ANTICORPOS
DEFINIÇÃO / CARACTERÍSTICAS
- Glicoproteínas solúveis produzidas por linfócitos B e células plasmáticas após a
estimulação com um antígeno.
- Por convenção estabelecida pela OMS, devem ser chamados de imunoglobulinas (abreviado como Ig)
- Pertencem a um grupo de polipeptídeos chamados imunoglobulinas (separação
eletroforética).
- Interação Ag – Ac se dá através de forças não covalentes
(ligações de hidrogênio, atração eletrostática e força de van der Waals).
IMUNOGLOBULINAS
A – albumina
B – alfa-globulina
C - beta globulina
D – gama-globulina
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
PLASMÓCITO PATÓGENOS
EFEITOS PROTETORES DA
IMUNIDADE HUMORAL SÃO
MEDIADOS POR UMA FAMÍLIA DE
GLICOPROTEÍNAS DENOMINADAS
ANTICORPOS
B
Plasmócito
anticorpos
Imunidade humoral
Anticorpos (Ac) ou Imunoglobulinas (Ig)
- São moléculas com receptores específicos para o
mesmo antígeno que estimulou a sua síntese, e
apresentam a mesma estrutura básica.
- Porção Fab (fragment antigen binding): liga-se ao
antígeno e varia segundo a especificidade de cada ly B.
- Porção Fc (fragment crystalizable): interage com
células, principalmente fagócitos, através de receptores
Fc ou ativa o complemento.
Anticorpos
Estrutura
Quatro cadeias polipeptídicas ligadas por pontes dissulfeto. * Cadeias pesadas (55 a 70 Kd) - Zona de dobradiça – prolina – até 180o
* Cadeias leves (25 Kd)
* Enzimas proteolíticas (papaina)): - fragmento cristalizável (Fc) - fragmento que se liga ao antígeno (Fab): variabilidade ext. aminoterminal
2 leves (L)
2 pesadas (H)
ESTRUTURA
- 4 cadeias polipeptídicas
- 2 isotipos de cadeia leve: (kapa), (lâmbida)
- 5 isotipos de cadeia pesada:
(alfa), (delta) , (gama) (epsilon) (mi)
* Cada cadeia tem segmentos relativamente estáveis ou constantes (C), que controlam as funções efetoras da molécula.
* Zonas onde a sequência de aminoácidos varia enormemente: regiões variáveis
(V).
- Conteúdo de carboidrato: 2 – 12%
- Ligações dissulfeto
O anticorpo é constituído por quatro cadeias polipeptídicas, possuindo dois sítios
de ligação para o antígeno
Antígeno
cadeias
sítios de ligação
O anticorpo é formado de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas unidas por pontes dissulfeto
CADEIA PESADA
C
C
N
N
N
NCADEIA LEVE
CC
CADEIA PESADA
C
C
N
N
N
NCADEIA LEVE
CC
PONTES DISSULFETO
ESTRUTURA DAS IMUNOGLOBULINAS
Região amino terminal
Dobradiça
Região Carboxi terminal
Cadeia leve
Cadeia pesada
Ponte dissulfeto
Cadeia leve
Cadeia pesada
aminoácidos
aminoácidos
aminoácidos
Tratamentos enzimáticos
Papaína: 3 fragmentos
(2 Fab, 1Fc).
Pepsina: 2 fragmentos Fab.
ESTRUTURA
Duas porções:
Fab: ligação com o Ag.
Fc: cristalizável.
INTERAÇÃO COM O ANTÍGENO
Afinidade refere-se à força individual da ligação Ac-Ag (um epítopo e um sítio combinatório). É proporcional ao grau de complementaridade entre o epítopo e o sítio combinatório.
Especificidade refere-se a especificidade dos sítios combinatórios de um Ac. Quando o Ac reage apenas com o Ag A, e não com o B, diz-se que ele é específico. Quando alguns epítopos de um antígeno C são também reconhecidos, diz-se que ocorre uma reatividade cruzada.
• Antígenos
- Substância capaz de induzir e reagir com a resposta imunológica.
• Epítopos ou Determinantes antigênicos
- São fragmentos da molécula do antígeno que induzem ou reagem com a resposta imunológica.
- Porção específica que liga-se ao anticorpo.
