UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Erythroxylum mucronatum
Benth. (ERYTHROXYLACEAE)
GRACIELLE SILVA SANTANA
Aracaju 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Erythroxylum mucronatum
Benth. (ERYTHROXYLACEAE)
GRACIELLE SILVA SANTANA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cavalcante Duarte
Aracaju
2018
GRACIELLE SILVA SANTANA
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Erythroxylum mucronatum
Benth. (ERYTHROXYLACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas
Aprovada em: ___/____/_____
___________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cavalcante Duarte
___________________________________________________ 1º Examinador: Profa. Dra. Cristiani Isabel Banderó Walker
____________________________________________________ 2º Examinador: Profa. Dra. Tamires Cardoso Lima
PARECER
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por permitir que eu concluísse o trabalho, me
dando força diante de cada obstáculo encontrado (que não foram poucos). Por cada
―anjo humano‖ que colocou no meu caminho, eles foram essenciais para guiar cada
passo dado.
Meu orientador, prof. Marcelo Cavalcante, no nosso primeiro contato tive a
certeza que eu estava diante de uma pessoa de coração maravilhoso, e isso foi de
extrema importância pra mim. Obrigada por cada palavra de incentivo e principalmente
por acreditar em mim. Á Allan John, meu colega de laboratório desde o primeiro dia, por
quantas vezes parou um tempinho pra tirar minhas dúvidas.
Á professora Anamara, não tenho nem palavras para agradecer toda a ajuda que
me deu na parte de antioxidantes. Sempre muito paciente e prestativa na hora de me
explicar. Além de tudo, disponibilizando o laboratório para que eu pudesse realizar as
análises, e que sorte eu tive, por coincidência a técnica do laboratório era minha amiga
Suzanne, cada método realizado eu aprendi a fazer com ela.
Ao pessoal do Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA) da
UFPB. Quanta dedicação e companheirismo tiveram comigo, vocês foram essenciais na
conclusão do meu trabalho, momento em que eu mais precisei.
A todos os amigos do LCP/DQI, lugar que foi meu refúgio durante todo o
mestrado, onde sempre fui muito bem acolhida e jamais deixarei de fazer parte.
Ao pessoal do laboratório de Flavor da UFS, por toda assistência dada nos dias
em que estive lá.
À FAPITEC/CAPES pela bolsa concedida.
Aos meus colegas da turma 2016.1 do PPGCF, com os quais convivi momentos
fantásticos de descontração e estudos nos dois primeiros semestres de aula.
À minha família, que sempre me deu força nos estudos, em especial a minha
mãe, Givalda, que mesmo não entendendo nada sobre meu trabalho (rsrs...) estava
sempre a par de cada situação boa ou ruim que vivi durante esse tempo. E ao meu
namorado Antony, por tantas vezes ter que aguentar as crises de ansiedade que o
mestrado me causou, kkkk.
Por fim, e não menos importantes, aos meus amigos da graduação (e da vida),
que estão sempre ao meu lado, torcendo por mim. Obrigada a todos.
“Sem a convicção de uma harmonia íntima do
universo, não poderia haver ciência.”
Albert Einstein
Caracterização química bioguiada pela atividade antioxidante de Erytrhoxylum mucronatum Benth. (Erythroxylaceae) [dissertação]. Gracielle Silva Santana, Universidade Federal de Sergipe, 2018.
RESUMO
A busca pela cura e alívio de doenças através da ingestão de ervas e folhas pode ter
sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. Os cientistas e a
indústria farmacêutica têm demonstrado intenso interesse em desenvolver pesquisas
com a finalidade de descobrir novos princípios ativos de substâncias oriundas de
plantas. Algumas espécies encontradas na flora de Sergipe ainda são
desconhecidas ou pouco conhecidas cientificamente, a exemplo da espécie
Erythroxylum mucronatum que não possui relatos na literatura de seu uso na
medicina popular, bem como estudos químicos e farmacológicos ainda não foram
registrados. O presente estudo teve como objetivo realizar a caracterização química
bioguiada pela atividade antioxidante dessa espécie. Foi feita a investigação da
capacidade antioxidante para o extrato etanólico bruto (EEB) e as fases acetato de
etila (FAE), clorofórmica (FC) e hexânica (FH), todos apresentaram atividade
antioxidante, com destaque para a FAE que mostrou-se a mais ativa, através dos
métodos de eliminação dos radicais DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) (IC50= 37,9
µg/mL), ABTS (2,2'-azinobis (ácido 3 etilbenztiazolino-6- sulfônico)) (IC50= 452,8
µg/mL), NO (Óxido Nítrico) (IC50= 122,81 µg/mL) e ensaio de potencial reducional de
ferro (FRAP), onde demonstrou atividade superior ao padrão Trolox®. O conteúdo
de compostos fenólicos totais para a FAE foi de 348,85 ± 8,47 mg de equivalente de
ácido gálico/g da amostra. A análise em cromatógrafo líquido de alta eficiência
acoplado a espectrômetro de massas (HPLC-MS) identificou 20 compostos fenólicos
presentes na FAE. Entre os compostos identificados, FAE20 foi isolado e elucidado
por ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, denominado como
quercetina-3-O-α-L-ramnosídeo. Conjuntamente, estes resultados evidenciam que a
espécie estudada é bioprodutora de compostos fenólicos e que além de ser
antioxidante esta possui potencial para a realização de novos estudos
farmacológicos.
PALAVRAS-CHAVE: antioxidante, compostos fenólicos, Erythroxylum.
Chemical characterization bioguided by the antioxidant activity of Erytrhoxylum mucronatum Benth (Erythroxylaceae) [dissertation]. Gracielle Silva Santana, Universidade Federal de Sergipe, 2018.
ABSTRACT
The search for healing and the service of diseases through the ingestion of herbs
and leaves may have been one of the first ways of using natural products. Scientists
and the pharmaceutical industry have demonstrated intense in ventures researched
for the purpose of discovery. Other species found in the flora of Sergipe are still
unknown or little known scientifically, such as the Erythroxylum mucronatum species
that has no reports in the literature of its use in folk medicine, as well as chemical and
pharmacological studies have not yet been recorded. The objective of the present
study was to carry out a chemical characterization bioguided by the antioxidant
activity of this species. The antioxidant measurement for the crude ethanolic extract
(EEB) and ethyl acetate (FAE), chloroform (FC) and hexane (FH) phases were
tested, all of which presented antioxidant activity, with emphasis on FAE which
showed to be the most active, through the methods of elimination of DPPH radicals
(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazila (IC50 = 37.9 μg / mL), ABTS (2,2'-azinobis (3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) (IC50 = 452.8 μg / mL), NO (Nitric Oxide) (IC50 =
122.81 μg / mL) and reductive potential (FRAP), where it demonstrated activity
superior to the Trolox® standard. The content of total phenolic compounds for AED
was 348.85 ± 8.47 mg of gallic acid equivalent / g of the sample. A high-efficiency
liquid chromatograph coupled to mass spectrometer (HPLC-MS) analysis identified
20 sets of phenolic present in FAE. Among the compounds identified, FAE20 was
isolated and isolated by 1H and 13C nuclear magnetic resonance (RMN), termed
quercetin-3-O-α-L-rhamnoside. Together, these results show that it is a studied and
bioproductive species of phenolic compounds and that besides being an antioxidant,
it has the potential to carry out new pharmacological studies.
KEYWORDS: antioxidant, phenolic compounds, Erythroxylum.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de distribuição da família Erythroxylaceae no mundo......................17
Figura 2. Estrutura da cocaína..................................................................................18
Figura 3. Espécie E. mucronatum.............................................................................20
Figura 4. Estrutura básica dos flavonoides................................................................21
Figura 5. Exemplos de estruturas das classes de flavonoides..................................22
Figura 6. Esquema Simplificado da Biossíntese dos flavonoides.............................23
Figura 7. Estruturas dos flavonoides isolados por OLIVEIRA (2012)........................24
Figura 8. Estruturas isoladas por RIBEIRO (2013) ...................................................25
Figura 9. Estruturas isoladas por ALBUQUERQUE (2014).......................................25
Figura 10. Exsicata E. mucronatum...........................................................................29
Figura 11. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH no sequestro do radical
DPPH..........................................................................................................................36
Figura 12. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na captura do radical
ABTS..........................................................................................................................38
Figura 13. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na inibição do NO...........40
Figura 14. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH pelo potencial reducional
do Ferro......................................................................................................................42
Figura 15. Curva padrão de ácido gálico para a determinação do teor de fenólicos
totais..........................................................................................................................44
Figura 16. Cromatograma de íons totais da FAE obtido a partir da análise por HPLC-
MS no modo de ionização negativo.............................................................................45
Figura 17. Estrutura química das procianidinas diméricas do tipo B.........................47
Figura 18. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo B...................................48
Figura 19. Proposta de fragmentação do Ácido Clorogênico....................................49
Figura 20. Estrutura do Ácido clorogênico e seu isômero Ácido Criptoclorogênico..50
Figura 21. Procianidina trimérica. epicatequina-(4β-8)-epicatequina-(4β-8)-
epicatequina...............................................................................................................50
Figura 22. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo C...................................51
Figura 23. Proposta de fragmentação da Catequina e Epicatequina........................52
Figura 24. Fragmentação da perda da unidade osídica da isoquercitrina................53
Figura 25. Fragmentação da perda da unidade rutinosídeo para o composto
Rutina.........................................................................................................................53
Figura 26. Fragmentação da perda da unidade osídica da quercetin-3-o-
pentosídeo..................................................................................................................54
Figura 27. Fragmentação da perda da ramnose da quercetin-3-o-ramnosídeo........55
Figura 28. Cromatograma HPLC-UV da FAE comprimento de onda de 280nm.......56
Figura 29. Espectro de RMN-1H (DMSO-d6; 500 MHz) do pico majoritário da FAE.57
Figura 30. Espectro de RMN-13C (DMSO-d6; 125 MHz) do pico majoritário da
FAE.............................................................................................................................58
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Quadro 1. Espécies do gênero Erythroxylum estudadas quanto às atividades
farmacológicas...........................................................................................................19
Tabela 1. Compostos fenólicos identificados na FAE com correspondentes T.R. e
dados de espectrometria de massas (modo negativo) obtido por HPLC-MS............46
Tabela 2. Deslocamentos químicos RMN 13C 125 MHz............................................58
LISTA DE SIGLAS
ABTS 2,2'-azinobis (ácido 3 etilbenztiazolino-6- sulfônico)
APT Attached próton test
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
EEB Extrato etanólico bruto
EPM Erro padrão médio
ER Espécies reativas
