UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DE FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
OBTENÇÃO DE DERIVADOS DA PRIMINA: AVALIAÇÃO DO PERFIL DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
Célio Ricardo Melo do Nascimento
Recife, 2004
Célio Ricardo Melo do Nascimento
OBTENÇÃO DE DERIVADOS DA PRIMINA: AVALIAÇÃO DO PERFIL DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos. Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE) Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani Co-Orientador: Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite
1 ii
Recife
2004
Nascimento, Célio Ricardo Melo do
Obtenção de derivados da Primina : avaliaçãodo perfil de atividade biológica / Célio Ricardo Melo do Nascimento. – Recife : O Autor, 2004.
xiii, 221 : il., fig., tab. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2004.
Inclui bibliografia e apêndice.
1. Ciências farmacêuticas – Fármacos e medicamentos. 2. Fármacos – Síntese e planejamento. 3. Quinonas – Síntese de derivados da Primina. 4. Primina – Atividade biológica. I.Título.
615.31 CDU(2ed.) UFPE
615.31 CDD (22.ed.) BC2004-580
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Celso Pinto de Melo DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE José Thadeu Pinheiro VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Silvana Cabral Maggi VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Antônio Rodolfo de Faria COORDENADOR DO CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Miracy Muniz de Albuquerque VICE-COORDENADOR DO CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Pedro José Rolim Neto
3 iii
4
“Alguns homens têm aprendido que, ao lado de Deus, podemos andar além dos
nossos limites realizando os sonhos mais ousados...”
Autor desconhecido.
5 iv
Dedico este trabalho
In memoriam aos meus avós.
Aos meus pais pelo auxílio, compreensão e amor nas horas que precisei.
Ao meu irmão pelo amor, amizade e companheirismo.
A minha esposa, pelo auxílio, paciência, compreensão, amor, encorajamento e
apoio.
A minha filha, que veio encher de luz a minha vida.
6 v
AGRADECIMENTOS
A Deus, que permitiu a realização deste sonho.
Ao Prof. Dr. Dalci José Brondani, pela amizade, orientação científica,
incentivo e pela confiança depositada.
A Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite, pela amizade, pela orientação
científica, atenção, incentivo e apoio em todos os momentos.
A Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza, pela realização dos ensaios
biológicos, colaboração científica, atenção e apoio.
A Profa. Dra. Janete Magali de Araújo, pela realização dos ensaios de
atividade antimicrobiana.
Aos Colegas do LabSinfa Maria Patrícia, Dayane e Flávio, pela amizade,
convivência e incentivo.
Aos alunos de Iniciação Científica Diogo, Carol, Renata e Marcos pela
contribuição na realização deste trabalho.
Aos colegas do curso de mestrado e em especial a Lívia, Janaína e Nádia,
companheiras de estudo.
Aos professores e funcionários do Departamento de Farmácia pela
dedicação, amizade e convívio. Em especial a Iguacy.
Aos meus pais, Seu Teodomiro e Dona Tereza, pelo exemplo de vida,
caráter, dedicação e amor em tudo que fazem e pelo incentivo e carinho.
Ao meu irmão Rogério, que nunca mediu esforços para me auxiliar em tudo
que precisei.
7 vi
Ao meu amor, minha esposa Rossana, pelo auxílio, apoio, compreensão,
carinho e sua preciosa colaboração que contribuiu para concretização deste
trabalho.
A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho.
8 vii
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES x
RESUMO xii
ABSTRACT xiii
Capitulo 1 - Introdução e Revisão da Literatura 15
1. INTRODUÇÃO 16
1.1 Produtos Naturais e a Descoberta de Novos Fármacos 16
1.2 Objetivos 25
1.2.1 Objetivo Geral 25
1.2.2 Objetivos Específicos 25
2. REVISÃO DA LITERATURA 27
2.1 Primina: Isolamento e Identificação 27
2.2 Síntese da Primina e seus Análogos 29
2.3 Relação Estrutura-Atividade Biológica 35
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38
Capitulo 2 43
Artigo I – Synthesis, antitumour and Antiinflammatory activities of
a Primin Precursor 44
Capitulo 3 52
Artigo II – Síntese e Atividade Antitumoral de um Novo Pró-fármaco 53
9 viii
da Primina
Capitulo 4 70
Artigo III – Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados
Acetoxilados da Primina 71
Capitulo 5 - Conclusões e Perspectivas 87
CONCLUSÕES 88
PERSPECTIVAS 89
APÊNDICE 90
10ix
LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES
HTS - High-Thoughput-Screening
PhRMA - Pharmaceutical Research and Manufactures of América
FDA - Food and Drug Administration
MHQ-THP - 2-methoxi-1,4-hidroquinona-bis-(2’ tetrahidropiranil) éter
P-MHQ-THP - 2-methoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis-(2’ tetrahidropiranil)
éter
DHP - Dihidropirano
1H-RMN - Espectrometria de Ressonância Magnética de Hidrogênio
1H-NRM - Magnetic Resonance of hydrogen Espectrometry
IVTF - Espectrometria de Infravermelho com Transformada de
Fourier
IRFT - Infrared Espectrometry with Fourier Transformed
UV - Espectro de Radiação Ultra Violeta
DMSO-d6 - Dimetilsulfóxido deuterado
TOSOH - Ácido-p-toluenosulfônico
S180 - Sarcoma 180
ES - Carcinoma de Erhrlich sólido
TMEDA - Tetrametil etileno diamida
i.p. - Via de administração intraperitonial
TMS - Tetrametilsilano
11x
CCD - Cromatografia em camada delgada
h - Horas
mim. - Minutos
ppm - Partes por milhão
Hz - Hertz
hex. - Hexano
act. - Acetato de etila
Ac2O - Anidrido acético
oC - Grau Celsius
OMe - Grupamento metoxila
Rf - Referência de fase
p.f. - Ponto de Fusão
n-BuLi - n-butil lítio
J - Constante de Acoplamento
EPC - Edema de pata induzido por carraginina a 1%
INCA - Instituto Nacional do Câncer
IA - Coleção de microrganismo do Departamento de Antibióticos
da UFPE
Cn - Cadeia Alquílica com n carbonos
12xi
RESUMO
Há alguns milhares de anos a humanidade faz uso sistematicamente de
produtos naturais no tratamento de doenças e enfermidades. Desde então, a natureza tem contribuído de forma fantástica para obtenção de novas substâncias. A prospecção e testes biológicos de produtos naturais podem revelar substâncias candidatas a novos fármacos que poderão ser usadas como uma matriz adequada em um projeto de química medicinal. É neste universo de prospecção que surge a primina (2-metoxi-6-pentil –1,4-benzoquinona), um forte alergênico isolado pela primeira vez por Bloch & Karrer em 1927 da Prímula obconica (Primulaceae). Atualmente há métodos simples, diretos e generalizáveis para a preparação de análogos da primina. Esses análogos tem mostrado atividade biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade. A proposta deste trabalho foi a otimização do fármaco protótipo – a primina – através da síntese de derivados, potencializando seus efeitos farmacológicos e minimizando seus efeitos tóxicos. Os compostos 2-metoxi-hidroquinona bis(2’-tetrahidropiranil)-eter (MHQ-THP) e 2-metoxi-6-pentil-hidroquinona bis(2’-tetrahidropiranil)-eter (P-MHQ-THP) foram sintetizados partindo da 2-metoxi-hidroquinona, a primeira etapa foi à proteção das hidroxilas com o dihidropirano (DHP), obtendo o intermediário (MHQ-THP). A segunda etapa consistiu na litiação do MHQ-THP e subseqüente alquilação regioseletiva, obtendo o P-MHQ-THP. Os produtos tiveram suas estruturas confirmadas através de espectroscopia de infravermelho e de ressonância magnética nuclear de próton. A atividade biológica dos compostos sintetizados foi avaliada através dos testes de toxicidade aguda, atividade antitumoral frente ao sarcoma 180 (S-180) e carcinoma de Ehrlich (ES) e atividade antiinflamtória através do ensaio edema de pata induzido por carragenina. Os resultados da toxicidade aguda indicaram, tanto para o precursor MHQ-THP como para o P-MHQ-THP, que não houve efeitos tóxicos significantes em doses de 1000 mg/kg e 2000 mg/kg. Na avaliação da atividade antitumoral os dois compostos apresentaram boa resposta inibitória quando comparados à primina, com inibição variando entre 60,83% e 79,81%. Os resultados para atividade antiinflamatória do composto MHQ-THP, demonstraram boas taxas de inibição, de 69,05%. Estes resultados animadores nos levaram a planejar novas modificações no composto protótipo com o objetivo de minimizar custos e facilitar a obtenção de novos derivados. Baseados nos resultados anteriores escolhemos para a proteção das hidroxilas o grupamento acetoxi, introduzido através da reação de Thiele. A avaliação qualitativa preliminar da atividade antimicrobiana para esses compostos, mostrou que as modificações implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana.
13xii
ABSTRACT There are some thousands of years the humanity makes use systematically of natural products in the treatment of diseases. Ever since, the nature has been contributing to obtaining of new drugs. The search and biological tests of natural products can reveal substances candidates the new drugs that can be used in a project of medicinal chemistry. It is in this universe that appeared the primin (2-methoxy-6-pentyl -1,4-benzoquinone), a strong allergenic isolated for the first time by Bloch & Karrer in 1927 of the Prímula obconica (Primulaceae). Actually there are simple, direct and generalized methods for the preparation of analogous of the primin. Those analogous have been showing biological activity, but still with pronounced toxicity. The proposal of this work is the synthesis of the primin prodrug - through the synthesis of derivatives, its increasing effects therapeutic profile and minimizing its toxicity effects. The compounds 2-methoxy-hidroquinone bis(2'-tetrahidropyranyl)-eter (MHQ-THP) and 2-methoxy-6-pentyl-hidroquinone bis(2'-tetrahidropyranyl)-eter (P-MHQ-THP) they were synthesized through the route leaving of 2-methoxy-hidroquinone, the first step went to the protection of the hidroxyl groups with the dihidropyranyl (DHP), obtaining the intermediate (MHQ-THP). The second step consisted of the lithiation of MHQ-THP and subsequent alkylation, obtaining P-MHQ-THP. The products had its structures confirmed through IR spectra and 1H-NMR spectra. The biological activity of the synthesized compounds was evaluated through of the toxicity profile, antitumour activity to the sarcoma 180 (S-180) and Ehrlich carcinoma (ES) and antiinflamatory activity through the paw edema induced by carrageenin. The results of toxicity profile indicate, so much for precursory MHQ-THP as for P-MHQ-THP, that there were not significant toxicity effects in doses of 1000 mg/kg and 2000 mg/kg. In the evaluation of the antitumour activity the two compounds presented better inhibition when compared to the primin, with inhibition varying between 60,83% and 79,81%. The results for antiinflamatory activity of the composition MHQ-THP, demonstrated good inhibition rates, of 69,05%. These exciting results took us to plan new modifications in the prototype with the objective of to minimize costs and to facilitate the obtaining of new derivatives. Based on the previous results, we chose for the protection of the hidroxyl groups the acetoxy group, introduced through the Thiele reaction. The preliminary qualitative evaluation of the antimicrobial profile for those compounds, it showed that the implemented modifications didn't contribute to the antimicrobial activity.
