CCAARROOLLIINNEE CCRRIISSTTIINNAA FFEERRNNAANNDDEESS DDAA SSIILLVVAA
ANLISE QUMICA E ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTXICA DE AMOSTRAS DE PRPOLIS DE ALECRIM
SSoo PPaauulloo
2008
CAROLINE CRISTINA FERNANDES DA SILVA
ANLISE QUMICA E ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTXICA DE AMOSTRAS DE PRPOLIS DE ALECRIM
OOrriieennttaaddoorr:: PPrrooffaa DDrraa MMaarriiaa LLuuiizzaa FFaarriiaa SSaallaattiinnoo
DDiisssseerrttaaoo aapprreesseennttaaddaa aaoo IInnssttiittuuttoo ddee BBiioocciinncciiaass ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee ddee SSoo PPaauulloo,, ppaarraa aa oobbtteennoo ddee TTttuulloo ddee MMeessttrree eemm CCiinncciiaass,, nnaa rreeaa ddee BBoottnniiccaa
SSoo PPaauulloo
22000088
FFiicchhaa CCaattaallooggrrffiiccaa
CCoommiissssoo JJuullggaaddoorraa
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
Profa. Dra. Maria Luiza Faria Salatino
Silva, Caroline Cristina Fernandes da
Anlise qumica e atividades antioxidante e citotxica de amostras de
prpolis de alecrim
Nmero de pginas - 102
Dissertao (Mestrado) Instituto de Biocincias da Universidade de
So Paulo. Departamento de botnica
1. Atividade antioxidante 2. Atividade citotxica 3. Prpolis verde.
DDeeddiiccoo eessttee ttrraabbaallhhoo mmiinnhhaa ffaammlliiaa ee
aaoo mmeeuu nnaammoorraaddoo ZZ,, ppoorr eexxiissttiirreemm nnaa
mmiinnhhaa vviiddaa..
AAggrraaddeecciimmeennttooss
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eellaabboorraaoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo::
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FFaappeesspp,, ppeelloo ssuuppoorrttee ffiinnaanncceeiirroo..
nnddice
1. Introduo1
1.1. Elaborao e uso da prpolis pelas abelhas........................................2
1.2. Origem botnica e composio qumica da prpolis.............................2
1.3. Origem botnica e composio qumica da prpolis brasileira...............5
1.4. Atividades biolgicas e farmacolgicas atribudas prpolis.................8
1.5. Atividade antioxidante....................................................................9
1.6. Atividade cititxica.......................................................................11
2. Objetivos................................................................................................13
3. Material e mtodos...................................................................................14
3.1. Amostras de prpolis....................................................................14
3.2. Massa seca..................................................................................14
3.3. Preparao dos extratos metanlicos..............................................15
3.4. Extrao fracionada......................................................................15
3.5. Determinao do teor de fenis totais.............................................15
3.6. Determinao do teor de flavonas e flavonis totais..........................16
3.7. Determinao do teor de flavanonas e isoflavonas totais....................17
3.8. Determinao do teor de ceras totais..............................................18
3.9. Identificao das substncias presentes nas amostras.......................18
3.10. Derivao das fraes de clorofrmio............................................19
3.11. Testes de atividade antioxidante...................................................20
3.11.1. Mtodo de seqestro de radicais livres DPPH......................20
3.11.2. Sistema -caroteno/cido linolico....................................21
3.11.3. Atividade antioxidante por cromatografia em camada
delgada....................................................................................23
3.12. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio do mar...................24
3.13 Anlises estatsticas.....................................................................25
4. Resultados..............................................................................................27
4.1.Massa seca...................................................................................27
4.2. Determinao do teor de fenis totais.............................................27
4.3. Determinao do teor de flavonas e flavonis totais..........................29
4.3. Determinao do teor de flavanonas e isoflavonas totais....................31
4.5. Determinao do teor de ceras totais..............................................32
4.6. Teste de regresso linear...............................................................33
4.7. Identificao das substncias presentes nas amostras.......................35
4.8. Atividade antioxidante...................................................................47
4.8.1. Mtodo de seqestro de radicais livres DPPH..........................47
4.8.2. Atividade antioxidante dos extratos fracionados pelo mtodo do
DPPH................................................................................50
4.8.3. Atividade antioxidante no sistema -caroteno/cido
linolico.............................................................................51
4.8.4. Atividade antioxidante dos extratos fracionados no sistema -
caroteno/cido linolico.................................................................54
4.8.5.Teste de regresso linear relacionando a atividade
antioxidante...................................................................56
4.8.6. Atividade antioxidante por cromatografia em camada
delgada.............................................................................59
4.9. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio do mar.....................65
5. Discusso................................................................................................73
6. Consideraes finais.................................................................................86
7. Referncias bibliogrficas..........................................................................90
8. Resumo................................................................................................101
9. Abstract................................................................................................102
1
11.. IINNTTRROODDUUOO
A palavra prpolis deriva do Grego pro, em defesa de, e polis, cidade, ou
seja, um produto utilizado pelas abelhas na defesa da colmia (Ghisalberti,
1979). Trata-se de uma mistura complexa de substncias, com aspecto resinoso,
elaborada por abelhas Apis mellifera e tambm por abelhas indgenas sem ferro
(Melipona compressipes, Tetragonisca clavipes, Melipona quadrifasciata,
Friesomelitta varia, Melipona favosa, Scaptotrigona depilis, Paratrigona anduzei,
Tetragonisca angustula, entre outras) (Tomas-Barbern et al., 1993; Bankova et
al., 1999; Pereira et al., 2003).
Sua aparncia bastante varivel, tanto na colorao (desde amarelo claro
at marrom escuro ou vermelho) quanto na textura (desde rgida, se pulverizando
facilmente, at elstica e pegajosa) (Ghisalberti, 1979; Salatino et al., 2005).
composta principalmente por cera de abelhas e substncias derivadas de plantas,
que so incorporadas sem alterao (Burdock, 1998). Para a produo da prpolis,
as abelhas coletam substncias que so ativamente secretadas, tais como resinas e
compostos volteis, ou substncias que so exudadas por ferimentos, como
materiais lipoflicos em folhas e gemas foliares, alm de mucilagem, gomas, ltex
etc. (Bankova, 2005). Desse modo, a composio da prpolis ir depender da
planta da qual o material foi coletado e, portanto, da localizao geogrfica da
colmia, pois as plantas disponveis para as abelhas sero diferentes dependendo
do local onde a colmia est localizada.
2
11..11.. EEllaabboorraaoo ee uussoo ddaa pprrppoolliiss ppeellaass aabbeellhhaass
As abelhas fragmentam os pices vegetativos das plantas (gemas,
primrdios foliares e folhas jovens) com as mandbulas, coletando as resinas
liberadas. Com o primeiro par de pernas, transferem a massa de resina para as
pernas medianas e ento para a corbcula (parte posterior da tbia), nas pernas
posteriores. O tempo gasto do incio do processo de coleta at o depsito da massa
de resina na corbcula, leva em mdia 7 minutos. A freqncia de visita varia
dependendo de diversos fatores, dentre eles a necessidade da colmia por prpolis
(Teixeira et al., 2005).
As abelhas utilizam a prpolis para diversos fins, entre eles, selar aberturas e
cobrir a entrada da colmia, impedindo dessa forma a entrada de microrganismos,
como fungos e bactrias. A prpolis contribui tambm para a manuteno da
temperatura interna da colmia por volta de 35C. As paredes das clulas
hexagonais dos ninhos contm uma mistura de cera de abelha e prpolis. Dessa
forma, a prpolis no s enrijesse a clula, mas mantm o ambiente interno
assptico. Quando as abelhas no conseguem transportar para fora os animais
invasores mortos, elas revestem sua carcaa com prpolis. Este processo se
assemelha a um embalsamento e impede a putrefao do material (Ghisalberti et
al., 1979).
11..22.. OOrriiggeemm bboottnniiccaa ee ccoommppoossiioo qquummiiccaa ddaa pprrppoolliiss
Diversos estudos foram realizados na tentativa de elucidar quais seriam as
plantas utilizadas como fonte de resinas para a elaborao da prpolis. Os
primeiros trabalhos envolvendo a anlise qumica de amostras de prpolis datam
3
dos anos 70, com Lavie, na Frana (Lavie, 1975 apud Bankova et al., 2000) e
Popravko, na Rssia (Popravko et al., 1980 apud Bankova et al., 2000). Estudos
envolvendo a anlise de amostras de prpolis de regies temperadas atravs de
CLAE (Cromatografia Lquida de Alta Eficincia) demonstraram que exudatos da
gema de Populus e seus hbridos so a origem botnica da prpolis em diversos
locais como Monglia (P. suaveolens), Albnia (P. nigra e P. canadensis), Bulgria,
Frana, Gr-Bretanha, Hungria, Espanha, Mxico (P. nigra) (Marcucci et al., 2001),
Amrica do Norte (P. fremontii), Reino Unido (P. euramericana) (Marcucci, 1995),
Norte da Argentina, sul do Brasil e Uruguai (P. alba) (Park et al., 2002; Park et al.,
2004; Isla et al., 2005). Na Turquia, a principal fonte tambm P. nigra, porm
foram descritas amostras com a composio qumica semelhante de P.
euphratica, espcie nunca descrita anteriormente como fonte de resinas para
elaborao da prpolis (Popova et al., 2005). Na Nova Zelndia, espcies de
Populus introduzidas so fonte de substncias presentes na prpolis (Markham et
al., 1996).
Em regies onde Populus no nativo, as abelhas retiram exudatos de
outras plantas para a fabricao da prpolis. Na Rssia, a principal fonte Betula
verrucosa (Popravko et al., 1980 apud Bankova et al., 2000), enquanto na Polnia,
substncias da prpolis so retiradas de Betula spp. e Alnus spp.; no Hava,
Plumeria acutifolia e P. acuminata so fontes de resinas (Marcucci, 1995) e na
Austrlia as abelhas utilizam Xantorrea spp. (Ghisalberti, 1979). Na Venezuela, as
abelhas coletam resinas de Clusia minor e C. major (Tomas-Barbern et al., 1993).
Em Cuba, a principal origem botnica C. nemorosa (Cuesta-Rubio et al., 1999).
4
No Brasil, as abelhas coletam substncias principalmente de Baccharis
dracunculifolia.
Em geral, amostras de prpolis de diferentes regies do mundo so
constitudas por 30% de ceras, 50% de resinas vegetais, 10% de leos volteis,
5% de plen e 5% de outras substncias, incluindo compostos orgnicos (Burdock,
1998), alm de microelementos (Walker & Crane, 1987).
