu-Semen reg + 5U of Glutathione Peroxidase G4 = ACP-105 reg +
5U of Glutathione Peroxidase = G5-Botu Semen reg + 5mM cysteine G6 = ACP-105 reg
+ 5mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5U of Glutathione Peroxidase + + and 5 mM
Cysteine G8 = ACP-105 reg + 5U of Glutathione Peroxidase + 5mM cysteine Samples
from each experimental group were placed in triplicate in two boxes of cooling (14 deg C)
semen type Botutainer reg Semen samples were assessed as total motility vigor
membrane integrity acrosome integrity and mitochondrial membrane potential
immediately after arrival at the laboratory making the time zero (T0) and after 12
(T12h) 24 (T24h) and 36 hours (T36h) cooled to 14 oC
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
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41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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13
SUMAacuteRIO
Paacutegina
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUCcedilAtildeO 14
2 REVISAtildeO DE LITERATURA 16
21 Espermatozoacuteides 16
22 Plasma seminal 16
23 Preservaccedilatildeo do secircmen por refrigeraccedilatildeo 17
24 Fatores que afetam a viabilidade do secircmen equumlino refrigerado 18
25 Diluente para secircmen 19
26 Espeacutecies reativas de oxigecircnio e Antioxidantes
261 Glutationa peroxidase (GPx)
262 Cisteiacutena
27 Meacutetodos de avaliaccedilatildeo do secircmen equino com sondas fluorescentes
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio
(IP)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
273 Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin
(FITC-PNA)
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
4 EXPERIMENTO
21
22
23
24
25
25
26
28
34
41 Efeito do diluente e da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa
peroxidase e cisteiacutena na viabilidade de espermatozoides equinos
refrigerados
35
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 61
14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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14
1 INTRODUCcedilAtildeO
A inseminaccedilatildeo artificial (IA) em equumlinos eacute uma teacutecnica bastante desenvolvida e vem
sendo usada com grande frequumlecircncia nesta espeacutecie Esta bioteacutecnica tambeacutem eacute muito
utilizada em outras espeacutecies de produccedilatildeo como bovinos caprinos ovinos e animais de
companhia como os caninos As principais vantagens do seu uso satildeo reduccedilatildeo no custo
do transporte dos animais que se encontram em diferentes localidades uso de um
ejaculado para mais de uma fecircmea e proteccedilatildeo contra as doenccedilas sexualmente
transmissiacuteveis Esta teacutecnica eacute relativamente simples e implica na obtenccedilatildeo preacutevia do
secircmen para posterior uso in natura refrigerado ou congelado
Em equumlinos o secircmen refrigerado eacute o mais utilizado nas IAs Portanto vaacuterios
estudos vecircm sendo realizados a fim de se obter resultados cada vez melhores quanto agrave
preservaccedilatildeo e manutenccedilatildeo da viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas ateacute o momento de sua
deposiccedilatildeo no trato reprodutivo da fecircmea Como a refrigeraccedilatildeo trata-se de um processo
de criopreservaccedilatildeo faz-se necessaacuterio a adiccedilatildeo do diluente ao secircmen cuja funccedilatildeo eacute
aumentar o volume do ejaculado e proteger as ceacutelulas espermaacuteticas dos efeitos
deleteacuterios da criopreservaccedilatildeo (PENtildeA 2000)
As propriedades protetoras do diluente satildeo atribuiacutedas aos seus diferentes
componentes agrave interaccedilatildeo com as ceacutelulas espermaacuteticas de uma determinada espeacutecie e ao
indiviacuteduo (CUNHA e LOPES 2003) O diluente mais utilizado na espeacutecie equina satildeo
aqueles agrave base de leite desnatado com disponibilidade comercial de vaacuterios produtos
Com o advento da busca por produtos que natildeo sejam de origem animal a aacutegua
de coco tem se mostrado uma boa alternativa com accedilatildeo beneacutefica sobre a conservaccedilatildeo
celular Todavia existem poucos estudos utilizando este diluente em amostras de secircmen
na espeacutecie equina Na apresentaccedilatildeo em poacute semelhante aos diluentes convencionais
disponiacuteveis no mercado a aacutegua de coco (ACP-105) eacute obtida por um processo de alta
desidrataccedilatildeo a vaacutecuo e proporciona as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento assim como a praticidade dos diluentes comerciais de origem animal
(SOBREIRA NETO 2008)
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas que vivem em ambiente com condiccedilotildees
aeroacutebicas mas o metabolismo bioloacutegico oxidativo das moleacuteculas eacute potencialmente
toacutexico devido agrave formaccedilatildeo de espeacutecies reativas do oxigecircnio conhecidas como ROS
(BOUNHER et al 2000) As ROS incluem um grande nuacutemero de moleacuteculas
15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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15
quimicamente reativas oriundas do oxigecircnio como o radical acircnion superoacutexido (O2-) o
radical hidroxila (OH-) e o peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) (MAIA 2003) Aleacutem disso
algumas ceacutelulas possuem a capacidade de gerar ROS como parte de suas funccedilotildees
normais (BOUNHER et al 2000) No intuito de reduzir os danos causados aos
espermatozoacuteides pela formaccedilatildeo das ROS vaacuterios estudos vecircm sendo realizados
avaliando o efeito da administraccedilatildeo oral de antioxidantes ou da inclusatildeo dessas
substacircncias aos diluentes utilizados no secircmen de vaacuterias espeacutecies
Desta forma objetivou-se com este trabalho avaliar o ACP-105reg como diluente
para secircmen equino refrigerado bem como a accedilatildeo da adiccedilatildeo de 5Uml de glutationa
peroxidase (GPx) e 5mM de cisteiacutena (Cist) isoladas e associadas ao diluente testado
tendo como controle um diluente convencional para equumlinos a base de leite (Botu-
Secircmenreg)
16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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16
2 REVISAtildeO DE LITERATURA
21 Espermatozoacuteides
Os espermatozoacuteides satildeo ceacutelulas reprodutivas masculinas que se apresentam
revestidas por uma membrana plasmaacutetica composta por uma dupla camada de lipiacutedios
proteiacutenas e carboidratos (AMANN e GRAHAN 1993) Como divisatildeo estrutural baacutesica
esta ceacutelula apresenta cabeccedila que no equumlino eacute de forma oval e achatada onde se
encontra a cromatina altamente condensada que compreende um complexo DNA
(BARTH e OKO 1989) Na regiatildeo exterior da cabeccedila tem-se o acrossoma estrutura de
parede dupla que se situa entre a membrana plasmaacutetica e a porccedilatildeo anterior do nuacutecleo
onde se encontram as enzimas hidroliacuteticas envolvidas diretamente no processo de
fecundaccedilatildeo (EDDY e O‟BRIEN 1994) pela interaccedilatildeo entre os seus receptores e os da
zona peluacutecida do ovoacutecito (AMANN e GRAHAN 1993) O colo serve como ligaccedilatildeo da
cabeccedila com a peccedila intermediaacuteria local onde se encontram as mitococircndrias dispostas em
forma de heacutelice que convertem a glicose em ATP e liberam energia para a ceacutelula
(AMANN e GRAHAM 1993 ALBERTS 2004) As fibras densas que se iniciam na
peccedila intermediaacuteria continuam ao longo da ceacutelula e compotildeem a peccedila principal a qual eacute
envolvida por uma bainha proteacuteica e a cauda que eacute a ultima porccedilatildeo do espermatozoide
(MAKINNON e VOSS 1993 SQUIRES et al 1999)
22 Plasma Seminal
Segundo Kraus et al (2005) o plasma seminal eacute fundamental para as funccedilotildees
espermaacuteticas desde a ejaculaccedilatildeo ateacute a fertilizaccedilatildeo Este fluido possui inuacutemeros
componentes para a sobrevivecircncia e o funcionamento dos espermatozoacuteides como as
proteiacutenas do fluido seminal que satildeo encontradas em grande quantidade e satildeo
fisiologicamente importantes para as ceacutelulas espermaacuteticas A composiccedilatildeo o tamanho e
a conformaccedilatildeo dessas proteiacutenas satildeo especiacuteficos para cada espeacutecie (EDWARD et al
1981 JELIacuteNKOVAacute et al 2003)
As principais funccedilotildees do plasma seminal satildeo nutriccedilatildeo diluiccedilatildeo veiacuteculo e defesa
dos espermatozoacuteides (MILLER et al 1990) onde estatildeo presente as substancias
17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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17
antioxidantes enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas que atuam combatendo as ROS como
vitaminas A e C urato albumina taurina e hipotaurina (BAUMBER et al 2000
ALMEIDA e BALL 2005)
Aleacutem destas substacircncias componentes orgacircnicos e inorgacircnicos como
aminoaacutecidos iacuteons bicarbonato frutose sorbitol inositol antimicrobianos
imunoglobulinas e uma variedade de substacircncias hormonais estatildeo presentes em vaacuterias
quantidades no plasma seminal das diferentes espeacutecies (GARNER e HAFEZ 2004)
Essa diversidade natildeo eacute encontrada apenas entre as espeacutecies mamiacuteferas mas tambeacutem
entre raccedilas de uma mesma espeacutecie como observada em caprinos (PINHEIRO et al
1996)
A proteccedilatildeo contra ROS e prevenccedilatildeo contra danos celulares atraveacutes das
substacircncias antioxidantes satildeo fatores fundamentais para a eficiecircncia reprodutiva jaacute que
a baixa capacidade antioxidante total encontrada no secircmen apresenta correlaccedilatildeo direta
com os iacutendices de infertilidade (GUERRA et al 2004)
Todavia alguns estudos demonstram diferenccedilas na qualidade dos ejaculados em
relaccedilatildeo ao fotoperiacuteodo e a fatores alimentares (COLAS 1980 NUNES 1982 TULE e
HOLTZ 1995 PINHEIRO et al 1996)
Apesar dos benefiacutecios promovidos pela composiccedilatildeo quiacutemica do secircmen estudos
comprovaram que quando criopreservados algumas proteiacutenas podem atuar de forma
deleteacuteria aos espermatozoacuteides como por exemplo a horse seminal protein (HSP) que
corresponde a aproximadamente 20 da proteiacutena total do ejaculado equumlino e atua
viabilizando o processo de fertilizaccedilatildeo Estas proteiacutenas satildeo prejudiciais agrave
criopreservaccedilatildeo por induzirem a saiacuteda de lipiacutedios da membrana plasmaacutetica
(BERGERON e MANJUNATH 2006) Em virtude de alguns protocolos de
criopreservaccedilatildeo especialmente os de congelaccedilatildeo de secircmen utilizar a centrifugaccedilatildeo do