Podem ser:
- Determinantes lineares: formados por resíduos de aminoácidos adjacentes na sequência covalente.
- Determinantes conformacionais: formados por resíduos de aminoácidos de partes separadas da sequência linear . Estão justaposos espacialmente na pela estrutura terciária protéica.
Diferenças/marcadores (polimorfismo)
Isotípicas
- Entre indivíduos de espécies diferentes;
- Mamíferos: 5 tipos de cadeia pesada (, , , e
Alotipicas
- Entre indvíduos da mesma espécie;
- Geralmente demonstra diferenças raciais;
- Pequenas variações nas regiões constantes.
Idiótipos
- Regiões determinantes de complementaridade (CDR) ;
- Local nos anticorpos complementares para o antígeno;
- Na porção Fab - chamadas regiões hipervariáveis
- Existem entre anticorpos de clones diferentes de plasmócitos.
1. Na defesa do hospedeiro
marcação de organismos infecciosos;
recrutamento, no hospedeiro de mecanismos efetores de destruição;
neutralização de toxinas;
remoção de antígenos estranhos da circulação.
2. Na medicina clínica
níveis de Ac específicos antipatógeno usados no diagnóstico/monitoramento
de uma doença;
conjunto de Ac administrados passivamente para a terapia/proteção do
hospedeiro.
3. Em laboratórios científicos
diagnóstico e pesquisa.
Funções
- Inativação de toxinas e outros agentes químicos
- Inativação de vírus
- Lise de bactérias
- Citotoxicidade
- Transferência de imunidade para fetos (IgG)
- Transferência de imunidade a lactantes (IgA>IgG)
- Fixação do complemento
- Regulação da resposta imune
- Participação em reações auto-imunes e alérgicas
AÇÃO DOS ANTICORPOS
• NEUTRALIZAÇÃO
Ligação ao patógeno impedido interação deste com a membrana celular.
•OPSONIZAÇÃO
Revestimento do patógeno por proteínas sistema imune.
•AGLUTINAÇÃO
•ATIVAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO
•DEGRANULAÇÃO
Tabela: FUNÇÕES DOS ANTICORPOS
Neutralização
Opsonização
Sensibilização de NK
Ativação de complemento
Sensibilização de MASTÓCITO
ATIVIDADE
DISTRIBUIÇÃO
Transporte através do epitélio
Transporte através da placenta
Difusão extravascular
mg/mL
ANTICORPO IgM
A IgM constitui cerca de 5-10% do soro total .
Primariamente nos espaços intravasculares.
É o 1º anticorpo a ser produzido na resposta imune primária
ATIVA COMPLEMENTO !!
- Principalmente sob forma de pentâmero (cinco monômeros)
- Redução a monômero de peso molecular 180kDa
- Principal imunoglobulina da resposta primária aos antígenos
- Primeira classe ao elevar-se na fase aguda dos processos imunológicos
-Aglutinante e citolítico
-Fixação complemento melhor que IgG3
- Maturação de célula B, atuando como receptor e interagindo com o antígenoquanto ao controle da ativação ou supressão do linfócito
-Sintetizada à partir do 5 meses de vida fetal
- Não neutraliza vírus ou toxinas
* Níveis elevados de IgM normalmente indicam uma infecção recente ou uma exposição recente do Ag
IgM
ANTICORPO IgG
É a Ig mais abundante no sangue (80%), em particular na resposta secundária a um antígeno
A IgG1, IgG3 e a IgG4 são capazes de atravessar a placenta
A IgG3 é a mais eficiente ativadora de Complemento.
IgG- Principal Ig sintetizada na resposta secundária- Neutraliza toxinas bacterianas, vírus- Opsonina- Liga-se aos microorganismos para facilitar a fagocitose - Responsável pela memória imunológica
- Atravessa a barreira placentária humana- Monômero: 4 subclasses IgG1, 2, 3 e 4 (constituem 70, 20, 8 e 2%, respectivamente, do total de IgG)
- IgG3 fixa complemento com mais eficiência- PM 160kD
- Geralmente forma monomérica
ANTICORPO IgA
É a imunoglobulina presente em maior quantidade (10-15%) nas secreções externas como leite, saliva e lágrimas onde existe na forma de dímero.