A prpolis apresenta uma frao solvel em lcool, denominada blsamo da
prpolis e uma insolvel em lcool, ou frao de cera (Marcucci, 1995). Estudos
comparativos da cera da prpolis e dos ninhos das abelhas demonstraram como
principais constituintes steres, e hidrocarbonetos. No foram observadas
diferenas que permitissem distino entre as duas amostras de cera, o que sugere
uma fonte comum para ambas. O contedo total de cera nos ninhos varia de 1,5 a
3% e na prpolis de 4,8 a 19,3%; o contedo de hidrocarbonetos varia de 15,5 a
25,2% nos ninhos e de 6,4 a 33,3% na prpolis, enquanto o teor de steres de
67,4 a 75,8% nos ninhos e 49,2 a 77,1% na prpolis (Negri et al., 2000).
Entre as amostras de prpolis parece haver uma variao gradual na
proporo de substncias derivadas da via do mevalonato (terpenides, incluindo
sesqui, di e triterpenos) e os tpicos derivados da via do chiquimato (substncias
fenlicas, preniladas ou no) (Salatino et al., 2005). At o momento, mais de 300
substncias j foram descritas como constituintes da prpolis (Walker & Crane,
1987; Marcucci, 1995; Bankova et al., 2000; Pereira et al., 2003). A maioria das
substncias identificadas constitutiva da prpolis europia e grande parte delas
pertence ao grupo dos flavonides (flavonas, flavonis e flavanonas) (Kujumgiev et
al., 1999; Simes et al., 2004).
5
Apesar da atividade de algumas substncias isoladas j ter sido comprovada,
em alguns casos no possvel atribuir uma atividade para uma substncia
especfica (Kujumgiev et al., 1999), sendo muitas vezes feito o uso de extratos, o
que leva necessidade de haver uma padronizao entre amostras de prpolis.
Nesse sentido, alguns trabalhos foram realizados na tentativa de se aproximar de
uma padronizao ou controle de qualidade em amostras de prpolis. Woisky e
Salatino (1998) realizaram um trabalho com o objetivo de determinar o perfil
qumico de amostras de prpolis de diversas regies do Brasil. Foi quantificado o
teor de fenis totais, flavonides, substncias volteis, ceras, cinzas e resduos
secos livres de compostos volteis, sendo estes fatores considerados determinantes
para um controle de qualidade. Park e colaboradores (2000) realizaram um
trabalho com diversas amostras de prpolis brasileiras e, de acordo com a origem
botnica e composio qumica, reconhecem 12 grupos de prpolis brasileiras. Ao
trabalhar com material padronizado, os cientistas poderiam associar um tipo
qumico de prpolis a um tipo especfico de atividade biolgica.
11..33.. OOrriiggeemm bboottnniiccaa ee ccoommppoossiioo qquummiiccaa ddaa pprrppoolliiss bbrraassiilleeiirraa
No Brasil a principal fonte de resinas para a elaborao da prpolis verde (a
prpolis mais comercializada no pas e para exportao) Baccharis dracunculifolia.
Essa colorao verde caracterstica devida clorofila existente nos tecidos jovens
(gemas vegetativas) e folhas no-expandidas coletadas pelas abelhas. Essas folhas
jovens contm tricomas secretores, provavelmente com leos volteis e aromticos
(Salatino et al., 2005).
6
Baccharis dracunculifolia, conhecida popularmente como alecrim-do-campo,
devido sua semelhana morfolgica com o alecrim europeu, uma Asteraceae
arbustiva com cerca de 2-3 m de altura. Ocorre na Amrica do Sul, do sudeste ao
sul do Brasil, Argentina, Uruguai, Paraguai e Bolvia. Possui caractersticas de
plantas invasoras, produzindo um grande nmero de frutos e alta capacidade de
crescimento natural, alm de se desenvolver em reas que sofreram impacto
humano (Gomes et al., 2002).
Alm de B. dracunculifolia, outras espcies vegetais j foram descritas como
fonte de resinas para a elaborao de prpolis no Brasil. Em Alagoas Dalbergia
ecastophyllum (Fabaceae) a origem botnica de um tipo de prpolis conhecido
como prpolis vermelha (Silva et al., 2007). Na Bahia, a origem botnica da
prpolis marrom Hyptis divaricata (Lamiaceae), enquanto na regio Sul, as
resinas so retiradas de Populus alba (Salicaceae) (Park et al.,2002).
Park e colaboradores (2000), numa tentativa de classificar as amostras de
prpolis brasileiras de acordo com a origem botnica e composio qumica,
reconhecem 12 grupos diferentes de amostras, classificadas de acordo com suas
caractersticas fsico-qumicas. Essa classificao em 12 tipos porm ainda
subestimada, uma vez que as abelhas podem coletar resinas numa grande
variedade de plantas, dada a imensa diversidade da flora brasileira.
Dentre os componentes principais da prpolis verde brasileira, podem-se
citar os fenilpropanides prenilados, que so cidos fenlicos contendo um grupo
prenila. So substncias formadas a partir do cido cinmico e seus derivados
(cidos -cumrico, cafico, ferlico e sinpico), como a artepilina C (cido 3,5-
diprenil-4-hidroxicinmico), substncia caracterstica da prpolis verde (Figura 1)
7
(Aga et al., 1994; Loayza et al., 1995; Tazawa et al., 1998; Tazawa et al., 1999;
Marcucci et al., 2001; Kumazawa et al., 2003; Negri et al., 2003a; Negri et al.,
2003b; Park et al., 2004; Salatino et al., 2005; Teixeira et al., 2005). Na prpolis
vermelha, os constituintes principais so benzofenonas preniladas (Trusheva et al.,
2006).
O OH O OH
OH
O OH
OH
OH
O OH
OH
OMe
O OH
OH
OMeMeO
O OH
OH
Figura 1 Frmula estrutural de alguns fenilpropanides, classe de substncias mais
abundantes nas prpolis verde brasileiras.
cido cinmico
cido -cumrico cido cafico
cido ferlico cido sinpico
artepilina C
8
Os flavonides, mesmo no sendo um dos principais constituintes, esto
presentes esto presentes nas prpolis brasileira. Quercetina, campferida,
isosacuretina, pinocembrina, crisina, naringenina, campferol e galangina so seus
principais representantes (Tazawa et al., 1998; Tazawa et al., 1999; Park et al.,
2002; Park et al., 2004). Esto presentes tambm na prpolis verde terpenides e
seus derivados, alm de derivados do cido benzico.
11..44.. AAttiivviiddaaddeess bbiioollggiiccaass ee ffaarrmmaaccoollggiiccaass aattrriibbuuddaass pprrppoolliiss
O comportamento de microrganismos frente s aes antibiticas da prpolis
tem sido amplamente investigado. Estudos sobre a atividade antibacteriana de
amostras de prpolis de diferentes regies demonstraram que o crescimento de
bactrias gram-positivas (Staphylococcus aureus) inibido por baixas
concentraes de prpolis, enquanto bactrias gram-negativas (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa) so menos suscetveis (Kujumgiev et al., 1999; Sforcin
et al., 2000; Prytzyk et al. 2003; Popova et al., 2005; Silici et al. 2005). Extratos
etanlicos de amostras de prpolis do Brasil e da Bulgria mostraram-se ativos
contra Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae (Salomo et al., 2004).
O cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico (Artepilina C) um dos principais compostos
antimicrobianos da prpolis brasileira (Aga et al., 1994).
A atividade antifngica da prpolis em baixas concentraes tambm foi
verificada contra Candida albicans (Kujumgiev et al., 1999; Sforcin et al., 2001;
Prytzyk et al., 2003; Salomo et al., 2004), C. tropicalis (Sforcin et al., 2001),
dezesseis linhagens de Actinobacillus actinomiycetecomitans (Santos et al., 2003),
Sporothrix schenckii e Paracoccidioides brasiliensis (Salomo et al., 2004).
9
A atividade antiviral foi demonstrada contra o vrus da gripe aviria
(Kujumgiev et al., 1999), vrus da herpes simples tipo 1 (HSV-I) (Amoros et al.,
1992a), poliovrus (Amoros et al., 1992b), vrus influenza A e B e vaccnia vrus
(Marcucci, 1995).
Alm dessas atividades principais apresentadas pela prpolis, muitas outras
esto descritas, como por exemplo, antiinflamatria (Krol et al., 1996);
antiprotozoa, principalmente contra Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo (Higashi e
de Castro, 1994; de Castro e Higashi, 1995; Marcucci et al., 2001; Prytzyk et al.,
2003; Dantas et al., 2006); atividade hepatoprotetora (Banskota et al., 2000);
regenerao de tecido cartilaginoso, tecido sseo e da polpa dental; propriedade
anestsica; ao imunomodulatria; anti-lcera; anticries em ratos; proteo
contra radiao gama em camundongos, anti-leishmaniose em hamsters; entre
outras (Marcucci, 1995).
11..55.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee
Espcies reativas de oxignio (EROs) so formadas nas clulas, como
conseqncia de reaes bioqumicas oxidativas. Esses radicais desempenham
papis importantes no organismo, atuando na produo de energia, fagocitose,
regulao do crescimento celular e sinalizao intercelular, e na sntese de
compostos biologicamente importantes (Pietta, 2000). No entanto, EROs podem ser
danosas se sua produo for excessiva sob condies anormais (inflamao, fatores
externos), causando danos em membranas lipdicas, inativao de enzimas e
protenas e danos no DNA (Pietta, 2000). Esses danos podem estar relacionados na
etiologia de diversas doenas humanas, como envelhecimento precoce, doenas
10
cardacas, inflamao, doenas neurodegenerativas (Parkinson e Alzheimer) e
cncer (Pietta, 2000; Russo et al., 2002). O organismo humano possui substncias
antioxidantes endgenas (ex. Se-glutationa peroxidase, catalase, e superxido
dismutase), porm quando estas no so capazes de conter a produo excessiva
de EROs, o uso de antioxidantes exgenos atravs da dieta se faz necessrio
(Pietta, 2000).
A atividade antioxidante da prpolis foi verificada em amostras de diversas
localidades, atravs de metodologias diversas. Extratos de prpolis do Brasil, China,
Peru, Holanda, Coria, Austrlia, Bulgria, Chile, Ucrnia e Argentina,
demonstraram possuir significativa atividade varredora de radicais livres DPPH
(Banskota et al., 2000; Ahn et al., 2004; Kumazawa et al., 2004; Isla et al., 2005).