14xiii
Capítulo 1
Introdução e Revisão da Literatura.
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Produtos Naturais e a Descoberta de Novos Fármacos
Há mais de cinco mil anos a humanidade começou a usar produtos naturais
como base de uma medicina primária (Barreiro e Fraga, 2001). Ervas e raízes
começaram a serem usadas sistematicamente no tratamento de doenças e
enfermidades. Contudo, apenas a partir do século XIX surgiram os primeiros
estudos com base científica sobre algumas plantas que já eram conhecidas como
medicinais (Montanari e Bolzani, 2001).
Com desenvolvimento da química no início do século XX, foram isolados os
primeiros princípios ativos e surgiram algumas substâncias que, com o passar do
tempo, tiveram seu uso terapêutico consagrado, por exemplo, a morfina, a cânfora
e a cocaína. (Barreiro e Fraga, 2001). No século XX também surgiram os
primeiros antibióticos e foi possível o desenvolvimento de um grande número de
novos fármacos sintéticos, produzidos pela efervescente indústria farmacêutica do
pós-guerra. Isso fez com que o uso de produtos naturais e seus derivados
sofressem uma diminuição gradativa, mas não deixando de ter um papel
importante na história da sociedade (Montanari e Bolzani, 2001).
Atualmente, tem-se observado um extraordinário progresso no que diz
respeito aos estudos farmacológicos e químicos visando obter novos compostos a
partir de produtos naturais. Com o desenvolvimento de novas técnicas analíticas,
16
tornou-se possível elucidar estruturas moleculares complexas com extrema
rapidez e a realização de Bioensaios em Larga Escala [High-Throughput-
Screening (HTS)] permitiu testar um grande número de substâncias em apenas
um único dia (Montanari e Bolzani, 2001).
Ainda assim, considerando todos os avanços conseguidos, a descoberta de
novos fármacos constitui um processo demorado e dispendioso.
A Pharmaceutical Research and Manufactures of América (PhRMA) afirma
que, entre 5.000 – 10.000 compostos candidatos a novos fármacos, apenas um
passa nos testes pré-clínicos e clínicos e é submetido a aprovação do Food and
Drug Administration (FDA) para ser comercializado (Montanari e Bolzani, 2001).
Por isso, no planejamento racional de novos fármacos, não há como
desprezar o potencial que os produtos naturais possuem de fornecer substâncias
novas. A natureza tem se apresentado como uma fantástica fonte de prospecção
de novas moléculas. Um exemplo claro deste potencial são os vegetais, as plantas
são fonte de compostos com estruturas complexas e substâncias
enatiomericamente puras, muitas vezes impossíveis de serem obtidas
sinteticamente de modo racional (Montanari e Bolzani, 2001).
A prospecção e testes biológicos de produtos naturais podem revelar
substâncias candidatas a novos fármacos que poderão ser usadas como uma
matriz adequada em um projeto de química medicinal para planejar as
modificações moleculares que serão realizadas na estrutura deste composto
protótipo, visando estabelecer uma relação estrutura-atividade que permita
identificar os grupos farmacofóricos e toxicofóricos, otimizando o composto
17
protótipo candidato a novo fármaco. O fluxograma a seguir (Figura 1), mostra de
forma resumida este processo.
EXTRATOS SEMIPUROS
EXTRATO BRUTO
TESTES BIOLÓGICOS
PLANTA (PRODUTO NATURAL)
PROCEDIMENTOS CROMATOGRAFICOS
FRAÇÕES E COMPOSTOS PUROS
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL
MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL
SÍNTESE DE ANÁLOGOS
RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE
TESTES BIOLÓGICOS
TESTES BIOLÓGICOS
TESTES BIOLÓGICOS
TESTES BIOLÓGICOS
Figura 1. Fluxograma para obtenção de novos fármacos.
(adaptado de Cechinel Filho, 1998)
É neste universo de prospecção de novos protótipos, candidatos a fármaco,
que estão inseridos os compostos quinonoídicos. Amplamente distribuídos na
natureza, eles são encontrados em bactérias, fungos, plantas superiores e no
reino animal (artrópodes). Estão envolvidos em etapas importantes do ciclo de
18
vida desses seres vivos, principalmente nos níveis respiratórios e de fotossíntese.
(da Silva et al, 2003).
As quinonas representam, certamente, a maior classe entre os compostos
quinonoídicos e as que ocorrem na natureza estão divididas em três principais
grupos (em ordem crescente de tamanho), benzoquinonas, naftoquinonas e
antraquinonas. Em adição as quinonas de ocorrência natural há um grande
número de outras quinonas simples e complexas que têm sido sintetizadas.
As quinonas sofrem rapidamente reações de adição e substituição e podem
reagir diretamente com nucleófilos celulares (Esquema 1; Reações 1, 2 e 3).
O
O
N u + N u
O H
O H
+ H +
(1)
N u
O H
O H
O
O
N u H 2 O 2 + + O 2
(2)
N u
O H
O H
O
O
O
O
N u O H
O H
+ + (3)
Esquema 1.
Reações de adição e substituição de quinonas simples
(Nu, representa um nucleófilo)
19
Em estudos farmacológicos as quinonas têm mostrado variada
biodinamicidade, atuando de diferentes formas. Por exemplo, destaca-se o
processo de estresse oxidativo, que provocam ao induzirem a formação deletéria
endógena de espécies bioreativas derivadas do oxigênio (Esquema 2; Reações 4,
5, 6 e 7).
O
O
H++
+ e-
O
OH
(4)
+ 2 e-
2 H++
O
O
OH
OH
(5)
OH
OH
O
O
+
O
OH
2 (6)
O 2 +
O
O
O
O H
- H + + O 2 ( 7 )
Esquema 2. Formação de espécies derivadas do oxigênio
20
Outro processo que se destaca é a formação de radical semiquinona, o qual
pode formar ligações covalentes com o DNA e outras macromoléculas (Esquema
3; Reações 8 e 9).
C H D N A
C H
O H
O H
C H 2 D N A
C H
O H
O
+ ( 8 )
+
O H
O H
C H 2 D N A
C H 2
O
O
C H 2 D N A
C H 2
O H
O H
C H 2 D N A
C H 2 ( 9 )
Esquema 3.
Ligação covalente com o DNA
A facilidade para a rápida transferência de elétrons entre formas
quinonoídicas parcialmente ou completamente reduzidas, bem como a
transferência de elétrons com oxidantes ou redutores biológicos, mostra a
dificuldade de determinar qual o caminho metabólico e qual a forma do composto
quinonoídico é responsável pela atividade biológica (Powis, 1987).
Algumas quinonas, selecionadas entre um grande número de compostos
testados, têm sido usadas na terapêutica (Thomson, 1971). Em especial as
benzoquinonas têm se destacado por mostrar freqüentemente ação
antimicrobiana (Di Marco et al., 1975), em alguns casos antitumoral (Melo et al.,
21
1974), tripanosomicida (Santana et al., 1968; Melo et al.,1984) e supressora
alimentar em insetos (Bernays et al.,1984).
Dentre as benzoquinonas de estrutura simples encontramos vários
compostos 2-metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídos, que têm apresentado
atividade biológica relevante.
Um composto muito importante desta série é a primina (2-metoxi-6-pentil-
1,4-bezoquinona), um forte alergênico isolado da Prímula obconica (Primulaceae)
(ver Figura 2) e que provoca severa dermatite de contato (König et al., 1993). A
primina chegou a ser utilizada em Pernambuco no tratamento de câncer de pele
humano (Melo et al., 1974). Seus testes clínicos forneceram bons resultados o que
permitiu sua comercialização (Cotias et al., 1974), mas seu uso tornou-se restrito
devido ao seu efeito irritativo.
Figura 2. Prímula obconica (Primulaceae)
Vários análogos da primina (2-metoxi-6-pentil-1,4-benzoquinona) já foram
sintetizados. Muitos deles com diferentes substituintes alquílicos em posições
22
estruturais distintas (3,5 e 6-alquil substituídos), mostrando boa atividade
biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade.
Um estudo da primina à luz do Planejamento de Fármacos pôde solucionar
o problema da elevada toxicidade da primina e seus análogos. A partir dos
resultados já publicados sobre o metabolismo e atividade biológica para essa
classe de compostos, e com a síntese de novos derivados, pôde-se estabelecer
uma relação estrutura-atividade, que permitiu a obtenção de um novo protótipo
candidato a fármaco, em que seus efeitos tóxicos foram minimizados.
Sendo assim, nosso objetivo foi otimizar o fármaco protótipo - a primina –
potencializando seus efeitos farmacológicos e minimizando, sobretudo, seus
efeitos tóxicos, viabilizando seu uso através da aplicação de estratégias
adequadas de modificação molecular.
O presente trabalho se inicia com uma revisão da literatura, onde serão
abordados aspectos relevantes sobre a descoberta da primina, seu uso na terapia
contra o câncer de pele em humanos, discute sua síntese e a síntese de seus
análogos e finalmente os resultados obtidos que relacionam estrutura e atividade
biológica.
O capítulo seguinte traz o primeiro artigo científico, que trata da síntese,
caracterização e avaliação da atividade antitumoral e antiinflamatória do produto
intermediário 2-metoxi-1,4-hidroquinona-bis-(2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP).
O terceiro capítulo traz o segundo artigo científico, que trata sobre a
síntese, caracterização e avaliação da atividade antitumoral e antiinflamatória para
23
o derivado da primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis-(2’-
tetrahidropiranil) éter (P-MHQ-THP).
O quarto capítulo traz o terceiro e último artigo científico, sobre a avaliação
da atividade antimicrobiana de derivados acetoxilados da primina.
Finalmente, no quinto capítulo, serão apresentadas as considerações finais
à cerca dos resultados obtidos e as perspectivas que envolvem o trabalho.
24
1.2. Objetivos
1.2.1. Objetivo Geral
Otimização de um fármaco protótipo a partir de um núcleo base, a primina,
buscando potencializar efeitos farmacológicos e minimizar efeitos toxicológicos,
através da aplicação de estratégias adequadas de modificação molecular.
1.2.2. Objetivos Específicos
a) Preparar derivados não naturais da primina (2-metoxi-6-pentil-1,4-
benzoquinona);
b) Caracterizar a estrutura química dos compostos sintetizados através de
Espectroscopia de Infravermelho (IVTF) e de Ressonância Magnética
Nuclear de Prótons (1H-RMN), Ponto de Fusão e Rf;
c) Avaliar a toxicidade aguda, através do teste de efeitos gerais, dos
compostos sintetizados;
d) Avaliar a atividade antitumoral dos compostos sintetizados frente ao
sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich;
e) Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos sintetizados;
25
f) Avaliar a atividade antimicrobiana dos compostos sintetizados; e
g) Avaliar a relação Estrutura Química – Atividade Biológica.
