UNIVERSIDADE VILA VELHA - ES
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL
EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS
WISTAR IMUNOSSUPRIMIDOS COM DEXAMETASONA
ROBERTA DELESSA FARIA
VILA VELHA
SETEMBRO / 2013
UNIVERSIDADE VILA VELHA - ES
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL
EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS
WISTAR IMUNOSSUPRIMIDOS COM DEXAMETASONA
Dissertao apresentada Universidade Vila Velha, como pr-requisito do Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal, para obteno do grau de Mestre em Cincia Animal.
ROBERTA DELESSA FARIA
VILA VELHA
SETEMBRO / 2013
iv
ROBERTA DELESSA FARIA
EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS
WISTAR IMUNOSSUPRIMIDOS COM DEXAMETASONA
Dissertao apresentada Universidade Vila Velha, como pr-requisito do Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal, para obteno do grau de Mestre em Cincia Animal.
Aprovada em 24 de setembro de 2013 .
v
DEDICATRIA:
Dedico este trabalho ao meu pai, Derli da Silva Faria, por me tornar a cada dia
uma pessoa melhor, onde mesmo diante das dificuldades e obstculos, nunca
deixou de acredita em mim, e me apoiou do incio ao fim dessa jornada, pelo
amor incondicional de PAI que ele dedica e sempre dedicou a mim.
vi
AGRADECIMENTOS
Fundao de Amparo Pesquisa do Esprito Santo (FAPES) pela concesso da
bolsa que viabilizou meus estudos, dedicao e ao apoio financeiro ao projeto.
Universidade Vila Velha que proporcionou todo apoio na logstica e execuo do
projeto de pesquisa.
minha orientadora Betnia Souza Monteiro, por toda pacincia e dedicao
durante todo esse processo.
todos os professores do programa de Mestrado em Cincia Animal, que
contriburam para a minha formao.
Ao colega Mrio Srgio Wanzeller, do Laboratrio de Acompanhamento
Experimental da UVV, pela ajuda, amizade e companhia agradvel durante todo o
meu projeto.
s colegas, Noely Godoi Pianca e Emanuelle Pimentel Cruz que me ajudaram
durante a realizao do meu projeto. Muito obrigada meninas!!!
minha amiga Alessandra, pela parceria de todas as horas, pelo companheirismo e
pacincia nos momentos compartilhados de alegrias, tristezas e dificuldades nesse
longo percurso.
aos meus pais que so minha base, meu alicerce, meu amor maior, que me
tornaram a pessoa que hoje sou, tornando assim possvel a realizao deste
mestrado.
toda minha famlia (pais, irmo, tias, tios, primos e primas), pelo constante apoio
sem o qual o que hoje sou no seria possvel.
vii
Aos meus grandes e valiosos amigos e amigas Evelyn Baptista de Bortoli, Soraya de
Figueiredo Handere, Raphaela Haddad Tpias Bissoli e Fbio Macedo Pimentel, por
entenderem minha ausncia e por torcerem sempre por mim.
Ao meu querido, amado e saudoso av Ansio Gomes Dilessa in memoriam que
mesmo estando longe, sei que est sempre ao meu lado. Que com a pouca
educao que teve criou e educou filhos e netos brilhantemente, que me ensinou a
sempre respeitar ao prximo,a ser humilde, a fazer o bem sem olhar a quem, e a
amar os animais. Vov, muito obrigada por ter sido sempre muito presente na minha
vida, a saudade imensa!
Aos amigos do SHOP CO que sempre me apoiaram e souberam entender a minha
ausncia.
Ao colega Wagner Fiorio pelos ensinamentos de patologia neste projeto.
Ao colega e professor, Dominik Lenz por estar sempre disposto e pronto para ajudar.
Mnica de Alvarenga Feij Bianchi, que desde a minha graduao sempre me
incentivou, sendo um exemplo incomparvel de sabedoria, inteligncia,
profissionalismo e amor aos animais, ela em quem me espelho quando eu crescer
quero ser igual a voc.
Ao Bud in memoriam, meu amigo de quatro patas, cachorro mais extraordinrio
que conheci, ele se doava inteiramente a qualquer pessoa que demonstrasse
carinho a ele. Animal pelo qual eu busquei estudar mais, mais infelizmente no deu
tempo de salv-lo. Bud muito obrigada!!!
As minhas meninas Miryth, Mini e Lua, pelas quais eu tenho um amor
incondicional.
E tambm no poderia deixar de agradecer aos animais que tornaram esse projeto
possvel, que Deus abenoe todas as criaturas.
Os meus mais sinceros agradecimentos.
viii
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS viii
LISTA DE TABELAS x
LISTA DE ABREVIATURAS xi
RESUMO xiii
ABSTRACT xiv
1 INTRODUO 01
2 - REVISO DE LITERATURA 03
2.1 Corticoides 03
2.2 Anatomia e fisiologia da pele 07
2.3 Cicatrizao cutnea 08
2.3.1 - Coagulao 09
2.3.2 Inflamao 10
2.3.3 Proliferao 11
2.3.4 Contrao da ferida 12
2.3.5 Remodelao 12
2.3.6 Consideraes sobre o colgeno 14
2.4 Clulas tronco mesenquimal 14
3 OBJETIVOS 18
4 - MATERIAL E MTODOS 19
4.1- Isolamento, caracterizao e expanso de CTM 20
4.2- Procedimentos anestsicos, cirrgicos e tratamentos 22
4.3- Plano cirrgico 23
4.4- Tratamento 25
4.5- Avaliao clnica 27
4.6- Bipsias e procedimentos histolgicos 28
4.7 - Avaliaes estatsticas 30
5 RESULTADOS 30
ix
5.1- Cultura celular 30
5.2- Alteraes clnicas 33
5.3- Alterao macroscpica 34
5.4- Alterao histopatolgica 37
5.4.1 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps
a realizao da ferida cirrgica do GC 37
5.4.2 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps
a realizao da ferida cirrgica do GD 38
5.4.3 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps
a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 40
5.4.4 Material coletado dos animais eutanasiados 7 dias aps
a realizao da ferida cirrgica do GD 41
5.4.5 Material coletado dos animais eutanasiados 7 dias aps
a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 42
5.4.6 Material coletado dos animais eutanasiados 15 dias
aps a realizao da ferida cirrgica do GC 42
5.4.7 Material coletado dos animais eutanasiados 15 dias
aps a realizao da ferida cirrgica do GD 43
5.4.8 Material coletado dos animais eutanasiados 15 dias
aps a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 43
5.4.9 - Cellprofiler 43
6 DISCUSSO 47
7 CONCLUSO 51
8 REFERNCIAS 52
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura da Pele e seus anexos. 08
Figura 2: Fases da cicatrizao correlacionadas com a especificidade imune-celular.
13
Figura 3: Animal do grupo GC recebendo anestesia geral por via IM. 23
Figura 4: Animal tricotomizado (A); rea padronizada demarcada na pele
com tinta de carimbo (B); rea padronizada demarcada na pele com tinta
de carimbo j com campo operatrio (C); Ferida cirrgica sem fixao de
bordas (D).
24
Figura 5 Organograma ilustrando os animais do experimento e como
os mesmos foram divididos nos grupos de tratamento recebido.
26
Figura 6: Fotos ilustrativas dos animais recendo infuso de CTM 48
horas aps a criao da ferida cirrgica.
26
Figura 7: Imagem ilustrativa da mensurao da ARL nos dias 1, 5 e 10
aps a criao da ferida cirrgica, atravs do programa Image Pro Plus, no qual os traos em amarelo demonstram o contorno da rea da ferida.
27
Figura 8: Animais eutanasiados aos 3 (A), 7 (B) e 15 (C) dias
respectivamente, aps a criao da ferida cirrgica. Em destaque ,(retngulo) a rea de tecido coletada envolvendo a ferida cirrgica e a pele intacta, que foi encaminhada histopatologia.
Figura 9: Avaliao da frequncia de CD 34, CD 45, CD 90 e CD 54 por citometria de fluxo em clulas tronco mesenquimais (CTM) oriundas da medula ssea de ratos Wistar. A intensidade de fluorescncia de cada marcador de superfcie nas CTM indiferenciadas (grficos brancos ou abertos) esta comparada com os isotipos controle (grfico preto). O eixo X representa a escala de fluorescncia, sendo positivo quando as clulas ultrapassam 10 de clulas avaliadas durante o evento. A) Grfico de pontos demonstrando a populao celular selecionada para o estudo (R1), que representou 43% de homogeneidade. As amostras da cultura revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 (B) e 93,89% de CD45 (C) e expresso positiva para 99,0% de CD90 (D) e 95,8% de CD 54 (E).
29
32
Figura 10: Animais apresentando secreo ocular escura (A e B); reas
de hipotricose (C e D).
33
Figura 11 Fotos dos animais dos grupos GC, GD e GDCTM nos dias 1, 5, 10 e 15 aps a criao da ferida cirrgica.
34
xi
Figura 12 Demonstrao grfica dos valores das mdias das repeties para ARL dos grupos do experimento; GC em azul, GD em vermelho e GDCTM em verde. O eixo Y do grfico representa o valor de ARL em cm, enquanto o eixo X representa as repeties DIA 0; DIA 1; DIA 3; DIA 5; DIA 10; DIA 12 e DIA 15.
35
Figura 13 Demonstrao grfica ilustrando o TEC dos grupos: GC em azul; GD em vermelho e GDCTM em verde. No eixo Y representa o valor de TEC em dias, enquanto o eixo X representa os animais (1, 2, 3 e 4) avaliados para TEC.