Tambm foi verificada a capacidade de proteo de substratos lipdicos da
oxidao, avaliada pelo mtodo do descoramento do -caroteno (Kumazawa et al.,
2004).
Russo et al. (2002) avaliaram a capacidade antiperoxidativa de extratos de
prpolis e de seus compostos ativos (CAPE, do ingls caffeic acid phenethyl ester, e
galangina). Demonstraram que os extratos possuam efeito protetor contra a
peroxidao e uma potente capacidade de varrer radicais hidroxila.
Estudos com amostras brasileiras demonstraram a capacidade de substncias
presentes em extratos de prpolis em modular a produo de espcies reativas de
oxignio por neutrfilos estimulados in vitro, indicando que a ao destas
substncias no se restringe ao varredora de radicais livres (Simes et al.,
2004).
11
Estudos envolvendo induo de isquemia cerebral em coelhos demonstraram
que a administrao subaguda de CAPE desempenha um papel neuroprotetor
contra isquemia cerebral, devido atenuao da peroxidao de lipdeos e suas
propriedades antioxidantes (Altug et al., 2008).
11..66.. AAttiivviiddaaddee cciittoottxxiiccaa
A busca por substncias com atividade anticancergena sempre foi umas das
prioridades da qumica medicinal e um grande nmero de abordagens diferentes
vem sendo utilizado nessa busca. No entanto, a descoberta de substncias
antitumorais seletivas permanece um objetivo elusivo na pesquisa do cncer.
Conseqentemente, novas abordagens so necessrias para uma busca eficiente de
candidatos a serem testados como drogas anticancergenas (Pisco et al., 2006).
Estudos a cerca da atividade antitumoral de extratos e substncias isoladas
da prpolis vm crescendo muito nos ltimos anos, mostrando que diversas
linhagens de clulas tumorais so sensveis prpolis.
No estudo de Orsolic et al. (2004) investigou-se o efeito da prpolis, e de
substncias polifenlicas isoladas dela, no crescimento e potencial metstico de um
carcinoma mamrio transplantvel de um camundongo CBA. Nesses camundongos
foram geradas metstases no pulmo, e os componentes testados diminuram
significantemente o nmero desses ndulos tumorais.
Duas substncias isoladas da prpolis brasileira, drupanina e baccharina,
derivados prenilados do cido cinmico, mostraram efeitos antitumorais in vivo em
camundongos com fibrosarcoma murino S-180. Os camundongos que receberam
administrao oral dessas substncias apresentaram diminuio na formao dos
12
tumores. Esta atividade est relacionada com a morte celular das clulas tumorais,
sendo que a citotoxicidade mostrou-se preferencial para as clulas tumorais, no
afetando as clulas normais do fgado (Mishima et al., 2005a).
Watanabe e colaboradores (2004) demonstraram que o CAPE, conhecido por
inibir o NFkB, induz a morte celular por apoptose em clulas de cncer de mama
MCF-7, pela ativao de receptores Fas (mediador inicial da sinalizao da morte
celular); O CAPE tambm demonstrou induzir a apoptose mediada pela
mitocndria, em clulas tumorais U937 de leucemia mielide humana (Jin et al.,
2008)
13
22.. OOBBJJEETTIIVVOOSS
O presente trabalho teve como objetivos principais a caracterizao qumica,
por meio do doseamento de fenis, ceras e flavonides, de seis amostras de
prpolis verde, provenientes de Minas Gerais e do Paran, e a identificao de
algumas substncias presentes nas amostras por GC/EM e CLAE/EM. Alm disso,
foram testados os extratos brutos metanlicos e as fraes hexnicas,
clorofrmicas, metanlicas e de acetato de etila das amostras, quanto atividade
citotxica em embries de ourio-do-mar, e quanto atividade antioxidante. A fim
de se verificar possveis relaes entre os teores de fenis totais, os de flavonas e
flavonis totais, e os teores de ceras entre si e tambm com a atividade
antioxidante das amostras, foram realizados testes de correlao linear. A fim de se
avaliar possveis substncias que apresentavam atividade antioxidante, foi testado
o poder antioxidante de uma das amostras estudadas por meio de cromatografia
em camada delgada, seguida de anlises por cromatografia a gs e cromatografia
lquida de alta eficincia.
14
33.. MMAATTEERRIIAALL EE MMTTOODDOOSS
33..11.. AAmmoossttrraass ddee pprrppoolliiss
No presente trabalho foram estudadas seis amostras de prpolis verde,
sendo quatro delas provenientes de Minas Gerais (amostras A, B, C e D) e duas do
Paran (amostras E e F). As amostras de Minas Gerais foram gentilmente cedidas
pela Cia da Abelha. As amostras do Paran foram fornecidas pela Breyer e Cia Ltda
(Tabela 1).
Tabela 1 Amostras de prpolis verde e
localizao geogrfica.
Amostra* Localidade
A Trs Pontas/MG
B Esmeralda/MG
C Esmeralda/MG
D Esmeralda/MG
E Unio da Vitria/PR
F Unio da Vitria/PR
*A, B, C e D - Cia da Abelha Ltda Contagem, MG; Amostras E e F Breyer e Cia Ltda Unio da Vitria, PR.
33..22.. MMaassssaa sseeccaa
Para a obteno da massa seca, pesou-se exatamente 1 g de cada amostra,
previamente pulverizada, e esta foi mantida em estufa a 80C, at que fosse
atingido peso constante.
15
33..33.. PPrreeppaarraaoo ddooss eexxttrraattooss mmeettaannlliiccooss
Os extratos das amostras de prpolis verde foram preparados partindo-se de
2,5 g das amostras previamente pulverizadas com nitrognio lquido, at a
obteno de um p fino. Estes foram ento tratados com metanol em extrator
soxhlet por 5 hs. O volume final foi ajustado para 250 mL em balo volumtrico, e
estes extratos foram utilizados nos ensaios qumicos para determinao dos fenis,
flavonas e flavonis e flavanonas e isoflavonas totais, e tambm para os testes de
atividade antioxidante e citotxica das amostras.
33..44.. EExxttrraaoo ffrraacciioonnaaddaa
Exatamente 5 g de prpolis bruta previamente pulverizadas foram
submetidas a quatro extraes sucessivas em extrator Soxhlet, com solventes de
polaridade crescente. Primeiramente, foram tratadas com 200 mL de hexano, sendo
em seguida tratadas, consecutivamente, com 200 mL de clorofrmio, 200 mL de
acetato de etila e 200 mL de metanol. Aps cada tratamento, secava-se a amostra,
a fim de que ela fosse submetida ao tratamento seguinte. Os extratos obtidos
foram concentrados sob presso reduzida e ressuspendidos em volume e solvente
apropriados para anlises posteriores.
33..55.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffeenniiss ttoottaaiiss
A determinao da concentrao de fenis totais nas amostras foi feita com
base em uma curva de calibrao, preparada a partir de uma soluo padro de
cido p-cumrico 100 g/mL.
16
Cada volume da soluo padro (0, 10, 20, 30-...-100 L) foi transferido
para um tubo de microcentrfuga, contendo 1 mL de gua destilada, ao qual foram
adicionados 160 L do reagente Folin-Ciocalteau e 240 L de soluo saturada de
carbonato de sdio, sendo o volume final completado com gua destilada para 2
mL. Aps duas horas foi feita a leitura em espectrofotmetro UV-visvel a 760 nm.
Para os ensaios com os extratos das amostras, 4 L de cada extrato
metanlico bruto a 10 mg/mL foi transferido para um tubo de microcentrfuga,
contendo 1 mL de gua destilada. Em seguida, foram realizados os mesmos passos
utilizados para a construo da curva de calibrao (Woisky & Salatino, 1998).
33..66.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffllaavvoonnaass ee ffllaavvoonniiss
O procedimento descrito a seguir segue a adaptao de Woisky & Salatino
(1998) do mtodo da German Pharmacopoeia (Deutches Arzneibuch, 1978) e
determina a concentrao de flavonas e flavonis nas amostras. Foi utilizada para
isso, uma curva de calibrao de quercetina, preparada a partir de uma soluo
padro de 20 g/mL.
Alquotas de soluo padro foram transferidas para tubos de microcentrfuga
(0, 200, 400, 600, ...., 1600 L), ao qual foram adicionados 400 L de soluo
metanlica de cloreto de alumnio 5%, e o volume completado com metanol para 2
mL. A seguir a absorbncia foi lida em espectrofotmetro UV-visvel a 420 nm.
Para a determinao do teor de flavonas e flavonis totais, foi utilizada uma
alquota de 32 L do extrato metanlico bruto a 10 mg/mL sendo em seguida,
realizados os mesmos passos utilizados na construo da curva padro.
17
33..77.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffllaavvaannoonnaass ee iissooffllaavvoonnaass
O procedimento a seguir segue o mtodo descrito por Nagy & Grancai
(1996), com pequenas modificaes. A determinao da concentrao dessas
substncias nas amostras foi feita com base em uma curva de calibrao de
pinocembrina, preparada a partir de uma soluo padro de 1 mg/mL, dissolvida
em isopropanol. Para o preparo da curva de calibrao, 200 L da soluo de
pinocembrina foram transferidos para um tubo de microcentrfuga, ao qual foi
acrescentado 400 L de soluo do reagente dinitrofenil-hidrazina (0,1g de DNP
seco previamente a 60 C por 3 horas, dissolvido em 200 L de cido sulfrico
96%, e completando-se o volume para 10 mL com metanol). Esta mistura foi
mantida a 50 C em banho-maria, por 50 min. Aps esfriar, foram adicionados 1,4
mL de KOH (100 mg/mL), completando o volume para 2 mL. Desta soluo foram
transferidas alquotas de 40, 80, 120...320 L para novos tubos, adicionando-se
metanol suficiente para completar 2 mL. Esta mistura foi ento centrifugada a 3000
rpm por 5 min, e a absorbncia do sobrenadante lida a 486 nm.
Para determinao do teor de flavanonas e isoflavonas das amostras, 200 L
do extrato metanlico das amostras a 10 mg/mL foram tratados com 400 L do
reagente DNP. Esta mistura foi mantida a 50 C por 50 min. Aps esfriar,
acrescentou-se 1,4 mL de soluo de KOH (100 mg/mL). Uma alquota de 143 L
da soluo acima foi transferida para um novo tubo, adicionando-se metanol
suficiente para completar 2 mL. Esta mistura foi ento centrifugada a 3000 rpm por
5 min, e a absorbncia do sobrenadante lida a 486 nm.