ejaculado bem como quantidades elevadas de diluentes e retirada total ou parcial do
plasma seminal que eacute substituiacutedo pelo diluente podem ocorrer danos irreversiacuteveis aos
componentes celulares (BRINSKO et al 2000)
23 Preservaccedilatildeo do Secircmen por Refrigeraccedilatildeo
As primeiras constataccedilotildees de que a diminuiccedilatildeo da temperatura causa reduccedilatildeo
reversiacutevel da atividade metaboacutelica dos espermatozoacuteides permitindo seu
armazenamento foram realizadas por Spallazani em 1776 (JOHNSTON 2000) A
18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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18
refrigeraccedilatildeo do secircmen visando sua posterior utilizaccedilatildeo na IA determina menos danos agraves
ceacutelulas espermaacuteticas quando comparados agrave congelaccedilatildeo resultando em taxas mais
elevadas de prenhez principalmente nas espeacutecies ovina bovina caprina e equina
(ENGLAND e PONZIO 1996)
A refrigeraccedilatildeo do secircmen pode ser realizada de forma automatizada que consiste
em um aparelho de refrigeraccedilatildeo com taxas decrescente de temperatura rigorosamente
controlada ou de forma convencional que eacute mais difundida comercialmente na
reproduccedilatildeo equumlina devido ao baixo custo (VALLE et al 1999)
A teacutecnica de refrigeraccedilatildeo convencional utiliza uma caixa isoteacutermica que
proporciona a reduccedilatildeo gradativa da temperatura No entanto essas taxas de reduccedilatildeo de
temperatura sofrem interferecircncias da temperatura ambiente do volume da amostra e da
temperatura inicial da amostra (VALLE et al 1999)
Existem vaacuterias opccedilotildees comerciais de sistema convencional de refrigeraccedilatildeo de
secircmen O mais conhecido eacute o Equitainerreg em duas versotildees (Equitenerreg I e Equitenerreg
II) desenvolvido por Douglas Hamilton e colaboradores na deacutecada de 80 cujo custo
elevado fez surgir no mercado modelos nacionais economicamente viaacuteveis que satildeo
mais baratos Dentre os modelos nacionais haacute os mais especializados de material mais
resistente como o Botu-Boxreg e o Botutainerreg e modelos mais simples como o Max-
Secircmen Expressreg Ressalta-se que os dois primeiros satildeo utilizados para armazenamento
maacuteximo de 24 horas com temperatura final de 15 degC enquanto o penuacuteltimo permite o
armazenamento com temperatura final de 5 degC por no maacuteximo de 48 horas
(SOBREIRA NETO 2008)
Segundo Gunzel-Apel e Krause (1986) a fertilidade do secircmen refrigerado eacute de
no maacuteximo 72 horas No entanto Feldmen e Nelson (1996) afirmaram que se o secircmen
for adequadamente diluiacutedo e refrigerado os espermatozoacuteides podem permanecer viaacuteveis
por ateacute cinco dias Desta forma o que determina a boa qualidade do secircmen refrigerado
satildeo a qualidade do secircmen in natura a qualidade do diluente a forma de refrigeraccedilatildeo e
ateacute mesmo o indiviacuteduo (SQUIRES et al 1999)
24 Fatores que Afetam a Viabilidade do Secircmen Equumlino Refrigerado
De acordo com Moran (1982) o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen da
temperatura corpoacuterea agrave temperatura ambiente (20 degC) aparentemente natildeo causa danos
aos espermatozoacuteides desde que diluiacutedo em meio adequado No entanto no processo de
19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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19
refrigeraccedilatildeo existe uma faixa criacutetica de temperatura (de 19 a 8 degC) em que o
espermatozoacuteide pode ser severamente lesado Isto se daacute devido agrave membrana plasmaacutetica
apresentar-se como um mosaico fluido onde os lipiacutedios e as proteiacutenas estatildeo em
constante movimento garantindo sua funcionalidade agrave temperatura ambiente (JASKO
1994) Assim com a reduccedilatildeo da temperatura os lipiacutedios passam para um estado de gel
e as cadeias de aacutecidos graxos vatildeo se apresentar de forma riacutegida e paralela Por
conseguinte com a reduccedilatildeo da temperatura a membrana sofre alteraccedilatildeo de sua funccedilatildeo
devido agrave perda de mobilidade das proteiacutenas (AMANN e GRAHAM 1993)
Quando o processo de refrigeraccedilatildeo eacute realizado de forma inadequada os
espermatozoides ficam sujeitos ao choque teacutermico (WATSON 2000) resultando em
enrolamento da cauda e consequentemente ocorrecircncia de movimentos em ciacuterculos
reduccedilatildeo do metabolismo danos agrave membrana plasmaacutetica e ao acrossoma (PICKETT e
AMANN 1992)
Parks e Graham (1992) em estudos realizados com secircmen equumlino constataram
que a adiccedilatildeo de colesterol aos espermatozoacuteides aumentou a porcentagem de gametas
moacuteveis e com membrana intacta Este resultado foi atribuiacutedo ao fato de o colesterol
manter o estado fluido da membrana na temperatura de transiccedilatildeo Moran et al (1992)
recomendaram que o processo de refrigeraccedilatildeo do secircmen seja realizado em taxas
decrescentes de temperaturas em torno de 03 degC por minuto principalmente no
intervalo criacutetico de 19 a 8 degC para serem armazenados pelo periacuteodo de 24 a 48 horas
Outro fator que deve ser considerado eacute que grande parte do sucesso do processo
de refrigeraccedilatildeo do secircmen depende de cada garanhatildeo (FRANCL et al 1987 PICKETT
1993)
25 Diluentes para Secircmen Equino
Sabe-se que diluente para secircmen eacute um preparado liacutequido acrescido ao ejaculado
visando aumentar o volume da amostra assim como nutrir e proteger os
espermatozoides Todavia deve possuir osmolaridade compatiacutevel com a amostra
proteger as ceacutelulas em caso de mudanccedilas bruscas de temperatura neutralizar os
produtos toacutexicos ter condiccedilotildees apropriadas de nutrientes estabilizar o sistema
enzimaacutetico e garantir a integridade da membrana plasmaacutetica (MELO 2005)
Para equumlinos vaacuterios diluentes tecircm sido desenvolvidos com composiccedilatildeo variada
poreacutem na grande maioria estas substacircncias satildeo elaboradas agrave base de gema de ovo e
20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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20
principalmente leite desnatado No entanto a gema de ovo tem seu mecanismo de
proteccedilatildeo espermaacutetica ainda desconhecida Entretanto de acordo com Bergeron e
Manjunath (2006) a associaccedilatildeo da lipoproteiacutena da gema de ovo agrave membrana plasmaacutetica
tem a funccedilatildeo de estabilizaacute-la pela a formaccedilatildeo de uma peliacutecula protetora de fosfolipiacutedios
na superfiacutecie repondo os fosfolipiacutedios e competindo com os peptiacutedeos deleteacuterios
presentes no plasma
Diluentes agrave base de leite apresentam a caseiacutena que eacute a proteiacutena do leite e os
carboidratos vatildeo atuar na proteccedilatildeo celular auxiliando no tamponamento fisioloacutegico
(BATTELIER et al 2001 BERGERON e MANJUNATH 2006) Poreacutem deve-se levar
em consideraccedilatildeo a grande complexidade da composiccedilatildeo do leite sendo possiacutevel uma
presenccedila bastante diversa de substacircncias beneacuteficas e maleacuteficas como a α-lacto-
albumina que eacute uma proteiacutena soluacutevel encontrada no leite prejudicial agrave sobrevivecircncia
dos espermatozoacuteides (SILVEIRA NETO 2008)
Visando potencializar a atividade protetora dos diluentes por refrigeraccedilatildeo em
todos os produtos disponiacuteveis no mercado tem-se utilizado a adiccedilatildeo de antibioacuteticos
(AMMAN e PICKETT 1987)
Recentemente foi criado o diluente para refrigeraccedilatildeo de secircmen agrave base de aacutegua de
coco Segundo Blume e Marques Junior (1994) sua densidade e pH satildeo compatiacuteveis
com o plasma sanguiacuteneo aleacutem de ser composto de sais proteiacutenas accediluacutecares vitaminas e
gorduras neutras (NUNES e COMBARNOUS 1995) proporcionando nutrientes
necessaacuterios para manter a sobrevivecircncia dos gametas masculinos Vaacuterios estudos vecircm
sendo realizados com a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco como diluente apresentando
resultados favoraacuteveis em amostras de secircmen de caprinos (SALGUEIRO et al 2003)
ovinos (SALGUEIRO et al 2004) suiacutenos (TONIOLLI e MESQUITA 1990) caninos
(UCHOcircA et al 2002) peixes de aacutegua doce (FARIAS et al 1999) e humanos (NUNES
e COMBARNOUS 1995) Em equumlinos Sampaio (2002) observou a motilidade dos
espermatozoacuteides refrigerados agrave 4 degC por 6 horas constatando em meacutedia motilidade
total de 775 plusmn 75 e motilidade progressiva de 675 plusmn 75 evidenciando efeito
positivo para a utilizaccedilatildeo da aacutegua de coco em amostras de secircmen desta espeacutecie
(SILVEIRA NETO 2008)
21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
3 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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da membrana In__ Biologia Molecular da Ceacutelula 4 Ed Porto Alegre Artmed
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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21
26 Espeacutecies Reativas de Oxigecircnio e Antioxidantes
O estresse oxidativo eacute um fator que estaacute associado ao decliacutenio da capacidade
fecundante dos espermatozoacuteides durante o armazenamento do secircmen sob refrigeraccedilatildeo
A formaccedilatildeo de ROS eacute uma consequumlecircncia do metabolismo oxidativo e segundo
Maxwell e Stojanov (1996)
Atualmente jaacute existe o consenso de que a criopreservaccedilatildeo induz agrave formaccedilatildeo de
ROS uma das causas de reduccedilatildeo da capacidade fertilizante dos espermatozoacuteides
(WATSON 2000) Em 1977 Jones e Mann descobriram que o processo de peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica induz alteraccedilotildees estruturais e irreversiacuteveis aos espermatozoacuteides como perda de
motilidade alteraccedilotildees no metabolismo e descontrole no tracircnsito de componentes intra e
extra-celulares atraveacutes da membrana (VALENCcedilA e GUERRA 2007)
O plasma seminal e a ceacutelula espermaacutetica possuem mecanismos de defesa
antioxidantes O espermatozoide possui um sistema intracelular contra ROS
principalmente composto por enzimas como superoacutexido dismutase (SOD) catalase
glutationa peroxidase (GPx) e glutationa reduzida (GSH) assim como um sistema de
defesa natildeo enzimaacutetico como o α-tocoferol e o aacutecido ascoacuterbico (AITKEN 1995) Por
sua vez o plasma seminal atua na proteccedilatildeo das ceacutelulas espermaacuteticas por accedilatildeo de vaacuterias
