UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
IZABEL CAROLINA VARGAS PINTO GOGONE
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS DE IMPACTO REPRODUTIVO EM
SUÍNOS: APLICABILIDADE DA ESPECTROSCOPIA RAMAN
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DOIS VIZINHOS
2021
IZABEL CAROLINA VARGAS PINTO GOGONE
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS DE IMPACTO REPRODUTIVO EM SUÍNOS:
APLICABILIDADE DA ESPECTROSCOPIA RAMAN
Applicability of Raman micro spectroscopy for viral reproductive failure.
Dissertação apresentada como requisito para obtenção do título de Mestre em Zootecnia, do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia (PPGZO), da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
Orientadora: Prof.ª. Drª. Flavia Regina Oliveira de Barros
Coorientadora: Prof.ª. Drª. Raquel de Almeida Rocha Ponzoni
DOIS VIZINHOS
2021
4.0 Internacional
Esta licença permite remixe, adaptação e criação a partir do trabalho, mesmo para fins comerciais, desde que sejam atribuídos créditos ao(s) autor(es) e que licenciem as novas criações sob termos idênticos.
Conteúdos elaborados por terceiros, citados e referenciados nesta obra não são cobertos pela licença.
À minha mãe, axs amigxs de São Paulo e do Paraná, às irmãs com que a vida me surpreendeu.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a essa força tão invisível quanto vital, que alguns identificam como
Deus, outros como os Orixás, ou Alá, Buda, Destino, ou mesmo como essa vontade
genuína de fazer da nossa vida mais do que apenas a busca da felicidade individual.
Agradeço à minha mãe, quem lutou bravamente para me criar. Cada
sacrifício, eu sei, foi por amor (o maior de todos) e sou eternamente grata. Espero que
em breve possamos estar mais próximas. Certamente, D. Leninha estará aqui, de
alguma forma, para comemorar essa vitória conosco.
Agradeço às amigues: vocês são a base da minha vida! Amo cada ume!
Menines da Vet, Tchutchus, es guerreires que sobreviveram à Palotexas, amigues de
quase duas décadas do Rubens, amigues que parecem de décadas, mas que conheci
em Dois Vizinhos! Agradeço demais a cada ume!
Agradeço à vida por recentemente me abençoar com a realização de um
grande sonho de infância: ter irmãos! Aos 33 ganhei duas irmãs mais velhas (e sabe-
se lá quantos mais virão, né, Marília?! Chama o Bonde!).
Agradeço aos colegas de trabalho, tanto os da minha equipe como os de
outros setores, assim como à minha chefia, por sempre serem compreensivos e
pacientes. O apoio de vocês foi determinante para eu conseguir chegar até aqui.
Agradeço especialmente às minhas orientadoras, Flávia e Raquel, por quem
a profunda admiração que cultivo, assim como a forma gentil e profissional com que
conduziram todo o projeto, trouxeram leveza e seriedade a esta tarefa.
Agradeço com muito carinho e à equipe – orgulhosamente feminina – que
construiu esse projeto da ideia à publicação: Gláucia e Fabíola (UNIFESP), Danielle
e Rejane (EMBRAPA); ainda, registro minha gratidão à contribuição inestimável da
colega de profissão (muito mais gabaritada, sem dúvida) Marisete, assim como à toda
equipe da EMBRAPA – Concórdia e CEDISA.
E, claro, agradeço ao time de profissionais incríveis e cheios de energia do
LabBarros, foi inspirador trabalhar com vocês, e por favor me desculpem pelos
desenhos medonhos no Gartic!
"Cada tic-tac es un segundo de la vida que pasa, huye, y no se repite. Y hay en ella tanta
intensidad, tanto interés, que el problema es solo saberla vivir. Que cada uno lo resuelva como
pueda"
(Frida Kahlo)
RESUMO
GOGONE, Izabel C. V. P. Diagnóstico de vírus de impacto reprodutivo em suínos: Aplicabilidade da Espectroscopia Raman. 84 f. (Dissertação de Mestrado em Zootecnia - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Dois Vizinhos, 2021).
De grande relevância para a medicina veterinária preventiva, o parvovírus suíno (PPV) é uma das principais causas infecciosas de falha reprodutiva em granjas suínas, responsável por importantes perdas econômicas, principalmente em co-infecção com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Até o momento, as ferramentas de detecção mais utilizadas são baseadas na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), bastante sensível e específica, porém complexa, com altos custos associados, além de exigir de horas a dias para oferecer os resultados. Além disso, a recente pandemia mostrou o quanto a saúde pública demanda estratégias diagnósticas inovadoras e simples, mais adequadas para aplicações em larga escala. O objetivo do presente estudo foi identificar biomarcadores moleculares de infecção de PPV ou PCV2 através da Microespectroscopia Raman (RMS), a fim de fortalecer a base de dados da literatura científica, contribuindo para sua aplicação no diagnóstico em virologia no mundo todo. Para tanto, células de testículo de suíno (ST) foram inoculadas com PPV ou PCV2 e cultivadas in vitro (37 ºC, 5% CO2) por quatro dias. As células fixadas foram então submetidas à investigação RMS usando um laser de 633 nm. Um total de 225 espectros foi obtido para cada grupo experimental: PPV+, PCV2+ e controle negativo (NC). O ajuste teórico dos espectros obtidos foi realizado para o cálculo da Razão de Intensidade de Pico (PIR), a partir da qual os biomarcadores foram identificados. Os biomarcadores que separaram com precisão os três grupos foram, dos mais impactantes aos menos: ácidos nucleicos, proteínas e Arginina, enquanto os biomarcadores de infecção, i. e., picos capazes de diferenciar o controle negativo (NC) contra outros grupos foram principalmente proteínas. Curiosamente, o PPV apresentou resultados de assinaturas específicas, sendo lipídios e ácidos nucleicos os mais impactantes, embora também proteínas. Esses resultados contribuíram para a construção de bases promissoras para a aplicação de RMS em ciências biomédicas, como uma abordagem diagnóstica alternativa.
Palavras-chave: PPV, PCV2, impressões digitais, biomarcadores, SMEDI, PWMS.
ABSTRACT
GOGONE, Izabel C. V. P. Applicability of Raman micro spectroscopy for viral reproductive failure. 2021. 84 p. Thesis (Master’s Degree in Animal Science - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Dois Vizinhos, 2021).
Of great relevance for preventive veterinary medicine, porcine parvovirus (PPV) is one of the major infectious causes of reproductive failure in swine, responsible for important economic losses, specially along with Porcine Circovirus type 2 (PCV2). To date, the most useful detection tool is PCR-based, which is quite sensitive and specific, but laborious, costly and time-demanding. Moreover, the recent pandemic has shown how much public health demands innovative and simple diagnostic strategies that are more suitable for large scale applications. Our goal was to identify molecular biomarkers of PPV or PCV2 infection by Raman Microspectroscopy (RMS), in order to strength the Raman database and to contribute to its application on viral diagnostic worldwide. For this intent, swine testis (ST) cells were inoculated with PPV or PCV2 and in vitro cultured (37 ºC, 5% CO2) for four days. Fixed cells were then subdjected to RMS investigation using a 633 nm laser. A total of 225 spectra was obtained for each experimental group (PPV+, PCV2+ and negative control). Theoretical fitting of obtained spectra was performed for Peak Intensity Ratios (PIR) calculation, from which biomarkers were derived. Biomarkers which accurately separated all three groups were, from the most to the least impactful: nucleic acids, proteins and Arginine, while infection biomarkers, i. e., peaks able to differentiate negative control (NC) against other groups were mostly proteins. Interestingly, PPV show specific biomarkers assignments, being lipids and nucleic acids the most impactful ones, although proteins too. These results built a promising bases for RMS, as an alternative diagnostic approach for biomedical applications.
Keywords: PPV, PCV2, fingerprints, biomarkers, SMEDI, PMWS.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - C. V. Raman ............................................................................................. 17
Figura 2 - Espalhamentos elásticos (Rayleigh) e inelásticos (Raman) ilustrados. .... 19
Figura 3 - Capsídeo viral do PPV .............................................................................. 22
Figura 4 - Partícula pseudoviral de PCV2 ................................................................. 27
Figura 5 - Ilustração esquemática de um espectroscópio Raman associado ao microscópio confocal, semelhante ao modelo utilizado no presente experimento. ... 33
Figura 6 - Imagem obtida das amostras através do microscópio do equipamento (hotspot) para seleção dos pontos de aquisição de espectros. ................................. 34
Figura 7 – Média de 225 espectros por grupo amostral: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). O SE é representado pela área de menor opacidade ao redor das médias. ...................................................................................................... 37
Figura 8 - Modelo de análise multivariada PCA-LDA apresentando clara separação entre os três grupos experimentais: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). . 38
Figura 9 – Loadings relativos a cada uma das três PCs mais importantes, sendo: (A) PC1 (loading 1 – vermelho), (B) PC2 (loading 2- azul) e (C) PC3 (loading 3 – verde). .................................................................................................................................. 39
Figura 10 - PIR 1583 – Fenilalanina (Phe) ................................................................ 47
Figura 11 - PIR 1398 – Proteínas .............................................................................. 47
Figura 12 - PIR 894 – Ácidos Nucleicos e Proteínas ................................................. 48
Figura 13 - PIR 1669 – Lipídios, Proteínas e Ácidos Nucleicos. ............................... 48
Figura 14 - PIR 1101 – Ácidos Nucleicos .................................................................. 49
Figura 15 - PIR 1154 – Proteínas .............................................................................. 49
Figura 16 - PIR 985 – Proteínas e Arginina (Arg). ..................................................... 50
Figura 17 - PIR 937 – Proteínas ................................................................................ 52
Figura 18 - PIR 1554 – Amida III e Triptofano (Try) .................................................. 52
Figura 19 - PIR 1300 – Lipídios ................................................................................. 53
Figura 20 - PIR 1316 – Ácidos Nucleicos .................................................................. 54
Figura 21 - PIR 1336 – Ácidos Nucleicos .................................................................. 54
Figura 22 - PIR 1171 – Proteínas .............................................................................. 55
Figura 23 - PIR 757 – Proteínas. ............................................................................... 55
Figura 24 - PIR 1481 – Proteínas .............................................................................. 56
Figura 25 - PIR 1654 – Lipídios e Proteínas ............................................................. 56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Matriz de confusão de LOOCV do modelo analítico PCA-LDA, para a discriminação de espectros Raman obtidos de células infectadas com PPV ou PCV2, além do NC. .............................................................................................................. 38
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1 ....................... 40
LISTA DE ABREVIATURAS
aa Aminoácido
Arg Arginina
Cap Proteína de capsídeo
cm Centímetros
DAg Deformação angular
DAx Deformação axial
x g Força centrífuga relativa
He-Ne Hélio-Neônio
Kb Quilo pares de bases
min Minutos
mm Milímetros
mRNA RNA mensageiro
mW Miliwatts
nm Nanômetro
ºC Graus Celsius
Phe Fenilalanina
PLA2 Fosfolipase A2
RBm Modo de breathing do anel
Rep Replicase não estrutural
Se Sensibilidade
Sp Especificidade
Try Triptofano
Tyr Tirosina
v/v Proporção volume : volume
α Alfa
β Beta
μL Microlitro
LISTA DE SIGLAS
10FCV Validação cruzada 10-fold
DNA Ácido dessoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FWHM Largura a meia altura
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
LDA Análise de Discriminantes Lineares
LOOCV Validação cruzada leave-one-out
NA Abertura da lente
NC Controle negativo
NS1 Proteína não estrutural 1
NS2 Proteína não estrutural 2
ORF Fase de leitura aberta
PBS Tampão fosfato salino
PC Componente principal
PCA Análise de Componentes Principais
PCR Reação em cadeia pela polimerase
PCV2 Circovírus suíno tipo 2
PPV Parvovírus suíno tipo 1 ou Ungulate protoparvovirus 1
RMS Microespectroscopia Raman
RNA Ácido ribonucleico
RPA Amplificação pela polimerase da recombinase
RPMI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SDMS Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados
SDN Síndrome da Dermatite Nefropatia
SE Erro padrão
SFB Soro fetal bovino
ST Linhagem de cultivo celular proveniente de testículo suíno
VP1 Proteína viral 1
VP2 Proteína viral 2
VP3 Proteína viral 3
LISTA DE ACRÔNIMOS
SMEDI Natimortalidade, mumificação fetal, morte embrionária e infertilidade
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
LAMP Amplificação isotérmica mediada por Loop
PIR Razão de Intensidades dos picos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................13
2 HIPÓTESES E OBJETIVOS ................................................................................15
2.1 HIPÓTESES .....................................................................................................15
2.2 OBJETIVOS ......................................................................................................15
3 DESENVOLVIMENTO ..........................................................................................16
3.1 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................16
3.1.1 Espectroscopia Raman ...................................................................................16
3.1.2 Parvovirose suína ...........................................................................................21
3.1.3 Circovirose suína ............................................................................................25
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................30
3.2.1 Delineamento experimental ............................................................................30
3.2.2 Produção de Amostras ...................................................................................30
3.2.3 Espectroscopia Raman ...................................................................................32
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................36
3.3.1 Resultados da análise estatística (PCA-LDA) .................................................36
3.3.2 Biomarcadores gerais .....................................................................................46
3.3.3 Biomarcadores específicos: infecção viral ......................................................51
3.3.4 Biomarcadores específicos: PPV ....................................................................53
4 CONCLUSÕES ....................................................................................................57
REFERÊNCIAS .......................................................................................................58
APÊNDICE A - Teste de Permutação ...................................................................73
APÊNDICE B - PIRs de menor impacto ...............................................................75
13
1 INTRODUÇÃO
A segurança alimentar da população mundial, em consonância com práticas
sustentáveis de produção, é um dos grandes desafios para os próximos anos, em
especial considerando as previsões de crescimento demográfico global, capaz de
superar os 9 bilhões de pessoas até 2050, e 11 bilhões até o final do século (FAO,
2017). Nesse ritmo, seria necessário aumentar a produção mundial de alimentos em
torno de 70% até a metade do século XXI para garantir o acesso a todos os indivíduos
(FAO, 2009). Como resposta, a sociedade exerce pressões crescentes de demanda
para a produção de alimentos, em especial nos últimos 40 anos (MONTAGNESE et
al., 2019).
Na pecuária, a cadeia de suínos destaca-se como importante alternativa de
fonte de proteína animal, tendo em vista sua viabilidade econômica ímpar, graças às
altas taxas de conversão alimentar e prolificidade, além do ciclo de vida curto,
alavancadas principalmente pela criação intensiva (AFOLABI et al., 2019),
determinante para que o Brasil se insira entre os quatro maiores produtores e
exportadores mundiais de suínos, destacando-se o estado do Paraná como o 2º maior
produtor nacional (ABPA, 2020).
A criação intensiva propicia incremento na produção necessária às demandas
do mercado mundial, entretanto gera importantes desafios sanitários e relativos ao
bem-estar animal, uma vez que se baseia em alta densidade populacional (e, portanto,
de indivíduos suscetíveis) e, consequentemente, maior probabilidade de contatos
infecciosos, além de ambientes propícios à manutenção de patógenos
(MONTAGNESE et al., 2019).
Tanto a intensificação da produção como a globalização do comércio de
suínos expõem a importância do controle de doenças infecciosas, uma vez que
representam importante gargalo para o avanço da produtividade da suinocultura, além
de apresentarem recentes mudanças no perfil epidemiológico com crescente ênfase
para enfermidades virais e multifatoriais (BRUM et al., 2013; ZANELLA; MORÉS; DE
BARCELLOS, 2016). Dentre os vários agentes infecciosos que interferem direta e
indiretamente sobre o desempenho reprodutivo de suínos, destacam-se o parvovírus
suíno tipo 1 clássico (PPV) ou, mais recentemente denominado Ungulate
protoparvovirus 1, assim como o Circovírus suíno tipo 2 (PCV2), amplamente
14
dispersos pelas granjas do mundo todo (AFOLABI et al., 2019; COTMORE et al., 2019;
OPRIESSNIG et al., 2020).
A detecção rápida de agentes infecciosos é determinante para a
implementação de medidas de contenção e, portanto, para o controle do foco; a
importância da questão torna-se evidente com relação às doenças transfronteiriças e
ao comércio internacional (CHOMEL, 2003; YEH et al., 2020)
Atualmente, técnicas baseadas na reação em cadeia pela polimerase (PCR),
seja através da metodologia convencional e da quantitativa, são largamente utilizadas
para o diagnóstico de parvovirose e circovirose suínas. Embora sejam sensíveis e
específicas, apresentam algumas desvantagens como protocolos complexos de
extração e necessidade de profissionais altamente treinados para sua condução
(MÉSZÁROS et al., 2017; PISSUWAN et al., 2020). Em linhas gerais, apesar dos
grandes avanços em estratégias diagnósticas de patógenos, gargalos como estes,
além de exigências em infraestrutura, por exemplo, levam a comunidade científica a
explorar continuamente ferramentas inovadoras, especialmente para atender
demandas em saúde pública, como a recente pandemia por Sars-CoV-2 (DESAI et
al., 2020; YEH et al., 2020).
O presente trabalho pretende colaborar nesse esforço conjunto, oferecendo
subsídios para aplicação da espectroscopia Raman para o diagnóstico de mais dois
agentes virais.
15
2 HIPÓTESES E OBJETIVOS
2.1 HIPÓTESES
Os dados obtidos na espectroscopia Raman permitem a diferenciação entre
culturas de células de testículo suíno inoculadas com PPV ou PCV2 e células sem
inóculo, ou seja, o sistema consegue detectar a infecção viral inespecífica.