Estrutura da IgA secretora
Cadeia J
Componente secretor
IGA– 2ª mais abundante no soro (monomerica)– Ocorre como monômero e como dímero
– IgA secretora (mais encontrada secreções exócrinas)
– Principal Ig secretada para superfícies externas (mucosas)• lágrimas, saliva, leite, suco gástrico e secreções pulmonares• confere imunidade local-barreira contra vírus, micróbios, alérgenos
– Não fixa complemento– Neutraliza vírus
– Bactericida contra Gram-negativas, na presença de lisozima
– PM 160kDa (monômero) ou 360kDa (dímero)
– Importante papel impedindo a penetração, no organismo de substâncias alergênicas e de partículas microbianas
ANTICORPO IgE
•A IgE está presente em baixas concentrações no soro (0,004%), mas tem um papel significante no início da resposta inflamatória aguda, na proteção contra parasitas e nas reações alérgicas.
– Monômero longo com 4 domínios CH
– Baixa concentração no soro• Liga via porção Fc em basófilos e mastócitos • Não requer a presença do antígeno para se ligar
– Reações alérgicas - Níveis aumentam na resposta a parasitas ou pacientes com reações alérgicas (hipersensibilidade do tipo I)
– Interação mastócito / IgE / Ag, causa a ativação do mastócito com efeitos vasculares potentes localizados
– Infecções parasitárias (helmintos)• Ligação via Fc aos eosinófilos
– Não fixa complemento
IgE
ANTICORPO IgD
É uma imunoglobulina presente em baixas concentrações na circulação ( 0,3mg/ml), cuja função primária é o de receptor da célula B.
Não possui funções biológicas conhecidas.
– Concentrações séricas baixas– Meia-vida curta– Menos caracterizada das imunoglobulinas do ponto de vista
funcional– Sensível à proteólise– Está na superfície do linfócito B– Não liga complemento– Forma monomérica– PM 160kDa– Sensível a lise (lábil à degradação)– Existe como receptor na superfície de todo linfócito B em
determinado momento de sua ontogenia
IgD
• Inicialmente linfócitos B expressam IgM
• Durante a resposta imune, ocorre liberação de citocinas por células T que induzem a troca de isotipo para IgG, IgA ou IgE;
• Recombinação somática na célula B.
“Switching” / Troca de classe
GERAÇÃO DE DIVERSIDADE NA RESPOSTA HUMORAL
O Papel das Citocinas
Citocina
Inibe Inibe
Inibe
Inibe Inibe
Inibe
Inibe
Inibe
Induz
Induz
Induz
Induz
Induz
Aumenta produÇão
Induz
Resposta primária e secundária
Primeiro contato com Ag- Estimulo para linfócitos B que se diferenciam em plasmócito e liberam Ac- produção de Ac
Segundo contato (mesmo Ag)- Células receptoras (células de memória)- Resposta imunológica mais rápida- produção de Ac
RESPOSTA IMUNE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA Resposta humoral
Declínio
Tempo(dias)
Resposta primária
Resposta secundária (maturação de afinidade)
Tempo(dias)
Con
cent
raçã
o de
A
ntic
orpo
Con
cent
raçã
o de
A
ntic
orpo
• Produzidos pelo mesmo clone de linfócito B (mesma especificidade)
• Produção de Ac específico para um determinado epítopo (tecnologia dos anticorpos monoclonais)
Anticorpos Monoclonais
ANTICORPO MONOCLONAL - PRODUÇÃO
Imunização com antígeno X
Células de baço ativadas
Linhagem de mieloma mutante
FUSÃO
Cultivo de hibridomas em meio HAT
SELEÇÃO DOS HIBRIDOMAS
Sem produção de anticorpos desejados
Com produção de anticorpos desejados
Cultivo dos hibridos para produção de anticorpo mococlonal
Anticorpo purificado
ANTICORPOS MONOCLONAIS - APLICAÇÕES
TERAPIA CONTRA CÂNCER
Bloqueio dos receptores de
células cancerosas
GLOSSÁRIO IMUNOLOGIA
Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) Lise de células-alvo através da ação de anticorpos e neutrófilos, macrófagos ou células nulas. IgG.
Fagocitose É o ato de comer realizado pelas células. O termo compreende vários processos, inclusive quimiotaxia, aderência ingestão e digestão ede partículas.