36
Figura 14 Neovascularizao indicada com setas vermelhas (A); Demarcao da deposio do colgeno de forma mais discreta na rea circulada e neovascularizao indicada pela seta preta (B)
38
Figura 15 Neovascularizao indicada com a seta vermelha (A); Borda da Ferida marcada com as setas pretas (B); deposio de colgeno demarcado pelas reas circulares e neovascularizao indicada com a seta lils (C e D).
40
Figura 16 Vasodilatao indicadas pelas setas pretas (A); Evidenciao e maior nmero de fibras colgenas recm formadas destacada na rea circular (B).
41
Figura 17 Fibras colgenas menos evidentes em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GD (A); Fibras colgenas mais espessas, logo mais evidentes em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GDCTM.
42
Figura 18 Imagem histopatolgica original contendo fibras colgenas (A); Imagem histopatolgica em preto e branco (B); Imagem corada em verde e vermelho, onde a colorao verde demarca as fibras colgenas (C).
45
Figura 19 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3 e 15 aps leso.
45
Figura 20 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GD nos dias 3, 7 e 15 aps leso.
46
Figura 21 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3, 7 e 15 aps leso.
46
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Apresenta a mdia em centmetros da rea da leso (ARL) dos animais dos grupos do experimento nos dias 1, 3, 5, 10, 12 e 15 aps a criao da ferida.
35
Tabela 2: Mdias dos valores encontrados para a varivel TEC em ratos wistar submetidos aos tratamentos com imunossupresso com dexametasona (GD), com soluo fisiolgica (GC), e Imunossupresso por dexametasona com transplante de clulas-tronco mesenquimais (GDCTM)
36
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
CTM = Clulas tronco mesenquimais
MO = Medula ssea
SID = Uma vez ao dia
PBS = Tampo de fosfato salina
PSA = Penicilina, estreptomicina, anfotericina B
pH = Potencial hidrogeninico
DMEM = Dulbeccoss modified eagle medium
SFB = Soro fetal bovino
C = Graus celsius
CO2 = Dixido de carbono
HE = Hematoxilina e eosina
ACTH = Hormnio adrenocorticotrpico
CRH= Hormnio liberador de corticotropina
mg= Miligrama
Kg= Quilograma
ADH= Hormnio antidiurtico
TNF= Fator de necrose tumoral
PDGF= Fator de crescimento derivado de plaqueta
CTS= Clulas tronco somticas
EGF= Fator de crescimento vascular
CTGF= Fator de crescimento do tecido conectivo
FCF= Fator de crescimento fibroblstico
ICF= Fator de crescimento insulnico
EPGF= Fator de crescimento epidermal
IM= Intramuscular
IV= Intravenosa
SC= Subcutnea
FC= Frequncia cardaca
FR= Frequncia respiratria
xiv
TR= Temperatura retal
FAPES= Fundao de apoio a pesquisa do Esprito Santo
UVV= Universidade Vila Velha
UFV= Universidade federal de Viosa
UFMG= Universidade federal de Minas Gerais
g= Gramas
ml= Mililitro
mm = Milmetro
mm2= Milmetro quadrado
GC = Grupo controle
GD= Grupo dexametasona
GDCTM= Grupo dexametasona clula tronco mesenquimais
ARL= rea da leso
TEC= Tempo de cicatrizao
FIC= Fibras colgenas
ANOVA= Anlise de varincia
xv
RESUMO
FARIA, Roberta Delessa, MSc., Universidade Vila Velha ES, setembro de 2013.
Efeitos da infuso de clulas tronco mesequimais sobre a cicatrizao de
feridas cutneas em ratos Wistar imunossuprimidos com dexametasona.
Orientadora: Betnia Souza Monteiro.
A cicatrizao ocorre de forma dinmica, restaurando o tecido lesionado ou substituindo-o
por colgeno. Os corticoides interferem em todas as fases da cicatrizao, a dexametasona
um glicocorticoide que possui atividade anti-inflamatria e imunossupressora elevada.
Com o uso cada vez mais frequente desses frmacos na clnica veterinria e
subsequentemente seus prejuzos, surge a possibilidade promissora da terapia com clulas
tronco mesenquimais (CTM). As CTM so capazes de promover a manuteno e
regenerao de mltiplas linhagens de clulas do organismo. Inmeros estudos veem sido
realizados testando a regenerao de leses teciduais atravs do uso destas clulas. As
CTM podem ser administradas no local da leso ou por infuso intravenosa, e so atradas
por quimiotaxia para os locais de leso. O presente trabalho visa analisar a resposta do
processo cutneo mediante o uso de CTM, que sero administradas por via intravenosa, em
feridas cirrgicas de ratos da linhagem Wistar medicados prviamente com corticosteroides
por 30 dias. Este experimento constituiu-se com 3 grupos: grupo controle (GC), onde os
animais receberam 0,2ml de NaCl 0,9% SC/SID durante 30 dias, e uma nica aplicao de
0,5ml de NaCl 0,9% IV 48 horas aps a cirurgia; grupo dexametasona (GD) cujos animais
receberam aplicaes de corticoide durante 30 dias e aps esse tempo foi realizada a ferida
cirurgia, e o grupo dexametasona CTM (GDCTM) cujos animais receberam corticoide da
mesma forma ao grupo anterior, no entanto, foram tratados com CTM 48 horas aps a
realizao da ferida cirrgica. As feridas cirrgicas dos animais do GC fecharam em mdia
14,75 dias aps a realizao da leso, os animais do GD tiveram suas feridas cirrgicas
fechadas em at 22 dias, j as feridas cirrgicas dos animais do GDCTM foram fechadas em
14 dias. Verificou-se que os animais imunossuprimidos com dexametasona (GD) tiveram um
processo de cicatrizao em mdia com 8 dias a mais, quando comparados aos demais
grupos e o tempo de cicatrizao do GC e GDCTM apresentaram-se muito prximo e a
escolha pela infuso por via intravenosa foi efetiva para ao das clulas no local da leso.
Palavras-Chave: Reparao tecidual, corticoide, clulas-tronco.
xvi
ABSTRACT
FARIA, Roberta Delessa, MSc, University Vila Velha -. ES, September 2013. Effects
of infusion of mesenchymal stem cells on the healing of skin wounds in rats
immunosuppressed with dexamethasone. Adviser: Betnia Souza Monteiro.
Healing occurs dynamically, restoring damaged tissue and replacing it with collagen.
Corticosteroids interfere at all stages of healing, Dexamethasone is a glucocorticoid
that possess anti-inflammatory and high immunosuppressive activity. With the
frequent use of these drugs in veterinary clinic and subsequently its losses, the
promising possibility of therapy with mesenchymal stem cells (MSCs) arises. MSCs
are capable of maintaining and promoting the regeneration of multiple lineages of
cells in the organisms. Numerous studies have been conducted testing the
regeneration of tissue injury through the use of these cells. MSCs can be
administered at the site of injury or by intravenous infusion, and are attracted by
chemotaxis to sites of injury. This study aims to analyze the response of the
cutaneous process through the use of MSC, which will be administered intravenously
in surgical wounds in Wistar rats previously treated with corticosteroids for 30 days.
This experiment consisted with 3 groups: control group (CG), where the animals
received 0.2 ml of 0.9% NaCl SC / SID for 30 days and a single application of 0.5 ml
of 0.9% NaCl IV 48 hours after surgery; dexamethasone group (GD) whose animals
received corticosteroid applications for 30 days and after the wound was performed,
and the dexamethasone group (GDCTM) whose animals received similarly to the
previous group corticosteroids, were treated with MSC However 48 hours after the
completion of the surgical wound . The surgical wounds of animals GC closed on
average of 14.75 days after the completion of the lesion, the animals of GD had their
surgical wounds closed within 22 days, since the surgical wounds of animals GDCTM
were closed in 14 days. It was observed that immunosuppressed animals with
dexamethasone (GD) had a 8 days of average healing process when compared with
the other groups and the healing time of GC and GDCTM presented numbers in
close proximity, the choice by infusion via intravenously was effective for the action
of cells at the injury site.
Key words: Tissue Repair, corticosteroids, stem cells
1
1- INTRODUO
Desde os primrdios da humanidade, o homem sempre tm buscado alternativas
para o tratamento de suas feridas cutneas. Diversos produtos, medicamentos e
terapias vm sendo empregados ao longo dos sculos com o objetivo de melhorar e
acelerar a reparao cicatricial (CAMPOS, et al.,2007; DEALEY, 2008). Atualmente,
muito se tem investido em pesquisas na compreenso dos fenmenos e processos
envolvidos nas fases da reparao dos tecidos e, principalmente, no
desenvolvimento de novos recursos e tecnologias objetivando impulsionar avanos
no tratamento de feridas (GARCEZ, 2012).
O processo cicatricial comum a todas as feridas, independentemente do agente
causador, sistmico e dinmico e est diretamente relacionado s condies
gerais do organismo. A cicatrizao de feridas consiste em perfeita e coordenada
cascata de eventos celulares, moleculares e bioqumicos que interagem para que
ocorra a reconstituio tecidual (MANDELBAUM, et al., 2003; CAMPOS, et al.,2007).
A cicatrizao o processo biolgico que restaura a continuidade do tecido aps
uma leso. Consiste em uma combinao de eventos fsicos, qumicos e celulares
que restaura um tecido lesionado ou o substitui por colgeno. As fases da
cicatrizao ocorrem simultaneamente, uma vez que a cicatrizao dinmica. A
cicatrizao influenciada por fatores do hospedeiro, caractersticas da ferida e
outros fatores externos (MANDELBAUM et al., 2003). Alguns medicamentos
retardam o processo de cicatrizao, tais como os corticoides, estes deprimem todas
as fases da cicatrizao e aumentam as chances de infeco (CAMPOS et al.,
2007). Os glicocorticoides so capazes de bloquear desde as manifestaes mais
precoces do processo inflamatrio como dor, calor e rubor at as mais tardias como
2
reparao e proliferao tecidual alm de apresentarem atividade imunossupressora
(SPINOSA, 1999).