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ERO Espécies reativas de oxigênio
ESI Ionização por eletrospray
FAE Fase acetato de etila
FC Fase clorofórmica
FH Fase hexânica
FRAP Ferric reducing antioxidante power
HPLC High performance liquid chromatography
LC Liquid chromatography
MS Mass spectrometry
NO Óxido nítrico
RMN Ressonância magnética nuclear
SNC Sistema nervoso central
SNP Nitroprussiato de sódio
TPTZ Tripiridiltriazina
TR Tempo de retenção
UV Ultravioleta
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 15
2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 17
2.1. FAMÍLIA ERYTHROXYLACEAE ............................................................................... 17
2.2. GÊNERO ERYTHROXYLUM .................................................................................. 18
2.3. CONSIDERAÇÕES SOBRE A ESPÉCIE ERYTHROXYLUM MUCRONATUM (BENTH.) ........ 20
2.4. COMPOSTOS FENÓLICOS .................................................................................... 20
2.4.1. Flavonóides .............................................................................................. 21
2.4.2. Flavonoides no gênero Erythroxylum ........................................................ 24
2.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................................... 26
3. OBJETIVOS ................................................................................................... 28
3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 28
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 28
4. METODOLOGIA ............................................................................................ 29
4.1. COLETA ............................................................................................................ 29
4.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL ........................................................... 29
4.3. OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO (EEB) ............................................. 29
4.4. PARTICIONAMENTO DO EEB ............................................................................... 30
4.5. AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .............................................................. 31
4.5.1. Capacidade antioxidante por eliminação do radical DPPH• (2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo) ...................................................................................................... 31
4.5.2. Capacidade antioxidante por eliminação do radical ABTS•+(2,2'-azinobis
(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfônico))................................................................ 31
4.5.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO) ............... 32
4.5.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)....... 32
4.6. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FAE .................................................................... 33
4.6.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais ................................ 33
4.6.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos ...................................... 33
4.6.2.1. Análise Cromatográfica ...................................................................... 33
4.6.2.2. Isolamento do composto majoritário ................................................... 34
4.6.2.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C ................................................................................................................... 35
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 35
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 36
5.1. AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ............................................................. 36
5.1.1. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais DPPH• .................... 36
5.1.2. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais ABTS•+ ................... 38
5.1.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO) ............... 39
5.1.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)....... 41
5.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FAE .................................................................... 43
5.2.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais ................................ 43
5.2.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos ...................................... 45
5.2.2.1. Análise Cromatográfica ...................................................................... 45
5.2.2.2. Elucidação estrutural por Espectroscopia de Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) de 1H e 13C ............................................................................. 56
6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 60
APÊNDICES ............................................................................................................. 70
15
1. INTRODUÇÃO
A humanidade faz uso dos produtos naturais desde tempos imemoriais. A
busca pela cura e alívio de doenças através da ingestão de ervas e folhas pode ter
sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. Os povos
primitivos e indígenas tinham profundo conhecimento do arsenal químico da
natureza, o que foi considerado fator fundamental para o descobrimento de
substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A convivência e o
aprendizado com os mais variados grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições
para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da
relação próxima entre a química de um determinado composto e suas propriedades
biológicas (JUNIOR, 2006).
Atualmente os cientistas, bem como a indústria farmacêutica, têm
demonstrado um intenso interesse em desenvolver pesquisas com o objetivo de
descobrir novos princípios ativos e também aprimorar as descobertas de
ferramentas ou de novas atividades farmacológicas de substâncias já conhecidas e
oriundas de plantas (FIRMO et al., 2011).
Os estudos comprovam que os vegetais sintetizam compostos que são
agrupados da seguinte forma: os metabólitos primários, tais como carboidratos,
aminoácidos, lipídeos; e os metabólitos secundários que são compostos elaborados
a partir da síntese dos metabólitos primários, tais como compostos fenólicos,
terpenóides, alcalóides, entre outros. Esses compostos que resultam do
metabolismo secundário são os responsáveis pelos efeitos farmacológicos ou
tóxicos das plantas, e eles apresentam grande importância ecológica (SANTOS,
2011).
O Brasil detém a maior biodiversidade do mundo, despertando o interesse da
comunidade científica para estudo, conservação e utilização racional desses
recursos (SANTOS, 2011). Outro aspecto a ser ressaltado é que grande parte das
plantas existentes ainda não foram estudadas fitoquímica e biologicamente, sendo
promissoras fontes de compostos bioativos (DUARTE, 2009).
O estado de Sergipe é caracterizado por uma vegetação típica de caatinga,
bem como por remanescentes de mata atlântica (incluindo os mangues e as
16
restingas), com muitos elementos do cerrado e vegetação de campos rupestres.
Nestes ambientes, encontram-se plantas com reconhecida atividade terapêuticas
pela população local, bem como espécies de ocorrência endêmica. Algumas
espécies ainda são desconhecidas ou pouco conhecidas cientificamente, tanto do
ponto de vista botânico, químico, farmacológico e econômico (SAMPAIO, 2008).
Entre as espécies presentes na flora do estado de Sergipe têm-se aquelas
pertencentes à família Erythroxylaceae, com destaque para o gênero Erythroxylum
P. Browne. No estado, foram registradas 18 das 128 espécies de Erythroxylum
presentes no Brasil (FLORA DO BRASIL, 2018), ocorrendo 14 delas nas formações
vegetais da Mata Atlântica (restingas, tabuleiros litorâneos, florestas estacionais e
florestas ombrófilas) (PRATA et. al., 2013). Estudos fitoquímicos realizados
previamente com diferentes espécies do gênero levaram ao isolamento de muitos
metabólitos secundários, principalmente da classe dos alcaloides e flavonoides, com
efeitos farmacológicos (PAULA, 2012).
Diante de tais fatores, reconhecendo a importância química e biológica do
gênero Erythroxylum e levando em conta que a espécie Erythroxylum mucronatum
não possui relatos na literatura sobre seu uso na medicina popular, bem como
estudos químicos e farmacológicos ainda não foram registrados, considera-se assim
relevante a investigação do potencial químico e biológico de folhas da espécie no
estado de Sergipe, direcionando para a identificação de possíveis substâncias
naturais bioativas, assim contribuindo para a taxonomia da espécie.
17
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Família Erythroxylaceae
A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros e cerca de 240
espécies com distribuição pantropical (figura 1), tendo seus principais centros de
diversidade e endemismo na Venezuela, Brasil e Madagascar. No Brasil, são
encontradas 128 espécies (FLORA DO BRASIL, 2018) das 187 registradas para a
América tropical (ALBUQUERQUE et al., 2014).
Fonte: www.tropicos.org, 2018.
A maioria das espécies pertence ao gênero Erythroxylum, que apresenta
ampla distribuição na América, África, Ásia e Oceania, principalmente, na região
tropical do continente americano. Aneulophus Benth, Nectaropetalum Engl. e
Pinacopodium Excell & Mendonca, são os outros três gêneros pertencentes a família
Erythroxylaceae. Estes gêneros compreendem poucas espécies e apresentam
distribuição exclusiva na África. No Brasil, ocorre apenas o gênero Erythroxylum
(PAULA, 2012). A espécie Erythroxylum coca Lam. e as suas variedades, são as
plantas mais conhecidas dessa família, sendo amplamente cultivada para a
obtenção da cocaína (MENDONÇA,1998).
Figura 1. Mapa de Distribuição da Família Erythroxylaceae no Mundo.
18
2.2. Gênero Erythroxylum
O gênero Erythroxylum está presente nas regiões tropicais e subtropicais do
planeta (PAULA, 2012). Esse gênero possui grande versatilidade ecológica, com
espécies encontradas em ambientes úmidos como a Floresta Amazônica e a
Floresta Atlântica, e em regiões semiáridas, ocorrendo em diferentes níveis de
elevações (desde o nível do mar até hábitats montanhosos) (LOIOLA et. al.,2007).
As únicas espécies de interesse econômico são as espécies E. coca e E.
novogranatense, cultivadas devido ao seu teor de cocaína ( pode chegar a até 2%
da massa seca de folhas). A cocaína (figura 2) é encontrada em abundância nestas
duas espécies e ocorre em traços em algumas outras espécies (BROCK, et al.,
2005).
O interesse pelo gênero Erythroxylum intensificou-se no século XIX, após a
descoberta das atividades farmacológicas apresentadas pelas folhas de E. coca
Lam., amplamente empregada pelos indígenas da região andina da América do Sul
(LOIOLA et. al., 2007).Estudos fitoquímicos realizados com diferentes espécies do
gênero Erythroxylum levaram ao isolamento de muitos metabólitos secundários.
Várias espécies já apresentaram a ocorrência de metabólitos importantes como
flavonóides e alcalóides, também foram encontrados compostos como taninos,
terpenos e fenilpropanóides, que em resultados obtidos em trabalhos anteriores
mostraram que apresentam atividade antioxidante, antimicrobiana, antinociceptiva
dentre outras (PAULA, 2012). Destaca-se a presença da cocaína, um alcalóide
natural do grupo tropano, produzido por E. coca, que foi empregado como
anestésico local em pequenas cirurgias. Entretanto, a cocaína ganhou notoriedade
por sua atividade psicoativa no Sistema Nervoso Central (SNC) (LOIOLA et
al.,2007).
Figura 2. Estrutura da cocaína
19
Estudos farmacológicos com espécies dessa família demostraram excelentes
resultados frente ao sistema biológico (quadro 1) como vasorelaxamento em células
do musculo liso de ratos (OLIVEIRA et. al., 2012) atividade psicoativa (TAMAGNAN
et. al., 2004), antimicrobiana (ALBUQUERQUE et al.,2014) e antitumoral (AGUIAR
et. al., 2011).
Quadro 1. Espécies do gênero Erytrhoxylum estudadas quanto às atividades farmacológicas
Espécie (s) Atividade Biológica Órgão Vegetal Referência
E. sideroxyloides Atividade
antioxidante
folhas (SOOBRATTEE et
al.,2008)
E. caatingae Efeito vasodilatador caule (REIS et al., 2012)
E. pungens Efeito
cardiovascular
raízes (OLIVEIRA et al.