Hapteno Molécula não protéica que pode se ligar a sítios específicos de combinação de anticorpos mas não pode, pôr si só, iniciar uma resposta imune.
Hemaglutinação Agregação de eritrócitos pôr anticorpo ou vírus.
Monocinas São produtos protéicos de fagócitos mononucleares que influenciam as atividades de outras populações celulares.
Opsonina Substância que se liga a partículas e facilita sua fagocitose.
Pinocitose Literalmente é o ato de beber realizado pelas células.
Precipitação Agregamento de moléculas de antígenos solúveis pelos anticorpos para produzir um precipitado visível. Este contém tanto Ag como Ac.
PPG Im
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi
Cláudia Valle Cabral Dias dos Santos MESTRANDA
Laboratório de Imunologia Molecular e Celular - LIMC Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - CPqGMFundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZSalvador - BA
OBJETIVO GERAL
Produzir anticorpos monoclonais anti-amastigotas de
Leishmania chagasi, visando o desenvolvimento
futuro de técnicas imunodiagnósticas que permitam a
identificação de moléculas de Leishmania específicas
para o diagnóstico da infecção no homem e no cão.
Testar diferentes protocolos de imunização de camundongos com Leishmania chagasi ou seus antígenos, visando a obtenção de melhor resposta humoral anti-amastigota
Produzir hibridomas utilizando esplenócitos do animal que melhor respondeu às imunizações
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
PROTOCOLO DE PURIFICAÇÃO DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi
sacrifício e
coleta de baço
hamster infectado
separação de células
lise de hemácias em
NH4Cl a 0,85 %
purificação de amastigotas em gradiente de Percoll
lavagem de amastigotas e armazenamento à - 70oC
GRAU DE PURIFICAÇÃO DE AMASTIGOTAS
O melhor rendimento foi de 3.4 x 10 9 parasitos por hamster
““Imprint” do baçoImprint” do baço Amastigotas após Amastigotas após gradiente de Percollgradiente de Percoll
ESTRATÉGIA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI - AMASTIGOTAS DE
Leishmania chagasi
células pós-fusão
mieloma SP2/0
esplenócitos
+
promastigotas metacíclicos vivos
ELISA para amastigotas
seleção do animal melhor respondedor
seleção das células secretoras de anticorpos anti-amastigotas
fusão
RESUMO DA PRODUÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- AMASTIGOTAS DE
Leishmania chagasi
Número de poçosutilizados
Número de poçostestados com crescimento
de células
Números de poçospositivos para L. chagasi
em ELISA
1920 141 (7,3%) 05 (3,6% dos poçospositivos)
CLONAGEM DE CÉLULAS HÍBRIDAS
Diluição limitante
Distribuição em placas de 96 poços com cinco ou uma célula/poço
Seleção dos poços contendo apenas uma colônia
Expansão desses clones
CARACTERIZAÇÃO POR WESTERN BLOT DOS ANTÍGENOS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi
a. 4B6E11; b. 4B6F7; c. 5A9H8; d. 5A9H10; e. 5A9H11; f. 5A9H12; g. 9A7E12; h. salina; i. anticorpo monoclonal irrelevante. A- antígeno sob condições não desnaturantes; B- antígeno sob condições desnaturantes
a b c d e f g h i a b c d e f g h i
112KDa
84KDa
53KDa
35KDa29KDa21KDa
A B
CLASSES E SUBCLASSES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS E PESO MOLECULAR DAS
PROTEÍNAS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi
Clone Peso molecularClasse e subclassede imunoglobulinas
9A7E1260 kDa
4B6F735 e 68 kDa
5A9H8
A inoculação de camundongos com promastigotas metacíclicos
vivos de Leishmania chagasi demonstrou ser de fácil execução e
eficiente na obtenção de resposta imune humoral anti-amastigota
de Leishmania chagasi.
Um anticorpo monoclonal obtido pertencente à subclasse de
imunoglobulina IgG2a foi espécie e estágio específico,
reconhecendo dois antígenos de 35 e 68 kDa de proteína nativa
apenas das formas amastigotas de Leishmania chagasi.
Outro anticorpo monoclonal da classe IgM reconheceu uma banda
de 60 kDa de antígeno de amastigotas e promastigotas de quatro
diferentes espécies do gênero Leishmania.
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