ROS enzimaacuteticas e natildeo-enzimaacuteticas (ZINI et al 2000 Van OVERVELD et al 2004)
Para Ferreira e Matsubara (1997) esses sistemas podem atuar como removedor do
agente oxidante antes que ele ocasione lesatildeo celular ou como agente reparador da lesatildeo
jaacute ocorrida
Segundo Aitken (1995) a capacidade biossinteacutetica do espermatozoacuteide eacute
limitada tornando difiacutecil para este gameta substituir qualquer moleacutecula que tenha sido
danificada Aleacutem disso a enzima antioxidante pode estar concentrada na peccedila
intermediaacuteria deixando grande parte da membrana que cobre a cabeccedila e a cauda menos
protegida (MAIA 2003) Por isso o plasma seminal eacute importante na proteccedilatildeo
espermaacutetica contra os efeitos causados pelas ROS geradas pelos proacuteprios
espermatozoacuteides e pelos fagoacutecitos presentes no ejaculado (BAUMBER et al 2002)
Uma vez que os ejaculados utilizados para congelaccedilatildeo refrigeraccedilatildeo ou mesmo
in natura na inseminaccedilatildeo especialmente de eacuteguas sofrem adiccedilatildeo de diluente vaacuterios
estudos estatildeo sendo realizados visando enriquecer esses diluentes adicionando
substacircncias antioxidantes na sua composiccedilatildeo (GUERRA et al 2004)
22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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22
261 Glutationa peroxidase (GPx)
Dentre os sistemas fundamentais de defesa celular enzimaacutetica a glutationa
peroxidase (GPx) converte o peroacutexido de hidrogecircnio a H2O pela oxidaccedilatildeo da glutationa
a glutationa dissulfito a sua forma oxidada (MAIA 2003)
A Glutationa eacute um tripeptiacutedeo (γ ndash L ndash glutamil ndash L ndash cisteinil ndash glicina) que estaacute
presente no organismo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) Ela atua de
forma direta e indireta em muitos processos bioloacutegicos importantes como siacutentese de
proteiacutena metabolismo e proteccedilatildeo celular (MEISTER e ANDERSON 1983) Alguns
problemas na siacutentese e metabolismo da glutationa estatildeo associados a doenccedilas nas quais
as concentraccedilotildees de glutationa e de enzimas que atuam em seu metabolismo podem ser
bastante significativas no diagnoacutestico de alguns tipos de cacircncer e outras doenccedilas
relacionadas ao estresse oxidativo (DENEKE et al 1989 NAVARRO et al 1999) As
ROS podem tambeacutem estar envolvidas em processos patoloacutegicos ou associadas a
exerciacutecios fiacutesicos prolongados proteiacutenas e ao aacutecido desoxirribonucleico (DNA) das
membranas celulares (NAVARRO et al 1999) Assim um importante sistema de
defesa enzimaacutetica contra o aumento das ROS envolve a enzima GPx que estaacute presente
em muitos tecidos de origem animal (MANNERVIK et al 1985)
Segundo Rover Juacutenior (2000) a GPx foi descrita inicialmente por Mills em
1957 que relatou que esta enzima natildeo eacute encontrada em plantas superiores ou bacteacuterias
A atividade enzimaacutetica da GPx eacute um dos meios de controle do organismo das
concentraccedilotildees de peroacutexido de hidrogecircnio e hidroperoacutexidos lipiacutedicos provenientes da
accedilatildeo de espeacutecies radicalares (COHEN et al 1963 citado por ROVER JUacuteNIOR et al
2000 MEISTER et al 1983) A accedilatildeo da GPx se daacute por catalisaccedilatildeo da reduccedilatildeo do H2O2
e outros peroacutexidos orgacircnicos para seus alcooacuteis correspondentes convertendo GSH em
GSSG (NORDBERGER e ARNER 2001)
A GPx assim como outros antioxidantes vem sendo pesquisada e avaliada
quanto agrave sua accedilatildeo no secircmen principalmente em espeacutecies animais de produccedilatildeo Esta
enzima apresenta um resiacuteduo de cisteiacutena contendo selecircnio covalentemente ligado ao
restante da enzima (ROTRUCK et al 1973 citado ROVER JUacuteNIOR 2000) Aleacutem
disso a glutationa eacute o maior tiol natildeo proteacuteico dentre os componentes das ceacutelulas dos
mamiacuteferos tendo vaacuterias funccedilotildees como transporte de aminoaacutecidos siacutentese proteacuteica e de
DNA reduccedilatildeo de cadeias de dissulfito e proteccedilatildeo contra estresse oxidativo (VALENCcedilA
e GUERRA 2007)
23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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23
Segundo Nordberg e Arnerg (2001) existem 4 tipos de GPx (GPx 1 GPx 2 GPx
3 e GPx 4) Dentre elas a GPx 4 eacute a que estaacute mais associada a benefiacutecios ao
espermatozoacuteide Imai e Nakagawa (2003) afirmaram que a GPx 4 pode agir com o H2O2
e uma ampla variedade de hidroperoacutexidos de lipiacutedios sendo considerada responsaacutevel
pela proteccedilatildeo da membrana contra os danos oxidantes Aleacutem disso uma variante da
GPx 4 eacute encontrada especificamente no nuacutecleo do espermatozoide onde participa da
condensaccedilatildeo da cromatina espermaacutetica (NORDBERG e ARNER 2001) Esta enzima
tem ainda dupla funccedilatildeo na ceacutelula espermaacutetica sendo enzimaticamente ativa na
espermaacutetide e insoluacutevel funcionando como uma proteiacutena estrutural do espermatozoide
maduro (MAIA 2003)
262 Cisteiacutena
A cisteiacutena eacute um aminoaacutecido de baixo peso molecular que conteacutem um grupo tiol
com accedilatildeo redutora (BILODEAU et al 2001 MELO et al 2006) e uma de suas formas
eacute usada como agente mucoliacutetico Essa substacircncia apresenta accedilatildeo antioxidante
(PASQUALOTTO et al 2009) e tem sido relatado que a mesma pode contribuir na
prevenccedilatildeo de alguns tipos de cacircncer (ESTERDEN 1999)
Por participar da biossiacutentese intracelular da GPx que por sua vez atua na
proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo a cisteiacutena tem sido bastante utilizada em
experimentos com antioxidante para secircmen de vaacuterias espeacutecies animais Ela tem
demonstrado capacidade de penetrar nas membranas celulares atuando como agente
antioxidante direto eou por sua correlaccedilatildeo com a GPx (MENEZES et al 2009)
Segundo Michael et al (2008) vaacuterios estudos foram realizados com adiccedilatildeo da cisteiacutena
em diluentes de secircmen com resultados controversos Em equinos tecircm-se poucos estudos
sobre a utilizaccedilatildeo da cisteiacutena como antioxidante no diluente de secircmen
No entanto Safarinejade (2008) constatou que a suplementaccedilatildeo de um tipo de
cisteiacutena associada ao selecircnio melhora a qualidade seminal em humanos e defende a
sua utilizaccedilatildeo no tratamento da infertilidade masculina Uysal e Bucak (2007) testaram
diferentes concentraccedilotildees de cisteiacutena adicionada ao secircmen congelado de carneiros e
obtiveram resultados positivos na manutenccedilatildeo das caracteriacutesticas do secircmen
descongelado Funahashi e Sano (2005) relataram que um diluidor de secircmen com 5mM
de cisteiacutena melhora a viabilidade e a integridade da membrana das ceacutelulas espermaacuteticas
em javalis
24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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24
Segundo Meister e Tate (1976) sob condiccedilotildees in vitro a cisteiacutena atua na
proteccedilatildeo da ceacutelula espermaacutetica por sua accedilatildeo na formaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica da
membrana plasmaacutetica dos espermatozoides Gabitta et al (2000) observaram que a
glutationa oxidada (GSSG) interage com o siacutetio ativo de proteiacutenas livres e que siacutetios
com resiacuteduos de cisteiacutena vatildeo favorecer a accedilatildeo antioxidante com resultados positivos
27 Meacutetodos de Avaliaccedilatildeo do Secircmen Equino com Sondas Fluorescentes
A avaliaccedilatildeo dos espermatozoides por meio de microscoacutepio vem evoluindo bastante
A princiacutepio esta anaacutelise se restringiu ao uso do microscoacutepio ocular limitada agrave
concentraccedilatildeo motilidade e vigor espermaacuteticos Em seguida surgiu o microscoacutepio de
contraste de fase tornando possiacutevel avaliar o status do acrossoma em espeacutecies que
apresentam esta estrutura grande diferente dos equumlinos (TOLBOT e CHACON 1981
CROSS e MEZEL 1989) Depois surgiu a microscopia eletrocircnica que embora seja um
meacutetodo bastante eficaz possui um custo elevado e eacute de difiacutecil utilizaccedilatildeo na rotina da
maioria dos laboratoacuterios (ZEGINADOU et al 2000) Atualmente pode-se utilizar tanto
com a microscopia de fluorescecircncia quanto com os meacutetodos mais modernos de
avaliaccedilatildeo por sistema computadorizado como CASA (Computer Assisted Semen
Analyses)
Com o advento da microscopia de fluorescecircncia tornou-se possiacutevel a realizaccedilatildeo
de novos exames com o uso de sondas adequadas resultando em maior precisatildeo e
nitidez de detalhes As principais sondas utilizadas possibilitam a avaliaccedilatildeo da
integridade da membrana do acrossoma e das mitococircndrias Denomina-se fluorescecircncia
a propriedade de certas substacircncias que ao serem excitadas por uma luz de
comprimento de onda curta emitem luz de um comprimento de onda maior Emprega-
se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm de forma a se
obter radiaccedilotildees emitidas na gama de 400 a 700 nm Isto eacute dentro do espectro da luz
visiacutevel (Disponiacutevel em wwwdbiouevoraptjaraujobiocelmftecnicashtm)
Segundo Neild (2005) a grande vantagem do uso das sondas fluorescentes eacute o
maior contraste associada agrave menor variabilidade e maior especificidade em
comparaccedilatildeo aos meacutetodos claacutessicos de coloraccedilatildeo Sua accedilatildeo se daacute por uma interaccedilatildeo com
a ceacutelula espermaacutetica apresentando coloraccedilatildeo que vai indicar a existecircncia de lesatildeo na
25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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25
estrutura analisada A imagem observada eacute o resultado da radiaccedilatildeo eletromagneacutetica
emitida pelas moleacuteculas que absorvem a excitaccedilatildeo primaacuteria e re-emitem uma luz com
maior comprimento de onda Para deixar passar somente a emissatildeo secundaacuteria desejada
devem-se utilizar filtros apropriados (JAMESON 2009)
271 Diacetato de carboxifluoresceiacutena (DCF) e iodeto de propiacutedio (IP)
A integridade da membrana do espermatozoacuteide eacute um bom indicador de
viabilidade da ceacutelula (MAGISTRINI et al 1997) Sondas fluorescente como as DCF e
IP podem ser usadas para avaliaccedilatildeo da integridade de membrana em microscoacutepio de
fluorescecircncia (SMITH e MURRAY 1997)