2012)
E. monogynum Efeito
hepatoprotetor
folhas (SYED; NAMDEO,
2013)
E. caatingae, E.
subrotundum e E.
revolutum
Efeito relaxante
folhas (SANTOS et al.,
2013)
E. caatingae Atividade
espasmogênica
folhas (RIBEIRO, 2013)
E. caatingae Atividade
antinociceptiva
tronco (MAIA et al., 2014)
E. pulchrum
Atividade
antibacteriana
folhas
(ALBUQUERQUE
et al. 2014)
20
2.3. Considerações sobre a espécie Erythroxylum mucronatum (Benth.)
E. mucronatum é uma árvore de 2,5 - 4 metros de altura, amplamente
distribuída na América do Sul. No Brasil ocorre em matas úmidas da Mata Atlântica e
Amazônia, nas regiões norte, centro-oeste e nordeste. No estado de Sergipe essa
espécie ocorre em florestas ombrófilas, estacionais e na restinga arbórea.
Assemelha-se morfologicamente a E. citrifolium, com quem divide o mesmo hábitat.
Em E. citrifolium as estípulas são menores que 6,5 mm compr., caducas e
permanecem íntegras quando maduras, desprendendo-se dos ramos na base e os
fascículos estão localizados na axila das folhas e dos catafilos. Já em E.
mucronatum, as estípulas são maiores que 8 mm comprimento, persistentes e se
rompem longitudinalmente quando maduras e os fascículos são encontrados na
axila dos catafilos. Espécie que floresce e frutifica ao longo de todo o ano. No estado
do Sergipe foi registrada com flores nos meses de janeiro e fevereiro (PRATA et al.,
2013).
Figura 3. Espécie E. mucronatum
Fonte: www.floradobrasil.jbrj.gov.br
2.4. Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos constituem uma das classes de metabólitos
secundários mais importantes, numerosas e onipresentes no reino vegetal (NACZK;
SHAHIDI, 2004). Apresentam uma enorme diversidade estrutural e executam
diversas funções, desde proteção contra radiação UV até funções de sustentação e
suporte do vegetal (SOUSA, 2015), além de contribuir para as características
sensoriais de frutas e verduras.
21
Os compostos fenólicos têm como estrutura básica um anel aromático
podendo ter uma ou mais hidroxilas como substituintes, e variam de moléculas
fenólicas simples a compostos altamente polimerizados (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006). São classificados principalmente de acordo com o tipo
de esqueleto principal. Dentre as principais classes de compostos fenólicos estão: os
ácidos hidroxibenzóicos, ácidos hidroxicinâmicos, flavonoides, as ligninas e os
taninos condensados (SIMÕES, 2008). Cada classe de compostos apresenta ampla
variação estrutural, e de acordo com o número e posição de seus grupos hidroxilas e
de outros grupos substituintes que existem na molécula são divididos em subclasses
(MELO et al., 2009).
2.4.1. Flavonóides
Os flavonóides constituem uma importante classe de polifenóis presentes em
abundância entre os metabólitos secundários vegetais (SIMÕES, 2017). Seu núcleo
fundamental é composto por 15 átomos de carbono, arranjados em três anéis (C6 –
C3 – C6), sendo eles: dois anéis aromáticos (A e B), unidos por três carbonos que
formam um anel heterocíclico (C). O anel A se encontra acoplado ao C, e o anel B
se encontra ligado ao C, nas posições 2, 3 ou 4 (Figura 4).
Os flavonoides podem ocorrer em grande número conjugado com açúcares.
Essa forma, chamada de conjugada, também é conhecida como heterosídeo. São
O-heterosídeos quando a ligação ocorre por intermédio de uma hidroxila e C-
heterosídeos quando a ligação ocorre por intermédio de um carbono. Quando se
encontra sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também
Figura 4. Estrutura básica dos Flavonóides
22
denominada de forma livre (SIMÕES, 2017). Os açúcares conjugados com
flavonoides identificados até o momento são: as pentoses D-apiose, L-arabinose, e
D-xilose; as hexoses L-ramnose, D-alose, D-galactose, e D-glicose; e os ácidos D-
galacturônico e D-glicurônico. Os flavonoides também podem estar associados a
dissacarídeos e trissacarídeos.
A classificação dessas substâncias é baseada na modificação do anel
heterocíclico central (Anel C) ou na sua perda (como no caso das chalconas)
(COUTINHO et al.,2009). A figura 5 apresenta exemplos de estruturas de variadas
classes dos flavonoides.
A substituição do anel heterocíclico de seis membros por um de cinco
membros origina a subclasse aurona ou pela forma acíclica a subclasse chalcona.
Os flavonóides podem existir como oligômeros de flavan-3-ol, que são as
Figura 5. Exemplos de estruturas das classes de flavonoides.
Cianidina
(Antocianina)
Luteolina
(Flavona) Canferol
(Flavonóis)
Isoliquiritigenina
(Chalcona) Aureusidina
(Aurona)
Alpinetina
(Flavanona)
Prociadinina B
(Proantocianidina)
Catequina
(Flavan-3-ol)
Amentoflavona
(Biflavonoide)
23
proantocianidinas (também consideradas taninos condensados) ou como oligômeros
de flavona e flavanona, que são os biflavonoides (SIMÕES, 2017).
Os flavonóides são biossintetizados através da combinação das rotas do
ácido chiquímico e do acetato. As estruturas fenilpropanóicas dos anéis B e C são
sintetizadas a partir do ácido p-cumárico da via chiquimato, enquanto que o anel A é
oriundo da condensação tipo Claisen de três Acetil-SCoA da via do acetato (Figura
6) (SIMÕES, 2017).
Figura 6. Esquema Simplificado da Biossíntese dos Flavonóides
Fonte: Adaptado de SIMÕES, 2017
Carboidratos
ác. Chiquímico
ác.Fenilpirúvico
fenilalanina tirosina NH3
ác. cinâmico p-cumaroilCoA
3x malonil-CoA
acetil-CoA
chalconas
flavanonas flavonas
auronas
di-hidroflavonóis flavonóis leucoantocianidinas
antocianidinas catequinas
PROANTOCIANIDINAS
24
Diversas funções são atribuídas aos flavonoides nas plantas: proteção dos
vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, proteção contra insetos,
fungos, vírus e bactérias; atração de animais com finalidade de polinização por atuar
como pigmentos coloridos de flores; controle da ação de hormônios vegetais;
agentes alelopáticos e inibidores de enzimas.
Além da sua relevância em plantas, os flavonoides são importantes para a
saúde humana, principalmente, pela sua atividade farmacológica como eliminador de
radicais. O recente interesse destas substâncias tem sido estimulado pela gama de
benefícios para a saúde, decorrentes das atividades antioxidantes destes compostos
polifenólicos. Para HAMINIUK (2012), esses fitoquímicos revelaram-se muito
eficazes como eliminadores de radicais livres e são importantes antioxidantes por
causa do seu elevado potencial redox e sua capacidade de quelar metais.
Além disso, foram relatados que muitos flavonoides possuem propriedades
antibacterianas e antifúngicas. Isto tem aumentado o interesse da indústria de
alimentos em utilizar esses compostos naturais como componentes para melhorar a
estabilidade de alimentos contra agentes de deterioração microbiológica (SANTAS;
ALMAJANO; CARBO, 2010).
2.4.2. Flavonoides no gênero Erythroxylum
Estudos fitoquímicos já realizados com espécies variadas do gênero
Erythroxylum, demonstraram uma predominância no isolamento de metabólitos
secundários das classes dos alcaloides (tropânico), flavonoide e terpenoide. Outras
classes também já foram isoladas neste gênero, porém, com menor frequência.
OLIVEIRA (2012) isolou dois flavonoides (Figura 7) das folhas de E.
subrotundum. Foram eles: 5,7,4’ – trihidroxiflavona – 3-O-α-L- ramnosídeo [1] e
quercetina – 3-O-α-L- ramnosídeo [2].
Figura 7. Estruturas dos flavonoides isolados por OLIVEIRA (2012).
[1] [2]
25
Nas partes aéreas (folhas) de E. rimosum, foram isolados e identificados dez
flavonoides (Figura 8) dentre eles: quercetina, canferol-3-O-α-L-arabinofuranosideo,
quercetina-3-O-α-arabinofuranosideo, quercetina-3-O-α-arabinopiranosideo,
quercetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina-3-β-glicopiranosideo, canferol,
quercetina-3-O-β-galactopiranosideo [3-10 respectivamente], (+)-catequina e
epicatequina [11 e 12] (RIBEIRO, 2013).
Das folhas de E. pulchrum, ALBUQUERQUE (2014), realizou o isolamento de
quatro flavonoides: Epicatequina (Figura 8, [12); Quercetina – 3-O-α-L- ramnosídeo
(Figura 7, [2], pág. 24); ombuim-3-rutinosídeo (Figura 9, [13]) e ombuin-3-
rutinosídeo-5-glicosídeo (Figura 9, [14]).
Figura 8. Estruturas isoladas por RIBEIRO (2013).
[11] [12]
Figura 9. Estruturas isoladas por ALBUQUERQUE (2014).
[3] R1 = H; R2 = OH [4] R1 = α-L-arabinofuranosil; R2 = H [5] R1 = α-L-arabinofuranosil; R2 = OH [6] R1 = α-L-arabinopiranosil; R2 = OH [7] R1 = β-L-arabinopiranosil; R2 = OH [8] R1 = β-L-glicopiranosil; R2 = OH [9] R1= H; R2 = H [10] R1 = α-L-galactopiranosil; R2 = OH
[13] R1 = Glu-Rha; R2 = R4 = MeO; R3 = R5 = OH [14] R1 = Glu-Rha; R2 = R4 = MeO; R3 = OH; R5 =
Glu
Glu = Glicose
Rha = Ramnose
26
2.5. Atividade Antioxidante
A oxidação compreende um processo metabólico que ocasiona a produção de
energia necessária para as atividades essenciais das células, produzindo radicais
livres (ROESLER et al., 2007). Os radicais livres são átomos ou moléculas capazes
de possuir existência independente, contendo um ou mais elétrons
desemparelhados na sua última camada de valência. Devido a sua configuração, os
radicais livres possuem como característica a alta reatividade, instabilidade e meia-
vida curta, tornando-os doadores ou receptores de elétrons capazes de interromper
reações em cadeia e danos oxidativos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
Essas espécies reativas (ERs) são classificadas como: Espécies Reativas do
Oxigênio (EROs) e Espécies Reativas do Nitrogênio (ERNs). As ERs tanto incluem
radicais como o ânion superóxido (O2•-),o radical hidroxila(OH•), o óxido nítrico (NO•)
e o peroxinitrito (OONO-), como também espécies não- radicalares, que são agentes
oxidantes e/ou são facilmente convertidos em radicais, como por exemplo, o
peróxido de hidrogênio (H2O2), o oxigênio singlete e o ácido hipocloroso (HClO)
(NIKKI, 2010). Em baixo nível, os ERs são importantes em muitos processos
bioquímicos, entretanto, o seu excesso pode causar sérios problemas celulares,
como destruição de membrana celular (que é rica em lipídeos que são vulneráveis à
oxidação) e danos ao DNA (LIMA; BEZERRA, 2012). O excesso de formação e/ou
remoção insuficiente dessas espécies reativas é chamado de estresse oxidativo.