26
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Primina: Isolamento e Identificação
Vários compostos antibióticos da série de 6-alquil-2-metoxi-1,4-
benzoquinonas (1) já foram isolados e identificados, entre eles o antibiótico 6-
metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (1a), isolado de culturas de Aspergillus sp (Melo
et al., 1974), outro antibiótico é o 2-metoxi-6-propil-1,4-benzoquinona (1b) foi
isolada de Camarops microspora (Sood et al., 1982), mais recentemente, o
composto 2-metoxi-6-heptil-1,4-benzoquinona (1f) foi isolado da Miconia lepidota
(Gunatilaka, 2001) e (Berger, 2001) e o mais importante desta série, o composto
2-metoxi-6-pentil-1,4-bezoquinona, a primina (1d), isolada primeiramente por
Bloch e Karrer em 1927 da Primula obconica, uma planta ornamental que provoca
reações alérgicas devido à secreção desta quinona pelas folhas causando
dermatite (Esquema 4).
O
O
OMeR
1a. R = CH3
1b. R = C3H7
1c. R = C4H9
1d. R = C5H11
1e. R = C6H13
1f. R = C7 H15
(1)
Esquema 4.
2-metoxiquinonas 6-substituída
27
A primina também foi isolada do extrato bruto metanólico das raízes da
árvore Miconia eriodonta (Melastomaceae), de nome vulgar “Pau-Mondé”
(Santana et al., 1968), sendo relatado os primeiros informes sobre sua atividade
antimicrobiana e antineoplásica (Lima et al., 1970). A análise farmacológica
(Cotias et al., 1974) e os testes clínicos (Melo et al., 1974) realizados com a
primina permitiram a sua comercialização e utilização para o tratamento de câncer
de pele humana, apresentando resultados satisfatórios no tratamento de
epitelioma baso-celular (Figura 3) apesar de mostrar uma alta atividade irritativa
(Melo et al., 1974). Posteriormente, a primina foi retirada do mercado devido à
baixa procura e ao efeito alérgico bem pronunciado.
Figura 3. Epitelioma basocelular: forma nódulo-ulcerativa
(fonte: INCA – Instituto Nacional do Câncer, 1996)
Ainda foram isolados da natureza, outros dois regioisômeros do composto
1a. Um deles é a coprimina, o 5-metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (2a), isolada de
28
culturas de Coprinus radians e Coprimus similis (Volc et al., 1977), o outro é o 2-
metoxi-3-metil-1,4-benzoquinona (3a), um componente da secreção defensiva dos
artrópodes (Thomson, 1971) (Esquema 5).
O
O
OMe
R''
3a., R = CH3 (coprimina)
3b., R = C3H7
3c., R = C5H11
(3)
O
O
OMe
R'
2a., R = CH3 (coprimina)
2b., R = C4H9
2c., R = C5H11
2d., R = C6H13
(2)
Esquema 5.
2-metoxiquinonas 3 e 5-substituídas
2.2. Síntese da Primina e Seus Análogos
Em 1967 foi realizada a primeira síntese da primina e alguns de seus
isômeros, confirmando assim a estrutura proposta para o produto natural isolado.
Partindo da orto-vanilina a síntese foi realizada em seis etapas, usando o sal de
29
Fremy como oxidante, fornecendo rendimento global baixo. (Schildknecht e
Schmidt, 1967) (Esquema 6).
OH
CH3O CHO (CH3)2SO4
OCH3
CH3O CHO 1) BrMgR
2) HoAc/Eis
OCH3
CH3O CHO R
Cr2O72 / H
OCH3
CH3O C R
OAlCl3 / Toluol
OH
CH3O C R
OZn / Mg
HCl 1:1
OH
CH3O CH2 R
ON(SO3K)2pH = (8) 9
CH3O CH2 R
O
OR = C C C C
85 - 90 %
73 - 83 %
60 - 90 %70 - 89 %
20 - 40 %
H
Esquema 6.
Síntese da Primina (Schildknecht e Schmidt, 1967)
A otimização da última etapa da síntese de Schildneknecht foi obtida por
Gras em 1977. Na tentativa de obter a 2-metoxi-6-metil-1,4-benzoquinona (1a) ele
partiu da orto-vanilina e o 3-hidroxi-o-cresol para chegar ao 2-metoxi-6-metilfenol,
que foi oxidado por oxigênio molecular catalisado por salcomina (bis-(salicilideno)-
30
etilenodiamino-cobalto II), cuja função é complexar o oxigênio para uma oxidação
radicalar, levando a p-benzoquinona desejada (Gras, 1977) (Esquema 7).
OH
OCH3OHC
1) NaH-DMF
2) CH3I70%
salcomina (O2)
MgSO4 / DMF86%
O
OCH3H3C
O
OH
OHH3C1) NaH-DMF
2) CH3I70%
OH
OCH3H3C
Esquema 7.
Síntese da Primina (Gras, 1977)
O uso de reagentes metalorgânicos em Reações de Metalação surgiu como
uma importante estratégia para síntese regioespecífica na obtenção de análogos
6-alquil substituídos (Posner e Canella, 1985; Costa e Saá, 1987; Snieckus, 1990
e 1994).
Um método simples, direto e generalizável de preparação de 6-alquil-2-
metoxi-1,4-benzoquinonas foi desenvolvido a partir da litiação e posterior
alquilação do tetrahidropiranil éter de guaiacol. (Rolim Neto, 1988; Bieber et al.,
1990) (Esquema 8).
31
Os compostos 3-substituídos podem ser sintetizados a partir de 3-metoxi-
fenol em três etapas, semelhante às estruturas 6-substituídas.
OH
OCH3 O, H+ OTHP
OCH31) n-ButLi2) R'X
3) H3O+
OTHP
OCH3R' O2 / Salcomina
O
O
R' OCH3
R'= metil, etil, propil, butil, pentil e hexil
Esquema 8.
Síntese da Primina e seus análogos 6-substituídos (Rolim Neto, 1988; Bieber et
al., 1990)
Com controle cinético da reação e a escolha de um solvente apropriado foi
possível à obtenção de compostos 3-alquil substituídos com bom rendimento
(Brondani, 1991 e 1995). Partindo da 2-metoxi-hidroquinona, em um solvente
apolar, a metalação e subseqüente alquilação foi direcionada exclusivamente para
a posição 3. Com o uso de um solvente polar e sob controle cinético na
metalação, à baixa temperatura, a alquilação acontece quase que exclusivamente
na posição 6 (Esquema 9).
Os isômeros 5-alquil substituídos foram obtidos a partir da alquilação
seletiva da 2-metoxi-1,4-benzoquinona com trialquilboranos e subseqüente
oxidação, fornecendo exclusivamente o produto 5-substituído com excelente
rendimento, sendo possível à síntese de um grande número de compostos para
32
estudos comparativos de atividade biológica (Kalbaka, 1971; Rolim Neto, 1988;
Bieber, 1990). A reação ocorre via mecanismo radicalar e segundo Bieber a
seletividade do método pode ser explicada pela formação de um complexo
quinona/borano o qual sofre ataque direto do radical alquil (Esquema 10).
OH
OH
OMeO
TOSOH / THF
OTHP
OTHP
OMe
O
OTHP
OMe
O
LiSolv.
R
OTHP
O
OMe
Li
O
R
OTHP
OTHP
OMe
OTHP
OTHP
OMeR'
OTHP
OTHP
OMe
R'
R'X
R'X
Solv. Polar
n-ButLi
Solv. Apolar
n-ButLi
OTHP
OTHP
OMeLi- RH
OTHP
OTHP
OMe
Li
- RH
2)
1)
Esquema 9.
Síntese de Análogos da Primina 3 e 6—substituídos
(Brondani, 1991 e 1995)
33
A obtenção de benzoquinonas alquil substituídas através de reações de
adição com reagentes metalorgânicos tem demonstrado que com o uso de
reagentes de Grinard ou organolítios ocorre reação adição 1,4. Com
organoboranos também foi observado o mesmo tipo de adição (Brondani, 1991;
Bieber et al., 1999).
O
O
OCH3
O
O
OCH3
BrR3
OBR2
OCH3
O
HR
O
O
OCH3
R
O
O
OCH3
HR
BrR3
BR3 Riniciador
H3O+/Fe3+
BR3
Esquema 10.
Síntese de Análogos da Primina 5—substituídos
(Kalbaka, 1971; Rolim Neto, 1988; Bieber et al, 1990)
34
2.3. Relação Estrutura - Atividade Biológica
Vários estudos foram realizados ao longo desses anos onde a atividade
biológica da primina e seus análogos foram testados. Em 1982, Sood testou a
atividade antibacteriana e antifungica da 6-metil-3-metoxi-1,4-benzoquinona,
isolada de Aspergillus sp., que mostrou uma taxa de inibição moderada frente aos
microrganismos testados. O mesmo composto apresentou uma toxicidade aguda
(DL50, i.p.) de 7,4 mg/kg (Sood et al., 1982).
A primina também foi sintetizada e testada como um potencial agente
supressor alimentar contra seis espécies diferentes de insetos, apresentando
atividade supressora em todos os casos (Bernays, 1984).
Rolim Neto estudou novos métodos sintéticos para as 2-metoxi-
benzoquinonas-1,4-alquil-substituídas nas posições 5 e 6. Com os produtos
sintetizados por ele, foram realizadas as primeiras observações sobre atividade
antimicrobiana, toxicidade aguda e atividade antitumoral em relação à estrutura,
com resultados bastante interessantes.
A determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) contra 21
microrganismos representativos demonstrou que, comparando os resultados entre
as duas séries de compostos 5 e 6-substituídos, de modo geral os compostos 6-
substituídos apresentaram maior atividade. Com média para os valores de CMI
oscilando entre 30 e 100 µg/mL (Rolim Neto, 1988; Brondani et al., 2003).
35
Os resultados encontrados por Rolim Neto para a toxicidade aguda, através
da DL50 aproximada, indicam que para os compostos 5-substituídos os valores se
situaram a cima de 25 mg/kg de peso corpóreo, enquanto para o compostos 6-
substituídos variaram numa faixa entre 10 e 17 mg/kg de peso corpóreo.
Observou-se ainda que o aumento do peso da cadeia alquílica lateral não trouxe
significativas mudanças nos valores de toxicidade (Neto, 1988).
A atividade antitumoral da primina (6-pentil-2-metoxi-1,4-benzoquinona) foi
testada, in vivo, frente ao Sacoma 180, apresentando marcante efeito inibitório
para as doses de 7,0; 9,0 e 10,0 mg/kg de peso corpóreo, com resultados de
inibição tumoral de 68,73%, 78,13% e 80,86%, respectivamente (Neto, 1988).
Brondani (1991) desenvolveu novos métodos de síntese para 3-alquil-2-
metoxi-1,4-benzoquinonas, bem como para seus isômeros 5 e 6 substituídos, por
via de metalação e alquilação regioseletiva de 2-metoxi-hidroquinona. A atividade
antitumoral dos compostos sintetizados destas séries foi testada. Os resultados
obtidos indicaram uma inibição tumoral significativa, porém sempre com doses
próximas a toxicidade aguda.