18
33..88.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee cceerraass
Pores de 3g de cada amostra previamente pulverizadas foram submetidas
extrao exaustiva com clorofrmio em extrator Soxhlet, durante 6 horas. Em
seguida, os extratos foram concentrados sob presso reduzida, e 120 mL de
metanol quente foi adicionado ao resduo. A mistura foi mantida em ebulio at
que fossem separadas duas fases: uma soluo clara na poro superior e pequena
quantidade de resduo oleoso na poro inferior. A fase metanlica superior foi
filtrada a quente atravs de papel de filtro Whatman no 1 para um frasco de 150
mL, previamente pesado, evitando a passagem do resduo oleoso. O filtrado foi
ento resfriado a 0oC, e o contedo novamente filtrado atravs de papel de filtro
Whatman no 1 previamente pesado. O frasco e o resduo foram lavados com 25 mL
de metanol frio. Aps secagem em capela, o frasco e o resduo no papel de filtro
foram transferidos ao dessecador at que atingissem peso constante (Woisky &
Salatino, 1998).
33..99.. IIddeennttiiffiiccaaoo ddaass ssuubbssttnncciiaass pprreesseenntteess nnaass aammoossttrraass
As anlises qualitativas das substncias que compem as amostras de
prpolis foram feitas utilizando-se cromatografia a gs acoplada espectrometria
de massas (CG/EM) e cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a
espectrometria de massas (CLAE/EM). As anlises que necessitaram espectrometria
de massas foram realizadas na Central Analtica do Instituto de Qumica USP.
Os perfis cromatogrficos das fraes clorofrmicas (metiladas ou no) e de
hexano foram obtidos por cromatografia gasosa. Um volume de 1 L das fraes
ressuspendidas em metanol foi injetado no cromatgrafo a gs 5890 Series II Plus,
19
operando no modo split, sendo o split ajustado de acordo com a concentrao de
cada amostra. Foi utilizada uma coluna Zebron ZB 5-HT (30 m X 0,32 mm) a 100
C, tendo como gs de arraste o Hlio em fluxo de 1 mL/min. O mtodo utilizado
consistiu numa rampa de aquecimento de 8 C/min, com temperatura inicial de 100
C e temperatura final de 300 C, permanecendo por 10 min a 300 C ao trmino
do aquecimento; a temperatura do injetor e do detector foi ajustada para 300 C
(Negri et al., 2003a).
Para obteno do perfil cromatogrfico das fraes metanlicas e de acetado
de etila, 21,7 L das amostras foram injetados em cromatgrafo lquido de alta
eficincia HP 1090 series II, com detector de arranjos de fotodiodos e uma coluna
de fase reversa Zorbax C18 (4,6 X 250 mm). A fase mvel utilizada foi cido
actico 0,1% (solvente A) e metanol (solvente B), com fluxo constante de 0,5
mL/min e a leitura foi feita a 270 nm. O gradiente iniciou com 10% do solvente B
por 7 min, 10 a 35% de B de 7 a 12 min, 35 a 38% de B de 12 a 27 min, 38% de B
de 27 a 35 min, 38 a 50% de B de 35 a 50 min e 50 a 100% de B de 50 a 100 min.
Posteriormente as fraes foram enviadas Central Analtica do Instituto de
Qumica da Universidade de So Paulo, sendo submetidas a CLAE/EM (fraes de
metanol e acetato de etila) e CG/EM (fraes de clorofrmio e hexano), para
identificao dos constituintes presentes nas amostras.
33..1100.. DDeerriivvaaoo ddaass ffrraaeess ddee cclloorrooffrrmmiioo
Para a metilao das fraes de clorofrmio, 30 L das amostras foram
adicionados a 4 mL de soluo de H2SO4 5% (em metanol) e 2 mL de tolueno. A
mistura foi mantida aquecida a 80 oC por 4hs. Em seguida, acrescentou-se 4 mL de
20
soluo de NaCl 0,5 M e 1 mL de cloreto de metileno, misturando vigorosamente
em vrtex. A mistura foi ento centrifugada a 5000 rpm por 5 min, transferindo-se
a fase orgnica inferior para um novo tubo. O cloreto de metileno foi adicionado ao
primeiro tubo por mais duas vezes, centrifugando-se e transferindo-se a fase
orgnica para o tubo novo. Posteriormente, esses extratos de cloreto de metileno
foram lavados com 2 mL de NaCl 0,5 M, misturando-se vigorosamente em vrtex e
centrifugando a 5000 rpm por 5 min. A fase superior aquosa foi descartada, e a
lavagem repetida por trs vezes. Adicionou-se ao extrato sulfato de sdio anidro,
permanecendo em repouso por 1h. A seguir o extrato foi filtrado para um novo
frasco, e seco sob fluxo de nitrognio.
33..1111.. TTeesstteess ddee aattiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee
33..1111..11.. MMttooddoo ddee sseeqqeessttrroo ddee rraaddiiccaaiiss lliivvrreess DDPPPPHH
No presente mtodo, foi avaliada a capacidade das substncias presentes nas
amostras em seqestrar o radical livre 1,1-difenil-2-picril-hidrasila (DPPH, Sigma).
Foi preparada uma soluo metanlica do radical livre DPPH em concentrao
aproximada de 20 g/mL, de modo que o controle (800 L da soluo de DPPH +
400 L de metanol) apresentasse sua absorbncia entre 0,7 e 0,8 a 517 nm.
Para os testes de atividade antioxidante das amostras de prpolis, 400 L
dos extratos metanlicos das amostras nas concentraes de 8, 12,5 e 25 g/mL,
foram transferidos para tubos de microcentrfuga. Em seguida, com dois minutos de
intervalo entre cada amostra, foram adicionados 800 L da soluo de DPPH. Aps
a adio do DPPH, as amostras foram agitadas e mantidas no escuro por 20 min.
Aps este tempo, foi feita a leitura da absorbncia em espectrofotmetro UV-visvel
21
a 517 nm. Como branco foram utilizados 400 L da amostra em cada uma das
concentraes, adicionados a 800 L de metanol. Como substncia de referncia,
foi utilizado o cido sinpico, nas mesmas concentraes das amostras. A
porcentagem de atividade antioxidante (%AAox) das amostras foi avaliada de
acordo com a equao abaixo (Nieva-Moreno et al., 2000; Duarte-Almeida et al.,
2006):
% Aaox =
Na qual, Abs C = absorbncia do controle; Abs Am = absorbncia da amostra;
Abs B = absorbncia do branco.
Para testar a atividade antioxidante das fraes das amostras (hexano,
clorofrmio, acetado de etila e metanol), 400 L dos extratos fracionados
ressuspendidos em metanol (25 g/mL) foram transferidos para tubos de
microcentrfuga, e em seguida foram realizados os mesmos passos utilizados nos
extratos brutos metanlicos.
O cido sinpico foi utilizado como substncia de referncia por ser um
fenilpropanide, classe de substncia principal dentre os componentes da prpolis
verde brasileira, com propriedades antioxidantes (Hayashi et al., 1999).
33..1111..22.. SSiisstteemmaa --ccaarrootteennoo//cciiddoo lliinnoolliiccoo
A avaliao da capacidade antioxidante das amostras no sistema -
caroteno/cido linolico seguiu o mtodo utilizado por Duarte-Almeida et al.,
(2006), com pequenas modificaes. Para o preparo da soluo reativa, uma
alquota de 500 L de uma soluo de -caroteno em clorofrmio (0,2 mg/mL) foi
Abs C (Abs Am Abs B) AbsC
X 100
22
misturada com 12,5 L de cido linolico e 100 L de Tween 40. Em seguida o
clorofrmio foi evaporado at secagem completa, sob nitrognio. Aps a retirada do
clorofrmio, foram adicionados aproximadamente 12,5 mL de gua destilada,
saturada de oxignio. A absorbncia da soluo foi ento ajustada com gua, de
modo que a absorbncia do controle (1 mL da soluo reativa, adicionado de 20 L
de metanol.) apresentasse um valor entre 0,8 e 0,9 a 470 nm.
Para a reao de oxidao foram utilizadas cubetas plsticas, s quais foram
adicionados 1 mL de soluo reativa e 120 L dos extratos de prpolis nas
seguintes concentraes: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1 mg/mL. A
reao foi mantida em temperatura ambiente por 2 h, tendo a absorbncia medida
a 470 nm a cada 30 min, incluindo o tempo inicial, at o final das 2 h. Foi utilizado
como branco 120 L de cada concentrao de amostra, adicionados de 1 mL de
metanol; como substncia de referncia foi utilizado o cido sinpico, nas mesmas
concentraes da amostra. Os resultados foram expressos como porcentagem de
inibio (%I), comparando-se a queda da absorbncia nas amostras (Am=
absorbncia final absorbncia inicial), com a queda da absorbncia no controle
(Ac = absorbncia final absorbncia inicial), segundo a equao abaixo:
% I = (Ac Am) x 100 x Ac-1
Nos testes de atividade antioxidante das fraes das amostras (hexano,
clorofrmio, acetado de etila e metanol), 120 L dos extratos fracionados
ressuspendidos em metanol (1 mg/mL) foram transferidos para cubetas
23
plsticas, sendo em seguida realizados os mesmos passos utilizados nos
extratos brutos metanlicos.
33..1111..33.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee ppoorr ccrroommaattooggrraaffiiaa eemm ccaammaaddaa
ddeellggaaddaa
As anlises por cromatografia em camada delgada seguiram o mtodo
descrito por Jasprica et al. (2007), com pequenas modificaes. Foram utilizadas
placas cromatogrficas de 20 X 10 cm, recobertas com slica gel. A aplicao da
amostra foi feita em faixas de 15 cm, tendo como controle positivo o cido sinpico
na concentrao de 30 g/mL. As placas foram desenvolvidas com fases mveis
diferentes para cada uma das fraes, aps testes preliminares, tendo sido utilizada
a fase mvel que melhor separou as faixas: para as fraces de hexano e acetato de
etila: tolueno clorofrmio - acetona (40:25:35) (Nieva-Moreno et al.,2000); para
as fraes clorofrmicas: hexano - acetato de etila cido actico (31:14:5)
(Jasprica et al, 2004); para as fraes metanlicas: acetato de etila acetona -
cido actico - gua (60:20:10:10) (Birk et al., 2005). Aps o desenvolvimento da
cromatografia, uma pequena parte das placas foi nebulizada com DPPH 0,3 mM, e
mantidas por 30 segundos em temperatura ambiente. As faixas contendo
substncias antioxidantes foram visualizadas como uma mancha amarela no fundo
violeta, devido transformao do radical DPPH violeta na forma reduzida amarela.