Este tem sido associado ao processo de envelhecimento e ao desenvolvimento de
doenças como o câncer, diabetes, doenças cardíacas e degenerativas como o
Alzheimer (ROESLER et al., 2007).
As ERs podem ser geradas por fontes endógenas (dentro do organismo) ou
exógenas (externa). Alguns processos biológicos que ocorrem no organismo dão
origem às ERs endógenas. Já as fontes exógenas incluem tabaco, poluição do ar,
anestésicos, pesticidas e radiações. Os sistemas biológicos controlam estes fatores
oxidativos via diversos mecanismos antioxidantes que reduz a reatividade dos
radicais livres (SANTOS, 2015). O sistema de defesas antioxidantes é formado por
linhas de defesa enzimática e não enzimática que atuam de forma colaborativa e
coordenada no organismo. Entre os antioxidantes enzimáticos estão as enzimas
superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidases (GPx) e catalase (CAT). Já os
antioxidantes não enzimáticos obtidos através da dieta, são representados pelo
27
ácido ascórbico (Vitamina C), α-tocoferol (Vitamina E), carotenoides, compostos
fenólicos (flavonoides) e outros antioxidantes (VALKO et al., 2007).
Os compostos antioxidantes podem prevenir, impedir ou reduzir o dano de
oxidação provocado pelos radicais livres. Eles fazem isso através da doação de um
de seus elétrons que acaba estabilizando o radical livre e, por serem estáveis não se
tornam radicais livres quando doa este elétron (CASAGRANDE, 2014). Do ponto de
vista estrutural, os antioxidantes são compostos aromáticos que possui pelo menos
uma hidroxila. O átomo de hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos
radicais livres e radicais peróxidos, a partir daí são formadas espécies inativas para
reagir em cadeia e também um radical inerte oriundo do antioxidante. Este radical
inerte é estabilizado por ressonância, desta forma o mecanismo de ressonância que
os antioxidantes possuem (devido ao anel aromático em sua estrutura) os impede de
vir a se tornarem radicais livres e assim potencializar a oxidação lipídica (RAMALHO;
JORGE 2006).
Diversos mecanismos podem ser utilizados para testar a atividade
antioxidante de sistemas biológicos ou produtos naturais. Sendo estes baseados na
captura do radical livre (DPPH, ABTS e NO), no poder de redução do metal (FRAP),
na quantificação de produtos formados durante a peroxidação dos lipídeos (co-
oxidação do β-caroteno, TBARS e oxidação do LDL), na captura do radical hidroxila
(método de desoxirribose), na captura do radical peroxila (TRAP, ORAC), dentre
outros (CRAFT et al., 2012).
28
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Realizar a caracterização química bioguiada pela atividade antioxidante da
espécie Erythroxylum mucronatum.
3.2. Objetivos Específicos
Obter o extrato etanólico bruto e frações orgânicas da espécie E.
mucronatum;
Realizar os testes de captura de radicais livres (DPPH, ABTS e NO) e
capacidade redutora (FRAP) no extrato bruto e frações orgânicas de E. mucronatum;
Determinar por espectrofotometria o teor de compostos fenólicos totais na
fração acetato de etila;
Identificar, por HPLC-MS os compostos fenólicos presentes na fração de
acetato de etila;
Elucidar o componente majoritário da fração de acetato de etila por RMN de
1H e 13C;
29
4. METODOLOGIA
4.1. Coleta
As folhas de E. mucronatum foram coletadas no mês de março de 2016 na
Serra de Itabaiana, coordenadas [10°45’19’’ S, 37°20’32’’ W], município de Areia
Branca, Sergipe. O material vegetal foi identificado pela profa. Dra. Ana Paula do
Nascimento Prata, taxonomista vegetal do Departamento de Biologia da
Universidade Federal de Sergipe (UFS). Uma exsicata (Figura 10) do material em
estudo foi depositada no Herbário ASE/UFS sob o número de registro 36300.
4.2. Processamento do Material Vegetal
Depois de coletado, o material vegetal da espécie em estudo (folhas), foi seco
em estufa de ar circulante à temperatura de 40°C, durante 72 horas, em seguida
triturado em moinho mecânico, obtendo-se um pó seco (1145g).
4.3. Obtenção do Extrato Etanólico Bruto (EEB)
O material vegetal seco foi submetido à maceração exaustiva com etanol
(92,3%), com renovação de solvente em intervalo de 72 horas. A solução extrativa
obtida foi concentrada em rotaevaporador, sob pressão reduzida a uma temperatura
de 40°C, obtendo-se o extrato etanólico bruto (EEB) (23,87%).
Figura 10. Exsicata de E.mucronatum
30
4.4. Particionamento do EEB
Parte do extrato (100 g) foi suspenso em metanol-água (7:3) e, em seguida,
submetido a uma partição líquido/líquido com solventes de diferentes polaridades em
um funil de separação de 1000 mL, fornecendo as frações hexânica (2,03 %),
clorofórmica (2,53 %) e acetato de etila (17,38 %), respectivamente (Fluxograma1)
(LUCENA et al., 2013).
Extrato Etanólico Bruto
(100g)
MeOH:H2O (7:3)
Solução Hidroalcoólica
Hexano
Fase Hexânica
Fase Clorofórmica
Solução Hidroalcoólica III Fase Acetato de
Etila
Solução Hidroalcoólica II
Solução Hidroalcoólica I
Clorofórmio
Acetato de Etila
Fluxograma 1. Representação do processo de partição líquido/líquido do extrato etanólico bruto.
31
4.5. Avaliação de atividade antioxidante
Estes procedimentos foram realizados no laboratório de bromatologia do
Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Sergipe (UFS), com a
colaboração da Profa. Dra. Ana Mara de Oliveira e Silva.
4.5.1. Capacidade antioxidante por eliminação do radical DPPH• (2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo)
Para a avaliação da capacidade antioxidantedo EEB e das suas respectivas
fases contra o radical DPPH•, foi utilizada a metodologia adaptada de BRAND-
WILLIANS, CUVELIER e BREST (1995). Foiadicionada em microplaca 50 µL da
solução do EEB, fase acetato de etila, fase clorofórmica e fase hexânica (1, 3, 10,
30, 100 µg/mL) a 150µL da solução metanólica DPPH (0,06 mM). Foram utilizados
como acompanhamentos para os testes um controle negativo (branco sem
antioxidante, metanol) e um padrão análogo sintético da vitamina E, denominado
Trolox® (100 µg/mL). A placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos
(ausência de luz) e posteriormente, foi feita a leitura das absorbâncias (leitor de
placas) a 517 nm. O teste foi realizado em triplicata e os valores das absorbâncias
foram expressos em porcentagem de inibição do radical DPPH de acordo com a
seguinte equação:
% Inibição DPPH = 100 x [(controle – amostra)/controle]
(Equação 1)
4.5.2. Capacidade antioxidante por eliminação do radical ABTS•+(2,2'-azinobis (ácido 3-
etilbenztiazolino-6-sulfônico))
Para a avaliação da capacidade antioxidante do EEB e das suas respectivas
fases contra o radical ABTS•, foi utilizada a metodologia adaptada de REet al.
(1999). Inicialmente, foi formado o radical ABTS•+ a partir da reação de 5 mL da
solução estoque de ABTS (7 mM) em 88 µL de solução de persulfato de potássio
K2S2O8(140 mM), a qual foi incubada a temperatura ambiente na ausência de luz por
16 horas. Passado este tempo, a solução de ABTS foi diluída em etanol aos poucos,
até obter uma absorbância de 0,70 ± 0,05 em 734nm. Em microplaca 3µL das
32
amostras (10, 30, 100, 300, 1000 µg/mL) foram adicionados a 300µL do radical
ABTS. Foram utilizados como acompanhamentos para os testes um controle
negativo (branco sem antioxidante, álcool etílico) e o padrão Trolox® (1000 µg/mL).A
leitura das absorbâncias foi realizada após 15 minutos em leitor de placas a 734 nm.
O teste foi realizado em triplicata e os valores das absorbâncias foram expressos em
porcentagem de inibição do radical ABTS de acordo com a seguinte equação:
% Inibição ABTS = 100 x [(controle – amostra)/controle]
(Equação 2)
4.5.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO)
A partir da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio (20 mM) em
tampão fosfato (pH=7,4) (29,75mg de SNP + 5mL de tampão), foi gerado o NO. A
partir daí, o NO interage com o oxigênio para produzir íons nitrito, que foram
medidos por meio da reação de Griess, de acordo com o método de BASU et al.
(2006). Em uma microplaca, foram adicionados 50 µL das amostras (1, 3, 10, 30,
100 µg/mL) em 50µL do SNP e foi incubada a 37°C durante 1 hora. Em seguida,
foram adicionados 100µL do reagente de Griess (Need 0,2% + Sulfa 2%; 1:1) recém
preparado na ausência de luz. Foram utilizados como acompanhamentos para os
testes um controle negativo (branco sem antioxidante, tampão fosfato) e o padrão
Trolox® (100 µg/mL). Aguardou-se 15 minutos e as absorbâncias foram medidas no
comprimento de onda de 540 nm. O teste foi realizado em triplicata e foi gerada uma
curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2) (5, 10, 20, 40, 80, 100 µmol). A equação da
reta foi utilizada para calcular a capacidade antioxidante do EEB e das suas
respectivas fases.
4.5.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)
Na determinação do potencial reducional do ferro pelo EEB e suas fases, foi
utilizada a metodologia descrita por BENZIE e STRAIN (1996) com adaptações. Em
uma microplaca, foram adicionados 9 µL das amostras (1, 3, 10, 30, 100 µg/mL),
27µL de água destilada e 270 µL do reagente FRAP (15 mL de tampão acetato 0,3M
+ 1,5mL de uma solução de TPTZ 10mM e 1,5 de uma solução aquosa de cloreto
férrico 20 mM). A placa foi incubada a 37°C por 30 minutos e a leitura foi realizada a
33
um comprimento de onda de 595 nm. Foram utilizados como acompanhamentos
para os testes um controle negativo (branco sem antioxidante, tampão acetato) e o
padrão Trolox® (100 µg/mL). O teste foi realizado em triplicata e foi gerada uma
curva padrão de sulfato ferroso (FeSO4) (125, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µmol). A
equação da reta foi utilizada para calcular o potencial redutor das amostras.