Os dados obtidos na espectroscopia Raman permitem a diferenciação entre
os três grupos amostrais: células inoculadas com PPV, células inoculadas com PCV2
e células livres de inóculo, refletindo os testes de PCR.
2.2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Obter dados iniciais que fundamentem a utilização de espectroscopia Raman
como ferramenta diagnóstica para detecção de PPV ou PCV2 em amostras biológicas.
Objetivos específicos
Avaliar se os dados obtidos através da espectroscopia Raman diferem
quantitativamente entre os grupos amostrais, quais sejam (1) células inoculadas com
PPV; (2) células inoculadas com PCV2; e (3) células sem inóculo, refletindo os
resultados obtidos no teste padrão ouro, PCR.
Calcular Sensibilidade e Especificidade do teste diagnóstico para PPV e para
PCV2.
Avaliar se é possível identificar picos característicos para células inoculadas
com PPV ou PCV2, a fim de verificar se cada vírus oferece um padrão de leitura
específico (biomarcadores).
16
3 DESENVOLVIMENTO
Espera-se, com o presente trabalho, demonstrar a relevância da inovação em
métodos diagnósticos alternativos para parvovirose e circovirose suínas - e
potencialmente para outras doenças infecciosas, a partir de técnicas idealmente mais
rápidas, acuradas e simples.
A tecnologia de espectroscopia Raman oferece oportunidades promissoras
para essa finalidade e vem se provando como uma ferramenta poderosa para
pesquisa e diagnóstico em virologia (MOOR et al., 2013). Maiores detalhes sobre a
técnica, além de minucioso levantamento bibliográfico acerca das enfermidades em
questão seguem abaixo.
3.1 REVISÃO DE LITERATURA
3.1.1 Espectroscopia Raman
O fenômeno vibracional que receberia o nome de seu descobridor, Sir
Chandrasekhra Venkata Raman (Figura 1), foi descrito primeiramente em 1928
(FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003). Apenas nas décadas de 60 e 70 houve
registro da aplicação da técnica para estudo de ácidos nucleicos e virologia
(NĚMEČEK; THOMAS, 2009; THOMAS, 1976), ainda que a iniciativa de testar o
fenômeno para pesquisas nas áreas biológicas tenha sido discutida algumas décadas
antes (BLOUT; MELLORS, 1949; JIN; ZHANG; MARTIN, 2017). Todavia, foi no século
XXI que a combinação entre a microscopia e o desenvolvimento de abordagens
correlatas permitiram a aplicação em larga escala para ciências biomédicas
(ANDRYUKOV et al., 2019).
17
(BOHNING; MISRA; CHOUDHURY, 1998)
Em termos teóricos, é preciso estabelecer inicialmente alguns conceitos, que
são básicos para a interpretação das informações espectrais obtidas através da
espectroscopia Raman. Na ondulatória, a distância entre dois padrões idênticos que
se repetem em uma onda é denominada comprimento de onda (wavelength) (λ),
enquanto a frequência (frequency) (ν) significa o número repetições por unidade de
tempo. Levando em conta que a espectroscopia Raman se baseia no espalhamento
inelástico da luz, uma onda eletromagnética, e que está em velocidade c
(3,0 x 108 m/s), a frequência pode ser escrita como:
𝜈 = 𝑐
𝜆 (1)
Um outro conceito essencial é o do número de onda (wavenumber) (ṽ), cuja
unidade de medida é 1/cm ou simplesmente cm-1, definido pela equação:
(2)
Figura 1 - C. V. Raman
Fonte: Bohning, Misra & Choudhury (1998)
18
Assim, fica clara a diferença conceitual entre frequência (ν) e número de onda
(ṽ).
ν =𝑐
𝜆= 𝑐
1
𝜆= 𝑐ṽ (3)
Além disso, é preciso pontuar, por fim, a relação de interação entre moléculas
e energia do campo eletromagnético associado à luz, a chamada Condição de
Frequência de Bohr, na qual ΔE é a variação de energia entre dois estados quânticos
possíveis, h é a constante de Planck (6,62 x 10-34 m2 kg/ s) e c a velocidade da luz
(3,0 x 108 m/s), dada por
△ 𝐸 = ℎ𝜈 = ℎ𝑐
𝜆= ℎ𝑐ṽ, (4)
e que, consequentemente, pode se expressa pela equação abaixo, na qual E2
representa um estado excitado da molécula e E1 seu estado fundamental:
Δ𝐸 = 𝐸2 − 𝐸1 = ℎ𝑐ṽ (5)
Ou seja, uma molécula absorverá energia ao passar do estado fundamental
para um estado quântico excitado (de E1 para E2) e emitirá na hipótese inversa. As
magnitudes dessa variação de energia, podem ser detectadas por meio de
espectroscopia, ou seja, essa transição de estados energéticos de moléculas pode
ser detectada pela espectroscopia Raman (FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003).
Do ponto de vista dos pesquisadores em ciências biomédicas, interessa
compreender que o sistema detecta a variação que uma luz incidente sobre uma
amostra sofre. Portanto, se uma onda eletromagnética conhecida incide sobre uma
amostra, parte é refletida, enquanto outra é transmitida da superfície ao conteúdo do
material. Essa porção refletida emergirá da amostra, sendo majoritariamente
composta pela mesma frequência incidente (espalhamento elástico ou Rayleigh),
porém uma pequena proporção da luz espalhada é constituída por frequências
distintas da original (espalhamento inelástico), como consequência da interação com
a vibração das moléculas que formam a amostra, levando-os a estados mais ou
menos excitados, ainda que por um curto período de tempo (Figura 2). Esse fenômeno
19
é o efeito Raman (Raman effect) ou espalhamento Raman (Raman scattering)
(FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003; RODRIGUES; GALZERANI, 2012).
(RENISHAW, 2018a)
Ainda, como detalhado na Figura 2, o espalhamento Raman pode apresentar
dois perfis distintos, com relação à diferença entre a frequências da radiação incidente
(original) e a que emerge da amostra: se houve redução, ou seja, se a frequência que
deixa a amostra (espalhada) é menor do que a incidente, significa que o processo
espalhamento em si absorveu energia (Stoke scattering); por outro lado, se a
frequência da radiação espalhada é maior do que a incidente, o processo de
espalhamento cedeu energia à radiação (Anti-Stokes scattering). Assim, na
espectroscopia Raman, mede-se essa variação na frequência e, consequentemente,
no número de onda (FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003; RODRIGUES;
GALZERANI, 2012).
Portanto, o princípio da técnica consiste na detecção de variações de
frequências vibracionais que são únicas e originadas da interação da radiação com as
moléculas constituintes da amostra, refletindo assim sua composição em termos de
grupos funcionais, ligações entre os átomos e geometria molecular. Moléculas
complexas geram picos tão únicos de captação dessas frequências que são
Figura 2 - Espalhamentos elásticos (Rayleigh) e inelásticos (Raman) ilustrados.
Fonte: Renishaw (2018)
(Stokes)
20
comparados às impressões digitais (MOOR et al., 2013). Assim, os resultados obtidos
da análise fornecem um perfil bioquímico das amostras (NĚMEČEK; THOMAS, 2009).
Trata-se de uma ferramenta não invasiva, comprovadamente capaz de
identificar microrganismos específicos sem a necessidade de métodos de marcação
(tais como fluorescência, radioatividade, reações químicas etc), adaptável para ser
utilizada em diversos estados físicos de amostras; em especial, a água não interfere
na obtenção de dados, uma imensa vantagem para obtenção de informações de
infecção em células vivas de cultivos celulares, por exemplo (NĚMEČEK; THOMAS,
2009).
Resultados promissores já foram obtidos com Adenovirus (FAN et al., 2010;
MOOR et al., 2013, 2014), vírus da Hepatite B e C (CHENG et al., 2020; CUI; ZHOU,
2020; DITTA et al., 2019; KASHIF et al., 2020; KHAN et al., 2019; NASEER et al.,
2019; TONG et al., 2019), Echovirus 1 (RUOKOLA et al., 2014), vírus Influenza (EOM
et al., 2019; XIAO et al., 2019), Norovirus, Parvovirus, Rotavirus (FAN et al., 2010;
LUO et al., 2017), virus da Dengue (AMIN et al., 2017; GAHLAUT et al., 2020; KHAN
et al., 2016), HIV (OTANGE et al., 2019) Herpesvirus e Coronavirus (FAN et al., 2010;
HULEIHEL et al., 2016), inclusive o SARS-CoV-2 (CARVALHO; NOGUEIRA, 2020;
DESAI et al., 2020; MADDALI et al., 2020). A aplicação da espectroscopia Raman em
virologia foi extensivamente revisada há poucos anos (SANTOS et al., 2017).
Ainda, variações da metodologia original para incrementar o sinal a ser
detectado com o equipamento, também vem sendo desenvolvidas, através do
emprego de nano partículas de metais como o ouro ou prata, tais como Tip-enhanced
Raman spectroscopy e Surface-enhanced Raman spectroscopy (KHAN et al., 2016,
2018; LEBEDEV et al., 2016; MOOR et al., 2014; SALMAN et al., 2014; XIAO et al.,
2019).
Até o momento não se tem informação sobre o uso de espectroscopia Raman
para estudo e diagnóstico de vírus de importância reprodutiva em suínos, tais como
PPV e PCV2. Como trata-se de uma metodologia que dispensa processamento
complexo prévio e permite leituras rápidas e precisas de amostras biológicas, sua
aplicação neste contexto pode representar um campo promissor de estudo para
contribuir com o arcabouço de estratégias diagnósticas de forma inovadora e
potencialmente mais acessíveis.
21
3.1.2 Parvovirose suína
Ungulate protoparvovirus 1 (PPV)
PPV é considerado a mais importante causa infecciosa de falha reprodutiva
em suínos de todo o mundo, além de determinante da síndrome SMEDI (do inglês
stillbirth, mummification, embryonic death e infertility para natimortalidade,
mumificação fetal, morte embrionária e infertilidade). Desde sua descoberta no final
dos anos 60, as manifestações clínicas decorrentes da infecção por PPV são um
problema para a cadeia produtiva suína no mundo todo, constituindo-se como um dos
principais e mais comuns agentes relacionados à infertilidade (MÉSZÁROS et al.,
2017; STRECK; CANAL; TRUYEN, 2015), endêmico na maioria dos países
produtores de suínos (AFOLABI et al., 2019). Em fetos mumificados, a frequência de
material genético de PPV encontrada foi de 68%, sendo 45% de co-infecção com
PCV2 (HERDT et al., 2019).
Trata-se de um vírus pequeno, não-envelopado, constituído por capsídeo que
protege o genoma viral, composto por uma única molécula de DNA fita simples com 4
a 6,3 Kb, codificante de cinco proteínas através de splicing alternativo (Figura 3)
(ZIMMERMAN et al., 2019). As proteínas não estruturais NS1 e NS2 atuam na
replicação, particularmente do DNA, enquanto a proteína estrutural VP2 (smaller) é
codificada a partir do splincing alternativo de uma sequência maior, VP1 (larger);
assim, podemos dizer que a sequência codificante de VP2 está inserida no gene VP1.
Uma terceira proteína estrutural, VP3, é obtida após a ação pós-traducional de
proteases em algumas moléculas (ZIMMERMAN et al., 2019). O virion é composto de
60 cópias de proteínas estruturais, sendo 90% de VP2, principal envolvida na resposta
de defesa pelo hospedeiro e, portanto, de suma importância para o desenvolvimento
de profilaxia através de imunobiológicos ou desenvolvimento de testes diagnósticos
(OH et al., 2017; ZIMMERMAN et al., 2019).
(SIMPSON et al., 2002)
22
Até poucos anos atrás, acreditava-se que o PPV era único dentre os
parvovírus a apresentar relativa estabilidade evolutiva, inclusive do ponto de vista de
imunogenicidade e eficácia vacinal (MÉSZÁROS et al., 2017). Estudos recentes
demonstraram que PPV é muito mais geneticamente diverso do que se imaginava,
pois apresenta taxas de mutação análogas às de vírus RNA, de forma semelhante
aos aparentados parvovírus de carnívoros. Particularmente, mutações em VP1/VP2
são preocupantes com relação à eficácia das vacinas disponíveis, desenvolvidas
sobre isolados de décadas atrás (FOERSTER et al., 2016; STRECK; CANAL;
TRUYEN, 2015).
Manifestações clínicas
Do ponto de vista das consequências clínicas, muitos experimentos
demonstraram que a infecção em fêmeas gestantes a qualquer momento antes da
Figura 3 - Capsídeo viral do PPV
Fonte: Simpson et al. (2002)
23
metade da gestação causará falhas reprodutivas - exceto quando os embriões estão
protegidos pela zona pelúcida no período pré-implantação (até 17 dias após
fecundação) - ao passo que infecções fetais após os 70 dias de gestação geram
soroconversão dos fetos, já então imunocompetentes, que nascem clinicamente
saudáveis (KERR et al., 2006; MÉSZÁROS et al., 2017).
Morte embrionária e reabsorção de tecidos moles são as lesões mais
comumente encontradas no início do desenvolvimento fetal; entretanto, depois que os
fetos se tornam imunocompetentes, não há lesões macroscópicas nem
consequências clínicas da infecção, assim como em animais adultos, que podem
atuar como fontes de infecção do vírus (ZIMMERMAN et al., 2019). De fato, suínos
infectados podem excretar PPV desde o 4º dia pós-infecção e mantê-la por pelo
menos 49 dias (MÉSZÁROS et al., 2017).
Métodos diagnósticos
Didaticamente, as técnicas diagnósticas em microbiologia incluem métodos
diretos e indiretos. Os diretos são aqueles nos quais se pesquisa a presença atual do
agente, tais como estruturas morfológicas típicas, antígenos ou material genético.
Esse tipo de técnica favorece a correlação direta entre os achados clínicos e o
possível agente causal, na medida que comprovam a presença do microrganismo no
momento da coleta da amostra. Uma desvantagem desses métodos é que se a
infecção foi debelada pelo hospedeiro, o teste pode oferecer resultado negativo,
mesmo se o quadro foi causado pelo microrganismo. Alguns exemplos desse tipo de
metodologia diagnóstica são a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR),
Imunofluorescência Direta, Imunoperoxidase para detecção de antígenos, dentre
outros (WASHINGTON, 1996).
Técnicas diagnósticas indiretas, por sua vez, são aquelas que pesquisam os
anticorpos produzidos como resposta imune específica do hospedeiro contra a
infecção. Por essa razão, não necessariamente indicam que o processo infecioso
esteja ocorrendo no momento da coleta da amostra – embora a diferenciação entre o
tipo de Imunoglobulina presente, IgM ou IgG possa oferecer maiores informações
sobre o momento da infecção – tendo em vista que esses anticorpos podem durar
meses ou anos como, por exemplo, na proteção explorada através da vacinação. Um
dos exemplos clássicos de diagnóstico indireto é o Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
24
que, embora preciso, é complexo e depende da resposta imune do hospedeiro
(WASHINGTON, 1996).
Os diversos métodos diagnósticos são considerados em termos de dois
parâmetros principais, quais sejam a Sensibilidade e a Especificidade de testes
diagnósticos. A primeira variável determina, em proporção, a capacidade do teste em
detectar o patógeno-alvo na amostra ou, quando esta de fato é positiva, a habilidade
do teste em identificar indivíduos doentes. A Especificidade, por outro lado, determina
também em termos proporcionais a capacidade do teste em identificar corretamente
o indivíduo que, de fato, não está acometido, ou seja, classificar corretamente um
indivíduo como não-doente (PARIKH et al., 2008).
Outrossim, cabe delimitar os conceitos de Sensibilidade e Especificidade
Analíticas, distintos daqueles previamente descritos; neste caso, trata-se da mínima
quantidade amostral capaz de oferecer resultados confiáveis (Sensibilidade Analítica),
ou seja, que o teste detecte a presença do agente e não de qualquer outro
(Especificidade Analítica) (RIBEIRO et al., 2016).
As amostras comumente utilizadas para diagnóstico podem ser de secreções
de origem nasal ou genital, mucosa intestinal, sangue, rins, pulmões, linfonodos e
produtos de abortamentos. Outros métodos moleculares incluem Amplificação
Isotérmica Mediada por Loop (LAMP), um método alternativo à PCR que não depende
de altas temperaturas para desnaturação das fitas complementares de DNA;
nanoPCR, por sua vez, permite o incremento da técnica tradicional com relação à
sensibilidade, especificidade e taxas de extensão através da aplicação de nano
materiais mimetizando a ação de biomoléculas; amplificação pela polimerase da
recombinase (RPA), método oriundo da técnica clássica, cujo objetivo é permitir o
diagnóstico no ponto de cuidado por dispensar o uso de equipamentos elaborados
através de uma abordagem enzimática. Esses métodos, embora bastante sensíveis,
ainda não são atualmente aplicáveis na rotina diagnóstica (ABUKHALID; PASTEY,
2017; MÉSZÁROS et al., 2017; MONTAGNESE et al., 2019; PAN et al., 2012).
Apesar de bem estabelecidos, esses métodos ainda exigem tempo e valores
nem sempre acessíveis ao produtor, deixando uma lacuna em termos de métodos
diagnósticos rápidos, sensíveis, específicos e acessíveis, que recentemente diversos
autores procuram preencher (MONTAGNESE et al., 2019; PFANKUCHE et al., 2018;
WANG et al., 2017, 2019; YANG et al., 2016; YU et al., 2015).