As pores das faixas que no foram nebulizadas com o DPPH foram ento isoladas,
e submetidas cromatografia lquida de alta eficincia e cromatografia a gs, para
identificao destas substncias.
24
33..1122.. EEnnssaaiioo ddee cciittoottooxxiicciiddaaddee eemm eemmbbrriieess ddee oouurriioo ddoo mmaarr
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados no Centro de Biologia Marinha da
Universidade de So Paulo (Cebimar), com a colaborao do Prof. Dr. Jos Carlos
de Freitas, do Departamento de Fisiologia do Instituto de Biocincias da
Universidade de So Paulo.
A atividade antimittica foi avaliada como a habilidade dos extratos em inibir
a clivagem dos ovos de ourio do mar Lytechinus variegatus, coletados em Ilhabela,
So Sebastio, So Paulo, por tcnicos do Cebimar. A eliminao dos gametas foi
induzida pela injeo de KCl 0,5 M na cavidade perivisceral dos ourios. Os gametas
foram recolhidos em recipientes de vidro, contendo gua do mar filtrada. Os vulos
foram lavados duas vezes em gua do mar filtrada, para a remoo da cobertura
gelatinosa envolvendo as clulas. Os espermatozides foram mantidos em
refrigerador sem diluio at o momento do uso. Os ensaios foram realizados em
placas de 12 poos (CorningTM) e consistiu em misturar 1 mL da suspenso de
vulos com 20 L da suspenso de espermatozides (0,1 mL de espermatozides +
4,9 mL de gua do mar filtrada). Dois minutos aps a fertilizao foram adicionados
10 L dos extratos nas concentraes finais de 8, 16 e 32 g/mL, diludos em
etanol, sendo em seguida adicionada gua do mar filtrada, completando um volume
final de 2 mL. Como controle, foi realizado um ensaio utilizando 10 L de etanol em
lugar das amostras. As placas foram mantidas em temperatura ambiente (26 2
C). Em intervalo apropriado, quando a maioria dos embries apresentava-se na
segunda e terceira clivagens (quatro e oito clulas), alquotas de 500 L foram
fixadas no mesmo volume de formaldedo 4%, para observao posterior. Cem
ovos ou embries foram contados em triplicata para cada concentrao de extrato,
25
a fim de determinar o nmero de embries com desenvolvimento normal (Costa et
al., 1996).
33..1133.. AAnnlliisseess eessttaattssttiiccaass
Para verificar se os valores obtidos nos diferentes ensaios estatisticamente
diferente entre as amostra estudadas (cada triplicada foi considerada um grupo),
foi realizado o teste estatstico ANOVA (ANalysis Of VAriance) one-way,
considerando como significativos valores de P< 0,05. Alm disso, foi realizado o
ps-teste de comparao mltipla de Tukey, que comparou pares de amostras
individualmente, verificando se os valores obtidos eram estatisticamente diferentes
entre si.
Possveis relaes entre os resultados obtidos nos diferentes ensaios foram
testadas atravs de correlao linear (mtodo dos mnimos quadrados),
considerando como significativas as correlaes com R > 0,5. Para ambos os
testes foi utilizado o Software Prism 4.0.
Todos os ensaios foram realizados em triplicatas, a fim de minimizar o erro
do mtodo, e os resultados esto expressos na forma de mdias desvio padro.
As triplicatas com valores muito discrepantes das demais foram desconsideradas
das anlises.
Os dados referentes composio qumica e atividades biolgicas foram
submetidos tambm a uma anlise de componente principal (PCA) com o software
Fitopac v1 (Shepherd, 1996), a fim de avaliar as correlaes entre as amostras
provenientes de Minas Gerias e Paran. A fim de se avaliar qualitativamente as
amostras quanto s substncias identificadas, os dados obtidos foram submetidos
26
anlise de coordenadas principais (PCO) atravs do mesmo software utilizado
anteriormente.
27
44.. RREESSUULLTTAADDOOSS
44..11.. MMaassssaa sseeccaa
A massa seca das amostras de prpolis verde analisadas apresentou valores
entre 84 e 90% (Tabela 2), indicando que a quantidade de umidade presente nas
amostras variou de 10 a 16%.
Tabela 2 Massa seca das amostras de prpolis
verde.
Amostra* Massa Seca (%)
A 86
B 89
C 86
D 90
E 84
F 84
* A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F
prpolis provenientes do Paran.
44..22.. TTeeoorr ddee ffeenniiss ttoottaaiiss
A curva padro de cido p-cumrico obtida, bem como sua equao da reta e
coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 2.
28
Figura 2 Curva padro obtida a partir do cido p-cumrico, para
determinao dos teores de fenis totais de amostras brasileiras de
prpolis verde.
Com relao ao teor de fenis totais, foram obtidos valores variando de
132,69 0,26 mg/g (13,27 %, amostra F) a 187,57 7,17 mg/g (18,76 %,
amostra B) (Tabela 3).
Tabela 3- Teores de fenis totais dos extratos metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.
Fenis totais
Amostra* mg/g** %
A 166,63 9,62*** 16,66 0,96
B 187,57 7,17 18,76 0,72
C 155,3 3,98 15, 53 0,4
D 153,43 7,54 15,34 0,75
E 136,92 5,73 13,69 0,57
F 132,68 0,26 13,27 0,03
* = A a D amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; ** = mg de fenis totais presentes em 1g de prpolis; resultados expressos em relao massa seca; *** = valores expressos como equivalente de cido p-cumrico; mdia desvio padro, n=3.
29
O teste estatstico ANOVA demonstrou que houve diferenas significativas
entre os teores de fenis totais das amostras (P= 0,0002; F= 12,5), o que permitiu
comparar os resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que a amostra B
(MG) estatisticamente diferente das demais amostras (P< 0,05).
44..33.. TTeeoorr ddee ffllaavvoonnaass ee ffllaavvoonniiss ttoottaaiiss
A curva padro de quercetina obtida bem como sua equao da reta e
coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 3.
Figura 3 Curva padro obtida a partir da quercetina para determinao
dos teores de flavonas e flavonis de amostras de prpolis verdes
brasileiras.
30
As amostras apresentaram valores de flavonas e flavonis totais variando de
15,17 0,44 mg/g (1,52 %, amostra E) a 40,42 1,06 mg/g (4,04 %, amostra B)
(Tabela 4).
Tabela 4 Teores de flavonas e flavonis dos extratos
metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.
Teor de flavonas e flavonis
Amostra* (mg/g)** (%)
A 33,71 2,73*** 3,37 0,27
B 40,21 1,06 4,02 0,11
C 34,98 2 3,5 0,2
D 31,5 1,66 3,15 0,17
E 15,17 0,42 1,52 0,04
F 18,34 1,12 1,83 0,11
* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;
** = mg de flavonas e flavonis presentes em 1g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca;
*** = valores expressos como equivalente de quercetina; mdia desvio padro, n=3.
O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de flavonas e flavonis
totais das amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si (P <
0,0004; F= 11,5), o que permitiu a comparao dos resultados obtidos. O ps-teste
de Tukey demonstrou que as amostras de Minas Gerais, individualmente, so
estatisticamente diferentes das do Paran (P < 0,001).
31
44..44.. TTeeoorr ddee ffllaavvaannoonnaass ee iissooffllaavvoonnaass ttoottaaiiss
A curva padro de pinocembrina obtida, bem como sua equao da reta e
coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 4.
Figura 4 Curva padro obtida a partir da pinocembrina para a
determinao dos teores de flavanonas e isoflavonas de amostras de
prpolis verdes brasileiras.
As anlises do teor de flavanonas e isoflavonas nas amostras de prpolis
mostraram resultados variando de 11,95 mg/g 0,57 (1,2%, amostra E) a 18,91
0,89 mg/g (1,9%, amostra B) (Tabela 5).
32
Tabela 5 Teores de flavanonas e isoflavonas dos extratos
metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.
Flavonas e isoflavonas totais
Amostra* mg/g** %
A 16,05 1,55*** 1,61 0,16
B 18,91 0,89 1,89 0,09
C 13,91 1,21 1,39 0,12
D 15,54 1,1 1,55 0,11
E 11,95 0,57 1,19 0,06
F 15,23 0,93 1,52 0,09
* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;
** = mg de flavonas e isoflavonas presentes em 1 g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca;
*** = valores expressos como equivalente de pinocembrina; mdia desvio padro, n=3.
O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de flavanonas e
isoflavonas totais das amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si
(P= 0,0001; F= 13,64), o que permitiu comparar os resultados obtidos. O ps-teste
de Tukey demonstrou que as amostras A, C e D (MG), individualmente, no so
estatisticamente diferentes da amostra F (PR) (P > 0,05), e as amostras C e D no
apresentam diferenas estatsticas da amostra E (P > 0,05).
44..55.. TTeeoorr ddee cceerraass ttoottaaiiss
O contedo de ceras totais nas amostras variou de 38,79 11,06 mg/g
(3,88 %, amostra A) a 104,6 5,7 mg/g (10,46 %, amostra F). A amostra A de
Minas Gerais apresentou um teor de ceras muito mais baixo do que das demais
amostras (Tabela 6).
33
Tabela 6 Teores de ceras totais de amostras de
prpolis verde.
Ceras totais
Amostra* mg/g** %
A 38,79 11,06** 3,88 1,11
B 49,573 0,76 4,96 0,08
C 99,8 11,25 9,98 1,13
D 73,62 7,51 7,36 0,75
E 88,49 5,88 8,85 0,59
F 104,6 5,7 10,47 0,57
* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; **
=mg de ceras presentes em 1g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca; *** = valores expressos como equivalente de cido sinpico; mdia desvio padro, n=3.
O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de ceras totais das
amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si (P= 0,0007; F=
23,37), o que permitiu que os resultados obtidos fossem comparados. O ps-teste
de Tukey demonstrou que as amostras C e D (MG), individualmente, no so
estatisticamente diferentes das amostras E e F (PR) (P > 0,05). Entretanto, as
amostras A e B mostraram-se estatisticamente diferentes das demais (P < 0,05).
4.6 Teste de regresso linear
A fim de verificar possveis correlaes entre os diversos resultados obtidos,
foram realizados testes de regresso linear, pelo mtodo dos mnimos quadrados.
Os resultados indicam uma correlao inversa significativa entre os teores de ceras
e os teores de fenis totais (R = 0,626) (Figura 5 A), porm tal relao no foi
verificada em comparao com os teores de flavonas e flavonis (R2 = 0,3687)
(Figura 5 B).