O DCF eacute um composto hidrofoacutebico capaz de penetrar na membrana celular sem
interferir fisiologicamente em seu interior hidrolisado por accedilatildeo enzimaacutetica de interaccedilatildeo
e convertido em composto hidrofiacutelico com incapacidade de passar pela membrana
espermaacutetica Assim este composto se acumula no interior da ceacutelula onde quando
expostos a luz azul se excita e emite a coloraccedilatildeo verde caracteriacutestica de membrana
integra (GARNER e JONHSON 1995)
O IP eacute um corante que soacute penetra atraveacutes de membranas lesionadas Este
composto se liga ao DNA da ceacutelula corando-o em vermelho Portanto ceacutelulas onde se
observa a coloraccedilatildeo vermelha satildeo caracteriacutesticas de membrana danificada (HARRISON
e VICKER 1990)
272 Carboxianina fluorescente (JC-1)
A mitococircndria tem sido objeto de estudo mais intenso nas duas uacuteltimas deacutecadas
Esta organela eacute essencial para manutenccedilatildeo da fisiologia espermaacutetica e responsaacutevel pela
produccedilatildeo da maior parte da energia a partir da geraccedilatildeo de ATP possibilitando o
movimento celular (CAcircMARA e GUERRA 2008) Segundo Copeland (2002) a
mitococircndria eacute responsaacutevel por aproximadamente 90 da produccedilatildeo de energia celular
A avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com JC-1 tem sido utilizada
em vaacuterios tipos de ceacutelulas dentre elas os espermatozoacuteides de bovinos Em 1999
Gravance et al utilizaram esta sonda no secircmen equino e relataram que ela pode ser
utilizada na avaliaccedilatildeo do potencial de membrana mitocondrial com sucesso nesta
espeacutecie
26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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26
O JC-1 tem sido associado diferencialmente agrave ceacutelula com potencial de
membrana mitocondrial alto ou baixo (COSSARIZA et al 1993) Esta sonda possui
baixa toxicidade boa solubilidade e caracteriacutesticas fluorescentes apropriadas para a
detecccedilatildeo por sistemas de filtros comumente usados em microscopia de epifluorescecircncia
(SMILE et al 1991) Este corante possui a capacidade de formar multiacutemeros
conhecidos como J-agregados apoacutes seu acuacutemulo no interior das mitococircndrias com
elevado potencial de membrana (GRAVANCE et al 1999) Aleacutem disso o JC-1 pode
formar monocircmeros nas mitococircndrias com baixo potencial de membrana permitindo
assim a diferenciaccedilatildeo de ceacutelulas com potencial de membrana mitocondrial alto e baixo
(GRAVANCE et al 1999) A excitaccedilatildeo do JC-1 se daacute com emissatildeo do monocircmero na
faixa verde (530nm) e emissatildeo de I-agregados na laranja mitocondrial com
comprimento de onda alto (590nm) (KULKAMI 1998)
Sendo assim em mitococircndrias funcionais e que apresentam potencial de
membrana mitocondrial altamente negativo (-180mv) o JC-1 penetra e se acumula no
interior desta organela emitindo coloraccedilatildeo vermelha (REERS 1991)
273 Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) e Aglutinina de Arachis hypogea (PNA)
O acrossoma dos espermatozoacuteides possui em sua estrutura uma consideraacutevel
quantidade de carboidratos nos quais as lectinas se ligam (JONES et al 1988 apud
OLIVEIRA 2007) O Isoticianato de fluoresceiacutena (FITC) eacute uma sonda fluorescente que
conjugada ao Arachis hypogea (PNA) vem sendo utilizada com sucesso para avaliar o
acrossoma de vaacuterias espeacutecies animais (OLIVEIRA 2007) O PNA eacute oriundo do
amendoim se liga a galactose presente na membrana acrossocircmica externa natildeo se
ligando agrave plasmaacutetica (ZEGINIADOU et al 2000) Casey et al (1993) utilizaram a
associaccedilatildeo de FITC-PNA em espermatozoacuteides de garanhotildees e obtiveram sucesso em
suas avaliaccedilotildees de acrossoma
A associaccedilatildeo de FITC-PNA eacute utilizada em preparaccedilotildees que realizam a preacutevia
permeabilizaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica atraveacutes do uso de substacircncias como metanol
ou etanol Assim a sonda tem acesso a toda superfiacutecie da membrana acrossocircmica e
pode apresentar fluorescecircncia em todas as ceacutelulas natildeo reagidas visto que natildeo existe a
barreira da membrana plasmaacutetica Diversos padrotildees de fluorescecircncia representam a
fusatildeo parcial da membrana plasmaacutetica com a membrana acrossocircmica externa
caracteriacutestica de ceacutelulas que estatildeo sofrendo reaccedilatildeo acrossocircmica (OLIVEIRA 2007) A
27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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27
colororaccedilatildeo com FITC-PNA tambeacutem pode ser utilizada sem a permeabilidade da
membrana plasmaacutetica tornando fluorescente a regiatildeo acrossocircmica das ceacutelulas que estatildeo
sofrendo reaccedilatildeo Uma vez que esta sonda conjugada natildeo eacute penetrante a membrana
plasmaacutetica ela somente seraacute capaz de se ligar agrave membrana acrossocircmica externa nas
ceacutelulas em que houve a formaccedilatildeo de poros na membrana plasmaacutetica (KISK 2001
RAITHI et al 2001)
28
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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31
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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32
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000
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4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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34
4 EXPERIMENTO
35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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35
41 Efeito da adiccedilatildeo de glutationa peroxidase e cisteiacutena aos diluidores Botu-
secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides refrigerados de equumlinos
Effect of cysteine and glutathione peroxidase addition to Botu-Semenreg and ACP-105reg
extenders on the viability of equine chilled spermatozoa
Victor Netto Maia Felipe Costa Almeida Sildivane Valcaacutecia Silva Gustavo Ferrer
Carneiro Pierre Castro Soares Maria Madalena Pessoa Guerra
Resumo
Objetivou-se estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluidores Botu-secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoacuteides
refrigerados de equumlinos Foram utilizados quatro reprodutores da raccedila Mangalarga
Marchador submetidos a colheitas de secircmen com vagina artificial e fecircmea como
manequim As amostras de secircmen foram avaliadas e diluiacutedas em Botu-secircmenreg ou
ACP-105reg de acordo com os grupos experimentais G1 = Botu-Secircmenreg G2 = ACP-
105reg G3 = Botu-Secircmenreg + 5U de Glutationa Peroxidase G4 = ACP-105reg + 5U de
Glutationa Peroxidase G5 = Botu-Secircmenreg + 5 mM de Cisteiacutena G6 = ACP-105reg + 5
mM de Cisteiacutena G7= Botu-Secircmenreg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de
Cisteiacutena e G8 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As
amostras de cada grupo experimental foram colocadas em triplicata em duas caixas de
refrigeraccedilatildeo (14 oC Botu-boxreg) e submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto agrave motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
apoacutes zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) e 36 horas (T36h) de refrigeraccedilatildeo A anaacutelise da MT
evidenciou no T12h que as amostras do grupo Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que a de ACP-105reg + cisteiacutena Enquanto
no T24h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena apresentaram maior
(Plt005) motilidade total do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena O
vigor espermaacutetico no T12h foi maior (Plt005) nas amostras de Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena do que nas de ACP-105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T24h de ACP-105reg +
GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena foram maiores (Plt005) do que as de ACP-105reg
e ACP-105reg + cisteiacutena A integridade de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005)
entre grupos em todos os tempos de avaliaccedilatildeo enquanto a integridade de acrossoma no
T24h foi maior (Plt005) nas amostras de ACP-105reg + cisteiacutena do que nas de Botu-
secircmenreg O potencial de membrana mitocondrial natildeo diferiu (Pgt005) entre grupos apoacutes
12 24 e 36 h de incubaccedilatildeo Com base nos resultados conclui-se que o ACP-105reg natildeo
se mostrou um bom diluente para a preservaccedilatildeo de secircmen equino refrigerado e que o
uso da GPx e da cisteiacutena pode contribuir com a preservaccedilatildeo destas ceacutelulas espermaacuteticas
Palavras-chave Botu-Secircmenreg ACP-105reg refrigeraccedilatildeo secircmen equino
36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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36
Abstract
The objective was to study the effect of adding the antioxidant glutathione peroxidase
and cysteine-to semen extenders Botu reg and ACP-105 reg in sperm viability of equine
chilled We used four players Mangalarga Marchador crops undergo semen artificial
vagina and female as the dummy Semen samples were evaluated and diluted semen-
Botu reg or ACP-105 reg according to the experimental groups G1 = Botu-Semen reg G2
= ACP-105 reg G3 = Botu-5U Semen reg Glutathione Peroxidase G4 = 5U ACP-105 reg
Glutathione peroxidase = G5-Botu Semen reg 5 mM cysteine and G6 = ACP-105 reg 5
mM cysteine G7 = Botu-Semen reg 5 U of glutathione peroxidase and 5 mM cysteine
G8 = ACP-105 reg 5 U of glutathione peroxidase 5 mM cysteine Samples of each
experimental group were placed in triplicate in two boxes cooled (14 deg C Botu-box reg)
and subjected to total assessment for motility vigor membrane integrity and acrosome
and mitochondrial membrane potential after zero (T0) 12 (T12h) 24 (T24h) and 36
hours (T36h) cooling The analysis of MT in T12h showed that the samples of group-
Botu reg semen and semen-Botu reg GPx cysteine had higher (P lt005) than the MT of
ACP-105 reg cysteine While in T24h the diluted semen in Botu reg GPx-cysteine had
higher (P lt005) total motility than those diluted in ACP-105 and ACP-105 reg reg
cysteine The spermatic in T12h was higher (P lt005) in semen samples Botu reg GPx-
cysteine than in the ACP and ACP-105 reg reg cysteine-105 In T24h of ACP-105 reg GPx
and GPx reg Botu semen-cysteine were higher (P lt005) than those of ACP and ACP-
105 reg reg cysteine-105 The integrity of mitochondrial membrane did not differ (Pgt
005) between groups at all times of evaluation while the integrity of acrosome in T24h