25
Testes capazes de detectar simultaneamente mais de um agente são
particularmente interessantes, tais como multiplex-PCR, considerando que as co-
infecções são uma realidade em granjas suínas (ZHENG et al., 2018);
particularmente, parece bem estabelecida na literatura a relação associativa positiva
entre a infecção por PPV e PCV2 na conformação de desordens reprodutivas
(OUYANG et al., 2019; SEGALÉS, 2012). Foi sugerido que PPV seja capaz de facilitar
a infecção por circovírus, em razão das consequências de sua própria replicação no
sistema de defesa do hospedeiro ou, ainda, por incrementar a replicação viral através
de ativação celular no hospedeiro (MÉSZÁROS et al., 2017).
Profilaxia
As vacinas inativadas utilizadas atualmente são baseadas na estirpe NADL-2
ou similares; são bastante eficazes contra infecções homólogas, isto é, pela mesma
estirpe utilizada na vacina, mas não oferece proteção cruzada (contra a estirpe 27,
por exemplo) (MÉSZÁROS et al., 2017). Ainda que as vacinas vivas ou de vetores
sejam propostas promissoras, as questões éticas e legais envolvidas - por exemplo,
para obter a licença de manuseio de organismos geneticamente modificados - ainda
impedem que se tornem mais amplamente utilizadas. Além disso, falhas vacinais e a
dispersão através de populações não submetidas a profilaxia (tais como suínos ferais
ou fauna silvestre) representam importante fonte de variabilidade fenotípica,
destacando a importância de detecção rápida do vírus (MÉSZÁROS et al., 2017).
3.1.3 Circovirose suína
Circovírus suíno tipo 2 (PCV2)
PCV2 é conhecido como um patógeno viral universal, dada a sua presença
ubíqua em granjas suínas por todo o mundo, cuja soroprevalência pode chegar a 80%
(AFOLABI et al., 2017). Cerca de 98% das granjas americanas são positivas para
PCV2, e taxas semelhantes são descritas por todo o mundo; uma possível explicação
para a frequência altíssima é a capacidade do agente de manter infecções
persistentes, além da alta capacidade de viabilidade ambiental (SHEN; HALBUR;
OPRIESSNIG, 2012; SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY, 2015). A mortalidade
26
pode variar entre 3 a 10% e a taxa de descarte pode chegar a 40% (AFOLABI et al.,
2017). Há relato de frequência de 87% de PCV2 em fetos suínos mumificados, no Sul
do Brasil (HERDT et al., 2019).
Menor vírus relatado em animais, o PCV2 apresenta virion composto de
capsídeo não envelopado de morfologia icosaédrica, composta por 60 proteínas de
capsídeo. O DNA simples e circular apresenta 1767 a 1768 nucleotídeos (AFOLABI
et al., 2017; KLAUMANN et al., 2018; ZIMMERMAN et al., 2019) (Figura 4) . Postula-
se que a replicação viral seja dependente de proteínas expressadas na fase S do ciclo
celular, e por isso células com altas taxas de divisão celular seriam os principais alvos.
Após a penetração na célula hospedeira, o genoma consolida sua forma genômica
replicativa, apresentando conformação de dupla-hélice. São conhecidas 11 regiões
codificantes (ORF, do inglês open reading frame), sendo apenas 3 conhecidas por
expressar proteínas descritas: ORF1 (gene Rep), única na fita senso, é responsável
pela expressão de suas replicases não estruturais, Rep e Rep', importantes no
processo de replicação viral e a mais conservada entre os genótipos conhecidos;
ORF2 (gene Cap) expressa a única proteína do capsídeo viral (Cap); e ORF3, que por
sua vez codifica uma proteína estrutural de 105 aminoácidos capaz de induzir
apoptose celular in vitro, determinante para virulência do agente (ZIMMERMAN et al.,
2019). Por ser a linha de frente no reconhecimento imunológico do agente pelo
hospedeiro, a proteína Cap é o principal alvo para desenvolvimento de
imunobiológicos e ferramentas diagnósticas (SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY,
2015).
(MO et al., 2019)
Desde que foi descrito na década de 90, observa-se que PCV2 está em
dinâmico processo evolutivo e atualmente pelo menos cinco genótipos já foram
descritos, dos quais PCV2a, 2b e 2d foram correlacionados com manifestações
clínicas em suínos. A co-infecção entre os genótipos não só é possível como pode ser
fonte da variabilidade genética em razão de fenômenos de recombinação entre eles,
assim como a co-infecção com outros agentes pode impor pressões de seleção e
consequentemente variabilidade (AFOLABI et al., 2017; FRANZO; SEGALÉS, 2018;
SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY, 2015).
27
Manifestações clínicas
A maior parte das infecções cursa com manifestações subclínicas, ou seja,
que cursa sem sinais evidentes da infecção; porém, além das conhecidas
consequências reprodutivas, diversos quadros foram relacionados à infecção por
PCV2, sendo a Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados
(SDMS) e a Síndrome da Dermatite e da Nefropatia (SDN) as mais bem estabelecidos
na literatura (AFOLABI et al., 2017; OUYANG et al., 2019; SEGALÉS, 2012).
SDMS é mais comum em animais de 2 a 4 meses de idade, como resultado
da combinação de altas taxas de excreção viral, viremia intensa e baixa resposta
humoral. A morbidade varia de 4 a 30% mas pode alcançar até 60% e a mortalidade
varia de 4% a 20%. O quadro clínico é caracterizado por palidez, angústia respiratória,
Figura 4 - Partícula pseudoviral de PCV2
Fonte: Mo et al. (2019)
28
diarreia e ocasionalmente icterícia, podendo levar a descarte de animais
(ZIMMERMAN et al., 2019).
SDN acomete animais na creche, em crescimento e animais adultos. A
prevalência em geral é baixa; contudo, a mortalidade aumenta com o desenvolvimento
e pode chegar a 100% em animais com mais de 3 meses. Situações agudas levam o
indivíduo a óbito em poucos dias ou, em caso de recuperação, esta começa a ser
observada em 7 dias após início dos sintomas. Leitões acometidos apresentam
anorexia, depressão e pouca ou nenhuma febre e andar rígido assim como máculas
e pápulas difusas (ZIMMERMAN et al., 2019).
O contato direto é o mecanismo mais efetivo para a transmissão do vírus; a
maioria dos leitões se infecta entre 4 a 11 semanas de vida e, embora uma baixa
percentagem de fêmeas e leitões apresentem-se virêmicos durante a lactação, essa
via de transmissão é possível, assim como a transmissão sexual, tendo em vista que
o sêmen pode conter o vírus. Há relatos de que o DNA viral foi obtido após 125 dias
da infecção experimental, demonstrando o potencial de manutenção da fonte de
infecção. A campo, a viremia pode chegar a 22 semanas (SSEMADAALI; ILHA;
RAMAMOORTHY, 2015; ZIMMERMAN et al., 2019).
A suscetibilidade dos embriões suínos ao PCV2 varia segundo o estágio de
desenvolvimento gestacional. A inoculação direta experimental em fetos com 57 dias
de gestação desencadeou mumificação - inclusive de indivíduos adjacentes que não
haviam sido inoculados -, enquanto a infecção aos 75 dias foi associada à
natimortalidade. Todavia, a infecção experimental aos 92 dias de gestação parece não
causar nenhum efeito clínico detectável (ZIMMERMAN et al., 2019).
Ressalte-se que a placenta suína é do tipo epiteliocorial difusa, isto é, o
epitélio coriônico e o endotélio são preservados, resultado em seis camadas de tecido
que separam completamente a circulação materna da fetal. Essas camadas são tão
justapostas que sequer permitem a passagem de moléculas como anticorpos. Os
vírus podem ser encontrados em cardiomiócitos, hepatócitos e células da linhagem
de macrófagos e monócitos. Particularmente o coração contém os mais altos títulos
virais e é possível identificar lesões semelhantes a miocardite (ZIMMERMAN et al.,
2019). Abortamentos na fase final da gestação e natimortalidade com evidente
hipertrofia do miocárdio fetal são indicativos para a suspeita de circovirose suína.
Lesões compatíveis com miocardite fibrótica ou necrótica devem ser amostradas para
29
confirmação da presença do agente ou de seu material genético (ZIMMERMAN et al.,
2019).
Métodos diagnósticos
Testes diagnósticos podem ser processados em amostras de tecidos
linfoides, assim como fígado, pulmões, rins ou intestino; porém, em razão do perfil
ubíquo do agente, métodos indiretos podem gerar erros de interpretação, uma vez
que é altamente provável que os animais sejam soropositivos. Nesse sentido, o
padrão ouro para diagnóstico de doença reprodutiva associada a circovirose é a
detecção de antígeno ou material genético do vírus em quantidades que variem de
moderada a alta, através de técnicas como PCR, exame histopatológico, Hibridização
in situ e Imunohistoquímica (AFOLABI et al., 2017). Embora essas técnicas venham
se tornando mais comuns e baratas ao longo do tempo, ainda estão inacessíveis ao
produtor.
Profilaxia
Todas as vacinas disponíveis - inativadas ou recombinantes - se baseiam nos
genótipos PCV2-2a e/ou PCV2-2b e seu emprego nos protocolos vacinais tem sido
considerado bem-sucedido. Entretanto, estudos vêm demonstrando mudanças na
epidemiologia molecular do agente, alterações dos genótipos predominantes e
mesmo a emergência de novos - decorrentes de mutações, recombinação ou diversos
mecanismos de pressão de seleção - o que pode comprometer a eficácia vacinal
(AFOLABI et al., 2017; OPRIESSNIG et al., 2013; SSEMADAALI; ILHA;
RAMAMOORTHY, 2015). Embora não evite a infecção ou impeça a disseminação, a
profilaxia através de vacinas propicia redução da carga contaminante excretada pela
infectado, reduzindo a contaminação ambiental (AFOLABI et al., 2017).
Readequações de manejo vacinal podem, inclusive, ser necessárias para prover
imunidade à fêmea prenhe, no intuito de que a imunização passiva através da lactação
seja efetiva (HERDT et al., 2019).
O uso de vacinas desenvolvidas sobre a estirpe 2a parece ter desencadeado
uma mudança no padrão epidemiológico dos isolados, associado a um drift genotípico
30
- PCV2a substituída por 2b -, relacionado com maior intensidade (KARUPPANNAN;
OPRIESSNIG, 2017).
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção inclui a descrição pormenorizada dos procedimentos que
permitiram a obtenção dos dados, de modo que possam ser integralmente
reproduzidas futuramente.
Inclui tanto o preparo controlado das amostras de células inoculadas com PPV
ou PCV2, como todo o processo de aquisição dos espectros, pré-processamento dos
dados brutos, validação estatística dos resultados obtidos através de análise
multivariada e cálculo das razões de intensidade entre os picos (PIR), com vistas à
obtenção de biomarcadores específicos.
3.2.1 Delineamento experimental
Para a amostragem, desenhou-se um experimento com duração de cinco dias
incluindo a semeadura de cultivos celulares e inoculação das estirpes, separadamente
(dia 0); manutenção das placas (dias 1 a 3); sincronização do ciclo celular (dia 4); e
fixação e coleta de amostras celulares (dia 5).
Para garantir quantidade de células suficientes para análise e backup caso
repetições fossem necessárias, utilizaram-se placas de 6 poços para o experimento,
em que cada poço representava uma unidade amostral (replicata), e o conjunto de
três poços representa o grupo amostral (triplicata).
3.2.2 Produção de Amostras
Estirpes virais
O inóculo de PPV (101/18 e BRMSA 2341) foi isolado em 2018 a partir de
fetos mumificados oriundos de uma granja produtora de suínos, localizada em Rio
Verde, Goiás, Brasil. Já o inóculo de PCV2 (303/12 e BRMSA 01351) foi isolado em
2012, a partir de amostras de animais que apresentaram quadro clínico compatível
com a Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados, provenientes
31
de uma fazenda em Caibi, Santa Catarina, Brasil, o qual se demonstrou pertencer ao
genótipo 2b do PCV2Ambos isolados passaram por confirmação etiológica a partir de
sequenciamento genético (números de acesso MT812690 e KT719404,
respectivamente) (GAVA et al., 2018).
Replicação in vitro
Para replicação in vitro foram utilizadas células estabelecidas da linhagem de
testículo suíno (ST, do inglês Swine Testis), cultivadas em placas de seis poços
(confluência aproximada de 50%), contendo 3mL de meio de cultura para células
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Thermo Fischer®) suplementado com 10%
(v/v) de Soro Fetal Bovino (SFB).
Assim, para o preparo das amostras de células infectadas com PPV, foram
adicionados 500 µL de inóculo em cada poço com células estabelecidas, em triplicata,
ao primeiro dia do experimento, enquanto os três poços restantes da placa foram
utilizados como controle negativo (NC), ou seja, o cultivo celular sem inóculo.
Da mesma forma, foram adicionados 500 µL de inóculo de PCV2 a cada um
dos três poços de uma segunda placa, para preparo das amostras. Entretanto, tendo
em vista o requerimento particular para cultivo in vitro de PCV2 (TISCHER et al., 1987;
YANG et al., 2013), foram adicionados 500 µL de D-Glucosamina (Sigma®), no
primeiro e no quarto dias do experimento.
Após 1h de adsorção as placas foram incubadas em estufa (37 ºC, 5 % de
CO2, em umidade saturada), durante todo o experimento (cinco dias).
Para evitar potenciais vieses decorrentes de fases distintas do ciclo celular
nos espectros Raman coletados, ao final do quinto dia todas as amostras foram
submetidas à sincronização do ciclo celular, seguindo protocolo de depleção de SFB
(a 0,5 %) por 24h, o que, associado à confluência celular, permite eficiência no
processo de sincronização com mínimo dano ao material genético e evita morte
celular (BARROS et al., 2010).
Fixação e coleta das amostras
A coleta das amostras celulares foi realizada no quinto dia do experimento e,
para tanto, adicionaram-se 500 µL de solução composta de tripsina a 2 % (v/v) e ácido
32
etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 0,25 % (v/v) em tampão fosfato salino (PBS), em
temperatura ambiente, até que o desprendimento celular fosse macroscopicamente
detectável, quando se adicionou 1,5 mL de RPMI suplementado com SFB na
proporção de 10 % (v/v), para bloqueio da tripsinização.
As células foram, então, submetidas à centrifugação a frio (4 ºC), a 1200 x g,
por 4 min, formando precipitados celulares que foram ressuspendidos em 1000 µL de
uma solução de fixação (paraformaldeído 4 % em PBS (v/v)), por 4 min. Procedeu-se,
então, à lavagem para remoção de resíduos da solução fixadora, através de nova
centrifugação a frio, a 1200 x g, por 4 min, com subsequente descarte do
sobrenadante e ressuspensão em 1000 µL de PBS, quando as amostras foram
mantidas sob refrigeração (4-8 ºC), até a coleta dos espectros. Todas as amostras
positivas para PPV e para PCV2, assim como as células não inoculadas (NC), foram
submetidas à confirmação de presença ou ausência dos vírus através de uma técnica
previamente reconhecida pela literatura, atuando como padrão-ouro diagnóstico.
Para detecção de PPV, procedeu-se à extração de DNA através da incubação
(50 ºC, por 1 h) das amostras em solução tampão Cloridrato de
tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) com dodecilsulfato de sódio (SDS) (1%) e
proteinase K (0,5 mg / mL), seguida de associação de fenol com solução de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A amplificação foi realizada através de
nestedPCR e a sequência-alvo foi do gene codificante da proteína não-estrutural NS1,
por ser altamente conservada entre os parvovírus (SOUCIE et al., 2000).
Já para a confirmação de presença ou ausência de PCV2 foi realizada através
de qPCR, utilizando-se probes específicas (TaqMan) marcadas com FAMTM (6-
carboxyfluoresceína) (porção terminal 5’) e TAMRATM (6-carboxytetrametilrodamina)
(terminação 3’), após a extração com kit comercial (Nucleospin®) (OLVERA et al.,
2004).
3.2.3 Espectroscopia Raman
Aquisição dos espectros
33
Como preparo para a coleta de espectros, as amostras foram centrifugadas a
1200 x g, por 4min, à temperatura de 4º C. 5 µL do precipitado resultante foram
submetidos à coleta de espectros por um microespectroscópio Raman (InViaTM
Renishaw®), utilizando-se a objetiva de 50 x (0,75 NA), esquematizado na Figura 5.
(HOLLRICHER, 2018)
Para a excitação das amostras, utilizou se 100 % da potência de radiação de
um laser de He-Ne com 633 nm de comprimento de onda (espectro visível), ou seja
15 mW na saída do laser e 5 mW ao alcançar a amostra (variação esperada,
decorrente de perdas ópticas no trajeto entre a saída do tubo do laser até que o feixe
alcance a amostra). Embora houvesse outra opção de laser para excitação das
amostras (830 nm), optou-se pelo laser vermelho, uma vez que é sabido que a
eficiência do espalhamento Raman é substancialmente inferior em Infravermelho
Próximo (KERR; BYRNE; HENNELLY, 2015) A amplitude da faixa de detecção vai de
600 cm-1 a 1800 cm-1, com centro estático de 1300 cm-1, portanto na região
denominada fingerprint, na qual há prevalência de picos para amostras biológicas
(HASHIMOTO et al., 2019).