Gunatilaka (2001) e Berger (2001) prepararam alguns análogos da primina,
usando métodos descritos na literatura, para tentar estabelecer uma relação
estrutura-atividade entre os compostos isolados da Miconia lepidota, o 2-metoxi-6-
heptil-1,4-benzoquinona e o 2-metoxi-6-pentil-1,4-benzoquinona. Os resultados
demonstraram em ensaios de atividade antimicrobiana e citotoxicidade que houve
um acréscimo da atividade com o aumento da cadeia lateral alquílica até C10, mas
36
a atividade decresceu significativamente quando uma cadeia com C19 foi
introduzida (Gunatilaka et al., 2001; Berger, 2001).
A primina tem um poder irritante muito grande e pode causar séria
dermatite de contato, principalmente em indivíduos sensíveis a essa substância.
Alguns estudos à cerca do assunto têm usado a primina sintética na formulação
de “Patch” em testes para determinação de indivíduos alérgicos (Sugiura e
Hayakawa, 1994), (Dewert et al., 1997).
No intuito de determinar a relação estrutura-atividade alergênica da primina,
Alguns estudos têm sido realizados tentando relacionar a cadeia lateral alquilica
com potencial irritativo da primina. Vários análogos foram sintetizados com cadeia
lateral variando de C1 a C19 e o potencial de sensibilização destes compostos
testado em experimento com porcos da índia. Os resultados mostraram um
crescimento da capacidade de sensibilização com o aumento do tamanho da
cadeia lateral, tendo sensibilização máxima entre C10 e C12 (König et al., 1993;
Hausen et al., 1995).
Além destes, outros estudos também foram realizados. Horper & Marner
(2001) estudaram a biosíntese da primina em experimentos com precursores
radiativamente marcados e com homólogos. Alcanfôr e colaboradores (1994)
propuseram métodos fluorimétricos para a determinação de alguns compostos
quinonoídicos entre eles a primina (2-metoxi-6-n-pentil-1,4-bezoquinona).
37
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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42
Capítulo 2
Artigo I - Synthesis, Antitumour and Antiinflammatory Activities of a Primin
Precursor.
43
SYNTHESIS, ANTITUMOUR AND ANTIFLAMMATORY ACTIVITIES OF A
PRIMIN PRECURSOR Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Ivone A. de Souza2 , Lothar
W. Bieber3 and Ana Cristina Lima Leite1
1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas
2Departamento de Antibióticos, 3Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520,
Recife, Pernambuco - Brasil – [email protected]
Abstract
Primin, a naturally-occuring from Primula obconica (Primulaceae) has showen antimicrobial and antitumour activities. The synthesis of prodrugs of Primin to obtain 3- 5- and 6-alkyl substituted derivatives has been previously attempt seeking antitumour activity (unupublished data). The intermediate reaction product, 2-methoxy-1,4-hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether, was isolated, characterized and evaluated as antitumour, antiinflamatory agent and toxicity profile. In vivo antitumour activity tests showed that this intermediary compound was able to inhibits S-180 sarcoma and Ehrlich carcinoma growth in mice.
Keywords: Primin derivative; pro-drug; antitumour agent; antiinflammatory activity
1. Introduction
Primin the natural quinone, was first identified in primrose leaves (Primula
obconica)[1]. Its structure of 2-methoxy-6-n-pentyl-1,4-benzoquinone was
confirmed by synthesis[3]. The same product has also been found in the roots of a
Brazilian tree, called “pau mondé” and now identified as Miconia eriodonta DC[4].
This benzoquinone is known to its allergenic properties[5] and a strong sensitizer
that’s has early been recognized to induce contact dermatitis [6]. It also shows
significant antimicrobial and antitumour activity [7]. After clinical trial it was
marketed in Brazil for the treatment of basal cell carcinoma with excelent results[8].
In the last years several reports deal with this benzoquinone and derivatives
concerning the biosynthesis [9] and structure-activity relationships [10].
44
We have worked on the preparation of the synthesis of primin
derivatives in order to provide an easier accses to those rather simple quinones.
The direct synthetic strategy to introduce alkyl groups using 2-methoxy-1,4-
hydroquinone includes ortho-metalation by lithiation followed by alkylation.
Protection of phenolic hydroxyl groups by the using dihydropirane (DHP) was
necessary in this strategy, leaving to the intermediate 2-methoxy-1,4-hidroquinone-
bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP) [11]. In view to establish the
structure/activity relationships of alkyl substituents and protecting groups on
precursor and primin we present here toxicity profile, antitumour and anti-
inflammatory activity of MHQ-THP.
2. Chemistry.
The tetrahydropyranyl protecting group was chosen because of its
easy introduction and cleavage under acidic conditions and of its good directing
properties demonstrated in similar cases. The synthesis of 2-methoxy-1,4-
hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP), was carried out as
previously described [11]. Equation 1.
DHP/THF
TosOH
OHOMe
OH O
OOMe
O
O
Equation 1
45
3. Experimental procedures
3.1 Chemistry
1H-NMR spectra were recorded on a Varian UNITYplus-300 MHz NMR
spectrophotomether using DMSO-d6 as solvent and tetramethylsilane as an internal
standard. IR spectra were obtained on using KBr pellets. Thin-layer chromatography
was carried out on silica gel plates having fluorescence indicator F254 (0.2 mm, E.
Merck); the spots were visualised with UV light. Column chromatography was
performed on silica using Kiesegel 60 (230-400 mesh, E. Merck). All reagents used in
the present work were of analytical grade.
3.1.1 3-2-methoxy-1,4-hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether
To a solution of 2-methoxyhydroquinone (2.80 g, 20 mmol), in 20 mL of
anhydrous THF, were added at 0oC 3,4-dihydro-2H-pyran (4.56 mL, 50 mmol) and
anhydrous p-toluenosulfonic acid (50 mg). After standing at 5o C for 15 h, 10 mL of
10% sodium hydroxide were added. The mixture was diluted with 100 mL of water
and extracted with cyclohexane (3 x 30 mL). The combined extracts were washed
with 10% NaOH (2 x 20 mL) and then with water. After drying over anhydrous
K2CO3 the solvent was removed under vacuo and the oily residue purified over
silica gel column (20 g) eluting initially with toluene. Yield 5.126 g (84%) of
colourless oil. 1H NMR (CDCl3; δ= ppm) 1.46-2.06 (m, 12H); 3.86 (s)
superimposed to 3.40-4.10 (m, total 7H); 5.20-6.45 (m, 2H); 6.57 (dd, 1H, J=8.69
Hz e 2.69 Hz); 6.63 (d, 1H, J=2.69); 7.01 (d, 1H, J=8.69 Hz).
46
3.2 Pharmacology
3.2.1. Toxicity tests
36 male suisse adult white mice, (ca. 25-28 g.) were divided in 6 groups
and private of eat 20 hours before injections. The preliminary phase dosages are
1000 and 2000 mg/Kg to MHQ-THP. It was diluted in Tween 80 (two drops) and
saline (0.9%). Single intraperitoneal injections were given and the general effects
observed during 60 min and continued about 72 hs after injection. The control
group received solvent only.
3.2.2. Antitumor activity Compounds were diluted in Tween 80 (two drops) and saline (0,9%).
Females, 20-25 g, from Antibiotics Department of the Pernambuco Federal
University, were divided in 6 groups. Transplants of tumour fragments, about 1.5-
2.0 mm of Sarcoma S-180 are made subcutaneously in lateral thoracic wall of 6
mice; starting 48 hours later, injections (35 mg/Kg) of test compounds are made
i.p. once daily for 8 days. After treatment, tumours were removed and measured.
The efficacy of treatment was estimated by the ellipsoid formula, and V of control
group was taken in calculations for 100%.
3.2.3. Antiinflammatory activity
Carrageenin-induced hind paw edema in rats was produced by the method
of Winter et al. [12]. Carrageenin solution (1.0% in sterile 0.9% NaCl solution) in a
volume of 0.1 ml was injected subcutaneously into subplantar region of the right
hind paw 1 h after the administration of the test compound. Control animals
47
received only 0.9% NaCl solution. Right hind-paw volume was measured using a
hydroplethysmomether (model 7150, Ugo Basile, Italy) immediately before and 1,
2, 3, 4, 5 and 6h after the carrageenin injection. The increase of results was made
with five groups of rats, 10 animals each (the 1st one was control).
4. Results and discussion
Biological in vivo test
4.1. Antiinflamatory activity
Antiinflammatory activity was studied by carrageenin paw edema in mice. The
inhibition of the edema was mesured after 1, 2, 3, 4, 5 and 6h from administration
of the test compound. As reference substance in experiments Indometacin was
used (10 mg/Kg).
The synthetic precursor MHQ-THP, showed antiinflammatory activity higher
than that of Indometacin; it reduced carrageenin-induced rat paw edema in
69.05%.
4.2. Behavioral effects and Acute Toxicity.
The acute toxicity test of the MHQ-THP was realised through
intraperitoneal way, on the concentrations of 1000 and 2000 mg⁄/kg in mice. All
animals were monitored continuously for 72 hours after dosing for signs of
toxicosis.
In the present study, we verified that the tested substance did not
show any significant gross behavioral effects at the 1000 and 2000 mg/Kg. Clinical
48
signals to both doses included motor uncoordination, hiperactivity, tremors,
decrease of muscle tone, prostration and labored brating. At 2000 mg/kg dose was
observed clonic convultion. No death was observed during experimentation period.
The precursor MHQ-THP revealed low toxicity when compared to
primin (2-methoxy-6-n-pentyl-1,4-benzoquinone), which showed intraperitoneal
LD50 in mice of 14 mg/Kg [7]. That’s means the tetrahidropyranyl protetion group
can dispay a important role of the decrease of toxicity in the precursor that’s was
140-fold less toxic.
4.3 In vivo Antitumour activity.
The antitumour activity of compound was tested against murine sarcoma S-
180 and solid Ehrlich carcinoma in six Swiss albino mice (25-28 g) for tested
product. The treatment began forty eight (48) hours after the implantation of the
tumour and was continued for eight (8) days, with an intraperitoneal dose of 100
mg⁄ kg⁄ day.
In both cases MHQ-THP presented a antitumour profile with reduction of
the tumour mass in 70,7%, to S180 and 60,83% to Ehrlich Carcinoma. It was
previously reported that primin inhibited S180 with 66,7% and Ehrlich Carcinoma
55,6%, but with a lower dose 10mg/Kg. Although primin exhibited a better
antitumour profile, but its dosis is at the limite of acute toxicity [7].
In a preliminary analysis of the structure/activity relationship the lower
acute toxicity and better antitumour activity of MHQ-THP indicates that the
49
tetrahidropyranyl protetion group supresses the acute toxicity but not the antitumor
activity.
In conclusion MHQ-THP revealed potential antitumour, anti-
inflammatory activities and the low acut toxicity. Although these results deserve
further studies, it is very suggestive that MHQ-THP is an effective candidate for a
prodrug of primin and related benzoquinones.
Acknowledgements
The authors thank from the “Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnologico” (CNPq), the “Fundação de Amparo a Ciência do Estado
de Pernambuco” (FACEPE) and Banco do Nordeste for financial support.