was higher (P lt005) in samples of ACP-105 reg cysteine than in the semen-Botu reg The
mitochondrial membrane potential did not differ (Pgt 005) between groups after 12 24
and 36 h of incubation Based on the results we conclude that ACP-105 reg was not a
good solvent for the preservation of equine semen cooled and that the use of GPx and
cysteine may contribute to the preservation of these sperm cells
Keyword Botu-Secircmenreg ACP-105reg cooling semen equine
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo da inseminaccedilatildeo artificial (IA) na equinocultura eacute bastante difundida
em virtude desta bioteacutecnica possibilitar a utilizaccedilatildeo de reprodutores que se encontram
distante das eacuteguas tornar viaacutevel o uso de secircmen importado aproveitar o ejaculado para
mais de uma eacutegua e proteger contra doenccedilas sexualmente transmissiacuteveis aleacutem de ser
uma teacutecnica de custo relativamente baixo
A refrigeraccedilatildeo do secircmen eacute um processo de criopreservaccedilatildeo que visa
proporcionar maior longevidade agraves ceacutelulas espermaacuteticas Em equumlinos a grande maioria
das IAs satildeo realizadas com secircmen refrigerado e armazenado durante 12 a 36 horas
Segundo Ball et al (2000) a refrigeraccedilatildeo eacute uma teacutecnica importante na reproduccedilatildeo
equumlina por possibilitar a manutenccedilatildeo da motilidade e da fertilidade do espermatozoacuteide
durante um prazo de ateacute 72 horas No entanto para que estas ceacutelulas permaneccedilam
37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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37
viaacuteveis eacute fundamental o uso de diluidor que realize interaccedilatildeo de seus diferentes
componentes com as ceacutelulas espermaacuteticas (CUNHA e LOPES 2003) visando
prolongar a viabilidade do material geneacutetico masculino (SOBREIRA NETO 2008)
Mesmo sob condiccedilotildees de armazenamento hipoteacutermico e adiccedilatildeo de diluente a
geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio (ROS) eacute uma consequumlecircncia normal do
metabolismo oxidativo (BALL et al 2000) e demonstra estar envolvido no dano
sofrido pelos espermatozoacuteides (MAXWELL et al 1996) A propagaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo
lipiacutedica na membrana das ceacutelulas espermaacuteticas e a formaccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio
(H2O2) tecircm apresentado correlaccedilatildeo com a queda de motilidade funccedilatildeo mitocondrial
integridade de membrana e acrossoma dos gametas equumlinos (BAUMBER 2000 BALL
e BAUMBER 2001)
Em virtude da formaccedilatildeo de ROS e seus prejuiacutezos agrave fertilidade do secircmen
armazenado vaacuterios estudos tecircm sido realizados avaliando-se a adiccedilatildeo de substacircncias
antioxidantes aos diluentes de criopreservaccedilatildeo do secircmen (GUERRA et al 2004)
visando reduzir a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica das membranas e desta forma preservar a
viabilidade das ceacutelulas espermaacuteticas por mais tempo Por conseguinte este trabalho teve
como objetivo estudar o efeito da adiccedilatildeo dos antioxidantes glutationa peroxidase e
cisteiacutena aos diluentes Botu-Secircmenreg e ACP-105reg na viabilidade de espermatozoides
refrigerados de equinos
2 MATERIAL E MEacuteTODOS
21 Local do Experimento
A colheita fracionamento diluiccedilatildeo e acondicionamento do secircmen para
refrigeraccedilatildeo foram realizados no Haras Vida Boa localizado na cidade de Vitoacuteria de
Santo Antatildeo-PE (8deg 7prime 35Prime S 35deg 18prime 27Prime W) durante os meses de abril a junho de
2010 Apoacutes processamento as amostras foram levadas ao Laboratoacuterio de Andrologia
(ANDROLAB) da Aacuterea de Reproduccedilatildeo do Departamento de Medicina Veterinaacuteria da
Universidade Federal Rural de Pernambuco onde foram realizadas as etapas de
avaliaccedilatildeo e refrigeraccedilatildeo
38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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38
22 Animais
Foram utilizados quatro garanhotildees da raccedila Mangalarga Marchador com idade
variando entre 4 e 8 anos clinicamente sadios submetidos ao mesmo manejo
nutricional e sanitaacuterio Os animais receberam 6 kg de raccedilatildeo balanceada por dia
contendo milho e aveia sendo trecircs porccedilotildees de 2 kg assim como capim de corte
(Pennisetum purpureum) aacutegua e sal mineral ad libitum
Antes das colheitas os animais foram submetidos a exames cliacutenicos e
androloacutegicos onde foram classificados aptos agrave reproduccedilatildeo conforme os padrotildees
estabelecidos pelo Coleacutegio Brasileiro de Reproduccedilatildeo Animal ndash CBRA (1998)
23 Colheita e Avaliaccedilatildeo do Secircmen
Cada reprodutor foi submetido a trecircs colheitas de secircmen a intervalos de 24
horas totalizando 12 colheitas de secircmen Para a colheita de secircmen utilizou-se vagina
artificial (modelo colorado) aquecida a 42 ordmC e lubrificante iacutentimo K-Y gelreg Como
manequim foi utilizada uma eacutegua em estro
Apoacutes colheita procedeu-se agrave filtragem das amostras de secircmen com filtros de
nylon especiacutefico (nacional Reproshopreg) visando remover o gel e as partiacuteculas grandes
de debris celulares A seguir as amostras de secircmen sem a fraccedilatildeo gelatinosa foram
avaliadas macroscopicamente (coloraccedilatildeo aspecto e volume) colocadas em tubo esteacuteril
e procedida a avaliaccedilatildeo microscoacutepica que correspondeu agraves anaacutelises de motilidade total
e vigor espermaacutetico realizadas em microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x)
colocando-se uma gota (10 microL) da amostra de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula
previamente aquecidas a 37 ordmC segundo o Manual para exame androloacutegico e avaliaccedilatildeo
de secircmen animal do CBRA (Manual 1998)
24 Diluiccedilatildeo e Refrigeraccedilatildeo do Secircmen
Apoacutes anaacutelise duas aliacutequotas (5 mL) de cada ejaculado foram submetidas a
diluiccedilatildeo (10 mL) utilizando Botu-secircmenreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) ou
ACP-105reg (ACP Biotecnologia Fortaleza - CE Brasil) A seguir a amostra de cada
soluccedilatildeo (diluente + secircmen) foi dividida para formar os grupos experimentais de acordo
39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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39
com a adiccedilatildeo de substacircncia antioxidante G1 = Botu-secircmen G2 = ACP-105reg G3 =
Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA)
G4 = ACP-105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase G5 = Botu-secircmen + 5 mM de
Cisteiacutena (Sigma-Aldrichreg St Louis MO USA) G6 = ACP-105reg + 5 mM de Cisteiacutena
G5= Botu-secircmen + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena e G8 = ACP-
105reg + 5 U de Glutationa Peroxidase + 5 mM de Cisteiacutena As amostras de cada grupo
experimental foram colocadas em tubos de microcentriacutefuga (1 mL) em triplicata
etiquetados e acondicionadas em duas caixas de refrigeraccedilatildeo (14 oC) de secircmen (Botu-
boxreg (Biotech Botucatu Botucatu-SP Brasil) as quais foram protegidas contra o sol
Para maior controle da temperatura de refrigeraccedilatildeo foi colocado em cada caixa um
termocircmetro digital com visor externo
25 Avaliaccedilatildeo da Viabilidade Espermaacutetica
As amostras de secircmen foram submetidas agrave avaliaccedilatildeo quanto a motilidade total
vigor integridade de membrana e de acrossoma e potencial da membrana mitocondrial
imediatamente apoacutes a chegada ao laboratoacuterio constituindo o momento zero (T0h) assim
como apoacutes 12 (T12h) 24 (T24h) de refrigeraccedilatildeo a 14 oC e 36 horas (T36h) com
temperatura de aproximadamente 18 oC
251 Motilidade e vigor espermaacutetico
A motilidade total (MT) e o vigor espermaacutetico foram estimados apoacutes colocaccedilatildeo
de uma aliacutequota (10 microL) de secircmen entre lacircmina e lamiacutenula previamente aquecidas
(37 ordmC) observada ao microscoacutepio oacuteptico (Olympus Germany 100x) com aprovaccedilatildeo
das amostras que apresentaram valores miacutenimos de 70 (0-100) e 30 (0-5)
respectivamente de acordo com o Manual de exame androloacutegico do CBRA (1998)
252 Integridade da membrana plasmaacutetica
Utilizou-se o meacutetodo de coloraccedilatildeo dupla com Diacetato de Carboxifluoresceina
(DCF) e Iodeto de Propiacutedio (IP) modificado por Coleto et al (2002) Aliacutequotas (50 microL)
de secircmen foram diluiacutedas em 150 microL de Tris (3605 g de Tris 2024 g de aacutecido ciacutetrico
1488 g de frutose 100 mL de aacutegua ultrapura pH 68) contendo 5 microL de DCF (046
40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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40
mgmL em DMSO) e 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) incubadas por 10 minutos a 37
oC e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 400x usando filtro de emissatildeo DBP 580-630
nm e excitaccedilatildeo DBP 48520 nm e classificados com membrana intacta (IM) quando se
apresentavam corados em verde e com membrana danificada quando corados em
vermelho
253 Integridade do acrossoma
Os espermatozoides foram corados com a associaccedilatildeo do Iodeto de Propiacutedeo e
Isotiociacuteanato de Fluoresceiacutena conjugado a Peanut agglutinin (FITC-PNA Sigma-
Aldrichreg St Louis MO USA) Aliacutequotas (5 microL) de secircmen foram preparadas para
esfregaccedilo e secas ao ar Uma aliacutequota de 100 microL da soluccedilatildeo estoque de FITC-PNA (1
mgmL) foi descongelada e adicionada a 900 microL de PBS para obter a concentraccedilatildeo final
de 100 microgmL Aliacutequotas (10-20 microL) desta soluccedilatildeo foram colocadas sobre lacircminas
juntamente com 20 microL de IP (05 mgmL em PBS) as quais foram incubadas por 15
minutos em cacircmara uacutemida a 37 degC na ausecircncia de luz Apoacutes incubaccedilatildeo as lacircminas
foram enxaguadas duas vezes em PBS e colocadas para secagem na ausecircncia de luz
Imediatamente antes da avaliaccedilatildeo 5 microL de meio de montagem (45 mL de glicerol 05
mL de PBS e 5 mg de p-phenylenediamine) foi colocado sobre a lacircmina e coberto com
lamiacutenula
Foram avaliados 200 espermatozoides por lacircmina com aumento de 1000x sob
oacuteleo de imersatildeo em microscopia de epifluorescecircncia usando filtro de emissatildeo LP 515
nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo Os gametas foram classificados como portadores
de acrossomas intactos (IAc) quando apresentavam a regiatildeo acrossomal corada com