Para representar cada grupo experimental (PPV+, PCV2+ e NC) foram
utilizadas 15 células amostrais, com espectros coletados em 5 pontos distintos de
aquisição em cada uma delas, de forma a representá-las sem viés de localização
celular, totalizando 75 espectros por replicata e, portanto, 225 espectros por grupo
amostral (PPV+, PCV2+ e NC) (Figura 6). Cada aquisição corresponde a 5 s de
Figura 5 - Ilustração esquemática de um espectroscópio Raman associado ao microscópio confocal, semelhante ao modelo utilizado no presente experimento.
Fonte: Hollricher (2018)
Amostra
Espectrômetro
34
exposição ao laser, por janela espectral, com um total de 5 acumulações por espectro,
utilizando-se uma rede de difração de 1800 linhas/mm. Os dados espectrais brutos
foram coletados através do pacote WiRETM (RENISHAW, 2018b).
Pré-processamento dos espectros
O pré-processamento dos dados brutos é uma ferramenta para melhorar a
razão entre sinal e ruído (SANTOS et al., 2017), para o que se utilizou o pacote Raman
Tool Set (CANDELORO, 2013), e consistiu em (1) correção quadrática de baseline
sobre o espectro médio, por grupo amostral; (2) normalização do espectro médio, por
grupo amostral, pela área total do gráfico; (3) atenuação de ruídos, smoothing, através
de função spline cúbica com intensidade de 0,5 (em uma escala em que 0 corresponde
a 100 % de atenuação e 1,0 significa nenhuma), no intuito de evitar perda de picos.
Finalmente, para minimizar os efeitos de variação de uma célula para outra, calculou-
se (4) a média espectral por célula (considerando que foram coletados 5 espectros
por unidade celular), através do programa IGOR Pro (WAVEMETRICS INC., 2019).
Figura 6 - Imagem obtida das amostras através do microscópio do equipamento (hotspot) para seleção dos pontos de aquisição de espectros.
Fonte: Autoria própria (2020)
35
Análise estatística
A análise estatística utilizada para o conjunto de dados foi a multivariada,
aplicando-se Análise de Componentes Principais (PCA) associada à Análise de
Discriminantes Lineares (LDA), que permitem o uso da técnica de “machine learning”
para testes e predição. Nesse sistema, a PCA é utilizada como uma redução das
dimensões dos dados de forma não supervisionada; na segunda fase, aplica-se a LDA
nos dados oriundos da primeira fase, no intuito de incrementar a acurácia da predição
(NASEER et al., 2019).
Para avaliar a capacidade de generalização do modelo analítico escolhido, e
portanto, sua acurácia e capacidade de predição, utilizou-se a validação cruzada pelo
método leave-one-out (LOOCV), confirmada posteriormente pelo método 10-fold
cross-validation (10FCV) no qual a permutação do dados foi repetida 1000 vezes para
o cálculo do erro, conforme metodologia descrita anteriormente (LLOYD et al., 2012).
O teste de permutação é um teste de hipóteses no qual não se pressupõe
uma distribuição particular dos dados, portanto os rótulos dos dados (PPV+, PCV2+ e
NC) são aleatoriamente embaralhados entre cada uma das observações, quando são
calculados os valores de acurácia. Essas análises foram conduzidas através da
linguagem livre R (versão 3.3.0) (R CORE TEAM, 2019), em conjunto com o pacote
Machine Learning Toolbox (KOUL; BECCHIO; CAVALLO, 2018).
Ajuste teórico das curvas experimentais
O conjunto de espectros, representados por uma média, por grupo (PPV+,
PCV2+ e NC) dos dados empíricos, previamente submetidos ao pré-processamento,
assim como o seu respectivo erro padrão da média (SE), foram então submetidos ao
ajuste teórico através de funções gaussianas, utilizando para tanto o pacote Multi peak
Fitting do programa IGOR Pro (WAVEMETRICS INC., 2019). Os ajustes teóricos
foram realizados por janela espectral, a partir de regiões selecionadas do espectro
total. A partir desse ajuste teórico, cada pico do espectro médio é descrito a partir de
três parâmetros, quais sejam: largura a meia altura (FWHM), amplitude e localização.
36
Análise das Razões de Intensidade dos Picos (PIR)
A intensidade dos picos é uma medida arbitrária e, portanto, a análise
comparativa entre picos, necessária para se averiguar o impacto na separação dos
grupos amostrais, é realizada de forma relativa, ou seja, na razão entre as
intensidades dos picos (PIR).
A PIR é calculada a partir dos valores de intensidade obtidos no ajuste teórico,
através da divisão do valor de intensidade de cada um dos picos por um deles, de
cada vez, enquanto o grau de incerteza se expressa pela propagação dos respectivos
valores de SE no cálculo da divisão. O conjunto de dados resultante desse processo
é então apresentado graficamente, permitindo conclusões acerca de biomarcadores
moleculares a serem interpretados no curso do presente trabalho.
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados do presente trabalho estão organizados em duas partes. A
primeira contém a validação estatística do modelo, conforme descrito previamente,
composta dos resultados da PCA-LDA. O objetivo dessa primeira seção é demonstrar
que o sistema composto pelos espectros Raman associado à análise multivariada é
capaz de identificar adequadamente os grupos amostrais.
A segunda seção é dedicada à compreensão dos biomarcadores moleculares
encontrados através da análise das PIR, quando os principais picos capazes de
diferenciar adequadamente os grupos amostrais são esmiuçados e interpretados, a
fim de oferecer ferramentas para melhor compreensão dos fenômenos biológicos
decorrentes da infecção por cada um desses agentes.
3.3.1 Resultados da análise estatística (PCA-LDA)
Um total de 225 espectros foram utilizados para calcular um espectro médio
por grupo experimental, gerando, portanto, um respectivo SE (Figura 7).
37
(GOGONE et al., 2021)
A PCA isoladamente não foi capaz de discriminar os grupos experimentais.
Entretanto, a combinação PCA-LDA aplicada ao conjunto dos dados atingiu este
objetivo.
No intuito de evitar sobre-ajuste (overfitting) do modelo teórico aos dados
experimentais, impactando em sua aplicabilidade, foram incluídas apenas seis PCs
(correspondente a 93,73% da variância) para a LDA; portanto, menos da metade do
número de espectros obtidos para cada grupo (CHAN et al., 2009).
O modelo PCA-LCA apresentou clara separação dos grupos experimentais,
conforme se depreende da Figura 8, demonstrando a capacidade do sistema RMS
aliado à PCA-LDA em discriminar células infectadas e não infectadas. Esse resultado
foi validado através de LOOCV e 10FCV, resultando em acurácia de 99,97% e 100%,
respectivamente.
Figura 7 – Média de 225 espectros por grupo amostral: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). O SE é representado pela área de menor opacidade ao redor das médias.
Fonte: Gogone et al. (2021)
38
O teste de permutação resultou em 0,34 de precisão do nível de aleatoriedade
e classificação de acurácia de 1, confirmando que os resultados não são ao acaso
(Apêndice A). Ainda, um p-valor de 0,001 para o nível de confiança para exclusão a
hipótese nula (hipótese de o resultado da separação dos grupos ser obtida ao acaso)
foi obtido para o teste de permutação. Em razão de similaridades, apenas a matriz de
confusão para o teste LOOCV é apresentada na Tabela 1, na qual constam
Especificidade de 100% para ambos os agentes virais testados, além de Sensibilidade
de 95,55 % para PCV2 e 97,77 % para PPV.
Tabela 1 - Matriz de confusão de LOOCV do modelo analítico PCA-LDA, para a discriminação de espectros Raman obtidos de células infectadas com PPV ou PCV2, além do NC.
Diagnóstico previsto
NC PVC2+ PPV+
Res
ult
ad
os
ex
pe
rim
en
tais
NC 45 0 0
PCV2+ 2 43 0
PPV+ 1 0 44
Fonte: Gogone et al. (2021)
Figura 8 - Modelo de análise multivariada PCA-LDA apresentando clara separação entre os três grupos experimentais: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto).
Fonte: Gogone et al. (2021)
39
A três primeiras PCs explicam 80,17 % da variância total entre os grupos
amostrais, sendo 43,02 % decorrente de PC1, 21,67 % de PC2 e 15,48 % de PC3;
por serem as mais importantes, foram investigadas com maior detalhamento a partir
dos respectivos loadings, ou seja, a projeção gráfica quantitativa do impacto individual
de cada pico sobre a variância calculada entre as amostras (Figura 9), levando-se em
consideração as assinaturas espectrais associadas a cada pico, conforme Tabela 2.
Figura 9 – Loadings relativos a cada uma das três PCs mais importantes, sendo: (A) PC1 (loading 1 – vermelho), (B) PC2 (loading 2- azul) e (C) PC3 (loading 3 – verde).
Fonte: Gogone et al. (2021)
40
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1
(continua)
Picos
experimentais
(cm-1)
Dados
literatura
(cm-1)
Assinatura Espectral
745 746 DNA/RNA (RBm de Timina) (CHAN et al., 2006)
757 753-760
Triptofano (modo breathing simétrico) (CHENG et al., 2005;
DUKOR, 2006; GALLER et al., 2014; HANLON et al., 2000;
HUANG et al., 2003b; JARQUÍN-DÍAZ et al., 2019; KAMINAKA et
al., 2002; STONE et al., 2002, 2004; SU et al., 2012)
781 781-786
Citosina (RBm) (CHAN et al., 2006; RUIZ-CHICA et al., 2004;
STONE et al., 2002, 2004)
Uracila (RBm) (NOTINGHER et al., 2004; STONE et al., 2002,
2004)
828 826-831
DNA (DAx assimétrico de O-P-O) (LIU et al., 2008; STONE et al.,
2004)
Ácidos nucleicos (DAx de PO2-) (CHENG et al., 2005;
NOTINGHER et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004)
Grupo fosfato (CHAN et al., 2006; LIU et al., 2008; STONE et al.,
2002, 2004)
851 850
DNA (MOOR et al., 2014)
Tirosina (ressonância de Fermi do anel fundamental and
harmônico) (SHETTY et al., 2006)
876 876 Hidroxiprolina (νC-C) (assinatura proteica) (HUANG et al., 2003b)
DAx de C-C (FRANK; MCCREERY; REDD, 1995)
894 892-896 Desoxirribose (Dang em plano), Fosfodiéster (GAHLAUT et al.,
2020; RUIZ-CHICA et al., 2004)
937 937-938
Carboidratos (C-O-C) (NOTINGHER et al., 2004)
Glicogênio (BINOY et al., 2004)
Proteinas (DAx C-C, α-hélice) (NOTINGHER et al., 2004)
Proteínas (vibrações da cadeia lateral de aa da Proline e
Hidroxiprolina) (CHENG et al., 2005)
959 960 Fosfato (DAx simétrica de PO4-3) (CHENG et al., 2005)
974 974 Ribose (CHAN et al., 2006)
41
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1
(continua)
Picos
experimentais
(cm-1)
Dados
literatura
(cm-1)
Assinatura Espectral
1002 1000-1008
Fenilalanina (RBm simétrico) (BHATTACHARJEE et al., 2014;
BONNIER; BYRNE, 2012; CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;
HUANG et al., 2003a; LAKSHMI et al., 2002; LI et al., 2011; LIU et
al., 2008; MALINI et al., 2006; NAUMANN, 1998; SHETTY et al.,
2006; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et al., 2004)
1031 1030-1033
Fenilalanina (C-H em plano DAg) (CHAN et al., 2006; CHENG et
al., 2005; HUANG et al., 2003b; STONE et al., 2004)
Fosfolipídios (CH2CH3 DAg) (HUANG et al., 2003b)
1064 1064 Lipídios (DAx do esqueleto de C-C) (STONE et al., 2004)
1085
1093
1094
1078-1094
Fosfato (DAx simétrico) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;
GAZI et al., 2003; HUANG et al., 2003b; MOOR et al., 2014)
Fosfodiéster (DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003)
Fosfolipídios (DAx de C-C ou C-O) (HUANG et al., 2003b; MALINI
et al., 2006)
DNA (DAx simétrica de PO2−) (MALINI et al., 2006)
1098 1095-1099
Lipidíos (LASKA; WIDLARZ, 2005)
Proteínas (DAx de C-N) (CHENG et al., 2005)
Ácidos nucleicos (grupo fosfodioxi) (KRAFFT et al., 2005; LIU et
al., 2008)
1101 1095-1105
Lipídios e grupo Fosfodioxi (CHENG et al., 2005; KRAFFT et al.,
2005; LASKA; WIDLARZ, 2005; LIU et al., 2008); Proteínas e
ácidos graxos (LAKSHMI et al., 2002; SHAPIRO et al., 2011;
SHETTY et al., 2006); Fenilalanina (LAKSHMI et al., 2002)
1126 1124-1126
Carboidratos (dissacarídios, sacarose) (SHETTY et al., 2006)
Lipídios (esqueleto do grupo acil) (CHENG et al., 2005)
Proteína (DAx C-N) (CHAN et al., 2006)
1154 1152-1157
Carboidratos, Carotenóides e Proteínas, (CHAN et al., 2006;
DUKOR, 2006; MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM,
1997; NAUMANN, 1998; PUPPELS et al., 1993; RONEN; STIER;
DEGANI, 1990; SILVEIRA et al., 2002; STONE et al., 2002, 2004)
42
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1
(continua)
1171 1168-1176
Lipídios (DUKOR, 2006)
Tirosina (DAg C-H em plano)
(CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b;
LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008; STONE et al., 2002, 2004)
1206 1206-1210
Tirosina (BONNIER; BYRNE, 2012; LAU et al., 2005; STONE et
al., 2004); Triptofano
(BHATTACHARJEE et al., 2014; CHENG et al., 2005; HUANG et
al., 2003b; LAU et al., 2005; LIU et al., 2008; STONE et al., 2002,
2004); Citosina e Guanina (CHAN et al., 2006; CHENG et al.,
2005; LIU et al., 2008; RUIZ-CHICA et al., 2004)
1251 1242-1260
Amida III (BONNIER; BYRNE, 2012; DUKOR, 2006; KAMEMOTO
et al., 2010; LAKSHMI et al., 2002; NAUMANN, 1998; SHETTY et
al., 2006; STONE et al., 2004)
1306 1298-1309
Ácidos graxos (DUKOR, 2006; HUANG et al., 2011; KRAFFT et
al., 2005; SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004)
Lipídios (BHATTACHARJEE et al., 2014; CHENG et al., 2005;
HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008;
NOTINGHER et al., 2004; RONEN; STIER; DEGANI, 1990;
SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004)
Grupo Metileno (DAg proteínas e fosfolípides) (HUANG et al.,
2003a)
Fosfolipídios (HUANG et al., 2003a)
1316 1313-1320 Bases nucleotídicas; Guanina; Proteínas; Amida III (CHAN et al.,
2006; LAKSHMI et al., 2002; RUIZ-CHICA et al., 2004)
1335 1335-1339
Proteínas (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005; HUANG et al.,
2003b; STONE et al., 2004)
Ácidos nucleicos (DAg da cadeia de polinucleotídeos); Adenina e
Guanina (RBm) (HUANG et al., 2003b, 2003a; RUIZ-CHICA et al.,
2004; STONE et al., 2002)
1362 1362 Guanina (RUIZ-CHICA et al., 2004)
1398 1395-1938
DAx simétrico de C=O (Ó FAOLÁIN et al., 2005)
Deformação de CH2 (CHENG et al., 2005)
43
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1
(continua)
1447 1447-1465
Amida I e DAg de CH (proteínas) (CHAN et al., 2006; DUKOR,
2006; LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008; MOOR et al., 2013;
Ó FAOLÁIN et al., 2005)
Lipídios (CHENG et al., 2005; DUKOR, 2006; LIU et al., 2008)
Fosfolipídios (LAU et al., 2005)
Ácidos nucleicos (RUIZ-CHICA et al., 2004)
1481 1480-1484 Amida II (DUKOR, 2006)
1555 1548-1560
Amida II (LAKSHMI et al., 2002; Ó FAOLÁIN et al., 2005)
Triptofano (CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b; LAU et al.,
2005; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004)
1573 1573-1579
Adenina e Guanina (RBm) (CHAN et al., 2006; RUIZ-CHICA et al.,
2004; STONE et al., 2004)
Ácidos nucleicos (DOVBESHKO, 2000; MAHADEVAN-JANSEN;
RICHARDS-KORTUM, 1997; STONE et al., 2002, 2004)
1583 1582-1585
Fenilalanina (DAg e DAx C=C) (HUANG et al., 2003b)(HUANG et
al., 2011; LAU et al., 2003; Ó FAOLÁIN et al., 2005; SAHU et al.,
2013);
DAx de C-C (SHAPIRO et al., 2011)
1605
1614 1590-1623
Amida I (CHAN et al., 2006; DUKOR, 2006; LUO et al., 2017;
SIGURDSSON et al., 2004)
Lipídios (insaturados) (LUO et al., 2017)
Tirosina (DAx de C=C) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;
LAKSHMI et al., 2002; LUO et al., 2017; STONE et al., 2002,
2004)
Triptofano (DAx de C=C) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;
HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al., 2002; NOTINGHER et al.,
2004; STONE et al., 2002, 2004)
44
Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1
(conclusão)
1655
1640-1680 Proteínas (AGARWAL; TANDON; GUPTA, 2006; LAKSHMI et al.,
2002; MALINI et al., 2006; NĚMEČEK; THOMAS, 2009; STONE et
al., 2004)
1652-1659
Amida I (NĚMEČEK; THOMAS, 2009)
Colesterol (SILVEIRA et al., 2002)
Ácidos graxos (DUKOR, 2006; HANLON et al., 2000; SILVEIRA et
al., 2002)
Lipídios (DAx de C=C) (LAKSHMI et al., 2002; RONEN; STIER;
DEGANI, 1990; STONE et al., 2004)
Assim, levando-se em consideração os dados dos loadings e das assinaturas
espectrais, destacam-se bandas de assinaturas de vibração de DNA (745, 828, 851,
876, 1094, 1335 e 1573 cm-1) (BINOY et al., 2004; CHAN et al., 2006; CHENG et al.,
2005; HUANG et al., 2003b, 2003a; LIU et al., 2008; MAHADEVAN-JANSEN;
RICHARDS-KORTUM, 1997; MALINI et al., 2006; MOOR et al., 2014; NOTINGHER
et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004), grupos fosfodiéster dos ácidos nucleicos (1085
cm-1) (DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003), além de deformação axial (DAx) simétrica e
assimétrica de grupamentos fosfato (959 e 1085 cm-1) (CHAN et al., 2006; CHENG et
al., 2005; DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003; HUANG et al., 2003b; MOOR et al., 2014),
impactantes em todos as três PCs, que podem ser relacionadas ao impacto da
vibração viral no ambiente celular.