Acredita-se que os glicocorticoides prejudicam a cicatrizao, diminuindo a
proliferao celular na neovascularizao e da produo de matriz celular. Em
animais foi relatado retardo do afluxo de macrfagos, neutrfilos e fibroblastos.
Adimite-se que os corticoides suprimam a fase inflamatria da cicatrizao, visto que
seu uso crnico possa influenciar a reepitelizao, a neovascularizao e a sntese
do colgeno (AGUILAR-NASCIMENTO et al., 2000; TENIUS et al., 2007). A
dexametasona um glicocorticoide sinttico extremamente potente e de longa
durao, isto porque, possui uma ligao reduzida com protenas plasmticas,
menor velocidade de excreo e maior afinidade com receptores. Tendo portanto,
sua atividade anti-inflamatria e imunossupressora ampliadas (TENIUS et al., 2007;
SPINOSA et al., 2011). Na tentativa de minimizar os prejuzos decorrentes da
administrao contnua de agentes anti-inflamatrios esteroidas, surge a perspectiva
promissora das terapias com clulas tronco mesenquimais (COLOM et al., 2008).
As clulas-tronco mesenquimais (CTM) so clulas multipotentes e com ampla
plasticidade, capazes de promover a manuteno e regenerao de mltiplas
linhagens de clulas do organismo (NAUTA & FIBBE 2007). Esse tipo celular tem
sido utilizado em numerosos estudos clnicos com a finalidade de regenerar leses
teciduais, como por exemplo, cicatrizao de feridas (KEATING, 2006). Atualmente
sabe-se que as CTM podem ser aplicadas diretamente no local da leso (intra-
lesional) isoladas ou combinadas com biomateriais (SCHWINDT et al. 2005,
OLIVEIRA et al.,2010) ou serem administradas ou por infuso intravenosa, pois so
atradas por quimiotaxia para os locais de leso (COLOM et al., 2008).
3
2-REVISO DE LITERATURA
2.1 Corticoides
As glndulas adrenais, presentes em todos os animais vertebrados so
pequenas estruturas ovaladas, bilaterais localizadas na parte anterior dos rins. Esta
consiste em dois seguimentos endcrinos primrios: um exterior, chamado crtex
adrenal, responsvel pela secreo de hormnios esteroides; e outro interno menor
denominado medula interna, responsvel pela secreo de catecolaminas,
noradrenalina e adrenalina (ENGELKING, 2010; JERIC E MARCO, 2011;
SPINOSA et al., 2011; SILVA et al., 2008 ).
O crtex adrenal subdivido em trs zonas, zona glomerulosa que mais
externa a qual produz mineralocorticoides, como principal exemplo a aldosterona
que responsvel pela manuteno do equilbrio hdrico e eletroltico; zona
fasciculada responsvel pela produo de glicocorticoides, que afetam o
metabolismo de carboidratos e protenas, apresentando atividade anti-inflamatria e
imunossupressora sendo os principais representantes a hidrocortisona (cortisol) e
corticosterona; a zona reticulada a mais interna, onde ocorre a produo de
andrgenos ou esteroides sexuais (SAMUELSON, 2007; ENGELKING, 2010;
SPINOSA et al., 2011. ).
Os corticoides so sintetizados e liberados quando necessrios no sendo
liberados na clulas adrenais (JERIC E MARCO, 2011; ROMO, 2012). O principal
regulador da atividade adrenocortical o hormnio da hipfise anterior, hormnio
adrenocorticotrfico (ACTH) ou corticotrofina. A secreo do ACTH regulada
4
parcialmente pelo hormnio liberador de corticotropina (CRH) de origem
hipotalmica sendo a secreo do CRH controlada pelas concentraes sanguneas
dos glicocorticoides (ENGELKING, 2010; JERIC E MARCO, 2011; ROMO, 2012).
Segundo Jeric e Marco (2011) o colesterol um intermedirio obrigatrio na
sntese de corticoides. Nas espcies canina e felina a produo de cortisol em um
perodo de vinte e quatro horas de cerca de 1 mg/kg. O fgado responsvel por
cerca de 70% do metabolismo dos corticoides. Em sua maioria estes compostos so
excretados por via renal, uma parte dos corticoides so adicionados bile e
excretados pela rota intestinal (PEREIRA et al., 2007 e SAMUELSON, 2007).
Os hormnios glicocorticoides so agentes hiperglicemiantes tendo seu efeito
de inibio da captao e da utilizao perifrica da glicose e promoo da
gliconeognese a partir de aminocidos e cidos graxos livres (JERIC E MARCO,
2011; CHAMUSCA, 2012). Alm destes efeitos, interferem no metabolismo proteico,
aumentando o catabolismo e diminuindo a sntese de protenas, h uma
transformao generalizada de protena muscular em aminocidos para
gliconeognese heptica (PAPICH, 2009; CHAMUSCA, 2012).
O cortisol e alguns glicocorticoides sintticos como a dexametasona, em
concentraes farmacolgicas podem apresentar alguns efeitos mineralocorticoides
promovendo a reteno de sdio, a excreo de potssio e expanso do volume
extracelular. O cortisol tambm suprime a liberao do hormnio antidiurtico (ADH)
diminuindo o efeito deste sobre os tbulos coletores, portanto poliria e polidipsia
so evidentes (SILVA et al., 2008; PAPICH, 2009; JERIC E MARCO, 2011;
SPINOSA et al., 2011).
Os glicocorticoides antagonizam as aes da insulina no metabolismo da
glicose inibindo a captao da mesma pelos tecidos, sendo assim considerados
5
agentes hiperglicemiantes como anteriormente citado, onde promovem a polifagia
(SAMUELSON, 2007; PAPICH, 2009; ROMO, 2012).
De acordo com Engelking (2010) o cortisol possui efeito inotrpico no msculo
esqueltico causando protelise muscular e consequentemente reduo da massa
muscular e da fora (principalmente fibras musculares tipo I). Este hormnio tambm
aumenta a sntese de lipase de triglicerdeos adipcitos, elevando as aes de
hormnios lipolticos e diminuindo a captao de glicose nos adipcitos reduzindo
assim a deposio de triglicerdeos, induzindo assim a redistribuio de gordura nas
reas centrpetas.
O metabolismo de clcio tambm afetado pelo uso de glicocorticoides
atravs do aumento da excreo urinria do mesmo, causado pela reabsoro renal
com consequente hipercalciria e absoro intestinal de clcio diminuda. Em
excesso, os corticoides levam portanto, a uma diminuio da formao de ossos e
aumento na reabsoro ssea (PEREIRA et al., 2007; ENGELKING, 2010).
O uso prolongado de corticoides pode levar a inibio da sntese de colgeno
e atividade de fibroblastos, produzindo adelgaamento da pele e das paredes dos
capilares (SCOTT et al., 1996; TENIUS et al.,2007; ENGELKING, 2010).
O cortisol aumenta o nmero de eritrcitos circulantes uma vez que estimula a
produo e diminui a destruio dos mesmos, aumenta tambm o nmero de
plaquetas e neutrfilos circulantes, podendo causar portanto uma leucocitose. O uso
de corticoide diminui o nmero de linfcitos, eosinfilos e basfilos circulantes quatro
a seis horas aps sua administrao por meio da redistribuio dessas clulas para
longe da periferia e no pelo aumento da sua destruio. Diminui a massa de tecido
linfoide atravs da inibio direta da mitose, sendo por isso utilizado do tratamento
de linfomas e leucemia linfoctica (PEREIRA et al., 2007). De acordo com Engelking
6
(2010) a involuo de ndulos linfticos e rgos linfticos como timo e bao, causa
diminuio da produo de anticorpos, o que pode ajudar na reduo de uma
resposta imune de um rgo transplantado.
O uso crnico de glicocorticoides pode conduzir a um estado de
hipercoagulabilidade sangunea, isto se deve em parte ao aumento de fatores pr-
coagulantes tais como II, V, VII, IX, X, XII e fibrognio, e tambm a diminuio de um
fator natural anticoagulante, a antitrombina (SCOTT et al., 1996; TENIUS et al.,2007;
ENGELKING, 2010; CHAMUSCA, 2012).
Altos nveis de cortisol inibem a fosfolipase A2 e a cicloxigenase reduzindo a
biosntese de prostaglndinas, tromboxanos e leucotrienos. A inibio da sntese de
leucotrienos atrapalha a fagocitose de neutrfilos. Ocorre a interferncia na
elaborao de histamina, logo nas aes desta sobre a mediao da resposta
inflamatria (hiperemia local e edema). O cortisol estabiliza as membranas
lisossomais reduzindo a liberao de enzimas hidrolticas aps uma leso a celular
diminuindo a reao inflamatria (PEREIRA et al., 2007; ENGELKING, 2010;
CHAMUSCA, 2012).
Embora os efeitos antinflamatrios e imunossupressores dos glicocorticoides
possam ser teis no tratamento de diversos estados patolgicos, quando os
mesmos so administrados terapeuticamente por longos perodos podem levar a um
aumento da suscetibilidade a infeces fngicas e virais, permitindo ento, a
disseminao desses microorganismos, atraso da cicatrizao de feridas, agravar os
sintomas de diabetes melito, osteoporose, distrbios neurolgicos, e levar ao
hiperadrenocorticismo iatrognico (TENIUS et al.,2007; ENGELKING, 2010;
ROMO,2012).