fluorescecircncia verde ou acrossomas reagidos quando apresentavam faixa verde
fluorescente na regiatildeo equatorial da cabeccedila espermaacutetica ou natildeo apresentavam
fluorescecircncia verde em toda cabeccedila da ceacutelula
254 Potencial de membrana mitocondrial
Para uso do fluorocromo catiocircnico lipofiacutelico JC-1 (GUTHRIE e WELCH 2006)
duas soluccedilotildees foram previamente preparadas sendo uma com Botu-secircmenreg e outra
41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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41
com ACP-105reg acrescida de 5microL de JC-1 (015 mM em DMSO) incubadas por 10
minutos (38 oC) e fixadas com PBS contendo 05 de glutaraldeiacutedo Um total de 200
espermatozoides foi avaliado em microscoacutepio de epifluorescecircncia (Carl Zeiss
Goumlttingen Alemanha) com aumento de 1000x sob oacuteleo de imersatildeo usando filtro de
emissatildeo LP 515 nm e BP 450-490 nm para excitaccedilatildeo As ceacutelulas coradas em laranja na
peccedila intermediaacuteria foram classificadas com alto potencial de membrana mitocondrial
(aPMM) enquanto aquelas coradas em verde foram classificadas com baixo potencial
de membrana
26 Anaacutelise Estatiacutestica
Para realizaccedilatildeo das anaacutelises estatiacutesticas os dados foram submetidos agrave anaacutelise de
variacircncia (Teste F) que separou como causa de variaccedilatildeo o efeito de grupos (G1 G2 G3
G4 G5 G6 G7 e G8) e tempos de anaacutelise do secircmen (0h 12h 24h e 36h de
refrigeraccedilatildeo) Nos casos em que se constatou significacircncia no teste F as meacutedias dos
tratamentos foram comparadas pelo Teste de Duncan Para avaliaccedilatildeo de cada grupo em
funccedilatildeo do tempo utilizou-se ANOVA e o teste de Tukey Os dados foram analisados no
programa computacional Statistical Analysis System (SAS 2000) utilizando-se o
procedimento GLM (General Linear Model) do SAS Para todas as anaacutelises estatiacutesticas
realizadas foi adotado o niacutevel de significacircncia (p) de 5 O modelo utilizado foi o
seguinte Yij= G + T + GT + Eij onde Yij = valor observado G = efeito dos grupos T =
efeito dos tempos GT = Interaccedilatildeo entre grupo x tempos Eij = erro Realizou-se
tambeacutem anaacutelise de correlaccedilatildeo de Pearson para pares de variaacuteveis do secircmen segundo
Little e Hills (1978)
3 RESULTADOS
Os ejaculados apresentaram volume meacutedio de 404 mL cor branco opalescente
aspecto leitoso a aquoso motilidade meacutedia de 7292 e vigor meacutedio de 35
Apoacutes refrigeraccedilatildeo considerando o tempo de incubaccedilatildeo observou-se no T12h que
as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram
maior (Plt005) MT (Tabela 1) do que as diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena Apoacutes
42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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42
24horas de incubaccedilatildeo (T24h) as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena
apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-105reg e ACP-105reg +
cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx e Botu-
secircmenreg
+ GPS e cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) MT do que as diluiacutedas em ACP-
105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena
Avaliando a accedilatildeo de cada diluente constatou-se que as amostras com ACP-105reg Botu-
secircmenreg
+ GPx Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena ACP-105reg + cisteiacutena e ACP-105reg
+ GPx +
cisteiacutena apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT em relaccedilatildeo agraves amostras de secircmen
diluiacutedas e avaliadas antes da refrigeraccedilatildeo (T0h) Enquanto as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T24h em comparaccedilatildeo ao T0h e as
amostras ACP-105reg + GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena somente evidenciaram
reduccedilatildeo (Plt005) da MT no T36h em comparaccedilatildeo ao T0h
Ao se avaliar a anaacutelise do vigor espermaacutetico (Tabela 2) em cada tempo de
incubaccedilatildeo observou-se que no T12h as amostras de secircmen diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+
GPx + cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) valor do que as com ACP-105reg e ACP-
105reg + cisteiacutena No T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + GPx e Botu-secircmenreg +
GPx + cisteiacutena apresentaram maiores (Plt005) valores do que as diluiacutedas em ACP-
105reg e ACP-105reg + cisteiacutena No T36h as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + GPx +
cisteiacutena apresentaram maior (Plt005) vigor do que as diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena Avaliando a accedilatildeo de cada diluente
evidenciou que as amostras diluiacutedas em ACP-105reg ACP-105reg + GPx e ACP-105reg
+
cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) valores no T12h do que antes da refrigeraccedilatildeo
(T0h) Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg + cisteiacutena e Botu-secircmen
reg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores valores (Plt005) apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo
(T24h) em relaccedilatildeo ao T0h e as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg Botu-secircmen
reg + GPx e
Botu-secircmenreg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) do vigor apoacutes
36 horas de incubaccedilatildeo (T36h)
A anaacutelise de integridade de membrana (Tabela 3) evidenciou em cada tempo de
incubaccedilatildeo (T0h T12h T24h e T36h) que natildeo houve reduccedilatildeo (Plt005) do porcentual de
gametas com esta estrutura intacta Considerando cada grupo experimental constatou-
se que apenas a diluiccedilatildeo com ACP-105reg + GPx + cisteiacutena reduziu (Pgt005) o
porcentual de gametas com esta estrutura intacta durante 36 horas de incubaccedilatildeo
A anaacutelise de integridade de acrossoma (Tabela 4) considerarndo cada tempo
de incubaccedilatildeo constatou que no T24h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg+ cisteiacutena
43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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43
apresentaram maior (Plt005) porcentual de gametas com acrossomas intactos do que as
diluiacutedas em Botu-secircmenreg e que no T36h as amostras diluiacutedas em ACP-105reg + cisteiacutena
e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena apresentaram maiores porcentuais (Plt005) de
acrossomas iacutentegros do que as diluiacutedas com Botu-secircmenreg
Botu-secircmenreg
+ GPx ACP-
105reg + GPx e Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena Considerando cada diluente observou-se
que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena
apresentaram reduccedilatildeo (Plt005) dos porcentuais de gametas com acrossomas iacutentegros no
T24h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em ACP-105reg Botu-
secircmenreg + GPx ACP-105reg+ GPx e Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena apresentaram
menores porcentuais (Plt005) no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
O potencial de membrana mitocondrial (Tabela 5) considerando cada tempo de
avaliaccedilatildeo evidenciou diferenccedila entre os diluidores apenas no T0h com maiores
porcentuais (Plt005) para as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
em comparaccedilatildeo agraves
diluiacutedas em Botu-secircmen
reg + GPx + cisteiacutena e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena Enquanto as
anaacutelises de cada diluente evidenciou que as amostras diluiacutedas em Botu-secircmenreg
+ GPx e
Botu-secircmenreg
+ GPx + cisteiacutena apresentaram menores (Plt005) porcentuais de gametas
com aPMM no T12h em relaccedilatildeo ao T0h Em contrapartida as amostras diluiacutedas em Botu-
secircmenreg
ACP-105reg Botu-secircmenreg
+ cisteiacutena e ACP-105reg + cisteiacutena apresentaram
menores (Plt005) porcentuais no T24h em relaccedilatildeo ao T0h enquanto as amostras diluiacutedas
em ACP-105reg + GPx e ACP-105reg + GPx + cisteiacutena somente apresentaram reduccedilatildeo
(Plt005) destes porcentuais no T36h em relaccedilatildeo ao T0h
Na avaliaccedilatildeo dos dados da cor relaccedilatildeo de Pearson (Tabela 6) constatou-se alta
correlaccedilatildeo (plt005) da motilidade total com vigor e alto potencial de membrana
mitocondrial assim como do vigor com o alto potencial de membrana mitocondrial
Observou-se moderada correlaccedilatildeo da motilidade total com a integridade de membrana
do vigor com a integridade de membrana do alto potencial de membrana mitocondrial
com a integridade de membrana e a integridade de acrossoma Observou-se ainda que
motilidade total e integridade de acrossoma vigor e integridade de acrossoma e
integridade de membrana e integridade de acrossoma apresentaram baixa correlaccedilatildeo
entre si
Na avaliaccedilatildeo dos grupos testados em relaccedilatildeo aos tempos de refrigeraccedilatildeo
considerados observou-se uma regressatildeo dos valores de todos os paracircmetros no
decorrer do tempo (Figura 1) No entanto os paracircmetros de motilidade total e vigor
44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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44
espermaacutetico integridade de membrana e integridade de acrossoma no T12h e no T24h
natildeo apresentaram diferenccedila significativa (Pgt005) entre eles
4 DISCUSSAtildeO
A utilizaccedilatildeo de ACP-105 como diluente de secircmen equumlino quando comparada
ao do Equimixreg diluente comercial agrave base de leite como o botu-secircmen
reg foi avaliada
como viaacutevel de acordo com Raphael (2007) que obteve resultados semelhantes na
avaliaccedilatildeo do secircmen fresco adicionado deste diluente Fato que curiosamente difere dos
obtidos neste estudo No entanto no decorrer dos momentos de avaliaccedilatildeo Sobreira Neto
(2008) tambeacutem observou maior conservaccedilatildeo da motilidade das ceacutelulas utilizando
diluente agrave base de leite em relaccedilatildeo ao ACP obtendo resultados inviaacuteveis para utilizaccedilatildeo
na IA de acordo com os padrotildees estabelecidos pelo CBRA (1998) que preconiza
valores miacutenimos de 25 de motilidade progressiva o que tambeacutem foi observado por
Maia et al (2010) ao compararem o uso de meio aacute base de leite com aquele agrave base de
aacutegua de coco e natildeo obtiveram resultados satisfatoacuterio em relaccedilatildeo ao uso da aacutegua de coco
como diluente para secircmen equino
A meacutedia dos resultados obtidos na avaliaccedilatildeo do secircmen fresco (T0) natildeo