Em termos gerais, uma consequência comum das infecções virais é uma a
supressão da síntese de ácidos nucleicos do hospedeiro, cuja maquinaria celular é
direcionada à replicação e expressão do genoma viral (MACLACHLAN; DUBOVI,
2011), ainda que diversos genes do hospedeiro suíno se apresentem altamente
expressados quando da infecção por PCV2 (FINSTERBUSCH; MANKERTZ, 2009).
Por sua vez, a capacidade replicativa de PPV é bem reportada na literatura
científica (FERNANDES; BOISVERT; TIJSSEN, 2011) e está intimamente vinculada
ao ciclo da célula hospedeira, em especial com relação à fase S do ciclo celular, uma
Fonte: Gogone et al. (2021)
45
vez que o genoma do PPV não codifica sua própria polimerase, depende, portanto,
da enzima do hospedeiro, redirecionando suas atividades para a multiplicação do
parasita, o que é diretamente relacionado com os eventos patogênicos da história
natural da doença (MACLACHLAN; DUBOVI, 2017).
Na espectroscopia Raman não é possível diferenciar o genoma viral do
celular; ainda assim, considerando que a assinatura espectral 1093 cm-1 (vibração de
fosfato estrutural) exerce um papel importante como marcador de DNA na célula
(CHAN et al., 2006), bem como que possui impacto importante para a variância total,
é possível levantar a hipótese de que o genoma viral tenha impactado sobre as bandas
de DNA, permitindo a diferenciação entre os grupos amostrais.
Como consequência da replicação viral, proteínas são expressadas pela
maquinaria celular (MACLACHLAN; DUBOVI, 2011). Assim, um aumento da atividade
de transcrição do mRNA viral é uma explicação razoável para o pico 974 cm-1, que
corresponde à assinatura espectral de vibração da ribose presente no RNA (CHAN et
al., 2006), com importantes contribuições para todos os loadings.
Além disso, bandas a 1555 e 1655 cm-1 são claramente importantes para a
variância explicada pelos loadings de PCA. O pico 1555 cm-1 apresenta uma diferença
visual entre as intensidades referente a cada um dos grupos amostrais, sendo mais
intensa em amostras positivas para um dos inóculos (Figura 1). Ambas regiões (1555
cm-1 e 1655 cm-1) são associadas às estruturas proteicas secundárias, presentes em
proteínas virais – α-hélice e β-conformação –, assim como assinaturas espectrais de
Amida I (1655 cm-1) e a decomposição de Amida II (1555 cm-1) (LAKSHMI et al., 2002;
NĚMEČEK; THOMAS, 2009; Ó FAOLÁIN et al., 2005). Outros sinais associados a
proteínas são também observadas em 937 cm-1 (CHENG et al., 2005; NOTINGHER
et al., 2004) e 1447 cm-1 (CHAN et al., 2006; Ó FAOLÁIN et al., 2005), conforme se
depreende dos loadings das PC3 e PC2, respectivamente. O pico 1251 cm-1
relacionado com a decomposição da Amida III (NĚMEČEK; THOMAS, 2009), também
exerce importante papel para a separação dos grupos amostrais, conforme se conclui
na análise do loading da PC2.
Outra vibração associada com assinaturas proteicas que influenciou a
discriminação obtida na PCA-LDA inclui o modo breathing (RBm) de aminoácidos
aromáticos como a Fenilalanina (Phe) (1002, 1031 e 1605 cm-1) (CHAN et al., 2006;
CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b; MALINI et al., 2006; STONE et al., 2004),
Tirosina (Tyr) (851, 1171, 1206, 1605 e 1614 cm-1) (BONNIER; BYRNE, 2012; CHENG
46
et al., 2005; LAKSHMI et al., 2002; SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004) e
Triptofano (Try) (757, 1206, 1555 e 1614 cm-1) (CHAN et al., 2006; CHENG et al.,
2005; HUANG et al., 2003b; LAU et al., 2005; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et
al., 2002, 2004).
Ainda que dados obtidos na RMS não possam determinar a origem dos
aminoácidos detectados, e nem todos eles sejam constitutivos de proteínas virais, é
razoável inferir que, ao menos parcialmente, a variância observada é decorrente da
síntese de proteínas virais. Phe e Try aparecem principalmente nos loadings das PC1
e PC2, enquanto Tyr exerce impacto sobre todos os três loadings.
Por fim, a importância das assinaturas espectrais associadas a lipídios se
expressam majoritariamente nos loadings das PC1 e PC2, em especial com as
bandas 1064, 1098, 1126, 1171, 1306, 1447, 1605 e 1655 cm-1, relacionadas às
moléculas C=C e CH2 (modos de vibração de lipídios) (BHATTACHARJEE et al.,
2014; CHENG et al., 2005; DUKOR, 2006; HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al.,
2002; LASKA; WIDLARZ, 2005; LIU et al., 2008; NOTINGHER et al., 2004; RONEN;
STIER; DEGANI, 1990; STONE et al., 2004), sendo este último também associado a
vibrações de colesterol (SILVEIRA et al., 2002). Curiosamente, os fosfolipídios
(bandas a 1031, 1085, 1094, 1306 e 1447 cm-1) (HUANG et al., 2003b, 2003a; LAU et
al., 2005; MALINI et al., 2006) também contribuem com o loading 2.
De fato, a infecção por PPV, assim como para todos os membro da família
Parvoviridae, desencadeiam a cascata de ativação da Fosfolipase A2 de origem da
célula hospedeira, e é determinante para o sucesso da infecção (ZÁDORI et al., 2001).
Essa enzima promove a lise de membranas fosfolipídicas e endossomais, assim como
a liberação de seus ácidos graxos constitutivos (ZÁDORI et al., 2001), expressando o
papel dos lipídios na interação entre o vírus e a célula hospedeira (HEATON;
RANDALL, 2011), o que já foi observado em estudos pioneiros com cultivos celulares
infectados com adenovírus (MOOR et al., 2013).
3.3.2 Biomarcadores gerais
Um dos resultados mais impactantes obtidos através da análise das razões
de intensidade foi o conjunto de biomarcadores capazes de diferenciar corretamente
cada um dos três grupos amostrais, conforme se depreende das Figuras 10-16. A
47
Figura 7, por exemplo, PIR 1583 apresenta graficamente as razões de intensidade de
cada um dos 41 picos em relação à intensidade do pico 1583.
Figura 11 - PIR 1398 – Proteínas
Fonte: Autoria própria
Fonte: Autoria própria (2021)
Figura 10 - PIR 1583 – Fenilalanina (Phe)
A barra de erro corresponde à propagação do SE obtido
Número de onda (cm-1)
Razão d
e inte
nsid
ade d
os p
icos
Fonte: Autoria própria (2021)
48
Figura 12 - PIR 894 – Ácidos Nucleicos e Proteínas
Figura 13 - PIR 1669 – Lipídios, Proteínas e Ácidos Nucleicos.
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
49
Figura 14 - PIR 1101 – Ácidos Nucleicos
Figura 15 - PIR 1154 – Proteínas
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
50
Figura 16 - PIR 985 – Proteínas e Arginina (Arg).
Proteínas foram as principais macromoléculas biológicas para separação dos
grupos amostrais, apresentando-se principalmente como assinaturas de aminoácidos,
tais quais Fenilalanina (1583 e 1101 cm-1), Triptofano (1554 cm-1) e Arginina (985 cm-
1), mas também como grupos funcionais como Amida I (1669 cm-1), Amida II (1554
cm-1) e III (1101 cm-1).
Em infecções por PCV2 a maquinaria celular é desviada para a replicação
viral, iniciando pela expressão das proteínas Rep e Rep’ (produtos da ORF1), ambas
necessárias para a replicação viral através de metodologia específica em razão do
genoma circular, além da expressão da principal proteína de capsídeo, Cap
(CHEUNG, 2006; FINSTERBUSCH; MANKERTZ, 2009).
PPV, por sua vez, demanda a tradução de proteínas estruturais VP1 e VP2,
assim como aquelas não estruturais, NS1 e NS2 (MACLACHLAN; DUBOVI, 2017).
Tendo em vista as diferentes estratégias de replicação utilizadas, que PCV2 apresenta
genoma circular, enquanto PPV apresenta genoma linear, em contraste com células
não infectadas, ajudam a explicar o porquê de proteínas sejam a assinatura espectral
mais importante para a discriminação dos três grupos amostrais.
PIRs obtidas contra Fenilalanina (Phe) (Figura 7) foram as mais relevantes
uma vez que quase todas as razões constitutivas do gráfico apresentaram evidente
separação entre os grupos amostrais. Um possível explicação para esse resultado é
Fonte: Autoria própria (2021)
51
a que Phe é mais demandada pela maquinaria celular na fase de crescimento ativo,
em contraste com a manutenção e sobrevivência (CHOO; COTTON; DANKS, 1976).
Considerando que tanto a replicação tanto de PPV como PCV2 é intimamente
dependente da fase S do ciclo da célula hospedeira (REN; CHEN; OUYANG, 2016;
STRECK; TRUYEN, 2020), é possível inferior que a Phe atue como um biomarcadores
associado à infecção viral.
Em linhas gerais, postula-se que o ambiente interno da célula infectada por
vírus sofra mudanças substanciais em sua composição bioquímica, mas em especial
com relação à Phe (MOOR et al., 2018). Entretanto, entre grupos infectados (PPV ou
PCV2) não está claro o papel desse aminoácido, embora ele tenha a capacidade de
diferenciá-los. Uma hipótese poderia residir nas diferentes estratégias de replicação
observadas entre os agentes, assim como cascatas de sinalização intracelular
decorrentes ou mesmo a sequência de aminoácidos dos produtos traduzidos.
Curiosamente, a Arginina (Arg) (985 cm-1) destacou-se entre os principais
biomarcadores. Uma possível explicação, complementar àquelas sustentadas acima,
se relaciona com a porção terminal da proteína Cap de PCV2, rica desse aminoácido
(mais da metade da composição dos resíduos é de Arg) (DHINDWAL; FENG;
KHAYAT, 2019), em contraste com as concentrações de Arg em NC e PPV.
Finalmente, as assinaturas espectrais associadas ao conteúdo de ácidos
nucleicos também contribuíram marcadamente para a discriminação das amostras,
tais como DNA (1101 cm-1), desoxirribose e grupamentos fosfodiéster (894 cm-1),
assinaturas das bases nitrogenadas Adenina (894 cm-1), Citosina, Guanina e Timina
(1669 cm-1) e grupos fosfodioxi (1101 cm-1). Ainda que a técnica não permita a
distinção entre o genoma do hospedeiro e do parasita, é razoável propor a hipótese
de que as diferenças observadas refletem, ao menos parcialmente, a replicação do
genoma viral (NĚMEČEK; THOMAS, 2009). Além disso, tanto a infecção por PCV2
como por PPV induzem diferentes cascatas de microRNA (LI et al., 2015; REN; CHEN;
OUYANG, 2016) que podem se refletir nesses resultados.
3.3.3 Biomarcadores específicos: infecção viral
Uma segunda habilidade do sistema é diferenciar, em termos genéricos,
células infectadas (PPV+ ou PCV2+) daquelas não infectadas (NC), constituindo,
portanto, marcadores inespecíficos de infecção.
52
Neste estudo, foram obtidos dois desses marcadores de infecção, quais sejam
a assinatura espectral proteicas 937 cm-1 (Figura 17) e a assinatura do pico 1554 cm-
1 (Triptofano / grupo Amida II) (Figura 18). Esses achados são consistentes com dados
prévios, considerando que o espectro de proteínas virais é usualmente um reflexo da
multiplicidade de ligações entre os átomos, além de anéis aromáticos de aminoácidos
presentes em aminoácidos como o próprio Try (NĚMEČEK; THOMAS, 2009).
Figura 17 - PIR 937 – Proteínas
Figura 18 - PIR 1554 – Amida III e Triptofano (Try)
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
53
3.3.4 Biomarcadores específicos: PPV
Ainda, identificaram-se biomarcadores da infecção por PPV, curiosamente
associados a assinaturas espectrais de lipídios (em termos genéricos) ácidos graxos,
fosfolipídios, além de ácidos nucleicos e proteínas (757, 1171, 1300, 1316, 1336, 1481
e 1654 cm-1) (Figuras 19 a 25).
Uma possível explicação da especificidade desses marcadores está no
domínio de Fosfolipase A2 (PLA2) presente na VP2, e não reportada para PCV2, a
qual é determinante para a liberação do virion dos endossomos e vesículas
lisossomais da célula hospedeira, permitindo o acesso ao conteúdo nuclear e,
portanto, à replicação (CANAAN et al., 2004; ZÁDORI et al., 2001)). PLA2
desencadeia digestão enzimática dessas estruturas, liberando as moléculas
constitutivas (lipídios, ácidos graxos e proteínas das membranas fosfolipídicas) no
ambiente intracellular (MÉSZÁROS et al., 2017). Não há registro de qualquer atividade
análoga nas infecções por PCV2.
Figura 19 - PIR 1300 – Lipídios
Fonte: Autoria própria (2021)
54
Figura 20 - PIR 1316 – Ácidos Nucleicos
Figura 21 - PIR 1336 – Ácidos Nucleicos
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
55
Figura 22 - PIR 1171 – Proteínas
Figura 23 - PIR 757 – Proteínas.
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
56
Figura 24 - PIR 1481 – Proteínas
Figura 25 - PIR 1654 – Lipídios e Proteínas
Fonte: Autoria própria (2021)
Fonte: Autoria própria (2021)
57
4 CONCLUSÕES
Ainda que a espectroscopia Raman tenha se mostrado promissora para
estudos e diagnóstico em virologia, sendo aplicada para diversos outros agentes
virais, ainda são se tinham resultados sobre a capacidade de identificar PPV e PCV2.
Para avaliar essa possibilidade, idealizamos e executamos o presente estudo,
obtendo resultados animadores.
O sistema que inclui a coleta de espectros e análise estatística multivariada
(PCA-LDA) mostrou-se não só eficaz como acurado para identificar corretamente a
presença e ausência dos agentes em ambientes complexos, como células.
Mais do que identificar a presença de vírus, inespecificamente, foi possível
obter biomarcadores associados a uma ou outra das estirpes virais utilizadas. Esses
dados podem contribuir com a base de dados da comunidade científica, oferecendo
robustez para aplicação da espectroscopia Raman em rotinas diagnósticas.
Entre as principais vantagens dessa tecnologia estão o baixo custo
operacional, a simplicidade do preparo das amostras e rapidez para obtenção dos
resultados. Ainda que o custo de aquisição inicial do equipamento seja alto, existem
avanços promissores para o desenho de novos equipamentos, mais baratos e mesmo
portáteis (CHIWO; GONZALEZ, 2019; FARBER et al., 2019; GAHLAUT et al., 2020;
GOODING et al., 2017; SORAK et al., 2012).
O presente trabalho, embora desenhado no âmbito da ciência básica,
conseguiu oferecer respostas efetivas sobre a aplicabilidade da espectroscopia
Raman para o diagnóstico de PPV e PCV2, importantes agentes associados às falhas
reprodutivas em suínos, somando-se aos inúmeros trabalhos de aplicação da técnica
para diagnóstico e pesquisa em virologia.
Estudos futuros, porém, são necessários para validar esses achados em
amostras ainda mais complexas como tecidos, por exemplo, a fim de verificar a
capacidade do sistema em detectar estes e outros marcadores virais, o que
fortaleceria a proposta de uso em larga escala dessa ferramenta inovadora.