34
Figura 5 Relaes entre o contedo de ceras nas amostras de prpolis verde
e os teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos
metanlicos brutos, obtidas pela anlise de regresso linear pelo mtodo dos
mnimos quadrados. Correlao significativa - R2>0,5. A a D - amostras de
Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
35
44..77.. IIddeennttiiffiiccaaoo ddaass ssuubbssttnncciiaass pprreesseenntteess nnaass aammoossttrraass
As anlises dos espectros de massas nos permitiram a identificao de 34
substncias, sendo predominantes os derivados prenilados do cido p-cumrico,
com presena de cidos cafeoilqunicos e alguns flavonides (Figura 6).
Figura 6 Frmulas estruturais das substncias presentes nas amostras de prpolis verde
brasileiras estudadas, provenientes dos estados de Minas Gerais e Paran. As substncias
foram identificadas atravs de CLAE/EM e CG/EM.
36
Figura 6 Continuao
37
A identificao das substncias pelo CG/EM foi realizada atravs da
reconstruo da frmula estrutural das substncias, a partir dos fragmentos
gerados no espectrmetro de massas. A Figura 7 um exemplo dessa
reconstituio.
Figura 7 Padro de fragmentao e frmula estrutural do ster allico do cido 3-prenil
cinmico que apresentou on molecular= 256, identificado nas fraes hexnica e
clorofrmica da amostra de prpolis B, de Minas Gerais.
38
Para a identificao das substncias submetidas ao CLAE/EM, comparou-se o
on molecular formado e seus espectros de absoro no UV com os de substncias
descritas na literatura. A Figura 8 representa um exemplo dessa identificao.
Figura 8 - Artepilina C, identificada nas fraes metanlica e de acetato de etila da
amostra D, de Minas Gerais A: Espectro de massas, x105 (m/z)-= 299,1; B: espectro
de absoro no UV (315 nm); C: frmula estrutural, peso molecular = 300.
Nas fraes de hexano e clorofrmio foram identificadas 4 substncias
(Tabela 7, Figuras 9 e 10). As frmulas estruturais propostas esto descritas na
Figura 6.
39
Tabela 7 Constituintes das fraes de hexano e clorofrmio de amostras de
prpolis verde brasileiras, identificados por CG/EM.
Pico TR* Substncia Estrutura proposta
on molecular e Fragmentos
1
15,3 1-benzilideno-
2,2,3,3,tetrametil-ciclopropano
Fig. 6 XIX 186 (C14H18, 30**), 171 (100***), 128 (20), 115 (20), 91 (20), 77 (20)
2
16,7 cido benzeno propanico Fig. 6 XVII
150 (C9O2H10, 40), 104 (70), 91 (100), 77 (30)
3
21 p-vinil-O-prenilfenol Fig. 6 XVIII
188 (C13OH16, 70), 133 (100), 104 (30), 91 (30),
77 (30).
4
28,6 ster allico do cido 3-prenil
cinmico Fig. 6 XXVIII
256 (C17O2H20, 80), 201 (100), 185 (70), 157 (50), 145 (100), 115 (40), 91 (40), 77 (20), 69 (30)
*= Tempo de reteno
**= abundncia relativa
***= pico base, abundncia relativa =100
40
Figura 9 Cromatogramas das fraes de hexano de seis amostras de prpolis verde
brasileiras, obtidos por cromatografia gasosa. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas
Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.
41
Figura 10 Cromatogramas das fraes de clorofrmio de seis amostras de prpolis verde
brasileiras, obtidos por cromatografia gasosa. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas
Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.
As fraes de clorofrmio foram metiladas e obteve-se 13 picos que, devido a
sua derivao, foram identificados como steres metlicos das substncias
presentes nas prpolis (Tabela 8, Figura 11). As frmulas estruturais propostas
esto descritas na Figura 6.
42
Tabela 8 steres metlicos das substncias presentes nas fraes clorofrmicas de
amostras de prpolis verde brasileiras, obtidos aps metilao, identificados por
CG/EM.
Pico TR
(min)* Substncia Estrutura
on molecular e fragmentos
1 4,284 ster metlico do cido
benzenopropanico Fig. 6 XVII
164 (13**, C10H1202+),
104 (100***)
2 13,452 ster metlico do cido palmtico Fig. 6 XV 270 (1, C17H3402
+), 41 (98,98)
3 15,461 ster metlico do cido 4-hidroxi 3-
prenil cinmico (drupanina) Fig. 6 XXI
246 (70, C15H18 O3+),
191 (100), 171 (20), 131 (23).
4 16,309 ster metlico do cido esterico Fig. 6 XVI 298 (4, C19H34O2
+), 74(100)
5 17,479 ster metlico do cido 2,2-dimetil
8-prenilcromeno 6-propenico Fig. 6
312 (14, C20 H24O3+),
297 (100)
6 19,105 ster metlico do cido 3-hidroxi 2,2-dimetil 8-prenilcromano 6-
propenico Fig. 6 XXX
330 (100, C20H26 O4+),
297 (30), 272 (50), 225 (60), 197 (50),
171 (50).
7 19,230 ster metlico do cido 4-hidroxi
3,5-diprenilcinmico (artepilina C) Fig. 6 XXII
314 (68, C20H26 O3+),
259 (100), 243 (54), 211 (38), 203 (90).
8 19,561 ster metlico do cido 4-hidroxi 6-
metoxi 3,5-diprenilcinmico Fig. 6 XXXI
344 (18, C21H28 O4+),
86 (100),
9 19,905 ster metlico do cido 4-hidroxi 2-
metoxi 3,5-diprenilcinmico Fig. 6 XXXII
344 (8, C21H28 O4+), 43
(100)
10 20,782 ster metlico do cido 4-hidroxi 6-metoxi 3,5-diprenildiidrocinmico
Fig. 6 XXXIII
346 (2, C21H30 O4+), 43
(100)
11 21,02 ster metlico do cido 4-hidroxi 2-metoxi 3,5-diprenildiidrocinmico
Fig. 6 XXXIV
346 (1,51, C21H30 O4+),
73 (100)
12 21,733 ster metlico do cido 3-prenil 4(2-
metilpropioniloxi) cinmico Fig. 6 XXV
330 (13, C20H26 O4+ ),
43 (100)
13 22,117 ster metlico do cido 3 prenil 4-
cinamoiloxi cinmico Fig. 6 XXIV
376 (3, C24H24 O4+), 75
(100)
*= Tempo de reteno; **= abundncia relativa; **= pico base, abundncia relativa =100
43
Figura 11 Cromatogramas obtidos por CG-FID, das fraes de clorofrmio metiladas, de
seis amostras de prpolis verde brasileiras. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas
Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.
44
Nas fraes de acetato de etila foram obtidos 11 picos (Tabela 9, Figura 12):
cujas frmulas estruturais esto descritas na Figura 6.
Tabela 9 Constituintes da frao de acetato de etila de amostras de prpolis verde
brasileira, identificados por CLAE/MS.
Pico Substncia TR* UVmx** (m/z)- (m/z)+ PM*** Estrutura
1 cido -cumrico 34,073 310 162,9 nd**** 164 Fig. 6 XX
2 Metoxipinobanksina 65,9 290 301,1 303,1 302 Fig. 6 II
3 Isoramnetina 71,084 268, 365
315 317,1 316 Fig. 6 I
4 Luteolina-5-metil ter 74,355 265, 350
299 301,2 300 Fig. 6 V
5 Drupanina 78,433 315 231 nd 232 Fig. 6 XXI
6 cido 3-prenil-4-(2-
metilpropioniloxi) cinmico 81,54
275Sh, 318
315 nd 316 Fig 6 XXV
7 Campferida 82,883 268, 365
299 301,2 300 Fig. 6 IV
8 cido 3-hidroxi 2,2-dimetil
8-prenilcromano 6-propenico.
87,077 320 315,1 nd 316 Fig. 6 XXX
9 Artepilina C 91,43 315 299,1 nd 300 Fig. 6 XXII
10 5-metoxi-4'-hidroxi-
flavanona-7-O-glicosdeo 95,352 280 447,3 nd 448 Fig. 6 III
11
Baccharina (cido 3-prenil-4
(diidrocinamoiloxi) cinmico)
97,179 290, 330
363,1 nd 364 Fig. 6 XXIII
*TR = tempo de reteno; ** UVmx= pico mximo de absoro no ultra-violeta; *** PM = Peso molecular; ****nd = no
determinado.
45
Figura 12 Cromatogramas das fraes de acetato de etila de seis amostras de prpolis
verde brasileira, obtidos por cromatografia lquida de alta eficincia, com deteco a 270
nm. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do
Paran.
46
Nas fraes de metanol foram obtidos 13 picos (Tabela 10, Figura 13), cujas
frmulas estruturais esto descritas na figura 6.
Tabela 10 Constituintes da frao metanlica de amostras de prpolis verde
brasileira, identificados por CLAE/EM.
Pico Substncia TR* mx (nm)** (m/z)- (m/z)+ PM*** Estrutura
1 cido qunico 6,029 279 191 nd**** 192 Fig. 6 VI
2 cido 3-O-
cafeoilqunico 19,18 300, 330 353 355,1 354 Fig. 6 VII
3 cido 5-O-
cafeoilqunico 21,651 300, 330 352,9 355,2 354 Fig. 6 IX
4 cido 4-O-
cafeoilqunico 25,823 312 nd 355,1 354 Fig. 6 VIII
5
4-hidroxi 3-(3-metilbutano 4-sec-
butil-diidrocinamoiloxi 5-prenilcinmico
37,155 290, 325 519,1 521,3 520 Fig. 6 XXVI
6 cido 3,5-di-O-cafeoilqunico
39,621 300, 330 515,1 nd 516 Fig. 6 X
7 cido 4,5-di-O-cafeoilqunico
50,098 300, 330 515,1 517,2 516 Fig. 6 XI
8 cido 5-O-cafeoil-3-O-feruloilqunico
53,138 295, 325 529,2 531,3 530 Fig. 6 XIII
9 cido 3-O-feruloil-5-O-cafeoilqunico
56,988 300, 325 529,1 nd 530 Fig. 6 XIV
10 cido 3,4,5-
tricafeoilqunico 61,798 300, 330 677,1 679,3 678 Fig. 6 XII
11 Artepilina C 91,486 315 299 nd 300 Fig. 6 XXII
12 cido 7-prenil benzofuranil propenico
95,299 312 255,2 nd 256 Fig. 6 XXVII
*TR = tempo de reteno; ** mx = pico mximo de absoro no ultra-violeta; ***PM = peso molecular;
****nd = no determinado.
47
Figura 13 Cromatogramas das fraes de metanol de seis amostras de prpolis verde
brasileira, obtidos por cromatografia lquida de alta eficincia, com deteco a 270 nm. A,
B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.