surpreendeu no que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica
potencial de membrana mitocondrial e integridade de acrossoma considerando que
neste momento a ceacutelula ainda natildeo sofreu estresse oxidativo que segundo Saleh e
Agarwal (2002) e Ball (2008) tem iniacutecio agrave medida que estes gametas satildeo expostos a
baixas temperaturas aleacutem de ser indispensaacutevel algum tempo para que os
espermatozoacuteides produzam ROS e determinem estresse oxidativo
O fato das amostras diluiacutedas em botu-secircmenreg de maneira geral natildeo terem
proporcionado maior preseva preservaccedilatildeo da MT diferem daqueles encontrados por
Goulart (2004) que testou secircmen diluiacutedo com extensores agrave base de leite desnatado em
12 24 e 48 horas de refrigeraccedilatildeo e natildeo observou diferenccedila significativa entre os tempos
Este resultado pode ser explicado pelo fator individual do garanhatildeo e por caracteriacutestica
de boa refrigeraccedilatildeo que varia natildeo soacute de acordo com o indiviacuteduo mas tambeacutem com a
raccedila e o periacuteodo do ano (CARNEIRO et al 2005 SILVA et al 2008)
Bilodeau et al (2001) avaliaram o efeito da adiccedilatildeo de glutationa e cisteiacutena na
preservaccedilatildeo do secircmen bovino e concluiacuteram que estes antioxidantes quando utilizados
em concentraccedilatildeo acima de 05 mM mantecircm a motilidade alta por seis horas em diluente
45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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45
agrave base de Tris-gema o que estaacute de acordo com os achados observados neste estudo que
observou bons resultados na manutenccedilatildeo da motilidade e do vigor dos espermatozoacuteides
ateacute o T12h quando estas substacircncias foram utilizadas no botu-secircmenreg e diferem dos
encontrados por Foote et al (2002) que adicionaram glutationa e outros antioxidantes
ao diluente de secircmen bovino agrave base de leite Estes pesquisadores afirmaram que esses
antioxidantes natildeo exerceram nenhum efeito beneacutefico na motilidade e na qualidade geral
do secircmen tendo atribuiacutedo este fato agrave presenccedila da caseiacutena antioxidante natural
encontrado em abundacircncia no leite Sinha et al (1996) obtiveram aumento no
percentual de motilidade espermaacutetica apoacutes a adiccedilatildeo de 5 mM de glutationa ao secircmen
caprino no periacuteodo poacutes-descongelaccedilatildeo em diluente agrave base de leite No entanto
Atessahim et al (2008) trabalhando com a mesma espeacutecie e Cajueiro et al (2009)
com a espeacutecie ovina natildeo observaram aumento significativo da qualidade espermaacutetica
poacutes-descongelaccedilatildeo quando comparada ao grupo controle
Sarlos et al (2002) observaram que a adiccedilatildeo de antioxidantes no secircmen de
carneiros dentre eles a GPx prolonga o periacuteodo de conservaccedilatildeo do secircmem melhora a
motilidade e reduz o grau de danos celulares Os mesmos resultados favoraacuteveis ao uso
da GPx foram obtidos por Maxwell e Stojanov (1996) em secircmen ovino diluiacutedo em
TRIS No que diz respeito aos paracircmetros de integridade da membrana plasmaacutetica e
potencial da membrana mitocondrial neste trabalho natildeo houve diferenccedila do Botu-
secircmenreg comparado ao ACP em todo tempo de avaliaccedilatildeo A dinacircmica dos resultados se
manteve o que difere dos resultados obtidos pelos autores supracitados Este fato pode
ser explicado pelas caracteriacutesticas da espeacutecie utilizada bem como pelo fato de que os
equumlinos de um modo geral natildeo satildeo selecionados por fertilidade mas por desempenho
individual aleacutem de questotildees particulares como preferecircncia por linhagens e
caracteriacutesticas fenotiacutepicas
No que diz respeito agrave cisteiacutena pode-se observar que na concentraccedilatildeo utilizada
manteacutem paracircmetros semelhantes quanto ao grupo controle do ACP o que estaacute de acordo
com Severo (2009) que utilizou a cisteiacutena no secircmen suiacuteno refrigerado para inseminaccedilatildeo
artificial e com Menezes et al (2009) que estatisticamente tambeacutem natildeo observaram
melhora no uso da cisteiacutena em relaccedilatildeo ao grupo controle na conservaccedilatildeo do secircmen
ovino Poreacutem pode-se notar numericamente que a adiccedilatildeo da cisteiacutena no meio agrave base de
leite (Botu-secircmenreg
) apresentou accedilatildeo positiva agrave manutenccedilatildeo do vigor espermaacutetico em
relaccedilatildeo ao grupo controle de botu-secircmen (G1) Esta accedilatildeo pocircde ser obtida
46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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46
provavelmente por sua accedilatildeo antioxidante que atuam protegendo as ceacutelulas dos danos
provocados pelos ROS e evitando lesotildees celulares
Silva et al (2008) ao avaliarem outros antioxidantes adicionados ao secircmen de
garanhotildees feacuterteis e subfeacuterteis natildeo observaram eficaacutecia relevante na adiccedilatildeo de piruvato
de soacutedio e trolox na proteccedilatildeo as mitococircndrias durante o processo de
congelaccedilatildeodescongelaccedilatildeo Estes resultados corroboram com os obtidos no presente
estudo onde natildeo se constatou resposta positiva na adiccedilatildeo dos antioxidantes ao diluente
convencional para secircmen equumlino nem ao diluente a base de aacutegua de coco (ACP) em
relaccedilatildeo aos grupos controle Silva et al (2009) obtiveram resultado positivo na
preservaccedilatildeo da motilidade total e progressiva das ceacutelulas espermaacuteticas submetidas agrave
incubaccedilatildeo a 37ordmC por 120 minutos em diluente para secircmen equumlino acrescido de 120
microMmL de trolox apoacutes a descongelaccedilatildeo Este resultado provavelmente pocircde ser
observado pela maior exposiccedilatildeo agrave injuacuteria oxidativas sofridas pelo processo de
congelaccedilatildeo de secircmen que o processo de refrigeraccedilatildeo bem como pela accedilatildeo diferenciada
que cada antioxidante vai apresentar no meio diluente e sua interaccedilatildeo coma a ceacutelula
espermaacutetica
Os melhores resultados obtidos neste estudo na avaliaccedilatildeo da motilidade e vigor
das ceacutelulas espermaacuteticas de secircmen refrigerado de garanhotildees e da integridade de
membrana foram obtidos nos grupos onde se utilizou a associaccedilatildeo da GPx e da Cisteiacutena
isso se deve provavelmente agrave correlaccedilatildeo que a cisteiacutena apresenta com a glutationa
peroxidase como afirma Menezes et al (2009) que diz que a cisteiacutena participa da
biosiacutentese da GPx que por sua vez atua na proteccedilatildeo contra o estresse oxidativo
Um fato bastante curioso obtido neste trabalho foi o de que todos os grupos com
ACP-105reg apresentaram resultados superiores aos grupos onde se utilizou o Botu-
Secircmenreg no que se refere aos valores de integridade do acrossoma Uma possibilidade
para tal fato pode estar relacionada com a teacutecnica onde o corante se ligaria as lectinas
do leite que estatildeo disponiacuteveis em grande quantidade nos diluentes agrave base de leite natildeo
se ligando prioritariamente ao acrossoma por uma questatildeo de disponibilidade Outra
hipoacutetese eacute o fato de a aacutegua de coco segundo Barbier-Brygoo (1995) apresentar em sua
composiccedilatildeo o aacutecido 3-indol-aceacutetico (IAA) hormocircnio que atua no crescimento de
vegetais ligando-se a proteiacutenas soluacuteveis o que poderia acarretar uma provaacutevel alteraccedilatildeo
do corante utilizado na teacutecnica jaacute que o mesmo eacute de origem vegetal
47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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47
5 CONCLUSOtildeES
O uso da aacutegua do ACP-105reg natildeo se mostrou uma alternativa eficiente como
diluente para secircmen equumlino nem a fresco nem refrigerado quando comparado ao Botu-
secircmenreg
O uso de 5 U de glutationa peroxidase e 5 mM de cisteiacutena apresenta benefiacutecio
quando utilizados em associaccedilatildeo no que se refere aacute manutenccedilatildeo da motilidade vigor e
integridade da membrana espermaacutetica quando utilizados com Botu-secircmenreg
O uso de diluentes agrave base de leite desnatado ainda eacute a melhor alternativa para
secircmen equumlino Contudo estudos mais aprofundados do uso da aacutegua do ACP-105reg e de
diferentes concentraccedilotildees e tipos de antioxidantes para secircmen desta espeacutecie satildeo de
extrema necessidade
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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51
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54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
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ac 4596plusmn1907A
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bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
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61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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52
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ZINI A GARRELS K PHANG D Antioxidant activity in the semen of fertile and
infertile men Urology v 55 n 6 p 922-926 2000
54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
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Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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TONIOLLI R MESQUITA DSM Fertilidade de porcas inseminadas com secircmen
diluiacutedo em aacutegua de coco estabilizada e com BTS Revista Brasileira de Reproduccedilatildeo
Animal v 14 p 249-254 1990
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utilizaccedilatildeo de antioxidantes na criopreservaccedilatildeo do secircmen suiacuteno Revista Brasileira de
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Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
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Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
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Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
Livros Graacutetis( httpwwwlivrosgratiscombr )
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Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemaacuteticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterinaacuteriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MuacutesicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuiacutemicaBaixar livros de Sauacutede ColetivaBaixar livros de Serviccedilo SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