58
REFERÊNCIAS
ABPA. Relatório Anual. São Paulo. ABUKHALID, Norah; PASTEY, Manoj K. Nucleic Acid Amplification using Recombinase Polymerase: Enzymatic Approach. Journal of Medical Microbiology & Diagnosis, [S. l.], v. 06, n. 01, p. 1–3, 2017. ISSN: 21610703. DOI: 10.4172/2161-0703.1000250. AFOLABI, Kayode O.; IWERIEBOR, Benson C.; OKOH, Anthony I.; OBI, Larry C. Global Status of Porcine circovirus Type 2 and Its Associated Diseases in Sub-Saharan Africa. Advances in Virology, [S. l.], v. 2017, p. 1–16, 2017. ISSN: 1687-8639. DOI: 10.1155/2017/6807964. AFOLABI, Kayode Olayinka; IWERIEBOR, Benson Chuks; OBI, Larry Chikwelu; OKOH, Anthony Ifeanyi. Prevalence of porcine parvoviruses in some South African swine herds with background of porcine circovirus type 2 infection. Acta Tropica, [S. l.], v. 190, n. April 2018, p. 37–44, 2019. ISSN: 0001706X. ISBN: 1873-6254 0001-706X. DOI: 10.1016/j.actatropica.2018.10.010. AGARWAL, Ruchi; TANDON, Poonam; GUPTA, Vishwambhar Dayal. Phonon dispersion in poly(dimethylsilane). Journal of Organometallic Chemistry, [S. l.], v. 691, n. 13, p. 2902–2908, 2006. ISSN: 0022328X. DOI: 10.1016/j.jorganchem.2006.02.032. AMIN, Ayyaz; GHOURI, Nimrah; ALI, Safdar; AHMED, M.; SALEEM, M.; QAZI, Javaria. Identification of new spectral signatures associated with dengue virus infected sera. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.], v. 48, n. 5, p. 705–710, 2017. ISSN: 03770486. DOI: 10.1002/jrs.5110. ANDRYUKOV, B. G.; KARPENKO, A. A.; MATOSOVA, E. V.; LYAPUN, I. N. Raman Spectroscopy as a Modern Diagnostic Technology for Study and Indication of Infectious Agents (Review). Sovremennye tehnologii v medicine, [S. l.], v. 11, n. 4, p. 161, 2019. ISSN: 20764243. DOI: 10.17691/stm2019.11.4.19. BARROS, FRO; GOISSIS, MD; CAETANO, HVA; PAULA-LOPES, FF; PERES, MA; ASSUMPÇÃO, MEOA; VISINTIN, JA. Serum Starvation and Full Confluency for Cell Cycle Synchronization of Domestic Cat ( Felis catus ) Foetal Fibroblasts. Reproduction in Domestic Animals, [S. l.], v. 45, n. 1, p. 38–41, 2010. ISSN: 09366768. DOI: 10.1111/j.1439-0531.2008.01201.x. BHATTACHARJEE, T.; KUMAR, Piyush; MARU, G.; INGLE, A.; KRISHNA, C. Murali. Swiss bare mice: a suitable model for transcutaneous in vivo Raman spectroscopic studies of breast cancer. Lasers in Medical Science, [S. l.], v. 29, n. 1, p. 325–333, 2014. ISSN: 0268-8921. DOI: 10.1007/s10103-013-1347-9. BINOY, J.; ABRAHAM, Jose P.; JOE, I. Hubert; JAYAKUMAR, V. S.; PETTIT, G. R.; NIELSEN, O. F. NIR-FT Raman and FT-IR spectral studies andab initio calculations of the anti-cancer drug combretastatin-A4. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.],
59
v. 35, n. 11, p. 939–946, 2004. ISSN: 0377-0486. DOI: 10.1002/jrs.1236. BLOUT, E. R.; MELLORS, R. C. Infrared Spectra of Tissues. Science, [S. l.], v. 110, n. 2849, p. 137–138, 1949. ISSN: 0036-8075. DOI: 10.1126/science.110.2849.137. BOHNING, James J.; MISRA, T. N.; CHOUDHURY, M. The Raman Effect. Washington, D.C. DOI: 10.1038/nindia.2008.302. BONNIER, F.; BYRNE, H. J. Understanding the molecular information contained in principal component analysis of vibrational spectra of biological systems. The Analyst, [S. l.], v. 137, n. 2, p. 322–332, 2012. ISSN: 0003-2654. DOI: 10.1039/C1AN15821J. BRUM, Juliana S.; KONRADT, Guilherme; BAZZI, Talissa; FIGHERA, Rafael A.; KOMMERS, Glaucia D.; IRIGOYEN, Luiz F.; BARROS, Claudio S. L. Características e frequência das doenças de suínos na Região Central do Rio Grande do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira, [S. l.], v. 33, n. 10, p. 1208–1214, 2013. ISSN: 0100-736X. DOI: 10.1590/S0100-736X2013001000006. CANAAN, Stéphane; ZÁDORI, Zoltán; GHOMASHCHI, Farideh; BOLLINGER, James; SADILEK, Martin; MOREAU, Marie Eve; TIJSSEN, Peter; GELB, Michael H. Interfacial Enzymology of Parvovirus Phospholipases A 2. Journal of Biological Chemistry, [S. l.], v. 279, n. 15, p. 14502–14508, 2004. ISSN: 0021-9258. ISBN: 4506865626. DOI: 10.1074/jbc.M312630200. CANDELORO, Patrizio. Raman Tool Set. 2013. CARVALHO, Luis Felipe das Chagas e Silva De; NOGUEIRA, Marcelo Saito. Optical techniques for fast screening – Towards prevention of the coronavirus COVID-19 outbreak. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, [S. l.], v. 30, p. 101765, 2020. ISSN: 15721000. DOI: 10.1016/j.pdpdt.2020.101765. CHAN, James W.; LIEU, Deborah K.; HUSER, Thomas; LI, Ronald A. Label-Free Separation of Human Embryonic Stem Cells and Their Cardiac Derivatives Using Raman Spectroscopy. Analytical Chemistry, [S. l.], v. 81, n. 4, p. 1324–1331, 2009. ISSN: 0003-2700. DOI: 10.1021/ac801665m. CHAN, James W.; TAYLOR, Douglas S.; ZWERDLING, Theodore; LANE, Stephen M.; IHARA, Ko; HUSER, Thomas. Micro-Raman Spectroscopy Detects Individual Neoplastic and Normal Hematopoietic Cells. Biophysical Journal, [S. l.], v. 90, n. 2, p. 648–656, 2006. ISSN: 00063495. DOI: 10.1529/biophysj.105.066761. CHENG, Hong; XU, Chunlei; ZHANG, Di; ZHANG, Zhaoxia; LIU, Jie; LV, Xiaoyi. Multiclass identification of hepatitis C based on serum Raman spectroscopy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, [S. l.], v. 30, n. December 2019, p. 101735, 2020. ISSN: 18731597. DOI: 10.1016/j.pdpdt.2020.101735. CHENG, Wen-Ting Ting; LIU, Ming-Tzen Tzen; LIU, Han-Nan Nan; LIN, Shan-Yang Yang. Micro-Raman spectroscopy used to identify and grade human skin pilomatrixoma. Microscopy Research and Technique, [S. l.], v. 68, n. 2, p. 75–79, 2005. ISSN: 1059-910X. DOI: 10.1002/jemt.20229.
60
CHEUNG, Andrew K. Rolling-Circle Replication of an Animal Circovirus Genome in a Theta-Replicating Bacterial Plasmid in Escherichia coli. Journal of Virology, [S. l.], v. 80, n. 17, p. 8686–8694, 2006. ISSN: 0022-538X. DOI: 10.1128/JVI.00655-06. CHIWO, F. S.; GONZALEZ, And F. J. Design and implementation of a low-cost portable Raman spectrometer. Revista Mexicana de Física, [S. l.], v. 65, n. 3, p. 274, 2019. ISSN: 0035-001X. DOI: 10.31349/RevMexFis.65.274. CHOMEL, Bruno B. Control and Prevention of Emerging Zoonoses. Journal of Veterinary Medical Education, [S. l.], v. 30, n. 2, p. 145–147, 2003. ISSN: 0748-321X. DOI: 10.3138/jvme.30.2.145. CHOO, K. H.; COTTON, R. G. H.; DANKS, D. M. Phenylalanine hydroxylation and tyrosine requirement of cultured cells. Experimental Cell Research, [S. l.], v. 101, n. 2, p. 370–382, 1976. ISSN: 00144827. DOI: 10.1016/0014-4827(76)90389-X. COTMORE, Susan F. et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Parvoviridae. Journal of General Virology, [S. l.], v. 100, n. 3, p. 367–368, 2019. ISSN: 0022-1317. DOI: 10.1099/jgv.0.001212. CUI, Feiyun; ZHOU, H. Susan. Diagnostic methods and potential portable biosensors for coronavirus disease 2019. Biosensors and Bioelectronics, [S. l.], v. 165, n. January, p. 112349, 2020. ISSN: 09565663. DOI: 10.1016/j.bios.2020.112349. DESAI, Sanket et al. Raman spectroscopy-based detection of RNA viruses in saliva: A preliminary report. Journal of Biophotonics, [S. l.], v. 13, n. 10, p. 1–5, 2020. ISSN: 18640648. DOI: 10.1002/jbio.202000189. DHINDWAL, Sonali; FENG, Shanshan; KHAYAT, Reza. The Arginines in the N-Terminus of the Porcine Circovirus 2 Virus-like Particles Are Responsible for Disrupting the Membranes at Neutral and Acidic pH. Journal of Molecular Biology, [S. l.], v. 431, n. 17, p. 3261–3274, 2019. ISSN: 00222836. DOI: 10.1016/j.jmb.2019.05.044. DITTA, A.; NAWAZ, H.; MAHMOOD, T.; MAJEED, M. I.; TAHIR, M.; RASHID, N.; MUDDASSAR, M.; AL-SAADI, A. A.; BYRNE, H. J. Principal components analysis of Raman spectral data for screening of Hepatitis C infection. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, [S. l.], v. 221, p. 117173, 2019. ISSN: 13861425. DOI: 10.1016/j.saa.2019.117173. DOVBESHKO, G. FTIR spectroscopy studies of nucleic acid damage. Talanta, v. 53, n. 1, p. 233–246, 2000. ISSN: 00399140. DOI: 10.1016/S0039-9140(00)00462-8. DUKOR, Rina K. Vibrational Spectroscopy in the Detection of Cancer. In: GRIFFITHS, Peter R. (org.). Handbook of Vibrational Spectroscopy. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd, 2006. DOI: 10.1002/0470027320.s8107. EOM, Gayoung et al. Diagnosis of Tamiflu-Resistant Influenza Virus in Human Nasal Fluid and Saliva Using Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Sensors, [S. l.], v. 4, n. 9, p. 2282–2287, 2019. ISSN: 2379-3694. DOI: 10.1021/acssensors.9b00697.
61
FAN, Cui; HU, Zhiqiang; RILEY, Lela K.; PURDY, Gregory A.; MUSTAPHA, Azlin; LIN, Mengshi. Detecting food- and waterborne viruses by surface-enhanced raman spectroscopy. Journal of Food Science, [S. l.], v. 75, n. 5, 2010. ISSN: 00221147. DOI: 10.1111/j.1750-3841.2010.01619.x. FAO. Feeding the world in 2050. Rome. ISSN: 10325298. FAO. The future of food and agriculture: trends and challenges. Rome. ISSN: 1815-6797. ISBN: 1815-6797. FARBER, Charles; SHIRES, Madalyn; ONG, Kevin; BYRNE, David; KUROUSKI, Dmitry. Raman spectroscopy as an early detection tool for rose rosette infection. Planta, [S. l.], v. 250, n. 4, p. 1247–1254, 2019. ISSN: 14322048. ISBN: 0042501903. DOI: 10.1007/s00425-019-03216-0. FERNANDES, S.; BOISVERT, M.; TIJSSEN, P. Genetic Elements in the VP Region of Porcine Parvovirus Are Critical to Replication Efficiency in Cell Culture. Journal of Virology, [S. l.], v. 85, n. 6, p. 3025–3029, 2011. ISSN: 0022-538X. DOI: 10.1128/JVI.02215-10. FERRARO, John R.; NAKAMOTO, Kazuo; BROWN, Chris W. Introductory Raman Spectroscopy. 2nd Editio ed., San Diego: Academic Press, 2003. ISBN: 978-0-12-254105-6. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-012254105-6/50004-4. FINSTERBUSCH, Tim; MANKERTZ, Annette. Porcine circoviruses—Small but powerful. Virus Research, [S. l.], v. 143, n. 2, p. 177–183, 2009. ISSN: 01681702. DOI: 10.1016/j.virusres.2009.02.009. FOERSTER, Tessa; STRECK, André Felipe; SPECK, Stephanie; SELBITZ, Hans Joachim; LINDNER, Thomas; TRUYEN, Uwe. An inactivated whole-virus porcine parvovirus vaccine protects pigs against disease but does not prevent virus shedding even after homologous virus challenge. Journal of General Virology, [S. l.], v. 97, n. 6, p. 1408–1413, 2016. ISSN: 14652099. DOI: 10.1099/jgv.0.000446. FRANK, Christopher J.; MCCREERY, Richard L.; REDD, Douglas C. B. Raman Spectroscopy of Normal and Diseased Human Breast Tissues. Analytical Chemistry, [S. l.], v. 67, n. 5, p. 777–783, 1995. ISSN: 0003-2700. DOI: 10.1021/ac00101a001. FRANZO, Giovanni; SEGALÉS, Joaquim. Porcine circovirus 2 (PCV-2) genotype update and proposal of a new genotyping methodology. PLoS ONE, [S. l.], v. 13, n. 12, p. 1–12, 2018. ISSN: 19326203. DOI: 10.1371/journal.pone.0208585. GAHLAUT, S. K.; SAVARGAONKAR, D.; SHARAN, C.; YADAV, Sarjana; MISHRA, P.; SINGH, J. P. SERS Platform for Dengue Diagnosis from Clinical Samples Employing a Hand Held Raman Spectrometer. Analytical Chemistry, [S. l.], v. 92, n. 3, p. 2527–2534, 2020. ISSN: 15206882. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b04129. GALLER, Kerstin; SCHLESER, Franziska; FRÖHLICH, Esther; REQUARDT, Robert Pascal; KORTGEN, Andreas; BAUER, Michael; POPP, Jürgen; NEUGEBAUER, Ute.
62
Exploitation of the hepatic stellate cell Raman signature for their detection in native tissue samples. Integr. Biol., [S. l.], v. 6, n. 10, p. 946–956, 2014. ISSN: 1757-9694. DOI: 10.1039/C4IB00130C. GAVA, Danielle; SERRÃO, Vitor Hugo Balasco; FERNANDES, Lana Teixeira; CANTÃO, Mauricio Egídio; CIACCI-ZANELLA, Janice Reis; MORÉS, Nelson; SCHAEFER, Rejane. Structure analysis of capsid protein of Porcine circovirus type 2 from pigs with systemic disease. Brazilian Journal of Microbiology, [S. l.], v. 49, n. 2, p. 351–357, 2018. ISSN: 15178382. DOI: 10.1016/j.bjm.2017.08.007. GAZI, E. et al. Applications of Fourier transform infrared microspectroscopy in studies of benign prostate and prostate cancer. A pilot study. The Journal of Pathology, [S. l.], v. 201, n. 1, p. 99–108, 2003. ISSN: 0022-3417. DOI: 10.1002/path.1421. GOGONE, Izabel C. V. P.; FERREIRA, Glaucia H.; GAVA, Danielle; SCHAEFER, Rejane; DE PAULA-LOPES, Fabíola F.; ROCHA, Raquel de A.; DE BARROS, Flavia R. O. Applicability of Raman spectroscopy on porcine parvovirus and porcine circovirus type 2 detection. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, [S. l.], v. 249, p. 119336, 2021. ISSN: 13861425. DOI: 10.1016/j.saa.2020.119336. GOODING, Edward A.; DEUTSCH, Erik R.; HUEHNERHOFF, Joseph; HAJIAN, Arsen R. Fast, cheap and in control: spectral imaging with handheld devices. In: (Mark A. Druy, Richard A. Crocombe, Steven M. Barnett, Luisa T. Profeta, Org.) 2017, Anais [...]. [s.l: s.n.] p. 102100E. DOI: 10.1117/12.2279886. HANLON, E. B. et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology, [S. l.], v. 45, n. 2, p. R1–R59, 2000. ISSN: 0031-9155. DOI: 10.1088/0031-9155/45/2/201. HASHIMOTO, Kazuki; BADARLA, Venkata Ramaiah; KAWAI, Akira; IDEGUCHI, Takuro. Complementary vibrational spectroscopy. Nature Communications, [S. l.], v. 10, n. 1, p. 4411, 2019. ISSN: 2041-1723. DOI: 10.1038/s41467-019-12442-9. HEATON, Nicholas S.; RANDALL, Glenn. Multifaceted roles for lipids in viral infection. Trends in Microbiology, [S. l.], v. 19, n. 7, p. 368–375, 2011. ISSN: 0966842X. DOI: 10.1016/j.tim.2011.03.007. HERDT, Geslaine et al. High prevalence of porcine circovirus 2, porcine parvovirus, and pathogenic leptospires in mummified swine fetuses in Southern Brazil. Ciência Rural, [S. l.], v. 49, n. 4, p. 2–7, 2019. ISSN: 1678-4596. DOI: 10.1590/0103-8478cr20180965. HOLLRICHER, Olaf. Raman Instrumentation for Confocal Raman Microscopy. In: Springer Series in Surface Sciences. [s.l.] : Springer International Publishing, 2018. v. 66p. 69–87. ISSN: 09315195. ISBN: 9783319753805. DOI: 10.1007/978-3-319-75380-5_4. HUANG, Naiyan; SHORT, Michael; ZHAO, Jianhua; WANG, Hequn; LUI, Harvey; KORBELIK, Mladen; ZENG, Haishan. Full range characterization of the Raman spectra of organs in a murine model. Optics Express, [S. l.], v. 19, n. 23, p. 22892,
63
2011. ISSN: 1094-4087. DOI: 10.1364/OE.19.022892. HUANG, Zhiwei; MCWILLIAMS, Annette; LAM, Stephen; ENGLISH, John; MCLEAN, David; LUI, Harvey; ZENG, Haishan. Effect of formalin fixation on the near-infrared Raman spectroscopy of normal and cancerous human bronchial tissues. International Journal of Oncology, [S. l.], 2003 a. ISSN: 1019-6439. DOI: 10.3892/ijo.23.3.649. HUANG, Zhiwei; MCWILLIAMS, Annette; LUI, Harvey; MCLEAN, David I.; LAM, Stephen; ZENG, Haishan. Near-infrared Raman spectroscopy for optical diagnosis of lung cancer. International Journal of Cancer, [S. l.], v. 107, n. 6, p. 1047–1052, 2003 b. ISSN: 00207136. DOI: 10.1002/ijc.11500. HULEIHEL, Mahmoud; SHUFAN, Elad; ZEIRI, Leila; SALMAN, Ahmad. Detection of vero cells infected with herpes simplex types 1 and 2 and varicella zoster viruses using raman spectroscopy and advanced statistical methods. PLoS ONE, [S. l.], v. 11, n. 4, p. 1–17, 2016. ISSN: 19326203. DOI: 10.1371/journal.pone.0153599. JARQUÍN-DÍAZ, Víctor Hugo; BALARD, Alice; JOST, Jenny; KRAFT, Julia; DIKMEN, Mert Naci; KVIČEROVÁ, Jana; HEITLINGER, Emanuel. Detection and quantification of house mouse Eimeria at the species level – Challenges and solutions for the assessment of coccidia in wildlife. International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife, [S. l.], v. 10, n. July, p. 29–40, 2019. ISSN: 22132244. DOI: 10.1016/j.ijppaw.2019.07.004. JIN, Naifu; ZHANG, Dayi; MARTIN, Francis L. Fingerprinting microbiomes towards screening for microbial antibiotic resistance. Integrative Biology (United Kingdom), United States, v. 9, n. 5, p. 406–417, 2017. ISSN: 17579708. DOI: 10.1039/c7ib00009j. KAMEMOTO, Lori E.; MISRA, Anupam K.; SHARMA, Shiv K.; GOODMAN, Marc T.; LUK, Hugh; DYKES, Ava C.; ACOSTA, Tayro. Near-Infrared Micro-Raman Spectroscopy for in Vitro Detection of Cervical Cancer. Applied Spectroscopy, [S. l.], v. 64, n. 3, p. 255–261, 2010. ISSN: 0003-7028. DOI: 10.1366/000370210790918364. KAMINAKA, Shoji; ITO, Toshiaki; YAMAZAKI, Hiroya; KOHDA, Ehiichi; HAMAGUCHI, Hiro-o. Near-infrared multichannel Raman spectroscopy toward real-timein vivo cancer diagnosis. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.], v. 33, n. 7, p. 498–502, 2002. ISSN: 0377-0486. DOI: 10.1002/jrs.903. KARUPPANNAN, Anbu; OPRIESSNIG, Tanja. Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Vaccines in the Context of Current Molecular Epidemiology. Viruses, [S. l.], v. 9, n. 5, p. 99, 2017. ISSN: 1999-4915. DOI: 10.3390/v9050099. KASHIF, Muhammad; MAJEED, Muhammad Irfan; HANIF, Muhammad Asif; REHMAN, Ateeq ur. Surface Enhanced Raman Spectroscopy of the serum samples for the diagnosis of Hepatitis C and prediction of the viral loads. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, [S. l.], v. 242, p. 118729, 2020. ISSN: 13861425. DOI: 10.1016/j.saa.2020.118729.