44..88.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee
4.8.1. Mtodo de seqestro dos radicais livres DPPH
A fim de se obter um grfico que ilustrasse a cintica de reao antioxidante
do cido sinpico, foi feito um teste utilizando concentraes variadas desse cido.
Os resultados obtidos demonstraram que a partir de 30 g/mL a atividade
antioxidante do cido sinpico atinge um plat (Figura 14). Portanto, para testar a
48
atividade antioxidante das amostras, foram utilizadas as concentraes de 8, 12,5 e
25 g/mL.
Figura 14 Atividade antioxidante do cido sinpico, pelo mtodo do DPPH.
O mtodo de seqestro dos radicais livres DPPH nos permite verificar, de
uma maneira rpida e simples, se a amostra em questo possui atividade
antioxidante. Os resultados obtidos permitiram concluir que todas as amostras
analisadas possuem atividade antioxidante, e que esta dose-dependente (Figura
15).
49
Figura 15 Atividade antioxidante, pelo mtodo do DPPH, dos extratos metanlicos brutos de amostras de prpolis verde, em comparao com o cido sinpico. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran
As amostras A e B apresentaram maior capacidade antioxidante, com valores
de 19,2 e 18,56 respectivamente, na concentrao de 25 g/mL (Tabela 11).
Tabela 11 Valores da atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das amostras de prpolis verde, em diferentes concentraes, pelo mtodo do DPPH.
Atividade antioxidante (%)
Amostra* 8 g/mL 12,5 g/mL 25 g/mL
A 8,16 0,16** 10,9 0,32 19,2 0,6
B 7,57 0,57 10,02 0,77 18,56 0,62
C 6,32 0,13 8,61 0,83 14,97 1,17
D 6,71 0,65 11,79 0,56 15,19 0,47
E 4,55 0,5 4,76 0,76 12,57 0,66
F 4,02 0,3 5,27 0,7 10,5 0,17
* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; ** = resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.
50
A atividade antioxidante do cido sinpico foi bastante superior das
amostras testadas. Porm, importante salientar que o padro corresponde a uma
substncia isolada, ao contrrio dos extratos de prpolis, que so misturas
complexas de substncias, que podem ou no possuir atividade antioxidante.
O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de atividade
antioxidante do extrato metanlico bruto das amostras analisadas (25 g/mL) so
estatisticamente diferentes entre si (P < 0,0001; F= 56,11), o que permitiu a
comparao dos resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que as
amostras de Minas Gerais, individualmente, so estatisticamente diferentes das
amostras do Paran (p > 0,05).
4.8.2. Atividade antioxidante dos extratos fracionados pelo mtodo
do DPPH
Alm dos testes feitos com o extrato metanlico bruto, foi testado o poder
antioxidante dos extratos fracionados, na concentrao de 25 g/mL. Quanto
frao de hexano, a amostra A apresentou maior atividade antioxidante (20,43
0,55%), enquanto as demais amostras apresentaram valores entre 5,03 0,7% e
17,48 0,97%. J nas fraes de clorofrmio, os maiores valores apresentados
foram 20,22 1,57 e 20,69 0,18 % para as amostras A e B, respectivamente,
estando as demais amostras entre 8,13 0,57% e 17,45 0,47%. No que se
refere s fraes de acetato de etila, os resultaram variaram entre 10,79 1,1 e
25,59 0,73%, com maior valor para a amostra D. As fraes metanlicas
apresentaram os maiores valores de atividade antioxidante dentre as fraes
51
analisadas, com valores variando de 25,6 0,68 a 41,68 1,15%, sendo que
apenas as amostras A e C apresentaram valores abaixo de 35% (Tabela 12).
Tabela 12 Valores da atividade antioxidante das fraes das amostras de
prpolis verde, pelo mtodo do DPPH.
Fraes (25 g/mL) (%)
Amostra* Hexano Clorofrmio Acetato de Etila Metanol
A 20,43 0,55** 20,22 1,57 21,67 1,04 25,6 0,68
B 17,48 0,97 20,69 0,18 20,35 0,32 41,68 1,15
C 11,54 0,13 17,65 0,47 21,28 0,48 26,02 0,76
D 8,61 0,33 15,82 0,71 25,59 0,73 39,79 0,24
E 5,03 0,7 8,13 0,57 10,79 1,1 35,12 1,01
F 13,06 0,64 13,43 0,75 16,6 0,7 37,83 0,73
** = A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran;
** = resultados expressos em relao massa seca;mdia desvio padro, n=3.
4.8.3. Atividade antioxidante no sistema -caroteno/cido linolico
A primeira etapa realizada foi um teste com concentraes variadas de cido
sinpico (0,05; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; e 2,0 mg/mL), a fim de se obter um perfil de
sua capacidade antioxidante no presente sistema. Os resultados obtidos
demonstraram que a partir de 1 mg/mL de cido sinpico, no h aumento
significante em sua capacidade antioxidante (Figura 16). Dessa maneira a
capacidade antioxidante das amostras foi testada na concentrao de 1 mg/mL,
bem como em concentraes menores (0,05; 0,1 e 0,5 mg/mL).
52
Figura 16 Atividade antioxidante do cido sinpico em diferentes
concentraes, no sistema -caroteno / cido linolico
Atividade antioxidante do sistema -caroteno/cido linolico permite verificar
a capacidade de proteo de uma amostra contra a oxidao de substratos lipdicos
(Duarte-Almeida et al., 2006). Os resultados aqui obtidos mostram que todas as
amostras analisadas possuem tal atividade, e que esta dependente da
concentrao (Figura 17), com decaimento da absorbncia com o tempo,
semelhante do cido sinpico (Figura 18). As amostras B, C e D apresentaram
maior capacidade antioxidante, com valores de 84,11, 80,86 e 83,52%
respectivamente, na concentrao de 1 mg/mL (Tabela 13).
53
Figura 17 Atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das
amostras de prpolis verde pelo sistema -caroteno/cido linolico. A a D
amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
Figura 18 Descoramento do -caroteno relativamente ao tempo, na
presena de diferentes concentraes de cido sinpico.
54
Tabela 13 Atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das amostras
de prpolis verde, em diferentes concentraes, no sistema -caroteno/cido
linolico.
Atividade Antioxidante (%)
Amostra* 0,05 mg/mL 0,1 mg/mL 0,5 mg/mL 1 mg/mL
A 41,83 0,91** 53,781,21 73,34 0,89 76,82 0,56***
B 59,56 1,36 66,01 0,21 81,63 0,48 84,11 1,07
C 54,19 1,85 63,99 0,88 78,76 0,5 80,86 1,57
D 61,6 0,69 68,48 1,25 81,65 0,14 83,52 0,71
E 47,12 2,9 52,59 1,18 69,15 1,69 71,25 0,86
F 56,37 1,58 61,07 2,28 74,91 1,49 76,44 1,58
** = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;
* = resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.
O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de atividade
antioxidante do extrato metanlico das amostras analisadas (1 mg/mL) so
estatisticamente diferentes entre si (P= 0,0003; F= 11,65), o que permitiu a
comparao dos resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que as
amostras A, B, C, e D (MG), individualmente, no so estatisticamente diferentes
da amostra F (PR) (p > 0,05); a amostra A (MG) tambm no apresentou
diferenas estatsticas da amostra E (PR).
4.8.4. Atividade antioxidante dos extratos fracionados no sistema -
caroteno/cido linolico
Tambm foi testada a atividade antioxidante, na concentrao de 1 mg/mL,
das fraes (hexano, clorofrmio, acetato de etila e metanol) das amostras de
55
prpolis analisadas. Quanto frao de hexano, os resultados variaram de 50,55
0,52% a 86,27 1,19%, com as amostras A e D apresentando valores acima de
80%. J as fraes de clorofrmio apresentaram atividade antioxidante entre 65,18
0,16 e 87,75 1,37%, sendo que as amostras A, C e D apresentaram valores
acima de 80%. Nas fraes de acetato de etila, os resultados variaram entre 60,15
1,58 e 88,16 0,97%, com maior valor para a amostra D. As fraes de metanol
apresentaram valores de atividade antioxidante variando de 61,16 3,95 a 84,95
0,64%, sendo que as amostras A, C e D apresentaram valores acima de 80%
(Tabela 14). As amostras A, C e D apresentaram os valores mais altos de atividade
antioxidante, em todas as fraes testadas.
Tabela 14 Atividade antioxidante pelo sistema -caroteno / cido linolico, de
fraes de amostras de prpolis verde
Fraes (1mg/mL)
Amostra* Hexano (%) Clorofrmio(%) Acetato de etila(%) Metanol (%)
A 80,89 0,57** 81,07 1,64 80,7 0,57 80,39 1,74
B 54,67 1,42 65,18 0,16 60,15 1,58 61,16 3,95
C 76,23 0,33 83,72 0,44 83,05 1,45 82,95 1,6
D 86,27 1,19 87,75 1,37 88,16 0,97 84,95 0,64
E 70,69 0,93 77,69 0,4 79,17 1,32 77,03 1,07
F 50,55 0,72 73,79 0,72 76,72 0,54 73,91 0,54
* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;
** = % de prpolis, resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.
56
4.8.5. Teste de regresso linear relacionando a atividade
antioxidante
Quanto s atividades antioxidantes, houve uma correlao positiva
significativa entre a atividade antioxidante do extrato metanlico bruto e o teor de
fenis totais (R2= 0,835) (Figura 19 A), resultado obtido tambm entre o teor de
flavonas e flavonis totais (R= 0,738) (Figura 19 B), no mtodo do DPPH. No
sistema -caroteno/cido linolico, os resultados mostraram no haver uma
correlao significativa (R= 0,450) entre o teor de fenis totais e a capacidade
antioxidante do extrato metanlico bruto das amostras (Figura 20 A), entretanto,
houve uma correlao positiva significativa quanto a capacidade antioxidante e o
teor de flavonas e flavonis totais (R = 0,693, < 0,5) (Figura 20 B).
57
Figura 19 Relaes entre a atividade antioxidante, pelo mtodo do DPPH, e os
teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos metanlicos
brutos de amostras de prpolis verde, obtidas pela anlise de regresso linear
A
B
58
Figura 20 Relaes entre a atividade antioxidante, no sistema -caroteno/cido
linolico, e os teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos
metanlicos brutos de amostras de prpolis verde, obtidas pela anlise de
regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Correlao significativa -
R2>0,5. A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
A
B
59
4.8.6. Atividade antioxidante por cromatografia em camada delgada
Com o intuito de uma possvel elucidao sobre quais substncias seriam
responsveis pela atividade antioxidante nas amostras de prpolis estudadas, foi
realizado um teste de atividade antioxidante em cromatografia de camada delgada.