7
2.2 Anatomia e Fisiologia da Pele
A pele, ou tegumento, forma o revestimento e a principal barreira de proteo
do organismo, e tem como funes bsicas impedir a perda excessiva de lquidos,
proteger da ao de agentes externos, manter a temperatura corprea, agir como
rgo do sentido e participar da termorregulao (OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI,
2011; GARCEZ, 2012).
A pele formada por duas camadas distintas, a epiderme e a derme,
firmemente unidas entre si (Figura 1). A epiderme a poro mais superficial,
continuamente renovada e organizada em camadas (basal, granulosa, espinhosa,
lcida e queratinosa), apresentando trs diferentes linhagens celulares com
caractersticas e funes diferentes. Os queratincitos, so as clulas mais
abundantes e importantes da epiderme. Os melancitos, que so clulas
dendrticas, que produzem e secretam o pigmento melanina, que d a colorao a
pele e exerce tambm uma funo protetora contra os raios violetas. As clulas de
Langerhans, so clulas dendrticas apresentadoras de antgenos, atuando no
sistema imunolgico (DYCE et al.,1990; GARCEZ, 2012).
8
Figura 1 Estrutura da Pele e seus anexos (FONTE: BEAR et al., 2008).
2.3 Cicatrizao Cutnea
O processo de cicatrizao comum a todas as feridas, independentemente
do agente que a causou, sistmico, dinmico e est diretamente relacionado s
condies gerais do organismo (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007;
OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012).
A cicatrizao de feridas consiste em uma perfeita e coordenada cascata de
eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentao e
a reconstituio do tecido (MANDELBAUM et al., 2003).
A regenerao ocorre mediante a perda tecidual e pode atingir a derme
completa ou incompletamente, ou mesmo atingir todo o rgo, alcanando o tecido
celular subcutneo (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI,
2011; GARCEZ, 2012).
9
Os mecanismos da cicatrizao foram descritos por Carrel em 1910, e
posteriormente foram divididos em cinco elementos principais: inflamao,
proliferao celular, formao do tecido de granulao, contrao e remodelao da
ferida (CAMPOS et al., 2007).
Existem autores que consideram trs estgios no processo de cicatrizao:
iniciando com um estgio inflamatrio, seguido por um estgio de proliferao e
finalizado com o reparo em um estgio de remodelao (Figura 2). Outros autores
classificam de uma forma mais completa, dividindo o processo em cinco fases
principais (MANDELBAUM et al., 2003).
2.3.1 Coagulao
O incio imediato aps o surgimento da ferida, e depende da atividade
plaquetria e da cascata de coagulao. A formao do cogulo serve no somente
para juntar as bordas da ferida, mas tambm para transpor a fibronectina,
oferecendo assim uma matriz provisria, onde os fibroblastos, clulas endoteliais e
queratincitos possam dar entrada na ferida (MANDELBAUM et al., 2003;
OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012).
10
2.3.2 Inflamao
Extremamente ligada a fase anterior, a inflamao depende, alm de
inmeros mediadores qumicos, das clulas inflamatrias, como neutrfilos,
macrfagos e linfcitos (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007;
OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011).
Os neutrfilos so as primeiras clulas a chegar ferida, e permanecem por
um perodo que varia de trs a cinco dias. Os neutrfilos produzem radicais livres
que auxiliam na destruio bacteriana e so gradativamente substitudos por
macrfagos (CAMPOS et al., 2007; GARCEZ, 2012).
O macrfago a clula inflamatria considerada a mais importante dessa
fase. Este permanece do terceiro ao dcimo dia, fagocitando bactrias, desbridando
corpos estranhos e direcionando o desenvolvimento do tecido de granulao. Sua
maior contribuio a secreo de citocinas e fatores de crescimento, alm de
contriburem na angiognese, fibroplasia e sntese de matriz extracelular,
fundamentais para a transio para a fase proliferativa (MANDELBAUM et al., 2003;
GARCEZ, 2012).
Os linfcitos aparecem na ferida em aproximadamente uma semana. Seu
papel no bem definido, porm sabe-se que tem importante influncia sobre os
macrfagos (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al.,2007).
A fase inflamatria, alm de ter os mediadores qumicos e as clulas
inflamatrias, conta tambm com a importante funo da fibronectina. Esta
sintetizada por uma variedade de clulas como fibroblastos, queratincitos e clulas
endoteliais. A fibronectina adere, simultaneamente, fibrina, ao colgeno e a outros
tipos de clulas, funcionando assim como cola para consolidar o colgeno de fibrina,
11
as clulas e os componentes de matriz (CAMPOS et al., 2007; OLIVEIRA, 2010;
GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).
2.3.3 Proliferao
Dividida em quatro subfases (epitelizao, angiognese, formao de tecido
de granulao e deposio de colgeno), a proliferao responsvel pelo
fechamento da leso propriamente dita (MANDELBAUM et al., 2003; GIANOTTI,
2011).
A primeira das fases da proliferao a epitelizao, onde ocorre a migrao
de queratincitos no danificados das bordas das feridas e dos anexos epiteliais
(CAMPOS et al.,2007).
A angiognese, segunda fase da proliferao, estimulada pelo fator de
necrose tumoral (TNF-), e caracterizada pela migrao de clulas endoteliais e
formao de capilares, essencial para a cicatrizao adequada (GARCEZ, 2012).
A parte final da fase proliferativa a formao de tecido de granulao
(coleo de elementos celulares, incluindo fibroblastos, clulas inflamatrias e
componentes neovasculares e da matriz, como a fibronectina, as
glicosaminoglicanas e o colgeno). Os fibroblastos e as clulas endoteliais so as
principais clulas da fase proliferativa. Os fibroblastos dos tecidos vizinhos migram
para a ferida, porm precisam ser ativados para sarem de seu estado de repouso.
O fator de crescimento mais importante na proliferao e ativao dos fibroblastos
o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), em seguida liberado o fator
de necrose tumoral (TNF-), que estimula os fibroblastos a produzirem colgeno
12
tipo I (incio da deposio de colgeno) e a transformar-se em miofibroblastos, estes,
promovem a contrao da ferida (CAMPOS et al., 2007; DEL CARLO et al., 2008).
2.3.4 Contrao da Ferida
A contrao de ferida consiste no movimento centrpeto das bordas da ferida,
em sua espessura total. Uma ferida com espessura total tem contrao mesmo
quando h enxertos, que diminuem em 20% o tamanho da ferida. Em cicatrizes por
segunda inteno a contrao pode reduzir 62% da rea de superfcie da leso
cutnea (MANDELBAUM et al., 2003).
2.3.5 Remodelao
Esta a ltima das fases, ocorre no colgeno e na matriz, pode durar meses
e responsvel pelo aumento da fora de tenso e pela diminuio do tamanho da
cicatriz e do eritema. Reformulaes dos colgenos, melhoria nos componentes das
fibras colgenas e reabsoro de gua, so eventos que permitem uma conexo
que aumenta a fora da cicatriz e diminui sua espessura (MANDELBAUM et al.,
2003; TENIUS et al., 2007; GIANOTTI, 2011).
A neovascularizao diminui, e posteriormente a cicatriz considerada
avascular (OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011).
13
A caracterstica mais importante dessa fase a deposio de colgeno de
maneira organizada, por isso a mais importante clinicamente. Com o tempo, o
colgeno inicial reabsorvido e um colgeno mais espesso produzido e
organizado ao longo das linhas de tenso. A reorganizao da nova matriz um
processo importante da cicatrizao. Fibroblastos e leuccitos secretam
colagenases que promovem a lise da matriz antiga. A cicatrizao tem sucesso
quando h equilbrio entre a sntese da nova matriz e a lise da matriz antiga,
havendo sucesso quando a deposio maior (CAMPOS et al., 2007, TENIUS et
al., 2007; SIMES et al., 2010; OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).
Figura 2 Fases da cicatrizao correlacionadas com a especificidade imune-celular. (Fonte: adaptado por GARCEZ, 2012).
14
2.3.6 Consideraes sobre o Colgeno
O colgeno a protena mais importante do tecido conectivo em processo de
cicatrizao. A degradao do colgeno se inicia precocemente e muito ativa
durante o processo inflamatrio. A sua digesto ocorre no ambiente extracelular e
mediada por colagenases especficas. A atividade das colagenases controlada por
citocinas liberadas principalmente por clulas inflamatrias, endoteliais, fibroblastos
e queratincitos. A formao da matriz extracelular resultante da deposio
(sntese) e degradao do colgeno. O colgeno o principal componente da matriz
extracelular dos tecidos, este estrutura-se em rede densa e dinmica resultante da
sua constante deposio e reabsoro (CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI, 2011).
2.3 Clulas tronco Mesenquimais (CTM)
Clulas tronco so clulas indiferenciadas, onde suas principais
caractersticas que as tornam extremamente interessantes so: sua capacidade de
autorrenovao, ou seja, so capazes de se multiplicar, mantendo seu estado
indiferenciado, proporcionando uma reposio ativa de sua populao de maneira
constante nos tecidos; e, ainda mais interessante, sua capacidade de se diferenciar
em diversos tipos celulares. Desta forma, acredita-se que clulas tronco presentes
nos diferentes tecidos tenham papel regenerativo quando estes sofrem uma leso
15
ou injria (CABRAL et al., 2008; DEL CARLO et al., 2008; BYDLOWSKI et al., 2009;
PINTO FILHO et al., 2013).