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51
Capítulo 3
Artigo II - Síntese e Atividade Antitumoral de um Novo Pró-fármaco da Primina.
52
SÍNTESE E ATIVIDADE ANTITUMORAL DE UM NOVO PRÓ-
FÁRMACO DA PRIMINA
Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Ivone A. de Souza2,
Lothar W. Bieber3 e Ana Cristina Lima Leite1
1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas
2Departamento de Antibióticos, 3Departamento de Química Fundamental.
Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife,
Pernambuco - Brasil – [email protected]
53
Resumo. A primina, 3-metoxi-6-pentil-1,4-p-benzoquinona, um forte alergênico, isolado primeiramente da Primula obconica (Primulaceae), apresenta significativa atividade antimicrobiana e antitumoral. A primina chegou a ser usada no tratamento de câncer de pele humano, mas teve seu uso interrompido devido ao seu efeito irritativo pronunciado. Atualmente, existem vários métodos simples, diretos e generalizáveis para preparação de análogos da primina. Visando obter um fármaco protótipo otimizado, com melhor perfil farmacoterapêutico, sintetizamos o composto intermediário da síntese da primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (P-MHQ-THP), partindo do 2-metoxi-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP). A avaliação da toxicidade aguda para o P-MHQ-THP, demostrou que, assim como para o seu precursor o MHQ-THP, o composto testado nas doses de 1000 mg/Kg e 2000 mg/Kg, possui baixa toxicidade quando comparado a primina, que apresenta DL50 de 12 mg/Kg. Na avaliação da atividade antitumoral, os resultados encontrados para as doses terapêuticas testadas de 10 e 100 mg/Kg do P-MHQ-THP, também indicam um bom perfil de inibição antitumoral, respectivamente de 73,0% e 79,81% de inibição para o sarcoma 180 (S180) e 69,8 e 71,30 % para o carcinoma de Erhrlich sólido (ES). Esses resultados são animadores quando comparados aos valores obtidos tanto para o MHQ-THP, que na dose de 100mg apresentou inibição de 70,7% para o S180 e 60,83% para o ES, quanto para a primina, 3que nas doses de 8 e 5 mg/Kg, apresentou inibição tumoral respectivamente de 72,0% e 66,7% para o S180 e na dose de 5 mg/Kg de 55,6% para o ES, principalmente considerando que a dose terapêutica para a primina ficou bem próxima ao limiar de toxicidade. Summary. The primin, 3-methoxy-6-pentyl-1,4-p-benzoquinone, a strong allergenic, isolated firstly of the Primula obconica (Primulaceae), it presents significant antimicrobial and antitumour activity. The primin arrived to be used in the treatment of skin human's cancer, but she had its use interrupted due to its effect pronounced irritant. actually, exist several simple, direct and generalized methods for preparation of analogous of the primin. Seeking to obtain a prodrug, with better therapeutic profile, we synthesized the intermediate reaction product of the synthesis of the primin, the 2-methoxy-6-pentyl-1,4-hidroquinone-bis (2'-tetrahidropyranyl) ether (P-MHQ-THP), leaving of the 2-methoxy-1,4-hidroquinnone-bis (2'-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP). The evaluation of the toxicity profile for P-MHQ-THP, showed that, as well as for its precursor MHQ-THP, the compound tested in the doses of 1000 mg/Kg and 2000 mg/Kg, possesses low toxicity profile when compared to the primin, that presents LD50 of 12 mg/Kg. In the evaluation of the antitumour activity, the results found for the tested therapeutic doses of 10 and 100 mg/Kg of P-MHQ-THP, also indicate a good profile of tumour inhibition, respectively of 73,0% and 79,81% of inhibition for sarcoma 180 (S180) and 69,8 and 71,30% for the Erhrlich carcinoma solid (ES). Those results are exciting when compared to the values obtained so much for MHQ-THP, that presented inhibition of 70,7% for S180 60,83% ES, as for the primin, that in the doses of 8 and 5 mg/Kg, it presented tumour inhibition respectively of 72,0% and 66,7% for the S180 and in the dose of 5 mg/Kg of 55,6% for ES, mainly considering that the therapeutic dose for the primin was very close to the toxicity threshold.
PALAVRAS CHAVE: Quinonas, primina, atividade antitumoral e atividade antiinflamatória. KEY WORDS: Quinones, primin, Antitumour activity and antiiflammatory activity.
* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada. E-mail: [email protected]
54
1. INTRODUÇÃO
As quinonas representam a maior classe entre os compostos quinonoídicos
e, em adição as que ocorrem na natureza, há um grande número de outras
quinonas simples e complexas que tem sido sintetizados 1.
Algumas dessas quinonas tem apresentado interessante atividade
biológica. Em especial as benzoquinonas têm se destacado por mostrar
freqüentemente ação antimicrobiana 2, em alguns casos antitumoral 3 e 4,
tripanocida 5 e supressora alimentar em insetos 6.
Dentre as benzoquinonas de estrutura simples, encontramos vários
compostos 2-metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídos com potencial biológico
relevante. Entre esses compostos, um merece destaque, a primina (2-metoxi-6-
pentil-1,4-benzoquinona) (1), um forte alergênico isolado pela primeira vez por
Bloch & Karrer em 1927 7 da Primula obconica (Primulaceae) e que provoca
severa dermatite de contato 8.
Lima et al. 9 Isolaram a primina do extrato bruto metanólico das raízes da
árvore Miconia eridonta (Melastomaceae), relatando posteriormente os primeiros
informes sobre sua atividade antitumoral e antimicrobiana. Após estudos clínicos
10, a primina chegou a ser utilizada no tratamento de câncer de pele humano 3,
mas seu uso tornou-se restrito devido ao seu efeito irritativo (Figura 1).
55
O
O
OMe
(1)
Figura 1. Primina
A primeira síntese da primina foi realizada por Schildknecht & Schmidt em
1967 11, confirmando a estrutura proposta para o produto natural. Partindo da o-
vanilina a síntese foi realizada em 6 etapas, obtendo rendimento global baixo.
Outras sínteses foram realizadas, mas sempre em baixo rendimento e com
número elevado de etapas.
Atualmente há métodos simples, diretos e generalizáveis para preparação
de análogos da primina com diferentes substituintes alquílicos em posições
estruturais distintas (3,5 e 6 alquil substituídos), mostrando boa atividade
biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade 12, 13, 14, 15 e 16.
Esses métodos empregados na preparação de análogos da primina
baseiam-se na introdução de substituintes via metalação e alquilação
regioseletiva. Este tipo de reação exige uma proteção das hidroxilas presentes a
fim de evitar reações indesejadas. Um grupo protetor largamente usado na síntese
de análogos da primina é o grupo tetrahidropirano (THP) devido a sua relativa
estabilidade em meio básico e facilidade de introdução e remoção em meio ácido.
56
Recentemente sintetizamos o composto intermediário 2-metoxi-6-pentil-1,4-
hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP) 17, na avaliação da atividade
biológica deste composto foi constado que o mesmo apresenta baixa toxicidade e
efetiva atividade antitumoral quando comparado a primina.
Visando obter um fármaco protótipo otimizado, com melhor perfil
farmacoterapêutico, sintetizamos um composto intermediário, precursor da
primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter, e
avaliamos sua atividade antitumoral e antiinflamatória, buscando estabelecer uma
relação entre estrutura química – atividade biológica.
1.1. Parte Química
A literatura mostra vários métodos de obtenção da primina (1) e seus
análogos estruturais utilizando diversas vias sintéticas e diferentes compostos de
partida. O composto 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis (2’-tetrahidropiranil)
éter (P-MHQ-THP) (3) foi obtido a partir da proteção da 2-metoxi-hidroquinona (2)
com dihidrofurano (DHP), seguida da litiação e subseqüente alquilação 13, 14, 15 e 16
(Esquema 1).
Todos os espectros de 1H-NMR foram registrados em um equipamento
Varian UNITY plus-300 MHz utilizando DMSO-d6 como solvente e tetrametilsilano
(TMS) como padrão interno. Os espectros de infravermelho (IVTF) foram obtidos
usando pastilhas de KBr. A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada
em placas de sílica gel (0.2 mm, E. Merck). Os cromatogramas foram visualizados
57
com luz ultravioleta (UV). Para cromatografia em coluna, foi utilizada sílica
Kiesegel 60 (230-400 mesh, E. Merck). Todos os reagentes usados neste trabalho
foram de grau analítico.
OH
OH
OCH3O
TOSOH / THF
OTHP
OTHP
OCH31) n-ButLi / THF
2) C5H11Br
OTHP
OTHP
OCH3H11C5
84% 60%
(1) (2) (3)
ESQUEMA 1.
Síntese do composto P-MHQ-THP (3) a partir da do MHQ-THP via litiação seguida
de alquilação regioseletiva
2. Procedimento Experimental
2.1. Química
2.1.1. 2-metoxi-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (2)
Em uma solução de 20 de mmol de (1) em 20 mL de THF seco, foi
adicionada à 0oC, 50 mmol de 3,4-dihidro-2H-pirano e 50 mg de ácido p-
58
toluenosulfonico anidro, como catalisador. Esta mistura foi mantida a 00C, em
ambiente anidro e sob atmosfera de argônio, por 2 h. Em seguida permaneceu na
geladeira a 50C por 15 h. Foram adicionados, logo após, 10 mL de 10% hidroxido
de sódio. A mistura foi diluída com 100 mL de água e foi extraída com ciclohexano
(3 x 30 mL). O extrato foi lavado com NaOH 10% (2 x 20 mL) e com mais 50 mL
de água. Depois foi seco com K2CO3 anidro. O solvente foi evaporado à vácuo e o
resíduo oleoso purificado em coluna de sílica de gel (20 g), eluido inicialmente
com tolueno/ciclohexano 1:1 e passando gradativamente para tolueno puro. O
redimento foi de 5,126 g (84%) de um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3; δ= ppm)
1,46-2,06 (m, 12H); 3,86 (s) sobreposto a 3,40-4,10 (m, total 7H); 5,20-6,45 (m,
2H); 6,57 (dd, 1H, J=8,69Hz e 2,69Hz); 6,63 (d, 1H, J=2,69); 7,01 (d, 1H, J=8,69
Hz). IVTF (KBr): νasCH3 2835 cm-1; νsCH3 2960 cm-1; ν C=Canel 1570 cm-1, 1500
cm-1; νsC-O-C 1250 cm-1; νasC-O-C 1100 cm-1; ν C=C 690 cm-1.
2.1.2. 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (3)
A uma solução de 1,0 mmol de (2) em 10 mL de THF seco, e 2,0 mmol de
tetrametil etileno diamida (TMEDA) foi adicionado 1,0 mmol de n-ButLi, a – 100oC,
deixando reagir por 2 h, até chegar a –10oC, quando foi adicionado 1,0 mmol de
brometo de pentila, deixando reagir por 15 h. A extração e purificação foram
efetuadas como descrito para o composto anterior. Rendimento 0,227 g (60%) de
um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3; δ=ppm): 0,96 (t, 3H, J = 7,5Hz); 1,20-2,22 (m,
59
18H); 2,50-2,86 (m, 2H); 3,90 (s) sobreposto a 3,42-4,26 (m) (total 7 H); 4,95-5,60
(m, 2 H); 6,58 (d, 1H, J=2,69Hz); 6, 64(d, 1H, J=2,6Hz). IVTF (KBr): νasCH3 2835
cm-1; νsCH3 2960 cm-1; ν C=Canel 1570 cm-1, 1500 cm-1; νsC-O-C 1250 cm-1; νasC-
O-C 1100 cm-1; ν C=C 690 cm-1.