4.6. Caracterização química da FAE
4.6.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais
Os compostos fenólicos totais na FAE foram quantificados de acordo com o
método de Folin- Ciocalteau (SWAIN; HILLIS, 1959) com algumas adaptações. Foi
adicionada 12,5 µL da amostra (1 mg/mL) a 200µL de água destilada. Agitou-se e,
em seguida, adicionou-se 12,5µL de reagente Folin- Ciocalteau, a mistura foi
novamente agitada e, após 3 minutos foi adicionada 25 µL de solução saturada de
carbonato de sódio (Na2CO3). Agitou-se e deixou em repouso por 1 hora em
temperatura ambiente. Foi feito um branco (controle negativo) com metanol puro. A
leitura das absorbâncias foi realizada em leitor de placas a um comprimento de onda
de 720 nm. Foi feita uma curva padrão de ácido gálico (10 a 250 µg/mL) nas
mesmas condições da amostra e o resultado foi expresso em equivalente de ácido
gálico.
4.6.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos
A identificação estrutural dos compostos fenólicos da FAE foi realizada no
Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA) da Universidade
Federal da Paraíba (UFPB), com colaboração do Prof. Dr. JoseanFechine Tavares.
4.6.2.1. Análise Cromatográfica
A análise estrutural dos compostos fenólicos da FAE foi desenvolvida
utilizando como técnica a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à
espectrometria de massas (Sistema LC-MS). O equipamento utilizado foi um HPLC
SHIMADZU, constituído por duas bombas LC-20 AD, um desgasificador DGU-20A3,
um auto-injetor SIL-20A, um detector de matriz de fotodiodo SPDM20Avp. Este
34
HPLC estava acoplado a um espectrômetro de massas da marca BRUKER modelo
AMAZON X ION TRAP, fonte de ionização por eletrospray. Os parâmetros de
análise do Ion-Trap foram: capilar 4,5 kV, offset da placa final 500 V, nebulizador
24,5 psi, gás seco (N2) com fluxo de 4,5 L/h e temperatura de 200 ºC. O sistema foi
equipado com uma coluna analítica Kromasil C18 diâmetro interno 250 x 4,6 mm
(tamanho da partícula de 5 µm). As medidas foram feitas no modo Full Scan 100-
1000 m/z (registrados a cada 2 segundos), com aquisição de dados dependente de
MS2, no modo de íon negativo. Não foi utilizado forno na coluna.
A FAE foi diluída em metanol (grau HPLC) a uma concentração de 1 mg/mL.
Os solventes utilizados para a fase móvel foram: (A) 0,1% de ácido fórmico em água
milli-q e (B) Metanol, desgaseificados através de banho ultrassônico. Foi injetado um
volume de 10µL da amostra e a taxa de fluxo de fase foi de 0,6mL/min. O sistema de
gradiente utilizado na eluição iniciou com 15-32% de B de 0,01-47 minutos, 32-70%
de B de 47-83 minutos, 70-80% de B de 83-85 minutos, 80-100% de B de 85-87
minutos . Foi feita a análise cromatográfica no comprimento de onda de 280 nm e os
dados foram avaliados usando o software COMPASS – BRUKER.
4.6.2.2. Isolamento do composto majoritário
O isolamento do componente majoritário da FAE foi realizado em
equipamento HPLC-DAD da marca SHIMADZU, constituído por duas bombas LC-
10AD, um desgasificador DGU-14A, injetor manual, um detector UV-VIS SPD-
10AVvp, sistema de comunicação SCL-10Avp. O cromatógrafo foi equipado com
uma coluna semipreparativa VENUSIL XBP C18 (10 x 250 mm; tamanho de
partícula de 10 µm). Não foi utilizado forno na coluna.
A FAE foi diluída em metanol (grau HPLC) a uma concentração de 30 mg/mL.
Os solventes utilizados para a fase móvel foram: (A) 0,1% de ácido fórmico em água
milli-q e (B) Metanol, desgaseificados através de banho ultrassônico. Foi injetado
um volume de 100 µL da amostra e a taxa de fluxo de fase foi de 3 mL/min. O
sistema de gradiente utilizado na eluição foi o mesmo utilizado para o LC-MS (Item
4.6.3.1). O detector foi ajustado para um comprimento de onda de 280 nm. O
composto majoritário foi coletado em erlenmeyer. Foram feitas sucessivas injeções
até se obter uma quantidade significativa da amostra que foi concentrada em
rotaevaporador.
35
4.6.2.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C
O composto majoritário da FAE foi estruturalmente determinado através do
método espectroscópico de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C.
A análise de RMN foi realizada em espectrômetro VARIAN-NMR-SYSTEM
500MHz, operando a 500MHz para RMN 1H e 125MHz para RMN 13C. O solvente
utilizado no preparo da amostra foi o dimetil sufóxido deuterado (DMSO) e foi
utilizado como padrão interno o TMS (tetrametilsilano). Os deslocamentos químicos
(δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J)
em Hz. As multiplicidades dos sinais em RMN 1H foram indicadas segundo a
convenção: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dl (dupleto largo), dd (duplo
dupleto), t (tripleto), q (quarteto) e m (multipleto). O programa utilizado para o
processamento dos dados foi o MestReNova.
4.7. Análise Estatística
Todos os ensaios antioxidantes foram realizados em triplicata e pelo menos
duas vezes. Para o tratamento estatístico dos dados foi utilizada a análise de
variância (ANOVA) para múltiplas comparações, seguida de teste do Tukey,
utilizando o software Prism® 6.0 (GraphPad). Os dados foram expressos como
média e desvio padrão, adotando como significativos os valores de p<0,05. A partir
da equação da reta dos gráficos do potencial de inibição (%) versus as
concentrações das amostras nas análises, foi possível calcular os valores de IC50 do
extrato e suas respectivas frações.
36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Avaliação de Atividade Antioxidante
5.1.1. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais DPPH•
A medida da capacidade sequestrante determinada pelo método DPPH
baseia-se no princípio de que o DPPH•, sendo um radical estável de coloração
violeta (em solução metanólica ou etanólica) é reduzido na presença de um
antioxidante e adquire coloração amarela (TIVERON, 2010). Isso se deve a
habilidade de transferência de hidrogênio do antioxidante para o radical livre estável
DPPH•. Em sua forma radical, o DPPH• tem maior absorção no comprimento de
onda a 517 nm, mas sob redução por antioxidante ou uma espécie radical, a
absorbância é reduzida (SANTOS, 2011). O grau dessa descoloração foi monitorado
espectrofotometricamente e indicou a habilidade das amostras em sequestrar o
radical livre. Os resultados de inibição do radical DPPH do extrato bruto (EEB), fase
acetato de etila (FAE), fase clorofórmica (FC) e fase hexânica (FH), nas
concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em percentual do
radical DPPH• e estão representados na Figura 11.
Figura 11. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH no sequestro do radical livre DPPH•
Os resultados expressam a média ± E.P.M. (Erro padrão da média) dos valores de inibição in vitro.
***p<0,001 ou **p<0,01 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.
+++p<0,001 entre concentrações do EEB e FAE. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey.
Rad
ical
DP
PH
(%)
0
25
50
75
100
125
Sistema 1 3 10 1 3 10 30 100 1 3 10 30 10030 100 1 3 10 30 100
Trolox
(g/mL)EEB
(g/mL)
FAE
(g/mL)
FC
(g/mL)
FH
(g/mL)
100
***
***
*** ***
***
***
***
***
*****
***
***
***
***
***
*
###
###
+++
+++
+++
37
Todas as amostras neutralizaram o radical DPPH a partir da concentração de
3 µg/mL, exceto a FH que começou a neutralizar o radical somente a partir de 30
µg/mL. Apenas as amostras de FC e FH apresentaram diferença estatística quando
comparados ao padrão trolox (100 µg/mL), indicando que as amostras de EEB e
FAE apresentam atividade antioxidante por inibição do radical DPPH tão eficiente
quanto a do padrão, com valores de inibição de 77,59 e 79,06% respectivamente,
enquanto o trolox inibiu 79,58% do radical. Nas concentrações de 3 a 30 µg/mL o
EEB e FAE tiveram diferença estatística significativa (p<0,001) entre eles.
A IC50 expressa à concentração mínima da amostra necessária para reduzir
em 50% a concentração inicial de DDPH existente no sistema. Desta forma, quanto
menor o IC50 maior será a capacidade da amostra em inibir o radical. O valor
calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH foram 39,53; 37,9; 100,03; 166,9
µg/mL, respectivamente.
O método que envolve a eliminação do radical DPPH é um dos mais
utilizados devido à facilidade e rapidez de desempenho. OLIVEIRA (2015)
descreveu a atividade redutora de DPPH• em extratos etanólico e acetato de etila
preparados a partir das folhas da espécie E. suberosum. Os mesmos apresentaram
IC50 180 µg/mL e 740 µg/mL, respectivamente. O autor relatou que, a atividade
encontrada para o extrato etanólico, apresentou uma relação com os valores altos
encontrados de fenóis totais. (OLIVEIRA et al.,2015). Sendo assim, o presente
estudo demonstrou habilidade em neutralizar o radical DPPH superior ao da
literatura citada.
Em outro estudo, os extratos etanólicos das folhas de E. affine e E.
macrocalyx reagiram com o radical DPPH com IC50 de 16 e 45 µg/mL,
respectivamente (CAIRES, 2015), . Já o resultado de IC50 encontrado no extrato
metanólico das folhas de E. deciddum, em estudo da atividade antioxidante pelo
DPPH•, realizado por ROCHA (2015) foi de 10 µg/mL. Ambos os resultados
apresentaram atividade antioxidante melhor que a do presente estudo.
Estes resultados indicam que mais espécies do gênero Erythroxylum
possuem potencial antioxidante e que estes podem estar associados a diferentes
compostos fenólicos presentes em suas composições.