As CTM so definidas como uma populao de clulas tronco somticas
presentes em regies perivasculares de todos os tecidos adultos, em pequenas
quantidades, incluindo a medula ssea, o tecido adiposo, o peristeo, o tecido
muscular e rgos parenquimatosos (MEIRELLES et al., 2008; BYDLOWSKI et al.,
2009; MONTEIRO et al., 2010; PINTO FILHO et al., 2013).
A medula ssea (MO) constitui um dos principais stios para a obteno
dessas clulas, assim como de clulas tronco hematopoiticas e endoteliais
(MONTEIRO et al., 2010; PINTO FILHO et al., 2013).
As CTM caracterizam-se por ser uma populao de clulas multipotentes
capazes de se diferenciar e produzir qualquer tipo celular necessrio em um
processo de reparao, como osteoblastos, condroblastos, hepatcitos, neurnios,
clulas epiteliais, renais, cardacas, dentre outras. Essas caractersticas de
plasticidade sugerem que esse tipo celular o responsvel pelo turnover e pela
manuteno de todos os tecidos do organismo (DEL CARLO et al., 2008;
BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al., 2010).
As CTM tornaram-se foco de inmeras pesquisas em todo o mundo devido ao
fato de fornecer perspectivas clnicas promissoras para terapia celular (CABRAL et
al., 2008; DEL CARLO et al., 2008; BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al.,
2010; PINTO FILHO et al., 2013).
As CTM so uma populao heterognea de clulas que proliferam, in vitro,
como clulas aderentes ao plstico, tendo morfologia semelhante ao fibroblasto,
capacidade de autorrenovao e diferenciao em tipos celulares distintos
(BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al., 2010).
16
Dentre todas as linhagens de clulas tronco somticas (CTS) estudadas at o
presente momento, as CTM apresentam maior plasticidade, originando tecidos
mesodermais e no mesodermais. Essas clulas podem ser transplantadas para os
stios lesionais logo aps a ocorrncia da injria tecidual e podem ser aplicadas na
forma indiferenciada, recebendo o estmulo do meio para posteriormente se
diferenciar, ou sofrer diferenciao em cultura antes da implantao (DEL CARLO et
al., 2009).
No processo de cicatrizao cutnea, o TGF-, ativinas, fator de crescimento
vascular (EGF), PDGF, fator de crescimento do tecido conectivo (CTGF), fator de
crescimento fibroblstico (FGF), fator de crescimento insulnico (IGF) e o fator de
crescimento epidermal (EPGF) contribuem para a organizao do tecido conjuntivo e
formao de queratincitos (BYDLOWSKI et al., 2009).
medida que o processo cicatricial avana, os estmulos mesenquimais so
ultrapassados pelos estmulos ectodermais. O TGF-, por exemplo, durante a fase
aguda da inflamao, inibe a diferenciao de queratincitos, entretanto, durante a
fase de reepitelizao, estimula a migrao dos queratincitos pela matriz de
fibronectina neoformada. O EPGF, por outro lado, inibe a apoptose de queratincitos
e diminui a resposta celular ao estmulo do TGF- e FGF (DEL CARLO et al., 2008).
Oliveira (2010) utilizou CTM em feridas ocasionadas por queimaduras em
ratos e concluiu que estas foram efetivas ao promoverem uma melhora da
cicatrizao, bem como o fechamento mais rpido das feridas em relao aos
animais do grupo controle da pesquisa.
Garcez (2012) analisou a associao de CTM e plasma rico em plaquetas
como adjuvantes da cicatrizao de leses cutneas e concluiu que a terapia com
17
CTM promoveu cicatrizes esteticamente melhores na avaliao clnica quando
comparado com os animais do grupo controle do experimento.
18
3 OBJETIVOS
Objetivos gerais:
Avaliar a contribuio teraputica da infuso endovenosa de CTM para a
cicatrizao cutnea de feridas cirrgicas em ratos Wistar imunossuprimidos com
dexametasona.
Objetivos especficos:
1 Aferir os efeitos da imunossupresso com dexametasona sobre as
variveis tempo de cicatrizao (TEC) e rea da leso (ARL) de feridas cutneas
cirrgicas de ratos;
2 Quantificar histopatolgicamente o percentual de deposio de colgenos
das feridas cutneas cirrgicas de ratos imunossuprimidos com dexametasona
tratados ou no com CTM;
3 Identificar se h efeito do tratamento com CTM sobre a reduo do tempo
de cicatrizao (TEC) e rea de leso (ARL) das feridas cutneas de ratos
imunossuprimidos com dexametasona.
19
4 - MATERIAL E MTODOS
A realizao do estudo obedeceu a lei federal 6.638 das normas do Colgio
Brasileiro de Experincia Animal (Cobea). O presente projeto foi aprovado pelo
Comit de tica em Pesquisa e Experimentao com Animais, da Universidade Vila
Velha (UVV), protocolado sob-registro: 249/2013.
Foram utilizados 35 ratos fmeas (Rattus novergicus albinus) da linhagem
Wistar, de dezesseis semanas de idade, pesando aproximadamente 300 gramas (g),
oriundos do Laboratrio de Acompanhamento Experimental do Campus Nossa
Senhora da Penha da Universidade Vila Velha (UVV).
Os animais foram mantidos em um ambiente com controle de temperatura em
23oC, umidade relativa de 55%, e fotoperiodo de 12 horas, alojados em grupos de 5
animais em cada caixa de polipropileno de dimenses 414mm x 344mm x 168mm
padronizadas para a espcie, todas as caixas eram higienizadas a cada 48 horas.
Os animais tiveram acesso irrestrito a uma dieta padro (rao comercial para
roedores) e gua filtrada.
Antes do incio do experimento, todos os animais foram vermifugados com
Ivermectina a 2% na dose de 0,4 mg/kg por via oral acrescidos em bebedouros de
700ml de gua com repetio aos 10 dias anteriores ao procedimento cirrgico.
20
4.1 Isolamento, caracterizao e expanso de CTM
Para essa fase foram utilizados dois ratos Wistar filhotes, como doador de
CTM, conforme metodologia descrita por Monteiro et al. (2012). Essa etapa foi
realizada em parceria com colaboradores da Universidade Federal de Viosa (UFV)
e do Laboratrio de Biologia Celular da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG).
Os animais foram submetidos eutansia em cmara anestsica, com
inalao passiva, at a sobredosagem de isoflurano. Foi realizada tricotomia do
abdmen e membros plvicos e em seguida os animais foram transferidos para
capela de fluxo horizontal. Foi realizada dissecao da musculatura do quadrceps e
o fmur do antmero direito e esquerdo foram retirados de forma assptica. As
epfases distais foram seccionadas e na epfase proximal foi acoplado uma agulha
(23G) e uma seringas de 10 mL contendo meio de cultura DMEM completo
(Dulbeccos Modified Eagle Medium - Gibco), acrescido de penicilina, estreptomicina
e anfotericina B (PSA) (Gibco, Paisley, UK) e apresentando pH 7,2, para lavar o
canal medular.
As clulas foram plaqueadas inicialmente na concentrao de 5x106 clulas
em frascos de cultura celular de 75 mm2 (Sarstedt, Nmbrecht, Alemanha) e
mantidas em estufa 37C com 5% de CO2. O aumento do nmero de clulas foi
acompanhado diariamente, com auxlio de microscpio invertido. Os meios de
cultura foram trocados mediante a necessidade e as tripsinizaes e passagens
21
realizadas quando visualizado 80% de expanso celular nas placas, at a quarta
passagem.
Uma alquota das clulas da quarta passagem foi caracterizada por citometria
de fluxo atravs da anlise de expresso de molculas de superfcie celular para CD
34, CD 45, CD 90 e CD 54, utilizando citmetro de fluxo FACScan e software
CellQuest, obtendo-se 30.000 eventos por amostra testada.
Outra alquota de clulas de quarta passagem foi submetida a etapas de
diferenciao osteognica. As clulas aderentes foram desprendidas com tripsina,
contadas e replaqueadas em placa de 6 poos, com lamnulas de 22 mm de
dimetro, com meio de cultura DMEN enriquecido com 10% de SFB, 10-8mol/mL de
dexametasona (Sigma, St Louis MO, USA), 5,0g/mL de cido ascrbico 2-fosfato
(Sigma, St Louis MO, USA) e 10,0mmol/L de -glicerofosfato (Sigma, St Louis MO,
USA) e incubado a 37C por quatro semanas. No 30 dia aps a colocao das
clulas no meio osteognico as lamnulas foram lavadas em PBS e coradas pelo
mtodo de Von Kossa para observar a deposio de clcio.
Aps a quarta passagem, as clulas foram tripsinizadas, observadas em
microscopia ptica para a avaliao da viabilidade celular, submetidas a contagem
em cmara de neubauer e aliquotadas na concentrao de 9 x 106 clulas/0,5 mL de
PBS. Cada alquota foi armazenada em seringa de 1,0 mL, acondicionada em caixa
de isopor sem gelo, aguardando o momento do transplante.
22
4.2 Procedimentos anestsicos, cirrgicos e tratamentos
Trinta dias antes do procedimento cirrgico, 25 animais foram pesados
individualmente, identificados com brincos de numerao na orelha esquerda e
distribuidos aleatoriamente em 2 grupos (Figura 3). Estes grupos foram
diferenciados quanto ao tratamento conforme a lista abaixo e observados
diariamente por 2 meses consecutivos:
Grupo Controle (GC): formado por cinco (5) animais que receberam
aplicaes de 0,2 ml soluo fisiolgica (NaCl 0,9%) a cada 24 horas
por via subcutnea (SC) durante 30 dias consecutivos.