64
KERR, Jonathan R.; COTMORE, Susan F.; BLOOM, Marshall E.; LINDEN, R. Michael; PARRISH, Colin R. (ORG.). Parvoviruses. London: Hodder Arnold, 2006. ISBN: 978 0 340 81198 6. KERR, Laura T.; BYRNE, Hugh J.; HENNELLY, Bryan M. Optimal choice of sample substrate and laser wavelength for Raman spectroscopic analysis of biological specimen. Analytical Methods, [S. l.], v. 7, n. 12, p. 5041–5052, 2015. ISSN: 1759-9660. DOI: 10.1039/C5AY00327J. KHAN, Saranjam; ULLAH, Rahat; ASHRAF, Ruby; KHAN, Ajmal; KHAN, Shamim; AHMAD, Iftikhar. Optical screening of hepatitis-B infected blood sera using optical technique and neural network classifier. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, [S. l.], v. 27, n. July, p. 375–379, 2019. ISSN: 15721000. DOI: 10.1016/j.pdpdt.2019.07.001. KHAN, Saranjam; ULLAH, Rahat; KHAN, Asifullah; ASHRAF, Ruby; ALI, Hina; BILAL, Muhammad; SALEEM, Muhammad. Analysis of hepatitis B virus infection in blood sera using Raman spectroscopy and machine learning. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, [S. l.], v. 23, p. 89–93, 2018. ISSN: 1572-1000. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.2018.05.010. KHAN, Saranjam; ULLAH, Rahat; SALEEM, Muhammad; BILAL, Muhammad; RASHID, Rashad; KHAN, Inamullah; MAHMOOD, Arshad; NAWAZ, Muhammad. Raman spectroscopic analysis of dengue virus infection in human blood sera. Optik, [S. l.], v. 127, n. 4, p. 2086–2088, 2016. ISSN: 0030-4026. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijleo.2015.11.060. KLAUMANN, Francini; CORREA-FIZ, Florencia; FRANZO, Giovanni; SIBILA, Marina; NÚÑEZ, José I.; SEGALÉS, Joaquim. Current Knowledge on Porcine circovirus 3 (PCV-3): A Novel Virus With a Yet Unknown Impact on the Swine Industry. Frontiers in Veterinary Science, [S. l.], v. 5, p. 315, 2018. ISSN: 2297-1769. DOI: 10.3389/fvets.2018.00315. KOUL, Atesh; BECCHIO, Cristina; CAVALLO, Andrea. PredPsych: A toolbox for predictive machine learning-based approach in experimental psychology research. Behavior Research Methods, [S. l.], v. 50, n. 4, p. 1657–1672, 2018. ISSN: 1554-3528. DOI: 10.3758/s13428-017-0987-2. KRAFFT, Christoph; NEUDERT, Lars; SIMAT, Thomas; SALZER, Reiner. Near infrared Raman spectra of human brain lipids. Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy, England, v. 61, n. 7, p. 1529–1535, 2005. ISSN: 1386-1425 (Print). DOI: 10.1016/j.saa.2004.11.017. LAKSHMI, R. Jyothi; KARTHA, V. B.; KRISHNA, C. Murali; SOLOMON, J. G. R.; ULLAS, G.; DEVI, P. Uma. Tissue Raman Spectroscopy for the Study of Radiation Damage: Brain Irradiation of Mice. Radiation Research, [S. l.], v. 157, n. 2, p. 175–182, 2002. ISSN: 00337587, 19385404. LASKA, Jadwiga; WIDLARZ, Joanna. Spectroscopic and structural characterization
65
of low molecular weight fractions of polyaniline. Polymer, [S. l.], v. 46, n. 5, p. 1485–1495, 2005. ISSN: 00323861. DOI: 10.1016/j.polymer.2004.12.008. LAU, David P.; HUANG, Zhiwei; LUI, Harvey; ANDERSON, Donald W.; BEREAN, Ken; MORRISON, Murray D.; SHEN, Liang; ZENG, Haishan. Raman spectroscopy for optical diagnosis in the larynx: Preliminary findings. Lasers in Surgery and Medicine, [S. l.], v. 37, n. 3, p. 192–200, 2005. ISSN: 0196-8092. DOI: 10.1002/lsm.20226. LAU, David P.; HUANG, Zhiwei; LUI, Harvey; MAN, Chris S.; BEREAN, Ken; MORRISON, Murray D.; ZENG, Haishan. Raman spectroscopy for optical diagnosis in normal and cancerous tissue of the nasopharynx?preliminary findings. Lasers in Surgery and Medicine, [S. l.], v. 32, n. 3, p. 210–214, 2003. ISSN: 0196-8092. DOI: 10.1002/lsm.10084. LEBEDEV, Nikolai; GRIVA, Igor; DRESSICK, Walter J.; PHELPS, Jamie; JOHNSON, John E.; MESHCHERIAKOVA, Yulia; LOMONOSSOFF, George P.; SOTO, Carissa M. A virus-based nanoplasmonic structure as a surface-enhanced Raman biosensor. Biosensors and Bioelectronics, [S. l.], v. 77, p. 306–314, 2016. ISSN: 0956-5663. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2015.09.032. LI, Xiaozhou; YANG, Tianyue; LI, Siqi; YU, Ting. Surface-enhanced Raman spectroscopy differences of saliva between lung cancer patients and normal people. In: (Nirmala Ramanujam, Jürgen Popp, Org.) 2011, Anais [...]. [s.l: s.n.] p. 808722. DOI: 10.1117/12.889320. LI, Xinqiong et al. Differential expression of microRNAs in porcine parvovirus infected porcine cell line. Virology Journal, [S. l.], v. 12, n. 1, p. 128, 2015. ISSN: 1743-422X. DOI: 10.1186/s12985-015-0359-4. LIU, Zhuang; DAVIS, Corrine; CAI, Weibo; HE, Lina; CHEN, Xiaoyuan; DAI, Hongjie. Circulation and long-term fate of functionalized, biocompatible single-walled carbon nanotubes in mice probed by Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences, [S. l.], v. 105, n. 5, p. 1410–1415, 2008. ISSN: 0027-8424. DOI: 10.1073/pnas.0707654105. LLOYD, G. R.; HUTCHINGS, J.; ALMOND, L. M.; BARR, H.; KENDALL, C.; STONE, N. Assessing the performance of spectroscopic models for cancer diagnostics using cross-validation and permutation testing. In: (Anita Mahadevan-Jansen, Wolfgang Petrich, Org.) 2012, Anais [...]. [s.l: s.n.] p. 82190C. DOI: 10.1117/12.919864. LUO, Zhihui; CHEN, Lina; LIANG, Chunjie; WEI, Qingmin; CHEN, Yuan; WANG, Jing. Porous carbon films decorated with silver nanoparticles as a sensitive SERS substrate, and their application to virus identification. Microchimica Acta, [S. l.], v. 184, n. 9, p. 3505–3511, 2017. ISSN: 0026-3672. DOI: 10.1007/s00604-017-2369-y. MACLACHLAN, N. James; DUBOVI, Edward J. Pathogenesis of Viral Infections and Diseases. In: MACLACHLAN, N. James; DUBOVI, Edward J. (org.). Fenner’s Veterinary Virology. Fourth Edi ed. San Diego: Elsevier, 2011. p. 43–74. ISBN: 9780123751584. DOI: 10.1016/B978-0-12-375158-4.00003-1.
66
MACLACHLAN, N. James; DUBOVI, Edward J. (ORG.). Parvoviridae. In: Fenner’s Veterinary Virology. 5th. ed. [s.l.] : Elsevier, 2017. p. 245–257. ISBN: 9780128011706. DOI: 10.1016/B978-0-12-800946-8.00012-X. MADDALI, Hemanth; MILES, Catherine E.; KOHN, Joachim; O’CARROLL, Deirdre Marie. Optical Biosensors for Virus Detection: Prospects for COVID‐19. ChemBioChem, [S. l.], p. 1–15, 2020. ISSN: 1439-4227. DOI: 10.1002/cbic.202000744. MAHADEVAN-JANSEN, A.; RICHARDS-KORTUM, R. Raman spectroscopy for cancer detection: a review. In: PROCEEDINGS OF THE 19TH ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCE OF THE IEEE ENGINEERING IN MEDICINE AND BIOLOGY SOCIETY. “MAGNIFICENT MILESTONES AND EMERGING OPPORTUNITIES IN MEDICAL ENGINEERING” (CAT. NO.97CH36136) 1997, Anais [...]. : IEEE, 1997 p. 2722–2728. ISSN: 1094-687X. ISBN: 0-7803-4262-3. DOI: 10.1109/IEMBS.1997.756895. MALINI, R.; VENKATAKRISHNA, K.; KURIEN, J.; M. PAI, Keerthilatha; RAO, Lakshmi; KARTHA, V. B.; KRISHNA, C. Murali. Discrimination of normal, inflammatory, premalignant, and malignant oral tissue: A Raman spectroscopy study. Biopolymers, [S. l.], v. 81, n. 3, p. 179–193, 2006. ISSN: 0006-3525. DOI: 10.1002/bip.20398. MÉSZÁROS, István; OLASZ, Ferenc; CSÁGOLA, Attila; TIJSSEN, Peter; ZÁDORI, Zoltán. Biology of porcine parvovirus (Ungulate parvovirus 1). Viruses, [S. l.], v. 9, n. 12, p. 1–14, 2017. ISSN: 19994915. ISBN: 3614674061. DOI: 10.3390/v9120393. MO, Xiaobing; LI, Xiangdong; YIN, Bo; DENG, Junhua; TIAN, Kegong; YUAN, Adam. Structural roles of PCV2 capsid protein nterminus in PCV2 particle assembly and identification of PCV2 type-specific neutralizing epitope. PLoS Pathogens, [S. l.], v. 15, n. 3, p. 1–24, 2019. ISSN: 15537374. DOI: 10.1371/journal.ppat.1007562. MONTAGNESE, Concetta et al. A diagnostic device for in-situ detection of swine viral diseases: The SWINOSTICS project. Sensors (Switzerland), [S. l.], v. 19, n. 2, 2019. ISSN: 14248220. DOI: 10.3390/s19020407. MOOR, K.; KITAMURA, H.; HASHIMOTO, K.; SAWA, M.; ANDRIANA, B. B.; OHTANI, K.; YAGURA, T.; SATO, H. Study of virus by Raman spectroscopy. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XI, [S. l.], v. 8587, n. February, p. 85871X, 2013. ISSN: 16057422. ISBN: 0277-786Xn978-0-8194-9356-9. DOI: 10.1117/12.2004476. MOOR, Kamila; OHTANI, Kiyoshi; MYRZAKOZHA, Diyas; ZHANSERKENOVA, Orik; ANDRIANA, Bibin. B.; SATO, Hidetoshi. Noninvasive and label-free determination of virus infected cells by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics, [S. l.], v. 19, n. 6, p. 067003, 2014. ISSN: 1083-3668. DOI: 10.1117/1.JBO.19.6.067003. MOOR, Kamila; TERADA, Yusuke; TAKETANI, Akinori; MATSUYOSHI, Hiroko; OHTANI, Kiyoshi. Early detection of virus infection in live human cells using Raman
67
spectroscopy. Journal of Biomedical Optics, [S. l.], v. 23, n. 09, p. 1, 2018. ISSN: 1083-3668. DOI: 10.1117/1.JBO.23.9.097001. NASEER, Khulla; SALEEM, Muhammad; ALI, Safdar; MIRZA, Bushra; QAZI, Javaria. Identification of new spectral signatures from hepatitis C virus infected human sera. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, [S. l.], v. 222, p. 117181, 2019. ISSN: 13861425. DOI: 10.1016/j.saa.2019.117181. NAUMANN, Dieter. Infrared and NIR Raman spectroscopy in medical microbiology. In: (Henry H. Mantsch, Michael Jackson, Org.) 1998, Anais [...]. [s.l: s.n.] p. 245–257. DOI: 10.1117/12.306089. NĚMEČEK, Daniel; THOMAS, George J. Raman Spectroscopy of Viruses and Viral Proteins. Frontiers of Molecular Spectroscopy, [S. l.], p. 553–595, 2009. ISBN: 9780444531759. DOI: 10.1016/B978-0-444-53175-9.00016-7. NOTINGHER, Ioan; GREEN, Chris; DYER, Chris; PERKINS, Elaine; HOPKINS, Neil; LINDSAY, Chris; HENCH, Larry L. Discrimination between ricin and sulphur mustard toxicity in vitro using Raman spectroscopy. Journal of the Royal Society Interface, [S. l.], v. 1, n. 1, p. 79–90, 2004. ISSN: 17425662. DOI: 10.1098/rsif.2004.0008. Ó FAOLÁIN, Eoghan; HUNTER, Mary B.; BYRNE, Joe M.; KELEHAN, Peter; MCNAMARA, Mary; BYRNE, Hugh J.; LYNG, Fiona M. A study examining the effects of tissue processing on human tissue sections using vibrational spectroscopy. Vibrational Spectroscopy, [S. l.], v. 38, n. 1–2, p. 121–127, 2005. ISSN: 09242031. DOI: 10.1016/j.vibspec.2005.02.013. OH, Woo Taek; KIM, Ri Yeon; NGUYEN, Van Giap; CHUNG, Hee Chun; PARK, Bong Kyun. Perspectives on the evolution of porcine parvovirus. Viruses, [S. l.], v. 9, n. 8, p. 1–13, 2017. ISSN: 19994915. ISBN: 0041-008x. DOI: 10.3390/v9080196. OLVERA, Alex; SIBILA, Marina; CALSAMIGLIA, Maria; SEGALÉS, Joaquim; DOMINGO, Mariano. Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs. Journal of Virological Methods, [S. l.], v. 117, n. 1, p. 75–80, 2004. ISSN: 01660934. DOI: 10.1016/j.jviromet.2003.12.007. OPRIESSNIG, Tanja et al. A PCV2 vaccine based on genotype 2b is more effective than a 2a-based vaccine to protect against PCV2b or combined PCV2a/2b viremia in pigs with concurrent PCV2, PRRSV and PPV infection. Vaccine, [S. l.], v. 31, n. 3, p. 487–494, 2013. ISSN: 0264410X. DOI: 10.1016/j.vaccine.2012.11.030. OPRIESSNIG, Tanja; KARUPPANNAN, Anbu K.; CASTRO, Alessandra M. M. G.; XIAO, Chao Ting. Porcine circoviruses: current status, knowledge gaps and challenges. Virus Research, [S. l.], v. 286, n. January, p. 198044, 2020. ISSN: 18727492. DOI: 10.1016/j.virusres.2020.198044. OTANGE, Ben; BIRECH, Zephania; ROP, Ronald; OYUGI, Julius. Estimation of HIV-1 viral load in plasma of HIV-1-infected people based on the associated Raman
68