38
5.1.2. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais ABTS•+
Diferentemente do DPPH•, que é um radical livre e é adquirido dessa forma,
sem a necessidade de preparo, o radical ABTS•+ deve ser gerado por reações
enzimáticas ou químicas (SOUZA, 2013). No presente estudo o ABTS•+, de
coloração azul-esverdeada, foi gerado por meio da reação do ABTS com perssulfato
de potássio, que possui máximos de absorção em 645, 734 e 815 nm, entretanto,
734 nm é o comprimento de onda mais comumente utilizado por minimizar a
influência da turbidez e de interferentes da amostra (CASTELO-BRANCO; TORRES,
2011). Em um meio contendo antioxidantes ocorre à redução do ABTS•+ a ABTS,
promovendo a perda da coloração do meio reacional, ocorrendo o decréscimo na
absorbância.
Os resultados de inibição do radical ABTS•+ do EEB, FAE, FC e FH, nas
concentrações de 10, 30, 100, 300 e 1000 µg/mL foram expressos em percentual de
radical ABTS e estão representados na Figura 12.
Figura 12. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na captura do radical livre ABTS•+
Os resultados expressam a média ± E.P.M. (Erro padrão da média) dos valores de inibição in vitro.
***p<0,001 ou *p<0,05 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.
+++p<0,001 entre concentrações do EEB e FAE. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey.
Todas as amostras neutralizaram o radical ABTS a partir da concentração de
100 µg/mL. Somente a FAE não apresentou diferença estatística significativa
quando comparado ao Trolox (1000 µg/mL), indicando que a mesma apresenta
atividade antioxidante por captura do radical ABTS semelhante a do padrão, com
Rad
ical
AB
TS
(%)
0
25
50
75
100
125
Sistema 10 30 300 1000
Trolox
(g/mL)EEB
(g/mL)
FAE
(g/mL)
FC
(g/mL)
FH
(g/mL)
1000100 10 30 300 1000100 10 30 300 1000100 10 30 300 1000100
***
***
***
***
***
***
******
***
* ***
***
***
###
###
###
+++
+++
39
valor de inibição do radical de 92,05%, enquanto que o do trolox foi de 90,38%. FAE
se mostrou ainda mais ativa que EEB nas concentrações de 300 e 1000 µg/mL.
O valor calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH em relação ao ABTS•+
foram 533,18; 452,98; 1182,82; 2079,02 µg/mL, respectivamente.
A avaliação da capacidade antioxidante pelo método de eliminação do radical
ABTS•+ apresenta a vantagem de que a atividade pode ser medida em compostos de
natureza lipofílica ou hidrofílica, enquanto que o DPPH só pode ser dissolvido em
meio orgânico. Além disso, o ABTS•+ é um nitro-radical, portanto, amostras com
atividades nesse sistema podem demonstrar boa resposta contra espécies reativas
de nitrogênio (CRAFT et al., 2012).
Não foram encontrados na literatura estudos de análise de atividade
antioxidante através do ensaio anti-radicalar ABTS em outras espécies de
Erythroxylum, indicando que o presente estudo é inédito para o gênero.
5.1.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO)
Este método baseia-se na produção de NO a partir da decomposição
espontânea do nitroprussiato de sódio em solução aquosa. Este, por sua vez, reage
rapidamente com o oxigênio produzindo íons nitritos (Basu; Hazra, 2006). O
reagente de Griess é usado para determinar nitrito por espectrofotometria. Esse
reagente é composto por duas substâncias, ácido sulfanílico e N-(1-
naftalenodiamina). O ácido reage com o nitrito formando um sal diazônio, que irá
reagir rapidamente com o N-(1-naftalenodiamina) formando um composto azo
colorido que pode ser detectado espectrofotometricamente a 540 nm. A amostra
contendo antioxidante e o oxigênio competem pelo óxido nítrico, que este sendo
sequestrado pelo primeiro, leva a diminuição da produção de nitrito e
consequentemente, diminui a formação do composto azo colorido (CASTRO, 2012).
Os resultados de inibição do radical óxido nítrico do EEB, FAE, FC e FH, nas
concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em quantidades de
nitrito produzido e estão representados na Figura 13 (pág.40). A curva padrão de
nitrito de sódio gerada apresentou um R² = 0,9998.
40
Figura 13. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na inibição do radical NO.
Os resultados expressam a média ± E.P.M. (Erro padrão da média) dos valores de inibição in vitro.
***p<0,001 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox. ANOVA de uma via
seguida do teste de Tukey.
Todas as amostras apresentaram capacidade de reduzir o NO produzido em
todas as suas concentrações. Somente as amostras de FC e FH apresentaram
diferença estatística quando comparados ao trolox (100 µg/mL). Para o EEB e FAE
não houve divergência em relação ao padrão, o que indica que estas amostras
apresentam atividade antioxidante frente à inibição do NO em conformidade com o
mesmo, sendo seus valores de inibição 41,19 e 45,57% respectivamente, enquanto
o padrão reduziu 44,92% do NO produzido. Também não houve diferença estatística
significativa entre as concentrações de EEB e FAE, indicando que os mesmos
apresentam atividade semelhante.
O valor calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH em relação ao NO foram
133,85; 122,81; 426,76; 7003,45 µg/mL, respectivamente.
NO• é um mediador importante da inflamação aguda e crônica por
estimulação da atividade da enzima ciclooxigenase (COX), resultando em produção
desequilibrada de prostaglandinas pró-inflamatórias. Nas doenças
neurodegenerativas, o cenário inflamatório é considerado uma característica
fundamental que contribui significativamente para o aumento do estresse oxidativo
e, portanto, a progressão da doença. Uma condição pró-inflamatória pode levar a
###
Nit
rito
pro
du
zid
o (
mo
l/L)
0
25
50
75
Sistema 1 3 10 30 100 1 3 10 30 1001 3 10 30 100 1 3 10 30 100
Trolox
(g/mL)EEB
(g/mL)
FAE
(g/mL)
FC
(g/mL)
FH
(g/mL)
100
*** *** ******
***
*** ******
***
***
***
***
*** *** *** ****** *** *** *** ***
###
41
uma sobrecarga de óxido nítrico, aumentando o dano oxidativo devido à formação
de peroxinitrito (DORIA et al., 2015)
Não foram encontrados estudos que analisassem a atividade antioxidante de
outras espécies de Erythroxylum na inibição do radical NO in vitro, indicando que o
presente estudo é inédito para o gênero. Os resultados obtidos indicam que os
compostos presentes nas amostras analisadas podem interagir com o NO formado a
partir da decomposição do SNP, e assim proteger os sistemas biológicos dos danos
causados por essas espécies reativas.
5.1.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)
O método FRAP estima a capacidade da amostra em reduzir o complexo de
Ferro Férrico Tripiridiltriazina (Fe3+ - TPTZ), ao complexo de Ferro Ferroso
Tripiridiltriazina (Fe2+ - TPTZ) em meio ácido. Quanto maior for à capacidade
antioxidante da amostra, maior será a produção do complexo ferroso TPTZ, que
apresenta coloração azul intensa. O monitoramento da atividade redutora da
amostra é feito através da leitura da absorbância em um comprimento de onda de
595 nm (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).
Os resultados da capacidade antioxidante pelo potencial reducional do EEB,
FAE, FC e FH, nas concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em
forma de conversão do íon Fe3+ em íon Fe2+ (µmol de sulfato ferroso) Figura 14
(pág. 42). A curva padrão de sulfato ferroso gerada apresentou um R²=0,9957.
FAE e EEB apresentaram potencial em reduzir o ferro a partir da
concentração de 3 µg/mL, enquanto que FC e FH somente a partir de 10 µg/mL.
Todas as amostras (100 µg/mL) tiveram capacidade redutora significativamente
diferente do padrão Trolox (100 µg/mL), no entanto, enquanto os valores de FC e FH
indicaram que os mesmos têm eficiência inferior ao antioxidante padrão, EEB e FAE
demonstraram atividade superior a ele. FAE ainda demonstrou capacidade de
reduzir o ferro maior que EEB nas concentrações de 10 a 100 µg/mL.
42
Figura 14. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH pelo potencial reducional do Ferro.
Os resultados expressam a média ± E.P.M. (Erro padrão da média) dos valores de inibição in vitro.
***p<0,001ou *p<0,05 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.
+++p<0,001 entre concentrações do EEB e FAE. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey.
O teste de FRAP mede apenas o poder de redução, isso pode, em alguns
casos, servir como uma deficiência, mas quando usado em conjunto com outros
ensaios essa característica fornece oportunidades para determinar os mecanismos
dominantes de compostos antioxidantes (CRAFT et al., 2012).
A presença de metais iônicos, como ferro e cobre, em um sistema, pode
acelerar a taxa de oxidação desse sistema, produzindo radicais livres altamente
reativos. Compostos quelantes de metais podem alterar o potencial redox desses
íons, tornando-os inativos na geração desses radicais livres (CRAFT et al., 2012).
Compostos fenólicos podem agir como quelantes, possuindo a capacidade de se
ligar a íons metálicos formando um complexo incapaz de promover a oxidação.
Alguns requisitos estruturais são importantes no poder de quelação dos íons
metálicos, como por exemplo, a presença de hidroxilas fenólicas vicinais. Assim
como também a facilidade dos íons de metais de transição a serem quelados segue
uma ordem: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ (MIRA et al., 2002).
Não foram encontrados estudos que avaliaram a atividade antioxidante de
outras espécies de Erythroxylum através da capacidade redutora do ferro, indicando
este ser mais um tipo de estudo de atividade antioxidante inédito para o gênero.
Apesar das amostras do presente estudo terem apresentado capacidade redutora,
###
Po
ten
cia
l R
ed
uc
ion
al
(Fe
3+/F
e2
+)
0
200
400
600
800
1000
Sistema 1 3 30 100 1 3 30 1001 3 30 100 1 3 10 30 100
Trolox
(g/mL)FAE
(g/mL)
FC
(g/mL)
FH
(g/mL)
10010 1010
EEB
(g/mL)
****
***
***
***
***
***
***
******
***
******
*
***
###
### ###
+++
+++
+++
43
se faz necessário realizar o ensaio de quelação do Fe2+, a fim de comprovar também
a sua possível ação como quelante de metais.
5.2. Caracterização química da FAE
A partir dos resultados obtidos nas avaliações da atividade antioxidante,
dentre as frações observou-se que de forma geral a FAE apresentou os melhores
valores, em virtude disso a mesma foi submetida a análises de caracterização
química.
5.2.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais
Foi realizada a determinação do teor de compostos fenólicos totais na FAE,
pois, o solvente acetato de etila apresenta polaridade superior aos solventes
utilizados nas outras frações, e consequentemente, tende a extrair compostos que
apresentam alta polaridade, como por exemplo, os compostos fenólicos, que por
possuírem pelo menos uma hidroxila em sua estrutura, caracterizam-se como
compostos de capacidade antioxidante.