54
Tabela 1 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da motilidade total () de espermatozoides
equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com
GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e
18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6500plusmn1348Aa 4875plusmn1539Aac 3500plusmn2121ABbc 1833plusmn1557Ab
ACP-105reg 4750plusmn1574Aa 1708plusmn1405ABbc 708plusmn940BCb 333plusmn577BCbc
Botu-Secircmenreg + GPx 6458plusmn1529Aa 4208plusmn2641ABbcd 3375plusmn2090ABCcd 2208plusmn1616Ad
ACP-105reg + GPx 5458plusmn1712Aa 3600plusmn2271ABa 3625plusmn2258ABa 1750plusmn1530ABb
Botu-Secircmenreg + Cist 5625plusmn1667Aa 1833plusmn1354ABbc 1417plusmn1459ABCbc 333plusmn492BCbd
ACP-105reg + Cist 4417plusmn1703Aa 833plusmn651Bb 458plusmn498Cb 083plusmn195Cb
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 5708plusmn1864Aa 4958plusmn1840Aac 3958plusmn2050Aa 2167plusmn1528Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4875plusmn1509Aa 2375plusmn1025ABbc 1333plusmn1212ABCb 375plusmn608BCbd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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55
Tabela 2 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do vigor (0-5) de espermatozoides equumlinos diluiacutedos
em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena
(5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC (T0h T12h e T24h) e 18
oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 333plusmn049Aa 317plusmn039AB
a 267plusmn098ABC
a 192plusmn100ABCD
b
ACP-105reg 325plusmn075Aa 217plusmn083B
b 142plusmn100BC
c 058plusmn090CD
c
Botu-Secircmenreg + GPx 350plusmn067Aordf 300plusmn113ABa 300plusmn113AB
a 217plusmn111ABC
b
ACP-105reg + GPx 350plusmn067Aordf 333plusmn065ABb 342plusmn067A
b 242plusmn116AB
bc
Botu-Secircmenreg + Cist 350plusmn090Aa 242plusmn090AB
ad 208plusmn116ABC
bd 092plusmn116BCD
c
ACP-105reg + Cist 342plusmn079Aordf 225plusmn087Bb 158plusmn151BC
bc 033plusmn089D
d
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 367plusmn078Aordf 358plusmn051Aa 350plusmn052A
a 283plusmn094A
b
ACP-105reg+ GPx + Cist 358plusmn067Aa 292plusmn079AB
ab 225plusmn114ABC
bc 125plusmn154ABCD
c
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
Livros Graacutetis( httpwwwlivrosgratiscombr )
Milhares de Livros para Download Baixar livros de AdministraccedilatildeoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciecircncia da ComputaccedilatildeoBaixar livros de Ciecircncia da InformaccedilatildeoBaixar livros de Ciecircncia PoliacuteticaBaixar livros de Ciecircncias da SauacutedeBaixar livros de ComunicaccedilatildeoBaixar livros do Conselho Nacional de Educaccedilatildeo - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomeacutesticaBaixar livros de EducaccedilatildeoBaixar livros de Educaccedilatildeo - TracircnsitoBaixar livros de Educaccedilatildeo FiacutesicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmaacuteciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FiacutesicaBaixar livros de GeociecircnciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistoacuteriaBaixar livros de Liacutenguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemaacuteticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterinaacuteriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MuacutesicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuiacutemicaBaixar livros de Sauacutede ColetivaBaixar livros de Serviccedilo SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
56
Tabela 3 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de membrana () em
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 6117plusmn1490Aa 6129plusmn965
A
a 6008plusmn939A
a 4913plusmn1294
A
a
ACP-105reg 6483plusmn1004 A
a 5583plusmn1851A
a 5179plusmn2064A
a 4654plusmn2426
A
a
Botu-Secircmenreg + GPx 6925plusmn1494 A
a 6238plusmn1481
A
a 5779plusmn1566
A
a 6021plusmn1322
A
a
ACP-105reg + GPx 5908plusmn1153 A
a 6308plusmn1784
A
a 6275plusmn1447
A
a 5550plusmn1934
A
a
Botu-Secircmenreg + Cist 6754plusmn1590 A
a 5600plusmn1666
A
a 4467plusmn2320
A
a 4788plusmn2727
A
a
ACP-105reg + Cist 6558plusmn1210 A
a 5725plusmn2420
A
a 4842plusmn2523
A
a 5108plusmn2788
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6667plusmn1386 A
a 6617plusmn1668
A
a 5950plusmn761
A
a 7042plusmn2025
A
a
ACP-105reg+ GPx + Cist 6375plusmn1044Aa 5688plusmn1915A
a 3750plusmn1970A
b 5725plusmn2469A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
1675plusmn804ABbc
Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
775plusmn583Bb
ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
cd
ACP-105reg+ GPx + Cist 4033plusmn1438Aa 3929plusmn2003A
a 3325plusmn1683
AB
a 2958plusmn1569A
a
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
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Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
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Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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57
Tabela 4 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo da integridade de acrossomas () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 3300plusmn1943Aordf 2079plusmn1623Aordf 1383plusmn586Bb 450plusmn375B
bc
ACP-105reg 3896plusmn1580Aordf 2838plusmn1005Aab
3167plusmn1461ABab
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Botu-Secircmenreg + GPx 2958plusmn1430Aordf 2233plusmn1257Aab
1763plusmn1788ABab
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ACP-105reg + GPx 3096plusmn1912Aordf 2583plusmn1738Aordf 1567plusmn1400ABa 1267plusmn854B
b
Botu-Secircmenreg + Cist 3483plusmn1587Aa 3088plusmn1407A
a 3017plusmn1416
AB
a 1733plusmn821AB
b
ACP-105reg + Cist 3983plusmn2098Aa 3883plusmn1583A
a 3775plusmn1591A
a 2908plusmn1612
A
a
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 3683plusmn1741Aordf 2358plusmn1257Aordf 1642plusmn1554ABb 800plusmn779B
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AB
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Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
58
Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
localidades pode ser um fator limitante jaacute que a demanda por secircmen equino nesta
condiccedilatildeo eacute uma crescente
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Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemaacuteticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterinaacuteriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MuacutesicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuiacutemicaBaixar livros de Sauacutede ColetivaBaixar livros de Serviccedilo SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
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Tabela 5 ndash Meacutedia geral plusmn desvio padratildeo do potencial de membrana mitocondrial () de
espermatozoides equumlinos diluiacutedos em Botu-Secircmenreg ou ACP-105reg
suplementados com GPx (5 U) e ou Cisteiacutena (5 mM) apoacutes incubaccedilatildeo a 14 oC
(T0h T12h e T24h) e 18 oC (T36h)
Grupos
Experimentais
Tempo de incubaccedilatildeo
T0h T12h T24h T36h
Botu-Secircmenreg 7925plusmn1151Aa 6471plusmn1065A
abc 4508plusmn2619A
b 4992plusmn2066A
c
ACP-105reg 7629plusmn1187ABordf 5579plusmn2089Aordf 4550plusmn2274Ab 4129plusmn2896A
b
Botu-Secircmenreg + GPx 7358plusmn1198ABa 6550plusmn1534A
c 5775plusmn2214A
c 4438plusmn2636A
b
ACP-105reg + GPx 6946plusmn1987ABordf 7142plusmn714Aordfc 5863plusmn1997Aordf 4013plusmn2205A
bd
Botu-Secircmenreg + Cist 7046plusmn1318ABordf 6308plusmn1523Aab
4825plusmn2324Abd
3146plusmn2571Ace
ACP-105reg + Cist 7196plusmn1385ABordf 5333plusmn1641Aab
4713plusmn1898Abc
3842plusmn1959Ac
Botu-Secircmenreg+ GPx + Cist 6546plusmn1048Bordf 6292plusmn868Acd
5679plusmn2368Acd
4483plusmn2350Abd
ACP-105reg+ GPx + Cist 6388plusmn1374Ba 5967plusmn1402A
ac 4596plusmn1907A
a 3546plusmn2059A
bd
Cist = cisteiacutena Letras minuacutesculas distintas na mesma linha indicam Plt005 letras maiuacutesculas distintas na
mesma coluna indicam Plt005
59
Tabela 6 ndash Coeficiente de correlaccedilatildeo de Pearson entre variaacuteveis do secircmen de equumlinos
antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
utilizado natildeo manteacutem a temperatura constante por mais de 24 horas o que em algumas
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59
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antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo com e sem adiccedilatildeo de substacircncias antioxidantes
Vigor aPMM IM IAc
Motilidade
r = 083022 r = 070658 r = 039448 r = 015830
plt00001 plt00001 plt00001 00743
Vigor
r = 070357 r = 039356 r = 016194
plt00001 pgt00001 00678
aPMM
r = 047289 r = 034340
plt00001 plt00001
IM
r = 013976
01156 aPMM= alto potencial de membrana mitocondrial IM = integridade de membrana IAc= integridade de
acrossoma
60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
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Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
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60
Figura 1ndash Representaccedilotildees graacuteficas da anaacutelise de regressatildeo em funccedilatildeo dos tempos de
incubaccedilatildeo dos paracircmetros de motilidade vigor integridade de membrana
(IM) e de acrossoma (IAC) e alto potencial de membrana mitocondrial
(APMM) de espermatozoides equumlinos antes e apoacutes a refrigeraccedilatildeo
adicionados ou natildeo com diferentes antioxidantes
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
Tempo de Incubaccedilatildeo (horas)
61
5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
de se realizar mais estudos em relaccedilatildeo agrave accedilatildeo do ACP-105reg como diluente para secircmen
equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
e da viabilidade de secircmen equumlino refrigerado Outro ponto fundamental eacute a relativa
limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
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5 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
Diante dos resultados avaliados e obtidos neste estudo fica clara a necessidade
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equumlino bem como eacute fundamental que mais estudos sejam realizados em relaccedilatildeo ao uso
de antioxidantes isolados e associados nos diluentes para secircmen pois obtivemos claros
sinais que estes podem ser uma boa alternativa no que se refere agrave melhoria da qualidade
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limitaccedilatildeo de tempo de transporte do secircmen equino jaacute que o sistema de refrigeraccedilatildeo
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