Grupo Dexametasona (GD): formado por vinte animais (20) que
receberam aplicaes a cada 24 horas de dexametasona na dose de
0,1 mg/kg por via SC durante 30 dias consecutivos, conforme
metodologia proposta por Tnius et al (2007).
Aps o trmino de 30 dias da administrao de dexametasona, antecedendo
ao ato cirrgico, todos os animais foram submetidos a anestesia por meio de injeo
intramuscular (IM) de uma associao de cetamina 10% (20mg/kg), xilazina 2%
(4mg/kg), midazolan 0,5% (2,5mg/kg) e morfina 1% (1,0 mg/kg) (Figura 4). Aps a
perda do reflexo de endireitamento foi realizado tricotomia da regio dorsal (Figura
5A), seguida por anti-sepsia da rea tricotomizada com soluo de clorexidine
degermante e lcool 70%.
O plano anestsico foi monitorado de acordo com a ausncia de movimentos
e perda do reflexo de pinamento da cauda e dos dgitos, alm da avaliao clnica
23
dos parmetros relacionados a frequncia cardaca (FC), frequncia respiratria
(FR) e temperatura retal (TR). Os animais receberam antibioticoterapia profiltica
com enrofloxacina 10% (10mg/kg) por via SC no trans-operatrio.
Figura 3 Animal do grupo GC recebendo anestesia geral por via IM.
4.3 Plano cirrgico
Aps a anti-sepsia, foi realizada a marcao da rea da ferida cirrgica com
tinta de carimbo atxica (Figura 4B), e posteriormente, delimitou-se o campo
operatrio com gaze estril (Figura 4C). Foi confeccionada uma ferida cirrgica
circular de aproximadamente 1,5 cm de dimetro, com remoo da pele na regio
24
dorsal (Figura 4D). As bordas da leso foram suturadas a musculatura circunvizinha,
com fio monofilamentoso, no absorvvel (Nylon 3.0) em pontos simples separados,
visando minimizar o efeito de retrao das bordas da leso. As feridas cutneas de
todos os animais foram limpas diariamente, com gaze estril umedecida em soluo
fisiolgica.
Figura 4 Animal tricotomizado (A); rea padronizada demarcada na pele com tinta de carimbo (B); rea padronizada demarcada na pele com tinta de carimbo j com campo operatrio (C); Ferida cirrgica sem fixao das bordas (D).
25
4.4 Tratamento
Aps o procedimento cirrgico, os 20 animais do GD foram subdivididos
aleatoriamente em dois grupos com 10 animais cada, que foram diferenciados
quanto ao tratamento (Figura 3), com forme a lista abaixo:
Grupo Dexametasona (GD): formado por quinze animais que
receberam uma nica aplicao de 0,5 ml soluo fisiolgica (NaCl
0,9%) por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica e
acompanhados por mais 30 dias.
Grupo Dexametasona Clulas Tronco Mesenquimais (GDCTM):
formado por quinze animais que receberam o transplante de CTM, na
concentrao de 9x106 clulas/ml (volume final de 0,5 ml), em
aplicao nica, por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica
(Figura 6).
Os Animais do GC receberam uma nica aplicao de 0,5 ml soluo fisiolgica
(NaCl 0,9%) por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica. O local de
aplicao intravenosa, em todos os animais do estudo, foi a veia lateral da cauda.
26
Figura 5 Organograma ilustrando os animais do experimento e como os mesmos foram divididos nos grupos de tratamento recebido.
Figura 6 Rato Wistar recebendo infuso de CTM, pela veia lateral da cauda, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica.
27
4.5 Avaliao clnica
Em todos os animais foram acompanhados os parmetros peso, ingesto
hdrica e alimentar e inspeo das feridas uma vez ao dia at total cicatrizao da
leso cutnea.
Em quatro animais de cada grupo, escolhidos de forma aleatria e mantidos
durante todo o perodo de observao, as feridas foram fotografadas diariamente
para a avaliao das variveis rea da leso (ARL) e tempo de cicatrizao (TEC),
conforme metodologia proposta por Arglo-Neto et al. (2012). Para isso, foram
padronizados a intensidade de luz e altura da maquina fotogrfica digital por meio de
um suporte em acrlico. As imagens foram transferidas a um computador e avaliadas
com programa especifico de analise fotogrfica, o Image Pro Plus, para
mensurao da rea da ferida cirrgica (Figura 7).
28
Figura 7 Imagem ilustrativa da mensurao da ARL nos dias 1, 5 e 10 aps a criao da ferida cirrgica, atravs do programa Image Pro Plus, no qual os traos em amarelo demonstram o contorno da rea da ferida.
De cada individuo foram obtidas mdias dos valores encontrados para as
variveis rea da leso e tempo de cicatrizao. A partir da mdia de cada varivel
para cada animal do grupo correspondente, foi obtida a mdia dos grupos.
4.6 Bipsia e procedimentos histolgicos
Os demais 6 animais de cada grupo foram escolhidos de forma aleatria e
submetidos a eutansia por sobredosagem anestsica com isoflurano, nos dias 3, 7
e 15 aps a interveno cirrgica (2 animais por dia). Em seguida, os ratos foram
contidos em mesa cirrgica para a realizao de biopsia incisional onde coletou-se
toda a rea da ferida com uma pequena margem de pele integra (Figura 8).
29
Figura 8 Animais eutanasiados aos 3 (A), 7 (B) e 15 (C) dias respectivamente, aps a criao da ferida cirrgica. Em destaque ,(retngulo) a rea de tecido coletada envolvendo a ferida cirrgica e a pele intacta, que foi encaminhada histopatologia.
As amostras de pele foram fixadas em paraformaldedo tamponado a 10% por
24 horas e encaminhadas para exame histopatolgico. As amostras de pele foram
fixadas em paraformaldedo tamponado a 10% por 24 horas e, em seguida,
desidratadas em solues de concentraes crescentes de etanol (70, 80, 90 e
100%), diafanizadas em xilol, includas em parafina histolgica e seccionadas em
micrtomo rotativo, ajustado para 4m de espessura. Os cortes foram fixados em
lmina de vidro e corados com Tricrmio de Mallury para identificao e
quantificao das fibras colgenas, (Ferrera et al., 2003) e hematoxilina e eosina.
Os cortes histopatolgicos corados pelo mtodo de Tricrmio de Mallury
foram observados em microscpio ptico conectado a um microcomputador
equipado com um software de captura de imagem. Para permitir a quantificao de
fibras colgenas (FIC) foram registradas trs imagens de trs diferentes campos de
cada parte dos cortes histolgicos, utilizando-se objetiva de 10X. Depois de
capturadas, as imagens foram analisadas por meio de um programa de anlise de
imagens, Cellprofiler com o objetivo de avaliar a proporo de fibras colgenas
30
presentes na rea pr-determinada. O programa foi calibrado para o estudo,
padronizando a colorao das fibras colgenas a serem quantificadas na rea de
1mm2 e, a partir destas, calculada as mdias dos grupos.
4.7 Avaliao estatstica
A tabulao dos dados e avaliao estatstica foi realizada com o auxilio de
planilhas eletrnicas de Excel.
Os valores mensurados para ARL e TEC, foram submetidos a analise de
varincia (ANOVA) e teste de Tukey a 5% para comparao da diferena mnima
significativa das mdias de cada tratamento.
5 - RESULTADOS
5.1- Cultura celular
A medula ssea foi capaz de propiciar uma cultura heterognea,
composta por clulas arredondadas, no aderentes e micelas lipdicas no
31
sobrenadante da cultura nas primeiras 24 horas. A partir do oitavo dia, a populao
celular apresentava-se mais homognea, com predominncia das clulas aderentes
de morfologia fibroblastide, organizada em colnias.
A citometria de fluxo foi realizada com uma amostra de cultura de quarta
passagem de clulas e GFP demonstrou que cerca de 43% das clulas
homogneas revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 e 93,89% de
CD45 e expresso positiva para 99,0% de CD90 e 93,89% de CD90 e 95,8% de
CD54 (Figura 9). O conjunto de marcadores utilizados permitiu inferir que a
populao isolada e cultivada era homognea com marcadores positivos para CTM
e, claramente distinta da linhagem hematopoitica.
32
Figura 9 - Avaliao da frequncia de CD 34, CD 45, CD 90 e CD 54 por citometria
de fluxo em clulas tronco mesenquimais (CTM) oriundas da medula ssea de ratos Wistar. A intensidade de fluorescncia de cada marcador de superfcie nas CTM indiferenciadas (grficos brancos ou abertos) esta comparada com os isotipos controle (grfico preto). O eixo X representa a escala de fluorescncia, sendo positivo quando as clulas ultrapassam 10 de clulas avaliadas durante o evento. A) Grfico de pontos demonstrando a populao celular selecionada para o estudo (R1), que representou 43% de homogeneidade. As amostras da cultura revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 (B) e 93,89% de CD45 (C) e expresso positiva para 99,0% de CD90 (D) e 95,8% de CD 54 (E).
33
5.2 Alteraes clnicas
Os animais do experimento que receberam aplicaes SC de
dexamentasona, apresentaram reduo do peso corporal com 7 dias de aplicao
do corticoide. Com 14 dias de aplicao do corticoide 8 animais apresentaram
secreo ocular de colorao vermelho-amarronzada e regies de hipotricose
(Figura 10). No momento da cirurgia, apenas a hipotricose persistia. A partir de 7
dias aps a cirurgia observou-se discreto ganho de peso em todos os animais.