spectroscopic peaks. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.], v. 50, n. 5, p. 620–628, 2019. ISSN: 10974555. DOI: 10.1002/jrs.5557. OUYANG, Ting; ZHANG, Xinwei; LIU, Xiaohua; REN, Linzhu. Co-infection of swine with porcine circovirus type 2 and other swine viruses. Viruses, [S. l.], v. 11, n. 2, p. 16–20, 2019. ISSN: 19994915. DOI: 10.3390/v11020185. PAN, Dun; MI, Lijuan; HUANG, Qing; HU, Jun; FAN, Chunhai. Genetic analysis with nanoPCR. Integrative Biology, [S. l.], v. 4, n. 10, p. 1155, 2012. ISSN: 1757-9694. DOI: 10.1039/c2ib20076g. PARIKH, Rajul; MATHAI, Annie; PARIKH, Shefali; CHANDRA SEKHAR, G.; THOMAS, Ravi. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian Journal of Ophthalmology, [S. l.], v. 56, n. 1, p. 45, 2008. ISSN: 0301-4738. DOI: 10.4103/0301-4738.37595. PFANKUCHE, Vanessa M. et al. Comparison of different in situ hybridization techniques for the detection of various RNA and DNA viruses. Viruses, [S. l.], v. 10, n. 7, 2018. ISSN: 19994915. DOI: 10.3390/v10070384. PISSUWAN, Dakrong; GAZZANA, Camilla; MONGKOLSUK, Skorn; CORTIE, Michael B. Single and multiple detections of foodborne pathogens by gold nanoparticle assays. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology, [S. l.], v. 12, n. 1, p. 1–19, 2020. ISSN: 1939-5116. DOI: 10.1002/wnan.1584. PUPPELS, G. J.; GARRITSEN, H. S. P.; KUMMER, J. A.; GREVE, J. Carotenoids located in human lymphocyte subpopulations and natural killer cells by Raman microspectroscopy. Cytometry, [S. l.], v. 14, n. 3, p. 251–256, 1993. ISSN: 0196-4763. DOI: 10.1002/cyto.990140303. R CORE TEAM. R: A language and environment for statistical computing. Vienna, Austria R Foundation for Statistical Computing, 2019. REN, Linzhu; CHEN, Xinrong; OUYANG, Hongsheng. Interactions of porcine circovirus 2 with its hosts. Virus Genes, [S. l.], v. 52, n. 4, p. 437–444, 2016. ISSN: 0920-8569. DOI: 10.1007/s11262-016-1326-x. RENISHAW. Raman Spectroscopy Explained. 2018 a. ISSN: 09737847. ISBN: 8571398682. RENISHAW. WiRE Software. Gloucestershire, U.K. 2018 b. RIBEIRO, Eduardo L.; OLIVEIRA, Anna G. G.; LAGUARDIA-NASCIMENTO, Mateus; MATA, Camila Pacheco Silveira Martins Da; REIS, Jenner K. P. Dos; FONSECA JÚNIOR, Antônio A. Estudo comparativo e validação de três técnicas de PCR em tempo real (qPCR) para diagnóstico de Peste Suína Africana. Pesquisa Veterinária Brasileira, [S. l.], v. 36, n. 6, p. 473–478, 2016. ISSN: 0100-736X. DOI: 10.1590/S0100-736X2016000600003. RODRIGUES, Ariano De Giovanni; GALZERANI, José Cláudio. Espectroscopias de
69
infravermelho, Raman e de fotoluminescência: potencialidades e complementaridades. Revista Brasileira de Ensino de Física, [S. l.], v. 34, n. 4, p. 4309, 2012. ISSN: 1806-1117. DOI: 10.1590/S1806-11172012000400009. RONEN, S. M.; STIER, A.; DEGANI, H. NMR studies of the lipid metabolism of T47D human breast cancer spheroids. FEBS Letters, [S. l.], v. 266, n. 1–2, p. 147–149, 1990. ISSN: 00145793. DOI: 10.1016/0014-5793(90)81526-T. RUIZ-CHICA, A. J.; MEDINA, M. A.; SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, F.; RAMÍREZ, F. J. Characterization by Raman spectroscopy of conformational changes on guanine–cytosine and adenine–thymine oligonucleotides induced by aminooxy analogues of spermidine. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.], v. 35, n. 2, p. 93–100, 2004. ISSN: 0377-0486. DOI: 10.1002/jrs.1107. RUOKOLA, P.; DADU, E.; KAZMERTSUK, A.; HAKKANEN, H.; MARJOMAKI, V.; IHALAINEN, J. A. Raman Spectroscopic Signatures of Echovirus 1 Uncoating. Journal of Virology, [S. l.], v. 88, n. 15, p. 8504–8513, 2014. ISSN: 0022-538X. DOI: 10.1128/JVI.03398-13. SAHU, Aditi; DALAL, Krishna; NAGLOT, Sarla; AGGARWAL, Parveen; MURALI KRISHNA, C. Serum Based Diagnosis of Asthma Using Raman Spectroscopy: An Early Phase Pilot Study. PLoS ONE, [S. l.], v. 8, n. 11, p. e78921, 2013. ISSN: 1932-6203. DOI: 10.1371/journal.pone.0078921. SALMAN, A.; SHUFAN, E.; ZEIRI, L.; HULEIHEL, M. Characterization and detection of Vero cells infected with Herpes Simplex Virus type 1 using Raman spectroscopy and advanced statistical methods. Methods, [S. l.], v. 68, n. 2, p. 364–370, 2014. ISSN: 1046-2023. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2014.02.022. SANTOS, Marfran C. D.; MORAIS, Camilo L. M.; NASCIMENTO, Yasmin M.; ARAUJO, Josélio M. G.; LIMA, Kássio M. G. Spectroscopy with computational analysis in virological studies: A decade (2006–2016). TrAC Trends in Analytical Chemistry, [S. l.], v. 97, n. January, p. 244–256, 2017. ISSN: 01659936. DOI: 10.1016/j.trac.2017.09.015. SEGALÉS, Joaquim. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis. Virus Research, [S. l.], v. 164, n. 1–2, p. 10–19, 2012. ISSN: 01681702. DOI: 10.1016/j.virusres.2011.10.007. SHAPIRO, Amos; GOFRIT, Ofer. N.; PIZOV, Galina; COHEN, Jeffrey Kirk; MAIER, John. Raman Molecular Imaging: A Novel Spectroscopic Technique for Diagnosis of Bladder Cancer in Urine Specimens. European Urology, [S. l.], v. 59, n. 1, p. 106–112, 2011. ISSN: 03022838. DOI: 10.1016/j.eururo.2010.10.027. SHEN, H. G.; HALBUR, Patrick G.; OPRIESSNIG, Tanja. Prevalence and phylogenetic analysis of the current porcine circovirus 2 genotypes after implementation of widespread vaccination programmes in the USA. Journal of General Virology, [S. l.], v. 93, n. Pt_6, p. 1345–1355, 2012. ISSN: 0022-1317. DOI: 10.1099/vir.0.039552-0.
70
SHETTY, G.; KENDALL, C.; SHEPHERD, N.; STONE, N.; BARR, H. Raman spectroscopy: elucidation of biochemical changes in carcinogenesis of oesophagus. British Journal of Cancer, [S. l.], v. 94, n. 10, p. 1460–1464, 2006. ISSN: 0007-0920. DOI: 10.1038/sj.bjc.6603102. SIGURDSSON, S.; PHILIPSEN, P. A.; HANSEN, L. K.; LARSEN, J.; GNIADECKA, M.; WULF, H. C. Detection of Skin Cancer by Classification of Raman Spectra. IEEE Transactions on Biomedical Engineering, [S. l.], v. 51, n. 10, p. 1784–1793, 2004. ISSN: 0018-9294. DOI: 10.1109/TBME.2004.831538. SILVEIRA, Landulfo; SATHAIAH, Sokki; ZÂNGARO, Renato A.; PACHECO, Marcos T. T.; CHAVANTES, Maria C.; PASQUALUCCI, Carlos A. G. Correlation between near-infrared Raman spectroscopy and the histopathological analysis of atherosclerosis in human coronary arteries. Lasers in Surgery and Medicine, [S. l.], v. 30, n. 4, p. 290–297, 2002. ISSN: 01968092. DOI: 10.1002/lsm.10053. SIMPSON, Alan A.; HÉBERT, Benoı̂t; SULLIVAN, Gail M.; PARRISH, Colin R.; ZÁDORI, Zoltán; TIJSSEN, Peter; ROSSMANN, Michael G. The structure of porcine parvovirus: comparison with related viruses. Journal of Molecular Biology, [S. l.], v. 315, n. 5, p. 1189–1198, 2002. ISSN: 00222836. DOI: 10.1006/jmbi.2001.5319. SORAK, Damir; HERBERHOLZ, Lars; IWASCEK, Sylvia; ALTINPINAR, Sedakat; PFEIFER, Frank; SIESLER, Heinz W. New Developments and Applications of Handheld Raman, Mid-Infrared, and Near-Infrared Spectrometers. Applied Spectroscopy Reviews, [S. l.], v. 47, n. 2, p. 83–115, 2012. ISSN: 0570-4928. DOI: 10.1080/05704928.2011.625748. SOUCIE, J. Michael et al. Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate:C porcine factor VIII concentrate. Transfusion, [S. l.], v. 40, n. 6, p. 708–711, 2000. ISSN: 00411132. SSEMADAALI, M. A.; ILHA, M.; RAMAMOORTHY, S. Genetic diversity of porcine circovirus type 2 and implications for detection and control. Research in Veterinary Science, [S. l.], v. 103, p. 179–186, 2015. ISSN: 0034-5288. DOI: 10.1016/J.RVSC.2015.10.006. STONE, Nicholas; KENDALL, Catherine; SHEPHERD, Neil; CROW, Paul; BARR, Hugh. Near-infrared Raman spectroscopy for the classification of epithelial pre-cancers and cancers. Journal of Raman Spectroscopy, [S. l.], v. 33, n. 7, p. 564–573, 2002. ISSN: 0377-0486. DOI: 10.1002/jrs.882. STONE, Nicholas; KENDALL, Catherine; SMITH, Jenny; CROW, Paul; BARR, Hugh. Raman spectroscopy for identification of epithelial cancers. Faraday Discussions, [S. l.], v. 126, p. 141, 2004. ISSN: 1359-6640. DOI: 10.1039/b304992b. STRECK, André Felipe; CANAL, Cláudio Wageck; TRUYEN, Uwe. Molecular epidemiology evolution of porcine parvoviruses. Infection, Genetics and Evolution, [S. l.], v. 36, p. 300–306, 2015. ISSN: 15677257. DOI: 10.1016/j.meegid.2015.10.007.
71
STRECK, André Felipe; TRUYEN, Uwe. Porcine Parvovirus. Current Issues in Molecular Biology, [S. l.], v. 126, n. 7, p. 33–46, 2020. ISSN: 14673037. DOI: 10.21775/cimb.037.033. SU, L. et al. Raman spectral properties of squamous cell carcinoma of oral tissues and cells. Laser Physics, [S. l.], v. 22, n. 1, p. 311–316, 2012. ISSN: 1054-660X. DOI: 10.1134/S1054660X12010185. THOMAS, George J. Raman Spectroscopy and Virus Research. Applied Spectroscopy, [S. l.], v. 30, n. 5, p. 483–494, 1976. ISSN: 00037028. DOI: 10.1366/000370276774456912. TISCHER, Ilse; PETERS, D.; RASCH, R.; POCIULI, S. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence. Archives of Virology, [S. l.], v. 96, n. 1–2, p. 39–57, 1987. ISSN: 0304-8608. DOI: 10.1007/BF01310989. TONG, Dongni; CHEN, Cheng; ZHANG, JingJing; LV, GuoDong; ZHENG, Xiangxiang; ZHANG, Zhaoxia; LV, Xiaoyi. Application of Raman spectroscopy in the detection of hepatitis B virus infection. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, [S. l.], v. 28, p. 248–252, 2019. ISSN: 15721000. DOI: 10.1016/j.pdpdt.2019.08.006. WANG, Jian chang; LIU, Li bing; HAN, Qing an; WANG, Jin feng; YUAN, Wan zhe. An exo probe-based recombinase polymerase amplification assay for the rapid detection of porcine parvovirus. Journal of Virological Methods, [S. l.], v. 248, n. 38, p. 145–147, 2017. ISSN: 18790984. DOI: 10.1016/j.jviromet.2017.06.011. WANG, Yong; YANG, Kan kan; WANG, Jing; WANG, Xiao peng; ZHAO, Liang; SUN, Pei; LI, Yong dong. Detection and molecular characterization of novel porcine parvovirus 7 in Anhui province from Central-Eastern China. Infection, Genetics and Evolution, [S. l.], v. 71, n. March, p. 31–35, 2019. ISSN: 15677257. DOI: 10.1016/j.meegid.2019.03.004. WAVEMETRICS INC. Igor Pro. Lake Oswego, OR, USA 2019. XIAO, Meng et al. Ultrasensitive detection of avian influenza A (H7N9) virus using surface-enhanced Raman scattering-based lateral flow immunoassay strips. Analytica Chimica Acta, [S. l.], v. 1053, p. 139–147, 2019. ISSN: 0003-2670. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2018.11.056. YANG, Xin; CHEN, Fuwang; CAO, Yuhang; PANG, Daxing; OUYANG, Hongsheng; REN, Linzhu. Comparative analysis of different methods to enhance porcine circovirus 2 replication. Journal of Virological Methods, [S. l.], v. 187, n. 2, p. 368–371, 2013. ISSN: 01660934. DOI: 10.1016/j.jviromet.2012.11.001. YANG, Yang; QIN, Xiaodong; ZHANG, Wei; LI, Yanmin; ZHANG, Zhidong. Rapid and specific detection of porcine parvovirus by isothermal recombinase polymerase amplification assays. Molecular and Cellular Probes, [S. l.], v. 30, n. 5, p. 300–305, 2016. ISSN: 10961194. DOI: 10.1016/j.mcp.2016.08.011.
72
YEH, Yin Ting et al. A rapid and label-free platform for virus capture and identification from clinical samples. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, [S. l.], v. 117, n. 2, p. 895–901, 2020. ISSN: 10916490. DOI: 10.1073/pnas.1910113117. YU, Hai Qiong; CAI, Xian Quan; LIN, Zhi Xiong; LI, Xiang Li; YUE, Qiao Yun; LI, Rong; ZHU, Xing Quan. Rapid and specific detection of porcine parvovirus using real-time PCR and High Resolution Melting (HRM) analysis. BMC Veterinary Research, [S. l.], v. 11, n. 1, p. 1–5, 2015. ISSN: 17466148. DOI: 10.1186/s12917-015-0364-2. ZÁDORI, Zoltán; SZELEI, József; LACOSTE, Marie-Claude; LI, Yi; GARIÉPY, Sébastien; RAYMOND, Philippe; ALLAIRE, Marc; NABI, Ivan R.; TIJSSEN, Peter. A Viral Phospholipase A2 Is Required for Parvovirus Infectivity. Developmental Cell, [S. l.], v. 1, n. 2, p. 291–302, 2001. ISSN: 15345807. DOI: 10.1016/S1534-5807(01)00031-4. ZANELLA, Janice Reis Ciacci; MORÉS, Nelson; DE BARCELLOS, David Emilio Santos Neves. Principais ameaças sanitárias endêmicas da cadeia produtiva de suínos no Brasil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, [S. l.], v. 51, n. 5, p. 443–453, 2016. ISSN: 16783921. ISBN: 2016000500004. DOI: 10.1590/S0100-204X2016000500004. ZHENG, LL; JIN, XH; WEI, FS; WANG, CQ; CHEN, HY; WANG, YB; WEI, ZY. Simultaneous detection of porcine pseudorabies virus, porcine parvovirus and porcine circovirus type 2 by multiplex real-time PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green I. Veterinární Medicína, [S. l.], v. 63, n. No. 8, p. 358–366, 2018. ISSN: 03758427. DOI: 10.17221/3/2018-VETMED. ZIMMERMAN, Jeffrey J.; KARRIKER, Locke A.; RAMIREZ, Alejandro; SCHWARTZ, Kent J.; STEVENSON, Gregory W.; ZHANG, Jianqiang (ORG.). Diseases of Swine. 11. ed., NJ: Wiley Blackwell, 2019. ISBN: 9781119350903.
73
APÊNDICE A - Teste de Permutação
74
Perfil de distribuição nula para os resultados do teste de permutação da 10FCV para o modelo PCA-LDA. A precisão do nível de aleatoriedade é representada pela linha vertical vermelha e a precisão da classificação real pela linha vertical azul.
75
APÊNDICE B - PIRs de menor impacto
76
77
78
79
80
81
82
83
84
Top Related