2.2. Estudos Biológicos
2.2.1. Toxicidade Aguda – Testes de Efeitos Gerais
O teste de toxicidade aguda para o composto P-MHQ-THP foi realizado
através de via intraperitonial (i.p.), nas concentrações de 1000 e 2000 mg/ kg de
peso corpóreo, com grupos de 6 camundongos albinos suíços para cada dosagem
administrada, com peso variando entre 25-30 g. Os composto foram solubilizados
com solução fisiológica (0,9% de NaCl, p/v) e Tween 80, o grupo controle recebeu
apenas solução fisiológica (0,9% de NaCl, p/v). Os animais foram monitorados
continuamente por 72 horas, segundo o método descrito por Malone e Carlini 18.
2.2.1. Atividade Antitumoral
Os testes de atividade antitumoral in vivo, seguindo à técnica descrita por
Stock 19, foram realizados com tumores transplantáveis sarcoma 180 (S180) e
carcinoma de Erhrlich sólido (ES) em camundongos albinos suíços. Quarenta e
60
oito horas após a implantação dos tumores foi iniciado o esquema terapêutico com
o composto testado. O tratamento teve duração de oito dias, com uma dose diária
de 100 mg/Kg/dia utilizando via intraperitonial (i.p.). No oitavo dia, os animais
foram sacrificados e os tumores isolados e pesados, e a inibição do crescimento
tumoral calculada em comparação ao grupo controle. Foram realizados três
experimentos para cada dose testada.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Determinação da Toxicidade Aguda
Os animais testados não apresentaram reações diversificadas. As reações
verificadas no experimento se caracterizaram com sendo neurovegetativas, com
respostas estimulantes e depressoras. Os sinais clínicos para ambas doses de
1000 mg/kg e 2000 mg/kg incluíram movimentos esteriotipados, piloereção,
alteração do sistema músculo-esquelético, falta de coordenação motora,
hiperatividade, tremores, convulsão clônica e prostração. Nenhuma morte foi
observada durante período de experimentação.
É importante salientar que os mesmos resultados foram observados
também para o composto MHQ-THP 17 em seu ensaio de toxicidade aguda, o que
evidencia a contribuição do grupamento THP para a diminuição desta em relação
ao composto protótipo primina. Os precursores MHQ-THP e P-MHQ-THP
revelaram-se bem menos tóxicos. Uma vez que, de acordo com a literatura 10 e 12 ,
61
a primina tem uma DL50 de 12 mg/Kg, ou seja, a princípio 100 vezes mais tóxica
que os precursores. Mesmo considerando que o P-MHQ-THP tem massa 45%
maior que a primina, o que reduz em quase pela metade a concentração
administrada deste princípio ativo, ainda assim o efeito tóxico foi
consideravelmente menor.
3.2. Avaliação da Atividade Antitumoral
Os testes de atividade antitumoral realizados com a primina e os seus
diversos análogos já sintetizados 10, 12 e 14 mostraram, de modo geral, um bom
efeito inibitório, mas com o problema da dose aplicada está, geralmente, bem
próximo ao limiar de toxicidade. Os resultados obtidos mostram que o composto
P-MHQ-THP (3) apresenta uma boa taxa de inibição tumoral. Para o P-MHQ-THP,
nas doses terapêuticas de 10 mg/Kg e 100 mg/Kg, tivemos 73,0 e 79,81% de
inibição para o S180 e 69,30 e 71,30 % para o ES, conforme indica a tabela 1.
Quando comparado ao precursor, MHQ-THP, constatamos que o composto
P-MHQ-THP, substituído na posição 6 por um grupo pentil, apresentou um perfil
de atividade antitumoral ligeiramente melhor. O que sugere que a introdução do
grupo pentila na posição 6 altera a lipofilia da molécula de forma a facilitar sua
absorção.
62
TABELA 1. Atividade antitumoral para os seguintes compostos: Primina, MHQ-
THP e P-MHQ-THP.
Composto Dose
(mg/Kg/dia)
No de
sobreviventes
Inibição
(%) Tumor
Primina O
O
OMeH11C5
8
5
5
5/6
6/6
6/6
72,00
66,70
55,60
S180
S180
ES
100
6/6
70,70
S180
MHQ-THP
OTHP
OTHP
OCH3
100 6/6 60,83 ES
10
6/6
73,00
S180
100 6/6 79,81 S180
10 6/6 69,30 ES
P-MHQ-THP OTHP
OTHP
OCH3H11C5
100 6/6 71,30 ES
Contudo, o composto MHQ-THP apresenta também uma boa taxa de
inibição tumoral na dose terapêutica testada de 100 mg/Kg, respectivamente,
63
70,7% para o S180 e 60,83% par o ES, o que mostra uma relevante melhora da
atividade inibitória tumoral para essa classe de compostos (proteção com o grupo
THP) em relação ao composto protótipo, a primina, que apresentou inibição nas
doses testadas de 5 e 8 mg/Kg, respectivamente, de 66,7% e 72,0% pra o S180 e
na dose de 5 mg/Kg apresentou inibição de 55,6% para o ES. Sendo que na dose
de 8 mg/Kg para o S180 apresentou um óbito.
Ë importante considerar o fato que o produto P-MHQ-THP com a presença
do grupo protetor THP quase dobra a massa molecular (45% a mais) em relação
ao composto protótipo, a primina. Desta forma, a dose administrada possui quase
a metade da concentração de princípio ativo (primina), e mesmo assim,
apresentou uma resposta inibitória tumoral mais eficiente, enquanto com os
compostos MHQ-THP e P-MHQ-THP não foi registrado nenhum óbito entre os
animais tratados.
Ao aumentar a dose do P-MHQ-THP de 10 mg/Kg para 100 mg/Kg houve
um acréscimo na resposta terapêutica, passando a inibição tumoral
respectivamente para 79,81 para o S180 e 71,30 para o ES, sem haver
manifestações dos efeitos deletérios verificados para a primina.
Após analisar os resultados das respostas inibitórias frente aos tumores
S180 e ES constatamos que o composto P-MHQ-THP, além de apresentar uma
significativa inibição frente aos tumores, sem apresentar óbito entre os animais
teste, apresenta-se como um potencial pró-fármaco.
Os resultados da inibição significativa frente aos tumores S180 e ES podem
ser melhor visualizados na figura 1.
64
o e e o
méto
comp
verifi
revel
tóxic
MHQ
Control
Figura 1. Comparação entre os tumores tr
grupo controle (à esquerda para o S180
4. CONCLUSÕES
Na preparação dos precursores MHQ-THP
dos simples, econômicos e generalizáveis d
ostos foram obtidos com bons rendimentos.
Na avaliação do perfil de atividade biológi
camos que a proteção das hidroxilas da 2
ou que os derivados MHQ-THP e P-MHQ-T
o que a primina e seus análogos.
Verificamos que, a avaliação da atividade
-THP, apresentou um perfil de redução
Tratad
atados com o com
e à direita para o E
e P-MHQ-THP, fo
escritos na literatu
ca, o teste de toxi
-metoxihidroquino
HP são potencial
antitumoral para
tumoral superior
Control
Tratadposto (3) e o
S)
ram utilizados
ra. Todos os
cidade aguda
na com DHP
mente menos
composto P-
ao reportado
65
anteriormente para a primina 10 e 12, cuja dose terapêutica fica próxima ao limiar de
toxicidade, o que não ocorre com o composto testado.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnologico (CNPq), a Fundação de Amparo a Ci6encia e Tecnologia
do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Banco do Nordeste pelo suporte
financeiro.
66
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15. BRONDANI, D. J.; BIEBER, L W.; regioselective Lithiation and Alkylation of 2-Methoxy-Hydroquinone, Química nova, Vol. 18, No. 2, 144-146, 1995.
16. BIEBER, L. W; ROLIM NETO, P.; GENERINO, R. M.; Regioselective Alkylation of Substituted Quinones by Trialkylboranes, Terahedron Letters, 40, 4473-4476, 1999.
17. BRONDANI, D. J.; NASCIMENTO, C. R. M.; de SOUZA, I. A.; BIEBER, L. W.; LEITE, A. C. L. Synthesis, Antitumour and Antiflammatory Activities of a Primin Precursor. IL FARMACO, 2004 (submetido)
68
18. a) CARLINI, E. A.; OLIVEIRA, M. G. M.; Monteiro, M. G. MACAÚBAS, C.; BARBOSA, V. P.; Pharmacologic and Toxicologic Esseects of Two Maytenys Species. In: laboratory Animals. J. Ethnopharmacology, 34, 29-41, 1991. b) Malone, H. H; Natural Products and Plants Drugs Phamacological or Therapeutical Activity, 1977.
19. STOCK, C. C.; CLARCK, D. A.; PHILIPS, F.; Sarcoma 180 – Inibition of Screening Date. Cancer Research, 1977. 2: 2-3, 1955.
69
Capítulo 4
Artigo III – Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados Acetoxilados
da Primina.
70
Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados
Acetoxilados da Primina.
Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Janete Magali de
Araújo2 e Ana Cristina Lima Leite1
1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas 2Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá
S/N, CDU, 50740-520, Recife, Pernambuco - Brasil – [email protected]
Resumo: A primina, 3-metoxi-6-pentil-1,4-p-benzoquinona, é um forte alergênico, isolado primeiramente da Primula obconica (Primulaceae) e apresenta significativa atividade antimicrobiana e antitumoral. Visando, principalmente, minimizar custos e facilitar a obtenção de novos derivados da primina, idealizamos uma série de compostos, onde procuramos utilizar vias sintéticas simples e reagentes de fácil aquisição. A preparação do ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (6) foi realizada em duas etapas, a partir da acetoxilação da hidroquinona com anidrido acético catalisado por ácido sulfúrico e subseqüente reação de Friedel-Crafts com anidrido succínico e cloreto de alumínio. Para o composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (9) a via sintética escolhida foi através da oxidação da 2-metilhidroquinona (7) com óxido de manganês e ácido sulfúrico, obtendo a toluquinona (8), que foi posteriormente acetoxilada (reação de Thiele), Os diferentes intermediários e os produtos obtidos foram testados quanto a sua atividade antimicrobiana frente a algumas espécies de microorganismos Gram-positivos, Gram-negativos e fungos. Todos os derivados acetoxilados foram sintetizados com bons rendimentos e o conjunto dos resultados mostra que as modificações implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando, entretanto, a importância das hidroxilas livres.