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método
espectrofotométrico de Folin- Ciocalteau, utilizando o ácido gálico como padrão de
referência. A quantificação por esse método se baseia na redução dos ácidos
fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), que estão presentes no
reagente de Folin – Ciocalteau, a óxido de tungstênio (W3O23) e óxido de molibdênio
(Mo3O23) em meio alcalino, pelos compostos fenólicos que estão presentes na
amostra. Esses óxidos formados apresentam coloração azulada, que foi possível ser
quantificada a absorbância da solução na região do visível a 720 nm (CRUZ, 2008).
O resultado de teor de compostos fenólicos totais para a FAE foi de 348,85
mg EAG/ g amostra (miligrama em equivalente de ácido gálico por grama da
amostra) ± 8,47 (Desvio Padrão). A curva padrão de ácido gálico gerada (figura 15,
pág. 44) apresentou um R²=0,9985.
44
Figura 15. Curva padrão de ácido gálico para a determinação
do teor de fenólicos totais.
Na literatura, apenas um estudo de determinação de teor de fenólicos totais
foi realizado com extrato de acetato de etila para o gênero Erythroxylum. OLIVEIRA
(2015), determinou 242,2 ± 9,53 mg EAG/ g amostra no extrato de acetato de etila
das folhas de E. suberosum, sendo assim, o presente estudo apresentou teor de
compostos fenólicos totais mais elevado que o da literatura citada. O autor relatou
ainda que através de triagem fitoquímica foi sugerida a provável presença de uma
única classe de compostos fenólicos nesse extrato, os flavonoides (OLIVEIRA et al.
2015).
Os compostos fenólicos têm o poder de amenizar e/ou prevenir danos
oxidativos causados no organismo pelo excesso de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio através da doação de um de seus elétrons tornando-os moléculas
estáveis, interrompendo assim possíveis reações em cadeia. Dessa forma, é
considerada importante a inserção de alimentos ricos nessas substâncias na dieta, a
fim de evitar o desenvolvimento de doenças associadas ao estresse oxidativo.
y = 0,0039x + 0,0744 R² = 0,9985
0
0,5
1
1,5
0 50 100 150 200 250 300A
bso
rbân
cia
Concentração de Ác. Gálico
45
5.2.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos
5.2.2.1. Análise Cromatográfica
A FAE foi submetida à análise de cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada à espectrometria de massas, com o objetivo de identificar os compostos
fenólicos que contribuem para a sua bioatividade. Na figura 16 é apresentado o
cromatograma de íons totais obtido no modo de Ionização por Eletrospray Negativo
(ESI-).
Figura 16. Cromatograma de íons totais da FAE obtido a partir da análise por
HPLC-MS no modo de ionização negativo
Foram observados compostos que co-eluíram no mesmo pico do
cromatograma com tempos de retenção muito próximos. Os compostos foram
identificados através de comparação com injeções de amostras padrão ou com base
nos fragmentos obtidos comparando com aqueles de referências da literatura. Os
dados obtidos na análise estão descritos na tabela 1 (pág. 46).
18,8
20,1
20,6
24,0
25,3
26,6
28,8
33,2
34,9
39,1
41,5
42,7 45,6
59,5
61,6
63,4
70,1
71,0
72,1
74,9
46
Tabela 1. Compostos fenólicos identificados na FAE com correspondentes T.R. e dados de
espectrometria de massas (modo negativo) obtido por HPLC-MS.
Os compostos FAE1, FAE3, FAE5, FAE8, FAE12 e FAE15, de tempos de
retenção 18,8; 20,6; 25,3; 33,2; 42,7 e 61,6 minutos respectivamente, tiveram como
sugestão a Procianidina do tipo B. A procianidina B é um tanino condensado
constituído por 2 unidades de flavan-3-ois (catequina ou epicatequina). As
procianidinas diméricas do tipo B possuem apenas ligações interflavanólicas
covalentes entre o carbono 4 de uma unidade flavan-3-ol e o carbono 8 ou 6 da
N° T.R(min.) [M – H]- (m/z) Fragmentos (m/z) MS2
Composto Sugerido
FAE1 18,8 577,11 451, 425, 407, 289 Procianidina B
FAE2 20,1 353,02 191, 179, 173 Ácido Clorogênico
FAE3 20,6 577,07 451, 425, 407, 289 Procianidina B
FAE4 24,0 865,15 695, 577 Procianidina C
FAE5 25,3 577,09 451, 425, 407, 289 Procianidina tipo B
FAE6 26,6 865,15 695, 577 Procianidina C
FAE7 28,8 289,06 - Catequina
FAE8 33,2 577,07 451, 425, 407, 289 Procianidina B
FAE9 34,9 865,13 695, 577 Procianidina C
FAE10 39,1 353,21 191, 179, 173 Ácido Criptoclorogênico
FAE11 41,5 865,16 695, 577 Procianidina C
FAE12 42,7 577,10 451, 425, 407, 289 Procianidina B
FAE13 45,6 289,00 - Epicatequina
FAE14 59,5 865,14 695, 577 Procianidina C
FAE15 61,6 577,14 451, 425, 407, 289 Procianidina B
FAE16 63,4 865,14 695, 577 Procianidina C
FAE17 70,1 463,15 445, 301, 273, 178 Quercetin-3-O-glicopiranosídeo
FAE18 71,2 609,11 591, 463, 343, 301 Rutina
FAE19 72,1 433,16 151, 179, 301 Quercetin-3-O-Pentosídeo
FAE20 74,9 447,08 429,301, 179,151 Quercetin-3-O-Ramnosídeo
47
outra unidade. São ainda classificadas, numericamente de acordo com a
estereoquímica do carbono 3 do anel C de cada uma das unidades (Figura 17)
(GONÇALVES, 2007).
Fonte: GONÇALVES, 2007
A estrutura sugerida para esses picos teve como base a comparação das
fragmentações observadas nos seus respectivos espectros de massa (MS2)
(Apêndice A) com as fragmentações desse mesmo composto já identificado na
literatura (SANTOS et al., 2013). Uma proposta de fragmentação da estrutura da
Procianidina do tipo B está representada na Figura 18 (pág. 48).
Figura 17. Estrutura química das procianidinas diméricas do tipo B.
Dímeros C4 – C8 Dímeros C4 – C6
48
O fragmento em m/z 425 pode ser explicado pela reação de Retro Diels-Alder
(quebra de ligação C – C) no anel C. Já o fragmento com m/z 407 é justificado a
partir de uma desidratação do fragmento em 425 e 289 é a representação da
unidade monomérica.
Para FAE2 e FAE10, de tempo de retenção 20,1 e 39,1 min. respectivamente,
ambos os compostos possuem fragmentos com m/z 191 (100 e 15,7%) atribuído à
perda da unidade cafeoil, e m/z 179 (48,5 e 32,8%) atribuído à perda do ácido
quínico, originados de cisão eletrolítica e m/z 173 (4,5 e 98,4%) pela desidratação do
ácido quínico (Figura 19, pág. 49), havendo diferenciação apenas nas intensidades
dos íons (Apêndice B), foi sugerido que se trata do ácido clorogênico e seu isômero
ácido criptoclorogênico (Figura 20, pág. 50).
Figura 18. Proposta de fragmentação da procianidina tipo B.
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016
49
Estudo realizado por CLIFFORD (2003) afirmou que a abundância relativa
dos referidos fragmentos pode ser utilizada para a identificação dos ácidos
clorogênicos: criptoclorogênico, clorogênico e neoclorogênico. É fácil distinguir o
ácido criptoclorogênico (grupo acila ligado na posição 4 – OH) pelo seu pico base
em m/z 173, já os ácidos clorogênico e neoclorogênico (grupos acila conectados na
posição 3 – OH e 5 – OH, respectivamente) dão origem ao mesmo pico base m/z
191, a diferenciação entre eles se dá pelo íon do ácido cafeico m/z 179, que irá
aparecer mais abundante no ácido clorogênico com intensidade média de 49%
enquanto que no neoclorogênico é de 5%. Outro fato relevante que o autor
identificou, foi a presença do fragmento m/z 161, encontrado exclusivamente no
espectro de massas do ácido neoclorogênico (CLIFFORD et al., 2003).
Figura 19. Proposta de fragmentação do Ácido Clorogênico
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
50
A procianidina C, foi sugerida como composto para os picos FAE4, FAE6,
FAE9, FAE11, FAE14 e FAE16, com tempos de retenção 24,0; 26,6; 34,9; 41,5;
59,5; 63,4 min. respectivamente. As procianidinas triméricas do tipo C, são taninos
condensados constituídos por 3 unidades de flavan-3-ol (catequina ou epicatequina)
e também são classificadas de acordo com as suas ligações interflavanólicas
covalente (Figura 21).
Ácido Clorogênico (posição 3 – OH)
Ácido Criptoclorogênico (posição 4 – OH)
Figura 20. Estrutura do Ácido clorogênico e seu isômero ácido criptoclorogênico
Figura 21. Estrutura química da procianidina trimérica. Trímero C1 epicatequina-(4β-8)-epicatequina-(4β-
8)-epicatequina.
51
A estrutura sugerida para esses picos teve como base a comparação das
fragmentações observadas nos seus respectivos espectros de massa (MS2)
(Apêndice C) com as fragmentações desse mesmo composto já relatado na
literatura (RODRIGUES, et al., 2007). Uma proposta de fragmentação da estrutura
da Procianidina C está representada na Figura 22. O fragmento m/z 577 obtido a
partir de uma cisão homolítica gerando a unidade dimérica e o fragmento m/z 695
gerado a partir de uma reação de Retro Diels-Alder (quebra de ligação C – C)
seguido de desidratação.
Os compostos FAE7 e FAE13, com tempos de retenção 28,8 e 45,6 min.,
respectivamente, apresentaram mesma [M – H]- de m/z 289, porém, seus espectros
Figura 22. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo C.
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
52
de massas MS2 não apresentaram fragmentações, com isso foram identificados
através de co-injeções com padrões. Por comparação com o pico do íon molecular e
com seus tempos de retenção (28,5 e 45,6 min. respectivamente), sugeriu-se os
compostos Catequina e Epicatequina (Apêndice D), respectivamente. Foi proposta a
fragmentação para esses compostos, que está representada na Figura 23, com os
fragmentos m/z 245 e m/z 205 oriundos a partir de uma fissão do anel heterocíclico e
m/z 179 originado a partir da perda de uma unidade catecol.