Figura 10 - Animais apresentando secreo ocular escura (A e B); reas de
hipotricose (C e D).
34
5.3 Avaliao macroscpica
Em todos os animais as feridas apresentaram-se ressecadas, eritemato
crostosas e no exsudativas, que regrediram lentamente at a perda da crosta
superficial e epitelizao (Figura 11).
Figura 11 Fotos dos animais dos grupos GC, GD e GDCTM nos dias 1, 5, 10 e 15 aps a criao da ferida cirrgica.
As imagens capturadas de 4 animais de cada grupo do experimento foram
avaliadas para ARL pelo programa Image Pro Plus, posteriormente foi realizada a
mdia de cada grupo (Tabela 1) para realizao da anlise de varincia e teste de
35
Tukey a 5% (Figura 12), onde constatou-se que no houve diferena de significncia
nos tratamentos.
Tabela 1 Apresenta a mdia em centmetros da rea da leso (ARL) dos animais dos grupos do experimento nos dias 1, 3, 5, 10, 12 e 15 aps a criao da ferida.
GRUPO DIA 0 DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 10 DIA 12 DIA 15
GC 3,337a 2,229 a 1,780 a 1,543 a 0,542 a 0,093 a 0,000 a
GD 3,215 a 2,804 a 2,748 a 2,439 a 0,967 a 0,652 a 0,368 a
GDCTM 3,738 a 2,541 a 2,288 a 2,035 a 0,589 a 0,113 a 0,000 a
Pares de mdias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia.
Figura 12 Demonstrao grfica dos valores das mdias das repeties para ARL dos grupos do experimento; GC em azul, GD em vermelho e GDCTM em verde. O eixo Y do grfico representa o valor de ARL em cm, enquanto o eixo X representa as repeties DIA 0; DIA 1; DIA 3; DIA 5; DIA 10; DIA 12 e DIA 15.
O tempo de cicatrizao (TEC) foi observado diariamente em quatro animais
de cada grupo do experimento. Conforme pode ser observado na tabela 6, as feridas
cirrgicas dos animais do GC fecharam em at 15 dias aps a realizao da leso.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
DIA 0 DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 10 DIA 12 DIA 15
Controle
DEXA
CTM
36
Os animais do GD tiveram suas feridas cirrgicas fechadas em at 22 dias, j as
feridas cirrgicas dos animais do GDCTM foram fechadas em at 14 dias.
Com base nos resultados do TEC dos grupos, realizou-se anlise de varincia
(ANOVA) e teste de Tukey 5%, onde observou-se que houve diferena de
significncia entre os tratamentos (Tabela 6).
Tabela 2 - Mdias dos valores encontrados para a varivel TEC em ratos wistar
submetidos aos tratamentos com imunossupresso com dexametasona (GD), com soluo fisiolgica (GC), e Imunossupresso por dexametasona com transplante de clulas tronco mesenquimais (GDCTM)
TRATAMENTO MDIAS (dias) GD 21,25a GC 14,75b
GDCTM 13,5b
Pares de mdias seguidas de letras diferentes, na mesma coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia; Pares de mdias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia.
0
5
10
15
20
25
Animal 1
Animal 2
Animal 3
Animal 4
Nmero de dias de cicatrizao
Controle
DEXA
CTM
37
Figura 13 Demonstrao grfica ilustrando o TEC dos grupos: GC em azul; GD
em vermelho e GDCTM em verde. No eixo Y representa o valor de TEC em dias,
enquanto o eixo X representa os animais (1, 2, 3 e 4) avaliados para TEC.
5.4 Avaliao histopatolgica
5.4.1 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GC:
Na leso foi observada a presena de ferida extensa, compacta, recoberta por
material fibrinoso e neutrfilos, em processo degenerativo ou em hipersegmentao.
O tecido conjuntivo abaixo mostrou-se edematoso, com formao de uma delicada
trama fibrinosa e, exibiu tambm proliferao de fibroblastos imaturos, sendo
ocasionalmente vistas figuras de mitose. Houve discreta hipertrofia de clulas
endoteliais vasculares, os quais estiveram moderadamente dilatados em planos
profundos (Figura 14).
A zona de proliferao endotelial foi discreta a partir de vasos congestos
remanescentes.
Quanto ao colgeno, visualizou-se rarssimas fibras colgenas
remanescentes, com presena de fibras colgenas inconspcuas (no facilmente
perceptveis) (Figura 14).
Borda da ferida e tecidos adjacentes: verificou-se processo de hiperplasia
evidente do epitlio marginal, com ntida acantose (hipertrofia ou espessamento do
38
estrato germinativo da epiderme). Na derme pode-se verificar vasodilatao discreta,
porm com evidente processo de congesto e dilatao vascular em planos. Houve
intensa reatividade, com proliferao de fibroblastos localizados na periferia do
tecido muscular, acompanhada por discreto processo inflamatrio supurativo.
Clulas imaturas foram notadas em quantidade moderada.
Alm da margem da ferida evidenciou-se tambm congesto, dilatao
vascular e infiltrado inflamatrio mononuclear difuso moderado.
Quanto ao colgeno, houve deposio colgena perimsial discreta.
Figura 14 Neovascularizao indicada com setas vermelhas (A); Demarcao da deposio do colgeno, corado em verde pelo Tricrmio de Maully, de forma mais discreta, na rea circulada, e neovascularizao indicada pela seta preta (B) 5.4.2 - Material coletado de animal eutanasiado 3 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GD:
Na leso observou-se presena de crosta pio-serosa e fibrinosa mais frouxa
em relao ao GC, com a mesma qualidade celular. O tecido conjuntivo abaixo
apresentou edema difuso, com delicada trama fibrinosa, porm com vasos mais
evidentes e com vasos neoformados (Figura 15A). Houve proliferao intersticial
mais evidente ao GC. Marginao de polimorfonucleares foi evidente.
1mm 1mm
39
Borda da Ferida e tecido adjacentes: verificou-se processo de menor
hiperplasia do epitlio marginal (Figura 15B). Na derme pode-se verificar vaso
dilatao evidente, congesto e dilatao vascular em planos alm do msculo
cutneo. Houve intensa reatividade, com proliferao de fibroblastos perimisiais,
acompanhada por processo proliferativo de clulas mesenquimais pouco
diferenciadas.
Colgeno: visualizou-se rarssimas fibras colgenas remanescentes, com
presena de fibras colgenas inconspcuas. Deposio colgena perimsial mais
evidente (Figura 15C).
40
Figura 15 Neovascularizao indicada com a seta vermelha(A); Borda da Ferida marcada com as setas pretas (B); deposio de colgeno, corado em verde, demarcado pelas reas circulares e neovascularizao indicada com a seta lils (C).
5.4.3 - Material coletado de animal eutanasiado 3 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GDCTM:
Leso: Presena de crosta semelhante ao GD. A trama vascular mostrou
aspecto mais ramificado, com formao de inmeros brotos vasculares, zona
proliferativa ntida com discreta formao de capilares, alm de evidente hiperplasia
do endotlio vascular (Figura 16A). O tecido conjuntivo em plano profundo,
apresentou-se com maior celularidade, em relao aos grupos anteriores, por
clulas mesenquimais imaturas, porm com aspecto fibroblstico.
1mm
C
1mm 1mm
41
Colgeno: evidenciao de fibras colgenas (em discreta quantidade) maior
que os grupos anteriores (Figura 16B).
Borda da ferida e tecido adjacentes: verificou-se processo de menor
hiperplasia do epitlio marginal em relao ao GC, porm maior em relao ao GD,
com discreta acantose. Na derme pode-se verificar vaso dilatao evidente,
congesto e dilatao vascular em planos alm do msculo cutneo. Houve discreta
reatividade, com proliferao de fibroblastos perimisiais. Alm da margem da ferida
evidenciou-se tambm congesto, dilatao vascular e infiltrado inflamatrio
mononuclear difuso moderado em menor intensidade que o GD.
Figura 16 Vasodilatao indicadas pelas setas pretas (A); Evidenciao e maior nmero de fibras colgenas recm formadas destacada na rea circular (B). Estruturas esverdeadas representam as fibras colgenas em maior quantidade que nos GC e GD.
5.4.4 - Material coletado de animal eutanasiado 7 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GD:
Preenchimento do leito da ferida por tecido de granulao evidente. Edema
difuso moderado. Epitelizao desenvolvendo de forma adequada, sendo
presenciada ainda fibras colgenas delgadas, separadas por clulas mesenquimais
alongadas em grande quantidade.
1mm 1mm
42
5.4.5 - Material coletado de animal eutanasiado 7 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GDCTM:
Em relao ao GD 7 dias, apresenta fibras colgenas com aspecto mais
espesso, de forma mais compacta (Figura 17A). Neste grupo (GDCTM), o aspecto
do tecido de granulao mais maduro (com menor espessura) (Figura 17B).
Processo de epitelizao mais acentuado, ou seja, cobre mais o leito lesionado. H
presena de clulas alongadas multinucleadas, junto a extremidade remanescente
da musculatura esqueltica, o que no ocorreu no GD 7 dias.
Figura 17 Fibras colgenas menos evidentes e/ou menos definidas destacadas na rea retngular em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GD (A); Fibras colgenas mais espessas, logo bem mais evidentes, destacadas na rea circular, em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GDCTM.
5.4.6 - Material coletado de animal eutanasiado 15 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GC:
Epitelizado com tecido cicatricial em formao, apresentando fibras colgenas
delicadas. H reatividade de clulas musculares esquelticas.