Summary: The primin, 3-methoxy-6-pentyl-1,4-p-benzoquinone, it is a strong allergenic,
isolated firstly of the Primula obconica (Primulaceae) and it presents significant antimicrobial and antitumour activity. Seeking, mainly, to minimize costs and to facilitate the obtaining of new derivetes of the primin, we idealized a series of compounds, where we tried to use simple synthetic ways and drug of easy acquisition. The preparation of the 4-oxo(2,5-diacetoxyfenyl)butanoic acid (6) it was accomplished in two steps, starting from the acetylation of the hydroquinone with acetic anhydride catalyzed by sulfuric acid and subsequent Friedel-Crafts reaction. For the compound 2-methyl-1,2,5-triacetoxybenzoquinone (9) the chosen synthetic way went through to oxidation of 2-methylhydroquinone (7) with oxide of manganese and sulfuric acid, obtaining the toluquinone (8), that was acetylated later on (Thiele reaction), The differents intermediates and the obtained products were tested with relationship its antimicrobial activity front to some species of Gram-positive, Gram-negative microorganisms and fungus. Everybody acetylated derivetes was synthesized with good yield and the results exhibition that the implemented modifications didn't contribute to the antimicrobial activity, evidencing, however, the importance of the free hidroxyl groups..
PALAVRAS CHAVE: Quinonas, derivados da primina, atividade antmicrobiana. KEY WORDS: Quinones, primin derivates, antimicrbial activity.
* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada. E-mail: [email protected]
71
1. INTRODUÇÃO
Dentre os muitos compostos encontrados na natureza um pequeno grupo,
as quinonas 1 e 2, tem despertado interesse especial devidos as suas propriedades
biológicas. Muitas dessas quinonas apresentam ação antimicrobiana 3, antitumoral
4 , tripanocida 5 e supressora alimentar em insetos 6 . Em especial podemos citar,
entre as estruturas mais simples deste grupo, algumas séries de compostos 2-
metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídas, que possuem atividade biológica.
Entre estes compostos, vários antibióticos das séries 6-alquil-2-metoxi-1,4-
benzoquinonas (1) já foram isolados e identificados, entre eles o antibiótico 6-
metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (1a), isolado de culturas de Aspergillus sp 7,
outro antibiótico é o 2-metoxi-6-propil-1,4-benzoquinona (1b) isolado de Camarops
microspora 8 e o mais importante desta série, o composto 2-metoxi-6-pentil-1,4-
benzoquinona, a primina (1c), isolada primeiramente por Bloch & Karrer 9 em 1927
da Primula abconica, uma planta ornamental que provoca reações alérgicas
devido a secreção desta quinona.
Lima et al. 10 isolaram a primina do extrato bruto metanólico das raízes da
árvore Miconia eridonta (Melastomaceae), de nome vulgar “Pau-Mondé, relatando,
posteriormente, os primeiros informes sobre sua atividade antimicrobiana e
antineoplásica. A análise farmacológica 11 e os testes clínicos 7 e 11 realizados
permitiram a sua comercialização e utilização para o tratamento do câncer de pele
humano. Posteriormente, a primina foi retirada do mercado devido à baixa procura
e ao efeito alérgico pronunciado (Figura 1).
72
(1)
O
O
R O M e1 a . , R = C H 3 1 b . , R = n - C 3 H 7 1 c . , R = n - C 5 H 1 1 ( p r i m i n a )
Figura 1. 2-metoxiquinonas 6 substituídas
A primeira síntese da primina foi realizada em 1967 por Schildknecht &
Schmidt 12, confirmando a estrutura proposta para o produto natural. Esta síntese
mostrou baixo rendimento, além do composto de partida ser relativamente caro.
Na tentativa de se obter a primina e seus análogos estruturais, outros
métodos foram propostos, utilizando outras vias sintéticas e outros compostos de
partida 13, 14, 15, 16 e 17. Atualmente existem vários métodos de preparação dos
diferentes análogos da primina. Mas esses métodos ainda são complexos e
utilizam, no geral, reagentes caros.
Os métodos empregados na preparação de análogos da primina baseiam-
se na introdução de substituintes via metalação e alquilação regioseletiva. Este
tipo de reação exige uma proteção das hidroxilas presentes, a fim de evitar
reações indesejadas. Um grupo protetor largamente usado é o tetrahidropirano
(THP) devido a sua relativa estabilidade em meio básico e facilidade de introdução
e remoção em meio ácido. Além disso, resultados recentes indicam que os
73
compostos intermediários de síntese, protegidos com THP, apresentam atividade
biológica superior à primina e seus análogos, com a vantagem de apresentar
baixa toxidade18.
Com o objetivo de obter um novo candidato a fármaco mais potente e
menos tóxico e visando, principalmente, minimizar custos e facilitar a obtenção de
novos derivados da primina, idealizamos uma série de compostos, onde
procuramos utilizar vias sintéticas simples e reagentes de fácil aquisição.
Para atingir este objetivo, escolhemos para substituir o grupamento THP na
proteção das hidroxilas, o grupamento acetoxi. A acetoxilação de compostos
quinonoídicos tem sido bem estudada, Thiele 19 propôs um método para a
acetoxilação de quinonas através da reação desta com anidrido acético catalisada
por ácido sulfúrico. Wilgus e Gates (1967) 20 reportaram em suas investigações
que toluquinona reagindo com anidrido acético e ácido sulfúrico produz um
rendimento de 90% de uma mistura de 78% de 2,4,5-triacetoxi e 14,5% de 2,3,5-
isômero. (esquema 1.)
Ainda dentro do contexto de modificação estrutural, o composto (11) foi
planejado visando uma possível potencialização da atividade biológica com a
introdução do grupo ácido carboxílico, assim como, posteriormente, facilitar a
condensação com aminoácidos, obtendo um pró-fármaco direcionado para o
princípio da latenciação.
74
O
O
Ac2O
H2SO4
OAc
OAcOAc
OAc
OHOAc
OAc
OHOAc
H
(2) (3) (4) (5)
ESQUEMA 1. Reação de Thiele 19
O
O
H3CAc2O / H2SO4
3 h, 55-60oC
OAc
OAc
H3C
OAc
+
OAc
OAc
H3C OAc
(6) (7) 2,4,5-Isômero (8) 2,3,5-Isômero
78% 14,5%
ESQUEMA 2. Acetoxilação da toluquinona (6), Wilgus & Gates 20
Química
A preparação do ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11) foi realizada
em duas etapas, a partir da acetoxilação da hidroquinona com anidrido acético
75
catalisado por ácido sulfúrico 21 e subseqüente reação de Friedel-Crafts, com
anidrido succínico e cloreto de alumínio como catalisador (Esquema 3).
40' - 2h5 mim.
OH
OH
Ac2O
H2SO4
OAc
OAc
O OO
AlCl3
OAc
OAc
COOH
O
HCl+
(60-70) oC 130-200 oC
(9) (10) (11)
ESQUEMA 3.
Síntese do composto 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico
Para o composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (13) a via sintética
escolhida foi através da oxidação da 2-metilhidroquinona (12) com óxido de
manganês e ácido sulfúrico, obtendo a tuloquinona (6), que foi posteriormente
acetoxilada (reação de Thiele) 19, 20 e 21 (Esquema 4).
2. Procedimento Experimental
Parte Química
Todos os espectros de 1H-NMR foram registrados em um equipamento
Varian UNITY plus-300 MHz utilizando DMSO-d6 e CDCl3 como solventes e
76
tetrametilsilano (TMS) como padrão interno. O ponto de fusão foi determinado
utilizando um equipamento Quimis Mod. Q340.23 e os resultados foram expressos
sem correção. A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em placas
de sílica gel (0.2 mm, E. Merck). Os cromatogramas foram visualizados com luz
ultravioleta (UV). Para cromatografia em coluna, foi utilizada sílica-gel 60 (230-400
mesh, E. Merck). Todos os reagentes usados neste trabalho foram de grau
analítico.
OH
OH
CH3 MnO2
H2O / H2SO4
O
O
CH3
(65-70) oCt.a.
Ac2O
H2SO4
OAc
OAc
CH3
AcO
(12) (6) (13)
ESQUEMA 4.
Síntese do composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona
Diacetoxilação da hidroquinona (9)
A 50 mmol (5,5 g) de hidroquinona, foram adicionados 100 mmol (9,5 ml) de
anidrido acético e 5-10 gotas de H2SO4 concentrado. Deixando a mistura reagir à
5oC por 5 minutos, sob agitação constante. Em seguida a mistura foi filtrada e
77
lavada com 50 mL de água destilada em pequenas porções. Após evaporação o
resíduo cristalino foi recristalizado três vezes com 10 mL de etanol/água 1:1. O
rendimento foi de 65-70% de cristais incolores. Ponto de Fusão: 122oC e o Rf foi
de 0,57 (sist. hex./act. 8:2). 1H-RMN (CDCl3): 2,15 (s, 6H); 7,15 (s, 4H).
Ácido 2-4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11)
Em balão seco, foram adicionados 41,7 mmol (5,6 g) de cloreto de alumínio
e 13,9 mmol (1,4 g) de anidrido succínico. A mistura foi aquecida a 130oC sob
atmosfera de argônio e foram adicionados 13,9 mmol de (10). O sistema foi
mantido nestas condições por 40 minutos, depois a temperatura foi elevada à
200oC e permaneceu reagindo por 1 h e 20 mim. A extração foi realizada com três
vezes de 10 mL acetato de etila . Após a evaporação do solvente, o resíduo foi
purificado por cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido
inicialmente com hexano puro, passando para hexano/acetato de etila 5%. O
rendimento foi de 40% de cristais amarelos pálido e o Ponto de Fusão foi 115oC,
com Rf de 0,46 (sist. hex./act. 6:4). 1H-RMN (DMSO-d6) 2,22 (s, 6H); 2,58 (s, 2H);
3,36 (s, 2H); 6,72 (d, 1H, J=8,69Hz); 6,9 (d, 1H, J=8,69Hz); 9,4 (s, 1H).
Oxidação da 2-metoxihidroquinona (12)
A uma solução de 5 mL de água destilada, 5 mmol de toluquinona (6) e 1,0
mL de H2SO4 concentrado, foi adicionado 16 mmol (1,4 g) de MnO2. A mistura
78
reagiu por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, foi lavada com 50
mL de água destilada e extraída com três vezes de 10 ml de éter. Em seguida foi
seca sob Na2SO4 anidro, filtrada e o solvente evaporado. O resíduo foi purificado
por cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido com hexano puro.
2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (13)
A 3 mmol do composto (6) foram adicionados 35 mmol (3,3 mL) de anidrido
acético e 15-20 gotas de ácido sulfúrico concentrado deixar reagir por 2 horas à
temperatura ambiente. Logo após a mistura foi lavada com 50 mL de água
destilada e extraída com 3 vezes de 10 ml de éter. A mistura foi seca sob Na2SO4
anidro e filtrada. Após a evaporação do solvente, o resíduo foi purificado por
cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido com hexano. O
rendimento foi de 60% de cristais amarelos e o Ponto de Fusão foi 135oC, com Rf
de 0,70 (sist. hex./act. 6:4). 1H-RMN (CDCl3) 2,15 (s, 3H); 2,33 (s, 9H); 6,9 (s, 1H);
7,2 (s, 1H).
