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Engenharia Genética e a Tecnologia do DNA recombinante:
CLONAGEM MOLECULAR
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CLONAGEM
NDB – Núcleo de Difusão BiotecnológicaBiotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
Desenvolvimento Inicial da Genética Clonagem
1953 – Estrutura do DNA - Watson e Crick.
1971-1973 – Desenvolvimento das Técnicas de Clonagem de DNA – Boyer e Cohen
1962 –
1ª evidência da existência de Nucleases de Restrição –
Linn e Arber .
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• Após 1973 – o DNA passou a ser a molécula mais fácil de ser analisada.
As técnicas de clonagem permitiram:
isolar, seqüenciar e manipular genes individuais
de qualquer tipo celular; possibilitando estudos
moleculares detalhados da estrutura e função dos
genes eucarióticos.
Fundamental importância para o desenvolvimento de estudos na Biologia Celular,Bioquímica e Genética
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Clonagem MolecularIsolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas, permitindo a obtenção deuma amostra pura de um gene individual, separado de todos os outros genes da célula.
Etapas:
1- O fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outramolécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA
recombinante .
2- A molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeiracompatível, num processo chamado de transformação . A célula hospedeira queadquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante.
Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisãocelular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.
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Técnicas de Clonagem
Desenvolvimento fundamentado pela descoberta de:
● Enzimas de Manipulação de DNA.
● Vetores de Clonagem.
● Desenvolvimento de Métodos de Transformação deBactérias.
● Métodos Capazes de Distinguir Células Transformadas denão Transformadas.
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Enzimas Utilizadas na Manipulação
de DNA
● Nucleases
• Exonucleases
• Endonucleases
● Ligases
● Polimerases
Clivam, encurtam e degradamMoléculas de DNA, quebrandoligações fosfodiéster que únemnucleotídeos adjacentes.
Removem um nucleotídeo porvez, a partir da extremidade deuma molécula.
Quebram ligações fosfodiéster nointerior da molécular de DNA.
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1962 - Endonucleases de Restrição.
• As bactérias produzem uma enzima quedegrada o DNA de fagos antes que eletenha tempo para se replicar.
• O DNA bacteriano é protegido do ataque
por ser portador de grupos metila adicionais,os quais bloqueiam a ação da enzima.
Estas enzimas reconhecem seqüências
específicas de 4 a 8 pares de base (pb)na molécula de DNA e fazem dois cortes,um em cada fita.
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2 tipos distintos de clivagem:
O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüênciapalindrômica , isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de umafita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta
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• A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que
surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA .
Ela atua na clonagem molecular unindo ofragmento de interesse ao vetor utilizado,formando um híbrido vetor/fragmento.
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Junção de duas fitas de DNA
A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias deDNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia
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Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas emcoesivas pela adição de poli (A) e poli (T).
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Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados emcoesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restriçãoque reconhece o adaptador.
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• São enzimas que sintetizam uma nova fita de DNA, complementar a ummolde de DNA ou RNA preexistente
DNA Polimerase
Sua importância na clonagem molecular se dá,principalmente, em reações de PCR (Reaçãoem Cadeia da Polimerase), e na construção
de bibliotecas de DNA recombinante.
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Vetores de Clonagem
• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade doexperimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem podemser utilizados para geração de moléculas recombinantes.
Tipos de Vetores:
● Plasmídeos – clonagem de até 15.000 bp
● Fagos - clonagem de até 23.000 bp
● Cosmídeos – clonagem de até 35 a 40 kb
● Cromossomo Artificial de Leveduras (YACs) - Clonam até 20 a 40 kb
● Cromossomo Bacteriano Artificial (BACs) - podendo alguns cloneschegar a 300 kb.
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Plasmídeos
● Propriedades:
● Origem de replicação (O)
Multiplicar-se de maneira independente
● Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)Sítios p/ várias enzimas de restrição
● Gene marcador (AmpR)
● São os mais simples e mais utilizados na clonagem gênica;
● Restrição: tamanho de DNA a ser inserido (máximo 15.000bp)
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Eletroporação
Submeter células competentes de E. coli a um pulso de altavoltagem:
● Como conseqüência do campo elétrico gerado, a membranaplasmática desestabiliza (ddp), produzindo poros transitórios
e permitem a passagem de macro e micromoléculas.
● É bastante eficiente e simples
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Cloreto de Cálcio: Choque Térmico
- As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcioseguido de um choque térmico de curta duração.
- Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana
bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do
choque térmico.
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AATGCTTCG........CTGAGTAA
ATTACCAAGC........GACTCAT
Seleção das Células Transformadas
- A identificação das colônias recombinantes é feita utilizando característicasconferidas pelos vetores:
• Marcadores de Seleção lac Z (-galactosidade)AmpR
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AATGCTTCG........CTGAGTAA
ATTACCAAGC........GACTCAT
Meio Seletivo
Amp + X-Gal
Seleção das Céls. Tansformadas
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Bibliotecas de DNA
São coleções dos clones recombinantes obtidos por ligaçãode fragmentos de DNA de interesse a um vetor.
Amplificação do seu DNA de interesse
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Bibliotecas de DNA
● Bibliotecas Genômicas:
Contêm clones portando fragmentos de DNA representantes de todoo genoma do organismo
- Fragmentos entre 20 e 40 kb.
● Bibliotecas de cDNA:Clonar apenas mensagens que são
transcritas em mRNAs.
- É mais seletiva- Isolamento de genes específicos- Exclui regiões intrônicas- Baseia-se na transcrição reversa do mRNA de
interesse
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Bibliotecas de cDNA
● Dependente da síntese de um cDNA a partir deum mRNA
- Transcriptase reversa
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Bibliotecas de DNA Genômico● Utilizada em Projetos Genomas
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DNA Genômico x cDNA
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Bibliotecas de DNA Genômico
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Bibliotecas de DNA Genômico x cDNA
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Biotecnologia: o DNA em foco
Dúvidas?
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