1mm 1mm
43
5.4.7 - Material coletado de animal eutanasiado 15 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GD:
Epitelizao em avano, sem recobrir a ferida. Nota-se grande nmero de
clulas alongadas por entre as fibras colgenas, as quais apresentam padro mais
delicado em relao do GC. Presena de discreto infiltrado inflamatrio linfocitrio
associado ao epitlio formado.
5.4.8 - Material coletado de animal eutanasiado 15 dias aps a realizao da ferida
cirrgica do GDCTM:
Epitelizado, com tecido cicatricial apresentando fibras colgenas mais
espessas e contendo menor quantidade de clulas alongadas em relao ao GC e
GD. Ncleos de clulas musculares esquelticas muito reativas e em processo de
multinucleao. J se evidencia formao de papilas drmicas, evidente hiperplasia
com hipertrofia dos anexos cutneos adjacentes, comparado ao GD. Presena de
moderado infiltrado inflamatrio linfocitrio associado ao epitlio formado.
5.4.9 - Cellprofiler
As imagens foram analisadas pelo programa Cellprofiler, onde as fibras
colgenas foram coradas em verde, j as em vermelho e amarelo, no foram
identificadas como fibras, logo estas foram excludas (Figura 18). Os valores mdios
de fibras colgenas quantificadas aos 15 dias de observao foram 14,3 fibras no
GC, 7,3 fibras no GD e 12,7 fibras no GDCTM aos 15 dias de observao, numa
rea de 5mm2.
44
B A A
B
45
Figura 18 Imagem histopatolgica original contendo fibras colgenas (A) de animal do GDCTM aos 15 dias; Imagem histopatolgica em preto e branco (B); Imagem corada em verde e vermelho, onde a colorao verde demarca as fibras colgenas (C).
Figura 19 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3 e 15 aps leso.
NaCl
3 dias 7 dias 15 dias
fib
ros
-10
0
10
20
30
C
NaCl
3 dias 7 dias 15 dias
fib
ros
-10
0
10
20
30
46
Figura 20 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GD nos dias 3, 7 e 15 aps leso.
Figura 21 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GDCTM nos dias 3, 7 e 15 aps leso.
Dexa
3 dias 7 dias 15 dias
fib
ros
-10
0
10
20
30
Dexa & CMT
3 dias 7 dias 15 dias
fibro
s
-10
0
10
20
30
47
6 DISCUSSO
A cicatrizao um processo complexo, que comeou a ser entendido em
maior amplitude nos ltimos anos. Contudo ainda h necessidade de se continuar
estudando seus mecanismos, visto que grande parte dele ainda desconhecida
(CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).
O futuro promissor em medidas preventivas e curativas mais eficientes e
que possam estar a disposio dos cirurgies, diminuindo assim a possibilidade de
complicaes no manuseio dos doentes que necessitam agresso cirrgica para a
cura dos seus males (CAMPOS et al., 2007). Pacientes que fazem uso crnico de
corticoides, quando submetidos a procedimento cirrgico, apresentam pele com
comportamento distinto dos demais doentes e respondem ao processo regenerativo
de forma diferente (TENIUS et al., 2007). O que pode ser visualizado nos animais do
grupo GD deste presente estudo, visto que os mesmos demoraram em mdia 8 dias
a mais para obter cicatrizao total quando comparado com os outros grupos (GC e
GDCTM).
A imunossupresso experimental deve ser realizada apenas mediante
avaliao constante do paciente, visto que pacientes muito deprimidos podem
apresentar complicaes como aplasia medular, infeces e determinados tipos de
neoplasias (TEIXEIRA & REZENDE, 2004). No presente estudo as alteraes
clnicas observadas foram a presena de secreo ocular escura e reas de
hipotricose nos animais aps 14 dias de aplicao de dexametasona.
48
Os corticoides so bastante utilizados na pratica mdica, especialmente pelo
seu excelente efeito antiinflamatrio. No entanto, alguns efeitos adversos na
cicatrizao de feridas tais como, reduo da formao de tecido colgeno e tardio
aparecimento de fibrose, tm sido relatados (AGUILAR-NASCIMENTO et al., 2000;
TENIUS et al., 2007). No a quantidade do colgeno, mas sua organizao
espacial, que proporciona resistncia ferida (TENIUS et al., 2007). No grupo GC
foi observado presena de fibras colgenas inconspcuas, ou seja, pouco
perceptveis nos animais eutanasiados no terceiro dia aps a criao da ferida
cirrgica.
A reduo da reao inflamatria efeito j descrito na literatura, tanto que os
corticides so tambm conhecidos como antiinflamatrios hormonais (AGUILAR-
NASCIMENTO et al., 2000; TENIUS et al., 2007).
Tenius et al (2007) relataram que a medida das clulas inflamatrias esteve
diminuda no grupo que recebeu dexametasona em todos os momentos da
avaliao e significativamente no terceiro e stimo dias, caracterizando a ao da
dexametasona na fase inflamatria da cicatrizao. Neste estudo foi observado
reduo de infiltrado inflamatrio nos grupos que receberam dexametasona.
A partir de 1999, os estudos com clulas tronco tomaram conhecimento
pblico pelo seu potencial teraputico. Muito se alardou sobre o uso de clulas
tronco em diversas doenas. Houve enfoque em clulas tronco embrionrias, uma
vez que possuem capacidade de pluripotncia. Mas, com os estudos sobre a
plasticidade e ausncia de respostas imunolgicas as CTM se tornaram atrativas
para fins teraputicos (SEMEDO et al., 2009; OLIVEIRA, 2010).
As CTM encontram-se atualmente como a nova promessa na terapia contra
diversos tipos de doena, sejam elas congnitas e/ou hereditrias ou adquiridas, em
49
animais e seres humanos. Os resultados obtidos de pesquisas realizadas, utilizando
as fraes totais de CTM da medula ssea e tecido adiposo, demonstraram a
possibilidade de utilizao de clulas de diferentes tecidos, uma vez que essas
clulas so passveis de adaptao ao cultivo, expanso e armazenagem
(OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012; PINTO FILHO et al., 2013).
O protocolo de aplicao das CTM neste experimento foi baseado em
trabalhos semelhantes que avaliaram o potencial teraputico desse grupo celular em
leses cutneas (OLIVEIRA, 2010; ARGOLO-NETO et al, 2012; GARCEZ, 2012).
Estudo recente descreve a utilizao algena e autgena das CTM para a reparao
de diversos tecidos (MONTEIRO et al., 2010), no entanto, a capacidade destas
clulas em restaurar o tecido cutneo ainda no bem esclarecida (MEIRELLES et
al, 2008).
Mesmo no realizando o transplante de clulas tronco in situ, diretamente
sobre o tecido cutneo, e optando pela aplicao intravenosa, pela veia da cauda do
rato, observamos no GDCTM que houve presena em maior quantidade de fibras
colgenas, e estas aos 15 dias encontram-se mais espessas que nos outros grupos
experimentais (MONTEIRO et al., 2010).
Neste trabalho pretendeu-se avaliao da variveis dependentes ARL e
TEC, por serem dados importantes sobre o processo de evoluo de uma leso. Foi
clinicamente relevante a aparncia da cicatriz obtida com o tratamento com as CTM,
onde pode-se perceber uma maior qualidade cosmtica nos grupos os quais foram
utilizadas. Estes achados foram tambm descritos por autores que relatam que as
CTM alm de acelerar o processo cicatricial podem produzir uma cicatriz de melhor
qualidade esttica e funcional (GARCEZ, 2012).
50
A cicatrizao das feridas foi considerada quando do encontro das margens,
resultando na inibio da contrao pelo contato. Os animais do GC obtiveram
cicatrizao completa com mdia de 14,75 dias, j os indivduos do GD,
apresentaram cicatrizao total em mdia de 21,25 dias, e os animais do GDCTM
tiveram o processo de cicatrizao finalizado em mdia de 13,5 dias. Tendo em vista
a constatao clinica de uma possvel melhora no processo cicatricial das feridas
nos animais que receberam CTM, acredita-se que os benefcios referentes
qualidade da cicatrizao provenientes da utilizao das CTM possam ser melhor
evidenciadas em avaliaes superiores aos 15 dias, onde a produo de uma
cicatriz de melhor qualidade cosmtica poderia ser analisada pela organizao da
deposio de colgeno (GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).
sabido que as CTM indiferenciadas, fibroblastos e macrfagos iniciam a
formao do tecido e que a proliferao, diferenciao, modulao e coordenao
destas clulas ocorrem pela interao de vrios fatores de crescimento,
coordenando a mitose celular e a sntese proteica (DEL CARLO et al., 2008;
MONTEIRO et al., 2010). A terapia celular com CTM foi efetiva em nosso estudo,
acelerando o processo cicatricial e incrementado a formao de fibras colgenas. Os
mecanismos envolvidos nesse processo no foram elucidados durante o estudo,
assim sendo, maiores investigaes mostram-se necessrias a fim de confirmar
essa hiptese.
51
7- CONCLUSO
Sobre as condies que foram realizadas este experimento constata-se:
- que a dose de 0,1mg/kg SID SC de dexametasona, durante 30 dias, foi capaz de
inibir a formao do colgeno presente no processo de cicatrizao epitelial dos
animais do GD comparando-se ao GC;
- As CTM contriburam com a cicatrizao cutnea, reduzindo o tempo de
cicatrizao tanto quanto nos animais saudveis, denotando mnima interferncia da
dexametasona;
- que o transplante de CTM derivadas de MO contribui de maneira positiva na
varivel TEC para a cicatrizao de feridas cutneas em animais imunossuprimidos
com dexametasona;
- a escolha pela infuso por via intravenosa foi efetiva para ao das clulas no local
da leso.
52
8- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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