O padro de manchas com atividade antioxidante nas diferentes fraes foi
semelhante entre as amostras estudadas (Figura 21). Desse modo, o isolamento
das faixas, e as anlises por CLAE e CG foram realizados somente com a amostra
A, MG. Foram obtidas duas bandas contendo atividade antioxidante na frao de
hexano (Figura 21 I), seis na frao de clorofmio (Figura 21 II), seis na frao de
acetato de etila (Figura 21 III) e quatro na frao de metanol (Figura 21 IV).
60
Figura 21 Atividade antioxidante de amostras de prpolis verde brasileiras, por cromatografia em camada delgada. A visualizao foi feita pela nebulizao com soluo de DPPH 0,3 mM. I: frao de hexano, fase-mvel: toluenoclorofrmio-acetona (40:25:35); II: frao de clorofrmio, fase-mvel: hexano-acetato de etilacido actico (31:14:5); III: frao de acetato de etila, fase-mvel: toluenoclorofrmio-acetona (40:25:35); IV: frao de metanol, fase-mvel: acetato de etilaacetona-cido actico-gua (60:20:10:10). AS = padro de cido sinpico; A a D, amostras de Minas Gerais; E e F, amostras do Paran. Os algarismos arbicos correspondem s bandas com atividade antioxidante.
61
Na faixa 1 da frao hexnica observou-se a presena de duas substncias
principais, que correspondem aos picos 3 e 4 (Figura 22 A), enquanto na faixa 2
observou-se um pico principal, que correspondeu ao pico 4 (Figura 22 B). O pico 3
corresponde ao p-vinil-O-prenil fenol (Figura 6 XVIII), enquanto o pico 4
corresponde ao ster allico do cido prenilcinmico (Figura 6 XXVIII). A
identificao ocorreu por comparao do tempo de reteno dos picos obtidos no
presente teste, com o das substncias descritas na seo anterior.
Figura 22 Cromatogramas obtidos por CG-FID, das faixas isoladas por cromatografia em
camada delgada da frao hexnica da amostra A (MG), nas quais foi detectada atividade
antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2.
Nas faixas 1 e 2 da frao clorofrmica, verificou-se a presena de muitas
substncias, em quantidade muito pequena, de tal maneira que no foi possvel
atribuir a atividade antioxidante a uma delas, especificamente (Figura 23 A e B). A
cromatografia a gs da faixa 3 mostrou tambm a presena de vrias substncias,
entre elas o 1-benzilideno-2,2,3,3,tetrametil-ciclopropano (pico 1, Fig. 6 XIX), o -
vinil-O-prenilfenol (pico 3, Fig. 6 XVIII) e o ster allico do cido prenilcinmico
(pico 4, Fig. 6 XXVIII) (Figura 23 C). Nas faixas 4 e 5, observou-se a
62
predominncia do -vinil-O-prenilfenol (pico 3, Fig. 6 XVIII), alm de outros picos
de menor abundncia (Figura 23 D e E), enquanto na faixa 6 apareceu como pico
principal o ster allico do cido 3-prenilcinmico (pico 4, Fig. 6 XXVII) (Figura 23
F).
Figura 23 Cromatogramas obtidos por CG-FID das faixas isoladas por cromatografia em
camada delgada da frao clorofrmica da amostra A (MG), nas quais foi detectada
atividade antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3; D: faixa 4; E: faixa 5; F: faixa 6.
63
Nas faixas isoladas das fraes de acetato de etila, observamos a presena
do cido qunico (pico A, Figura 6 VI) como pico principal na faixa 1, alm da
presena de diversos picos de menor abundncia (Figura 24 A). Apesar do cido
qunico no ter sido identificado na frao de acetato de etila, o espectro de UV e o
tempo de reteno do pico A correspondem ao do cido qunico, identificado apenas
na frao de metanol. A faixa 2 correspondeu a um aglomerado de picos de baixo
tempo de reteno, muito difceis, portanto, de serem identificados (Figura 24 B).
Na faixa 3 a substncia predominante foi o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX),
mas encontramos tambm alguns picos com abundncia baixa, entre eles o cido
3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico (pico 6, Figura 6 XXV) (Figura 24 C). Na
faixa 4, tambm predominante o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX), com a
presena do cido qunico (pico A, Figura 6 VI), drupanina (pico 5, Figura 6 XXI),
cido 3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico (pico 6, Figura 6 XXV), cido 3-
hidroxi 2,2-dimetil 8-prenilcromano 6-propenico (pico 8, Figura 6 XXX), artepilina
C (pico 9, Figura 6 XXII) e 5-metoxi-4'-hidroxi-flavanona-7-O-glicosdeo (pico 10,
Figura 6 III) em menor quantidade (Figura 24 D). Na faixa 5 foi encontrado como
pico mais abundante a drupanina (pico 5, Figura 6 XXI), embora tambm estejam
presentes em grande quantidade o cido 3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico
(pico 6, Figura 6 XXV), a 5-metoxi-4'-hidroxi-flavanona-7-O-glicosdeo (pico 10,
Figura 6 III ) e uma substncia no identificada (pico B); com menor abundncia,
verificamos a presena do cido qunico (pico A, Figura 6 VI), campferida (pico 7,
Figura 6 IV) e artepilina C (pico 9, Figura 6 XXII) (Figura 24 E). Na faixa 6 foi
encontrado em grande quantidade uma substncia que no pode ser identificada
(pico C), a metoxipinobanksina (pico 2, Figura 6 II), a drupanina (pico 5, Figura 6
64
XXI) e o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX), embora este ltimo esteja
presente em menor quantidade (Figura 24 F).
Figura 24 Cromatogramas obtidos por CLAE, das faixas isoladas por cromatografia em
camada delgada da frao de acetato de etila da amostra A (MG), nas quais foi detectada
atividade antioxidante . A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3; D: faixa 4; E: faixa 5; F: faixa 6.
65
Nas faixas da frao de metanol observamos a predominncia do cido
qunico (pico 1, Figura 6 VI) nas faixas 1, 2, e 4 (Figuras 25 A, B e D). Na faixa 3,
temos a predominncia do cido 4,5-di-O-cafeoilqunico (pico 7, Figura 6 XI), com a
presena do cido 4-O-cafeoilqunico (pico 3, Figura 6 VIII) em menor abundncia
(Figura 25 C).
Figura 25 Cromatogramas obtidos por CLAE, das faixas isoladas por cromatografia em
camada delgada da frao de metanol da amostra A (MG), nas quais foram detectadas
atividade antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3 e D: faixa 4.
4.9. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio-do-mar
Os ensaios de atividade citotxica das amostras de prpolis, tanto das
fraes, como dos extratos metanlicos brutos, demonstraram haver grandes
diferenas entre o potencial citotxico das amostras, bem como das diferentes
66
fraes de uma mesma amostra. Alm disso, todas as atividades se mostraram
dose-dependentes.
Todos os extratos metanlicos brutos apresentaram alta atividade citotxica
na concentrao de 32 g/mL (97,33 1,53% a 100 0%) (Figura 26).
Quanto s fraes de hexano, apenas as amostras A e B apresentaram alta
atividade (98,5 2,12% e 68,5 4,95%, respectivamente). As outras amostras,
mesmo na maior concentrao testada (32 g/mL), apresentaram uma atividade
citotxica baixa, com valores entre 4,33 2,08% e 27,5 0,7% (Figura 27).
As fraes de clorofrmio das amostras A, B, C e D apresentaram alta
atividade citotxica, com valores entre 64 4,24% e 92,5 0,7% na concentrao
de 32 g/mL, enquanto as amostras E e F apresentaram atividade citotxica baixa
(2 1% a 15 1,41%) (Figura 28).
As fraes de acetato de etila apresentaram alta atividade citotxica, com
valores prximos de 100% na concentrao de 32 g/mL para todas as amostras.
As amostras C, D e F alcanaram valores superiores a 80% na concentrao de 16
g/mL (Figura 29).
As fraes metanlicas apresentaram atividade citotxica baixa, menor do
que 5% em todas as amostras, mesmo na concentrao mais alta utilizada (Figura
30).
67
Figura 26 Atividade citotxica dos extratos brutos metanlicos, em
diferentes concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D -
amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
Figura 27 Atividade citotxica das fraes de hexano, em diferentes
concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D - amostras
de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
68
Figura 28 Atividade citotxica das fraes de clorofrmio, em diferentes
concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D - amostras
de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
Figura 29 Atividade citotxica das fraes de acetato de etila, em
diferentes concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A, B, C
e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes
do Paran.
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Figura 30 Atividade citotxica das fraes metanlicas, em diferentes
concentraes, de amostras de prpolis verde brasileira. A a D amostras de
Minas Gerais; E e F amostras do Paran.
Como as fraes de acetato de etila foram as que apresentaram a maior
atividade citotxica dentre as testadas, foi realizada uma curva dose-resposta de
uma das amostras (amostra D), com concentraes logartmicas de razo 1,2, a fim
de traar o perfil da atividade citotxica desta amostra. Os resultados obtidos
apresentam-se na Figura 31, demonstrando que a partir de 15,48 g/mL, a inibio
da clivagem dos embries desta amostra foi prxima de 100%.
70
Figura 31 Curva dose-resposta da atividade citotxica da frao de acetato de
etila da amostra de prpolis verde D (Minas Gerais).
Embries tratados com 10 L de etanol foram utilizados como controles, e
apresentaram clivagens normais (Figura 32 A). Dentre os embries tratados com
32 g/mL de extrato metanlico bruto, a maioria apresentou inibio da 1a
clivagem (Figura 32 B), apresentando anomalias de diviso em concentraes
menores; j os embries tratados com 32 g/mL de extrato da frao de hexano
apresentaram anomalias de diviso (Figura 32 C); os embries tratados com 32
g/mL de extrato da frao de clorofrmio tambm apresentaram maioria das
divises anormais (Figura 32 D); os embries tratados com 32 g/mL de extrato da
frao acetato de etila apresentaram anomalias de diviso e ausncia de clivagem
nas mesmas propores (Figura 32 E); os embries tratados com 32 g/mL de
extrato da frao metanlica apresentaram clivagens normais (Figura 32 F).
71
Figura 32 Micrografias mostrando a atividade citotxica de amostras de prpolis verde em embries de Lytechinu
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