O composto FAE17, no tempo de retenção de 70,1 min. apresentou [M – H]-
m/z 463 e fragmentos em MS2 (Apêndice E) consistentes com a estrutura de uma
quercetina-3-O-glicopiranosídeo (isoquercitrina), quando comparado com dados da
literatura (TIBERTI et al., 2007; OSZMIANKI, et al., 2015). A perda da unidade
osídica por hidrólise, através do fragmento m/z 301, serviu para reforçar a sugestão
(Figura 24, pág. 53).
Figura 23. Proposta de fragmentação da Catequina e Epicatequina
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
53
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
O composto FAE18, com tempo de retenção 71,2 min. apresentou [M – H]-
m/z 609. A identificação desse composto foi feita por co-injeção de padrão,
comparando os seus tempos de retenção (71,0 min.) e seus espectros de massas
(MS2) (Apêndice F), observando principalmente o fragmento em m/z 301
correspondente a perda da unidade rutinosídeo por hidrólise (Figura 25), o que
sugere a identificação da substância rutina.
Figura 24. Fragmentação da perda da unidade osídica da isoquercitrina.
Figura 25. Fragmentação da perda da unidade rutinosídeo para o composto Rutina
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
54
O composto FAE19, no tempo de retenção de 72,1 min. apresentou [M – H]-
m/z 433 e fragmentos em MS2 (Apêndice G) consistentes com a estrutura de uma
quercetina-3-O-pentosídeo (possivelmente apiose, arabinose ou xilose, que são as
unidades de pentose mais frequentemente encontradas em glicosídeos de flavonol),
quando comparado com dados da literatura (TIBERTI et al., 2007). A perda da
unidade osídica por hidrólise, através do fragmento m/z 301, serviu para reforçar a
sugestão (Figura 26).
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
O composto FAE20, no tempo de retenção de 74,9 min. apresentou [M – H]-
m/z 447 e fragmentos em MS2 (Apêndice H) consistentes com a estrutura de uma
quercetina-3-O-ramnosídeo (quercitrina), quando comparado com dados da literatura
(TIBERTI, et al., 2007; OSZMIANKI, et al., 2015). Essa sugestão foi reforçada
principalmente devido à presença do fragmento m/z 301 que corresponde a perda
de uma L-ramnose (Figura 27, pág. 55).
Figura 26. Fragmentação da perda da unidade osídica da quercetin-3-o-pentosídeo
55
Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.
Na literatura, alguns estudos realizados com folhas de espécies de
Erythroxylum, identificaram compostos também detectados no presente trabalho. A
ocorrência desses compostos sugere que os mesmos possam ser considerados
marcadores quimiotaxonômicos nesse gênero. No recente estudo realizado por
Barros e colaboradores (2017) em E. suberosum, foi identificado rutina na
composição dos extratos etanólico e aquoso, além disso, observou-se a presença de
isoquercitrina nas frações diclorometano e hidrometanólica. Outro estudo que
também foi verificado a presença de compostos fenólicos nos seus extratos
etanólico e aquoso foi o das folhas de E. daphnites, sendo confirmados rutina e
ácido clorogênico em ambos (MARTINS, 2015).
Estudos já mencionados no item 2.4.2 (pág. 24), observou-se a identificação
dos compostos isolados: quercetina-3-O-α-L-ramnosídeo em E. subrotudum
(OLIVEIRA, 2012); catequina, epicatequina e quercetina-3-O-pentosídeo em E.
rimosum (RIBEIRO, 2013) e em E. pulchrum, epicatequina e quercetina-3-O-α-L-
ramnosídeo (ALBUQUERQUE, 2014). Todos esses foram isolados de fase acetato
de etila particionada do extrato metanólico.
Não foram encontrados na literatura identificação de procianidinas dimérica
e/ou trimérica em Erythroxylum, possivelmente, esse é o primeiro estudo que foi
observado à presença desses compostos no gênero.
Figura 27. Fragmentação da perda da ramnose da quercitrina
56
5.2.2.2. Elucidação estrutural por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) de 1H e 13C
O composto majoritário da FAE (FAE20), observado no cromatograma UV em
280 nm (Figura 28), com tempo de retenção 74,9 min., já com identificação sugerida
através de análise por espectrometria de massas (item 5.2.3.1), foi isolado em HPLC
(equipado com coluna semipreparativa) e submetido à análise por espectroscopia de
ressonância magnética nuclear de 1H e 13C.
No espectro de RMN-1H em (DMSO-d6) a 500 MHz (Figura 29, pág. 57) do
composto majoritário isolado correspondente ao pico com 74,9 min. Foram vistos
oito sinais: um singleto em δH 12,63 (s, 1H, OH-5), (Apêndice I), característico de um
grupamento hidroxila quelatogênica no C-5; δH 7,28 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-2’), δH 7,24
(dd, 1H, J = 2,0 Hz, H-6’), δH 6,84 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5’), (Apêndice J e K); δH 6,36
(s, 1H, H-8) e δH 6,18 (s, 1H, H-6), (Apêndice K). Foi observado também um singleto
em δH 5,24 (s, 1H, H-1’’), ( Apêndice L) e um dubleto em δH 0,80 (d, 3H, J = 6,0 Hz,
H-6’’),( Apêndice M) característicos de sinais da ramnose. A ocorrência de quatro
sinais de prótons aromáticos no espectro de RMN de 1H corroboram com dados da
Figura 28. Cromatograma HPLC-UV da FAE em comprimento de
onda de 280 nm.
74,9 min.
57
literatura, (CHANG et al., 2009). Não foi possível visualizar os H metilênicos da
ramnose devido o encobrimento pelo sinal da H2O.
O espectro de RMN-13C em DMSO-d6 a 125 MHz (Figura 30, pág. 58) do
composto majoritário supracitado apresentou vinte e um sinais, sendo quinze
característicos de esqueleto flavonol. O espectro APT do composto isolado revelou a
presença de um carbono metilico δC 17,4 de ramnose, 10 carbonos de metínicos e
10 carbonos quaternários. Na região alifática de ramnose, foram atribuídas 6
carbonos para uma fração entre as quais o sinal mais caracteristico foi em δC 101.8,
atribuído para carbono anomérico C1'' de ramnose, (CHANG et al., 2009). Portanto,
de acordo com os deslocamentos químicos de cada carbono do composto isolado
no espectro de RMN 13C foi possível denominar o composto como Quercetina-3-O-α-
L-ramnosídeo através de comparação com dados do estudo realizado por CHANG
(2009), utilizando mesmo solvente e frequência (Tabela 2, pág. 58).
Figura 29. Espectro de RMN-1H (DMSO-d6; 500 MHz) do pico majoritário da FAE.
Figura 27. Espectro de RMN-13
C, em DMSO-d6.
DMSO (m)
2,49
58
C δc δC(CHANG et al., 2009)
2 158.7 158.0 3 134.1 134.9 4 177.6 178.2 5 161.2 162.0 6 99.5 99.4 7 166.8 165.0 8 93.6 94.2 9 157,3 157.2 10 104,6 104.8 1’ 120.6 121.5 2’ 115.4 116.2 3’ 145.2 145.9 4’ 149,7 149.2 5’ 115.6 116.4 6’ 121.0 121.8 1’’ 101.8 102.6 2’’ 71.1 71.3 3’’ 70,0 71.1 4’’ 70,3 71.9 5’’ 70,5 70.8 6’’ 17,4 18.2
Figura 30. Espectro de RMN-13
C (DMSO-d6; 125 MHz) do pico majoritário da FAE.
DMSO
39,49
Tabela 2. Deslocamentos químicos RMN 13
C
125 MHz.
59
6. CONCLUSÃO
A investigação da atividade antioxidante para as folhas de E. mucronatum,
através dos métodos DPPH, ABTS, NO e FRAP apresentou resultado positivo para o
EEB, FAE, FC e FH. Este foi o primeiro estudo que mostrou os diferentes
mecanismos antioxidantes in vitro para esse gênero;
A FAE se comportou de maneira igual ou superior ao padrão Trolox® em
todos os testes realizados para atividade antioxidante;
Ao se realizar a quantificação do teor de fenólicos da FAE, foi observada uma
alta concentração desses compostos, desta forma o seu potencial antioxidante pode
ser atribuído à abundância de substâncias dessa classe em sua composição;
A caracterização desta fase por HPLC/MS sugeriu a identificação de 20
compostos fenólicos, todos já conhecidos e em grande parte identificados em outras
espécies do gênero, com exceção das procianidinas do tipo B e C, pois, não foram
encontrados estudos onde estas tenham sido detectadas em Erythroxylum;
Entre os compostos identificados apenas o majoritário FAE20 foi possível ser
isolado e elucidado por RMN de 1H e 13C, sendo determinado como a quercetina-3-
O-L-ramnosídeo, corroborando com o resultado sugerido em HPLC-MS;
O presente trabalho contribuiu para quimiotaxonomia da família
Erytrhoxylaceae, evidenciando que a espécie estudada é bioprodutora de compostos
fenólicos e que além de ser um forte antioxidante pode apresentar ainda outros
efeitos farmacológicos relacionados a tais substâncias.
60
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70
APÊNDICES
APÊNDICE A. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE1, FAE3, FAE5,
FAE8, FAE12 e FAE15, no modo de ionização negativo.
71
APÊNDICE B. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE2 e FAE10, no modo de
ionização negativo.
72
APÊNDICE C. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE4, FAE6, FAE9, FAE11,
FAE14 e FAE16, no modo de ionização negativo.
73
APÊNDICE D1. Espectro de massas (MS2) do padrão catequina em
28,5 min., no modo de ionização negativo.
74
APÊNDICE D2. Espectro de massas (MS2) do padrão epicatequina em
45,6 min., no modo de ionização negativo.
75
APÊNDICE E. Espectro de massas (MS2) do composto FAE17, no modo de
ionização negativo.
76
APÊNDICE F. Espectro de massas (MS2) do composto FAE18
(acima) e do padrão Rutina (abaixo), no modo de ionização
negativo.
77
APÊNDICE G. Espectro de massas (MS2) do composto FAE19, no modo de
ionização negativo.
78
APÊNDICE H. Espectro de massas (MS2) do composto FAE20, no modo de
ionização negativo.
79
APÊNDICE I. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 13 a
12 ppm.
APÊNDICE J. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 7,13 a
7,19 ppm.
80
APÊNDICE K. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre
6,95 a 5,96 ppm.
APÊNDICE L. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 5,4 a
3,8 ppm.
81
APÊNDICE M. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 1,02
a 0,70 ppm.
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