Atividade Antimicrobiana
Os diferentes intermediários e os produtos obtidos foram testados quanto a
sua atividade antimicrobiana frente a algumas espécies de microorganismos
Gram-positivos, Gram-negativos e fungos: Staphylococcus aureus W IA-02,
Bacillus subtilis IA-16, Escherichia coli IA-224, Micrococcus luteus IA-100, Candida
79
albicans IA-1007, Klesbisiela pneumoniae AI-396, Aspergillus niger IA-2003,
Pseudomonas auriginosa IA-416 (IA = Coleção de microrganismos do
Departamento de Antibióticos da UFPE).
A atividade antimicrobiana in vitro dos compostos sintetizados foi avaliada
de acordo com o método descrito por Bauer & Kirby 22. Esta técnica baseia-se na
inibição do crescimento de microrganismo na superfície do meio de cultura
inoculado, ao redor de um papel de filtro impregnado com a substância teste. Este
método é qualitativo e informa se o microrganismo é sensível ou resistente a um
determinado antibiótico.
Os resultados obtidos foram considerados positivos quando o halo de
inibição foi igual ou superior a 10 mm. Todos os produtos foram testados à
concentração de 25 mg/mL.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Parte Química
Todos os derivados acetoxilados foram sintetizados e isolados por
cromatrografia em coluna com bons rendimentos e caracterizados por 1H-RMN, pf
e Rf.
Os métodos de síntese empregados mostraram-se eficazes na obtenção de
compostos acetoxilados, bem como, compostos que contenham, ligados ao seu
80
anel aromático, três grupamentos contendo oxigênio, assemelhado-se ao
composto protótipo, a primina.
Atividade Antimicrobiana
Os resultados do espectro antimicrobiano estão apresentados na tabela 1.
O produto de partida 2-metoxihidroquinona (12), apresentou o maior espectro de
inibição, chegando a inibir totalmente o crescimento do Micrococos luteus e obteve
halos de inibição de 41 mm para o Staphilococos aureus e 37 mm para o Bacillus
subitilis.
Os intermediário e produtos acetoxilados (10), (11) e (13) apresentaram
comportamento inibitório semelhantes frente à maioria de microrganismos
testados. O composto (11) foi o mais ativo de todos os compostos acetoxilados.
Apresentando halo de inibição de 15 mm para o Staphylococos aureus, de 12 mm
para o Bacillus subtilis e de 23 mm para o Micrococos luteus. Este comportamento
evidencia a importância das hidroxilas livres na atividade antibiótica, uma vez que
o composto (12), que possui duas hidroxilas livres, apresentou melhores
resultados, enquanto o composto (11), com apenas uma hidroxila na função ácido
da cadeia lateral, apresentou melhor espectro de inibição entre os produtos
acetoxilados.
81
Tabela 1. Espectro antimicrobiano dos compostos: Diacetoxiquinona (10), ácido 2-
4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11), 2-metoxihidroquinona (12), 2-metil-1,4,5-
triacetoxibenzoquinona (13).
HALO DE INIBIÇÃO (mm)
MICRORGANISMO (10) (11) (12) (13) Staphylococos aureus - 15 41 15
Bacilus subitilis - 12 37 10
Echerichia coli - - 13 -
Micrococos luteus 26 23 *IT -
Cândida albicans - - - -
Klesbisiela pneumoniae - - 13 -
Aspergilus niger - - - -
Pseudomonas auringinosa - - 10 -
*IT – Inibição Total
4. CONCLUSÕES
Para a preparação dos derivados acetoxilados da primina foram
empregados métodos econômicos, simples e generalizáveis. A proteção das
hidroxilas foi realizada usando o grupo acetoxi, através de reações simples e em
temperatura branda (60-70oC). O composto (6) foi obtido através de reação de
acilação de Friedel-Crafts, merecendo uma melhor avaliação biológica, além de
funcionar como protótipo para possíveis modificações moleculares, como a
82
condensação com aminoácidos, visando obter um pró-fármaco direcionado para o
princípio da latenciação.
Os resultados qualitativos da atividade antimicrobiana demonstram que
compostos como, por exemplo, o composto (12), merece ter uma avaliação mais
criteriosa quanto a determinação de sua Concentração Mínima Inibitória (CMI).
O conjunto dos resultados mostra que as modificações implementadas não
contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando, entretanto, a
importância das hidroxilas livres.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnologico (CNPq), a Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia
do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Banco do Nordeste pelo suporte
financeiro.
83
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. THOMSON, R. H., Naturally Occuring Quinones, 2th ed. London, Academic Press, 1971.
2. POWIS, G.; Quinoid Anticancer Agents, Pharm. Ther. Vol. 35, pp. 57-162,
1987.
3. DI MARCO, A.; ARCAMONE, F., ZUNINO, F.; Antibiotics, 3, 101, 1975.
4. SANTANA, C. E. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACERDA, A. L.; MARTINS, O. G., Observações Sobre as Propriedades Antitumorais e Toxicológicas do Extrato do Líber e de Alguns Componentes do Cerne do Pau D’arco; Rer. Do Inst. De Antib., Recife, 8, 89, 1968.
5. MELO, E. J. T.; AMARAL, P. C.; ANDRADE, P. P.; ANDRADE, C. R.; Sensitivy of Lower Trypanosomatides to Anti-Trypanosoma Cruzi Drugs, Anais XIV. Enc. Anal Pesq. Bras. Doenças de Chagas, Caxanbu-MG, 1984.
6. BERNAYS, E.; LUPI, A.; MARINI BETTOLO, R; MASTROFRANCESCO, C.; TAGLIATESTA, P; Antifeedant Nature of the Quinone Primin and its Quinol Miconidin from Miconia spp.; Experienta. 40, 1010-1011, 1984.
7. MELO, A. M.; JARDIM, M. L.; SANTANA, G. F. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACET, Y; Primeiras Observações do Uso Tópico da Primina, Plumbagina e Maitenina em Pacientes Portadores de Câncer de Pele; Rer. Inst. Antib., Recife, 14 (1/2), 9, 1974.
8. BLOCH, B.; KARRER, P.; Beiblat Zur Vierteljahresschrif Der Naturforsch., 22 (3), 36, 1967.
9. LIMA, O. G.; MARINI-BERTTOLO, G. B.; MONACHE, F. D.; COÊLHO, J. S. B; D’ALBUQUERQUE, I. L.; MACIEL, G. M; LACERDA, A.; MARTINS, D. G.; Substâncias Antimicrobianas de Plantas Superiores, Revista do Instituto de Antibióticos, Recife, Vol. 10 No. (1 2), 29-34, 1970.
84
10. COTIAS, C. F.; PINTO, K. V.; LACERDA, A. L.; MARTINS, D. G.; Propriedades Farmacológicas da Primina; Rev. Inst. Antib., Recife, 14, 17, 1974.
11. SCHILDKNECHT, H.; SCHMIDT, H.; Synthesen und Eigenschaften des Primins und seiner Isomeren; Zeitschrif Naturforsch, 22B, 287, 1967.
12. ROLIM NETO, P. J.; Síntese de 2-metoxi-p-benzoquinonas 3,5 e 6 alquil substituídas, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas e Antibióticos, UFPE, Recife, 1988.
13. BIEBER, L. W.; CHAPPETA, A. A.; SOUZA, M. A. M.; GENERINO, R. M.; Simple Syntese of Primin and Its Analogues Vai Lithiation of Protected Gauiacol, Jounal of Natural Products, Vol. 53, No. 3, 706-709, May-Jun 1990.
14. BRONDANI, D. J., Litiação e Alquilação Regioseletivas de 2-metoxihidroquinona, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, Recife, 1991.
15. BRONDANI, D. J.; BIEBER, L W.; regioselective Lithiation and Alkylation of 2-Methoxy-Hydroquinone, Química nova, Vol. 18, No. 2, 144-146, 1995.
16. BIEBER, L. W; ROLIM NETO, P.; GENERINO, R. M.; Regioselective Alkylation of Substituted Quinones by Trialkylboranes, Terahedron Letters, 40, 4473-4476, 1999.
17. BRONDANI, D. J.; NASCIMENTO, C. R. M.; de SOUZA, I. A.; BIEBER, L. W.; LEITE, A. C. L. Synthesis, Antitumour and Antiflammatory Activities of a Primin Precursor. IL FARMACO, 2004 (submetido)
18. THIELE; WINTER, Org. React.; 19; 199, 1972
19. WILGUS, H. S., GATES Jr., J. W., Canad. J. Chem., 45, 1975, 1967.
85
20. MANO, E. B., Práticas de Química Orgánica, 3o edição. Ed. Edgard Blücher Ltda. 1987.
21. BAUER, A. W., KIRBY, W. M., Antibiotic Susceptibility Testing by a Standardized Single Disk Method, AMER. J. CLIN. PATH., 45 (4), 493-496, 1966.
86
Capítulo 5
Conclusões e Perspectivas.
87
CONCLUSÕES
Na preparação dos precursores MHQ-THP e P-MHQ-THP, foram utilizados
métodos descritos na literatura e todos os compostos foram obtidos com bons
rendimentos.
A proteção do produto de partida, 2-metoxi-hidroquinona, com o DHP
revelou, através da avaliação do perfil de atividade farmacológica dos precursores
MHQ-THP e P-MHQ-THP, que eles são potencialmente bem menos tóxico que a
primina e seus análogos e apresentam uma boa taxa de inibição tumoral frente
aos tumores testado quando comparado ao composto protótipo, cuja dose
terapêutica fica próxima ao limiar de toxicidade, o que não ocorre para o MHQ-
THP e o P-MHQ-THP.
Avaliação da atividade antiinflamatória mostrou que o composto MHQ-THP
apresenta uma boa inibição quando testado no modelo de edema de pata induzido
por carragenina 1% (EPC).
Utilizamos na preparação dos derivados acetoxilados métodos simples,
econômicos e generalizáveis descritos na literatura e todos os compostos foram
obtidos com bons rendimentos.
A avaliação qualitativa preliminar da atividade antimicrobiana para esses
compostos, indica que, no conjunto dos resultados, as modificações
implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando,
entretanto, a importância das hidroxilas livres.
88
PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos são promissores o que nos estimulam a continuar o
projeto. Inicialmente, pretendemos ainda testar os precursores MHQ-THP e P-
MHQ-THP quanto à atividade antiinflamatória, obtendo uma curva dose-resposta
para os dois compostos, conseguindo assim uma avaliação farmacológica mais
detalhada.
Quando aos compostos acetoxilados, pretendemos sintetizar novos
derivados, principalmente para o ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico, com a
condensação com aminoácidos, visando uma possível potencialização da
atividade biológica, obtendo um pró-fármaco direcionado para o princípio da
latenciação, além de realizar outros ensaios biológicos que permitam traçar um
perfil de atividade biológica para esta série.
Pretendemos ainda, sintetizar o composto 6-pentil-1,2,4-triacetoxibenzeno
para fazermos um estudo farmacológico comparativo com a primina e com o P-
MHQ-THP.
89
Apêndice
Produção Científica.
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
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